Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd met behulp van Leishmania major promastigoten om de binding, cytotoxiciteit en signalering geïnduceerd door porievormende toxines te bepalen. Een proof-of-concept met streptolysine O wordt verstrekt. Andere toxines kunnen ook worden gebruikt om de genetische mutanten die beschikbaar zijn in L. major te gebruiken om nieuwe mechanismen van toxineresistentie te definiëren.
Abstract
Het begrijpen van de functie en het mechanisme van poriënvormende toxines (PFT's) is een uitdaging omdat cellen bestand zijn tegen de membraanschade veroorzaakt door PFT's. Hoewel biofysische benaderingen helpen bij het begrijpen van porievorming, vertrouwen ze vaak op reductionistische benaderingen die het volledige complement van membraanlipiden en eiwitten missen. Gekweekte menselijke cellen bieden een alternatief systeem, maar hun complexiteit en redundanties in reparatiemechanismen maken het identificeren van specifieke mechanismen moeilijk. Daarentegen biedt de menselijke protozoaire ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor cutane leishmaniasis, Leishmania major, een optimale balans tussen complexiteit en fysiologische relevantie. L. major is genetisch handelbaar en kan in vitro worden gekweekt tot hoge dichtheid, en elke impact van verstoringen op infectie kan worden gemeten in gevestigde muizenmodellen. Bovendien synthetiseert L. major lipiden die verschillen van hun zoogdierachtige tegenhangers, wat de membraandynamiek zou kunnen veranderen. Deze veranderingen in de membraandynamica kunnen worden onderzocht met PFT's uit de best gekarakteriseerde toxinefamilie, cholesterolafhankelijke cytolysinen (CDC's). CDC's binden aan ergosterol in het Leishmania-membraan en kunnen L. major promastigoten doden, wat aangeeft dat L. major een geschikt modelsysteem is voor het bepalen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van de PFT-functie. Dit werk beschrijft methoden voor het testen van de PFT-functie in L. major promastigoten, waaronder parasietcultuur, genetische hulpmiddelen voor het beoordelen van lipidegevoeligheid, membraanbindingstests en celdoodtests. Deze testen zullen het snelle gebruik van L. major mogelijk maken als een krachtig modelsysteem voor het begrijpen van de PFT-functie in een reeks evolutionair diverse organismen en overeenkomsten in lipidenorganisatie.
Introduction
Poriënvormende toxines (PFT's) zijn de grootste familie van bacteriële toxines1, maar de mechanismen waarmee ze cellen perforeren en vernietigen zijn slecht begrepen. De best bestudeerde familie van porievormende toxines is die van cholesterolafhankelijke cytolysinen (CDC's). CDC's worden voornamelijk gesynthetiseerd door grampositieve bacteriën, waaronder de veroorzaker van necrotiserende fasciitis, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes scheidt de CDC streptolysine O (SLO) af, die zich bindt aan sterolen in het plasmamembraan van gastheercellen als monomeren, oligomeriseert en ~ 20-30 nm poriën in het membraan inbrengt1. De rol die lipiden in dit proces spelen, blijft slecht bepaald.
Een benadering voor het bestuderen van lipide-CDC-interacties is het gebruik van chemisch gedefinieerde liposomen. Hoewel gedefinieerde liposomen informatie verschaffen over de noodzakelijke drempels van lipiden om toxinebinding en porievorming te ondersteunen 3,4, recapituleren ze cellulaire functies niet volledig. Gereconstitueerde liposomen missen bijvoorbeeld de lipide-asymmetrie van zoogdiergastheren en lipidemodificaties als reactie op toxines5. Een alternatief voor liposomen is het gebruik van zoogdiercellijnen. Hoewel deze cellijnen fysiologisch relevanter zijn, is er een grote mate van redundantie in toxinedetectie- en weerstandsmechanismen2. Als gevolg hiervan blijven de reparatiepaden die worden gebruikt om CDC's te weerstaan slecht bepaald. Met name Ca2+ instroom is de primaire activator van membraanreparatie1. Stroomafwaarts van Ca2+ instroom worden meerdere paden ingeschakeld, waaronder een ceramide-afhankelijke reparatie 6,7 en een MEK-afhankelijke reparatieroute6. Deze routes interageren met andere eiwiteffectoren, waaronder het endosomale sorteercomplex dat nodig is voor transport (ESCRT)8, en annexinen 6,9,10. Het ontleden van deze paden in zoogdiercellen is een uitdaging vanwege de redundantie, die de interpretatie van gegevens vertroebelt.
Een manier om complexiteit in evenwicht te brengen met eenvoud voor het ontleden van reparatieroutes is het gebruik van eenvoudiger organismen, zoals protozoaire pathogenen in het geslacht Leishmania. Leishmania sp. veroorzaken leishmaniasis bij mensen en andere dieren. Leishmaniasis varieert van cutane leishmaniasis (zelfbeperkte huidlaesies) tot de fatale viscerale leishmaniasis (hepatosplenomegalie), afhankelijk van de soort en andere factoren11. Leishmania major, de veroorzaker van cutane leishmaniasis, wordt overgedragen op mensen via een zandvliegvector en wordt gebruikt om de Leishmania-functie en infectie te begrijpen12. Bovendien zijn Leishmania sp. digene12. Ze bestaan als intracellulaire macrofaagparasieten van zoogdieren die amastigoten worden genoemd en als vrijzwemmende, flagellated promastigoten in de zandvlieg12. L. belangrijke promastigoten kunnen worden gekweekt in serum-aangevulde media zoals M199 tot hoge dichtheid13. Promastigoten zijn ook genetisch handelbaar; er bestaan veel gen knock-outs, waaronder die gericht op lipide biosynthese pathways13. Deze knock-outs kunnen worden geëvalueerd op groei en verschillen in infectiviteit en laesieontwikkeling via infectie van Balb / c-muizen13.
Naast het relatieve gemak van de Leishmania-cultuur en het bereik van lipidebiosynthese knock-outs, heeft de parasiet een eenvoudiger genoom dan zoogdieren. De best gekarakteriseerde soort van Leishmania is L. major, die veel bestaande genetische hulpmiddelen heeft, zoals mutanten met een defect lipidenmetabolisme14. Met name veel reparatie-eiwitten zijn afwezig. L. major heeft tot op heden geen homologen geïdentificeerd voor belangrijke zoogdierhersteleiwitten zoals annexinen. Dit maakt de karakterisering van evolutionair geconserveerde reparatieroutes mogelijk zonder de complexiteit van zoogdiersystemen. Reparatiepaden zijn echter tot op heden niet gekarakteriseerd in Leishmania. Tegelijkertijd worden belangrijke signaleringsroutes die betrokken zijn bij reparatie, zoals de MEK-route6, bewaard in Leishmania sp.15,16, hoewel homologen moeten worden gevalideerd. De mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) -route is goed bestudeerd in L. mexicana, waar het bijdraagt aan intracellulaire overleving en thermostabiliteit in zoogdiercellen en metacyclogenese regelt16. In Leishmania sp. zijn 10 van de 15 MAPK's gekarakteriseerd17. LmMAPK9 en LmMAPK13 lijken naar verwachting het meest op zoogdier ERK1/2 op basis van identiteit in de geconserveerde fosforyleringslipsequentie. De fosforyleringslipsequentie is TEY voor zowel zoogdier ERK1/2 als LmMAPK9 en LmMAPK13. Acht van de Leishmania MAPKs hebben echter een TDY-fosforyleringsmotief15. Ten minste twee homologen van MEK zijn geïdentificeerd in Leishmania sp., LmxMKK18 en MEKK-gerelateerd kinase (MRK1)19. Dit suggereert dat inzichten geïdentificeerd in Leishmania zich kunnen vertalen naar zoogdiersystemen. Waar ze zich niet vertalen naar zoogdiersystemen, vertegenwoordigen ze therapeutische doelen voor de behandeling van leishmaniasis.
Om L. major promastigoten te gebruiken om membraanherstel en interacties met toxines te bestuderen, zijn technieken met gemiddelde doorvoer nodig. Hoewel live cell imaging met hoge resolutie de visualisatie van gelabelde eiwitten en membranen in realtime mogelijk maakt, is het een lage doorvoer en meet het mogelijk niet de cellulaire overleving. Medium-throughput levensvatbaarheidstests omvatten kleurstofopname gemeten door flowcytometrie, de meting van mitochondriale activiteit of de afgifte van cellulaire eiwitten zoals lactaatdehydrogenase (LDH). In zoogdiercellen meten LDH-assays de celdood niet kwantitatief20. Bovendien maken populatiegebaseerde assays zoals LDH-afgifte of mitochondriale activiteit geen robuuste eencellige of multiparametrische analyse mogelijk20. Flowcytometrie-gebaseerde assays maken daarentegen multiparametrische eencellige analysemogelijk 20. Deze testen zijn echter niet toegepast op het begrijpen van toxinebiologie of reacties op toxines in L. major promastigoten.
In deze studie wordt SLO gebruikt als een hulpmiddel om de plasmamembraanverstoring van de sfingolipide null-mutant van L. major in twee verschillende buffers te begrijpen - de M199-media die routinematig worden gebruikt om L. major promastigoten en de eenvoudigere Tyrode-buffer te kweken. Een medium-throughput flow cytometrie assay wordt beschreven en gebruikt om toxine dosis-respons curven te genereren. Gegevens van de flowcytometrische test worden gemodelleerd naar een logistieke curve om de LC50-waarden te bepalen. Met deze informatie kan een sublytische dosis SLO worden bepaald, zodat MAPK-antilichamen kunnen worden gevalideerd met behulp van western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle passende richtlijnen en standaard microbiologische, veiligheids- en celkweekpraktijken werden gebruikt voor het gebruik en de behandeling van de RG2-pathogeen Leishmania major en recombinant DNA. Alle experimenten met levende L. major werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast in een BSL-2 gecertificeerd laboratorium. Het werk stond onder toezicht van het Texas Tech University Institutional Biosafety Committee.
OPMERKING: Vanuit een veiligheidsperspectief zijn levende L. major promastigoten risicogroep 2 pathogenen. Behandel het gebruik van de juiste inperking, voorzorgsmaatregelen en toezicht van het Institutional Biosafety Committee (IBC). Behandel giftige stoffen en chemicaliën in overeenstemming met institutionele procedures voor giftige stoffen. Als recombinante toxines worden gebruikt, kan IBC-goedkeuring en toezicht nodig zijn voor recombinant DNA-werk.
1. Teelt en bereiding van L. major promastigoten
- Verkrijgen, of maken en valideren, L. belangrijke genetische mutanten zoals eerder beschreven met behulp van homologe recombinatie of CRISPR-gebaseerde methoden13,21. Gebruik knock-outs aangevuld met het gen toegevoegd aan een plasmide om de specificiteit van de knock-out te garanderen.
- Kweek wild type L. major en spt2- promastigoten bij 27 °C in volledig M199 medium. Kweek de episomale addbackcellen (spt2-/+SPT2) in volledig M199 plus 10 μg/ml G418 (zie tabel 1 en materiaaltabel).
OPMERKING: De volledige experimentele opstelling met experimenten met L. major-cellen moet worden uitgevoerd in een BSL2-gecertificeerde bioveiligheidskast. - Cultiveer de promastigoten in volledige M199 medium22 totdat ze de logfase bereiken (2-8 x 106 cellen / ml), zoals bepaald door L. belangrijke groeicurvetests die eerder zijn gedaan23. Plan 1 x 105 cellen voor elke put voor cytotoxiciteit, plus 5 x 105 cellen voor kleuringscontrole. Voor western blot, plan 2 x 107 cellen per put.
OPMERKING: Voer cytotoxiciteitstest uit met twee technische replicaties. - Om de juiste celdichtheid te controleren, mengt u een aliquot (10-40 μL) promastigoten met een gelijk volume fixatief (3,7% paraformaldehyde in 1x PBS). Laad 10 μL van het vaste monster op elke zijde van de hemacytometer.
LET OP: Formaldehyde is een giftige chemische stof. Behandel in overeenstemming met het institutionele beleid voor gevaarlijke chemische stoffen. - Voer celtelling uit met behulp van een microscoop met een vergroting van 20x. Tel alle cellen in de 25 kleine vierkantjes in het midden van de hemacytometer. Herhaal dit voor de vierkanten aan beide zijden en gemiddelde van de tellingen.
OPMERKING: Als de variatie tussen tellingen >10 is, hertelling en gemiddelde. Als het gemiddelde aantal <10 of >100 is, wijzigt u de verdunning en hertelling en berekent u vervolgens de cultuurdichtheid met behulp van de volgende formule:
(Eq 1)
Als er bijvoorbeeld gemiddeld 250 Leishmania in 25 vierkanten zijn, is de cultuurdichtheid 5 x 106 cellen / ml. - Breng na het tellen 5 x 106 cellen over naar een conische buis van 15 ml en centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
- Gooi het supernatant weg met een pipet van 10 ml en vortex de celpellet kort. Voeg 5 ml 1x PBS toe aan dezelfde buis en was de cellen door 3-6x voorzichtig om te keren. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
- Gooi het supernatant weg met behulp van een pipet van 10 ml en resuspenseer de 5 x 106-cel pellet in 5 ml medium (bijv. M199 of 1x Tyrode's buffer) die voor de experimenten wordt gebruikt met een 5 ml pipet om een eindconcentratie van 1 x 106 cellen / ml te geven.
(Eq 1)2. Cytotoxiciteitstest
- Experimentele voorbereiding
- Zuiver het toxine zoals eerder beschreven24, of koop het toxine van een leverancier. Aliquot in aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar −80 °C gedurende maximaal 1 jaar. Vermijd meerdere vries-dooicycli.
- Bepaal de hemolytische activiteit voor elk toxine met behulp van menselijke rode bloedcellen (zie materiaaltabel)24.
OPMERKING: Hemolytische activiteit wordt gebruikt omdat het controleert op verschillen in activiteit als gevolg van zuivering, mutaties, enz. De soortkeuze van erytrocyten kan de hemolytische activiteit veranderen (intermedilysine vereist bijvoorbeeld menselijke rode bloedcellen). - Plan twee technische replica's voor elke toestand, zeven verdunningen voor de dosis-responscurve en een controle zonder toxine.
OPMERKING: Met wild-type (WT), spt2- en spt2-/+SPT2-promastigoten kunnen twee behandelingen worden getest in één V-bottom 96-well-plaat. De gevoeligheid voor media kan bijvoorbeeld worden vergeleken (figuur 1). In plaats van een V-bodemplaat kunnen buizen van 1,2 ml microtiter (zie materiaaltabel) worden gebruikt. Vanwege de acquisitietijden op de cytometer wordt het uitvoeren van meer dan één plaat tegelijk niet aanbevolen. - Bepaal welke testbuffer moet worden gebruikt op basis van de benodigde testomstandigheden en het doel van het experiment.
OPMERKING: In dit voorbeeld worden twee testbuffers vergeleken: M199 en tyrodebuffer aangevuld met de levensvatbaarheidskleurstof propidiumjodide (PI). Cholesterol in serum zal interfereren met CDC-activiteit24. - Bereken de hoeveelheid toxine die nodig is op basis van de omstandigheden en het aantal behandelde genotypen. Zorg ervoor dat 50% specifieke lyse halverwege de verdunningscurve optreedt.
OPMERKING: Voor CDC's geeft een tweevoudige seriële verdunning een goed bereik voor latere logistieke modellering. Voor spt2-promastigoten is 4.000 HU/ml SLO de aanbevolen startverdunning. Wanneer inactieve toxines worden gebruikt, mag in plaats daarvan een massa worden gebruikt die overeenkomt met de hoogste dosis. - Plan een eindvolume van 200 μL per put en voeg een klein volume extra (50-100 μL) toe om rekening te houden met pipetfouten.
OPMERKING: Met drie genotypen, elk in tweevoud gedaan, zullen er zes monsters zijn voor de seriële verdunning. - Bepaal de totale hoeveelheid toxine die nodig is met behulp van de volgende formule:
(Eq 2)
waarbij ActivityMax de hoogste gebruikte concentratie is (HU/ml); TotalFinalVolume is het totale volume (voor zes monsters, 200 x 6 + 100 = 1.300 μL); ActivityStock is de activiteit van de toxinevoorraad (HU/ml); en VolStockToxin is het volume van de toxinevoorraad dat nodig is. - Bereid voldoende testbuffer voor die nodig is voor het experiment. Vul het basale medium aan met een levensvatbaarheidskleurstof en eventuele Ca2+ of EGTA die nodig is om Ca2+ niveaus onder controle te houden. Vortex om te mengen.
OPMERKING: Voeg bijvoorbeeld voor elke 10 ml Tyrode's buffer 50 μL van 2 mg / ml PI en 200 μL van 100 mM CaCl2 toe, wat de eindconcentraties van respectievelijk 10 μg / ml en 2 mM oplevert. - Zorg ervoor dat de levensvatbaarheidskleurstof PI niet conflicteert met andere gebruikte sondes, zoals voor fluorescerende bindingstests met Cy5 of AlexaFluor647-geconjugeerde toxines20,25.
- Plan toxineverdunningen om een 2x oplossing van toxine te maken. Voeg de testbuffer toe aan de centrifugebuizen van 1,5 ml en koel op ijs. Voeg het toxine alleen toe onmiddellijk voordat de test wordt gestart.
OPMERKING: In dit voorbeeld zou 1,3 ml testbuffer worden toegevoegd voor de bovenste verdunning en 650 μL zou worden toegevoegd voor seriële verdunningen om de 2x toxine-oplossing te bereiden.
- Experiment
- Reserveer 0,5 ml verwerkte promastigoten uit stap 1.8 in een aparte buis als "Niet-gekleurde controle".
OPMERKING: Dit monster wordt gebruikt om gating op de flowcytometer in te stellen. - Voeg 2 mg/ml PI toe aan een eindconcentratie van 10 μg/ml aan de resterende promastigoten. Vortex voor 3 s.
OPMERKING: Na de toevoeging van PI aan de verwerkte promastigoten kunnen deze cellen alleen worden gebruikt voor een periode van 2,5 uur. Na 2,5 uur beginnen de cellen af te sterven en worden de resultaten onjuist. - Voeg 1 x 105 (in 100 μL/put) verwerkte promastigoten toe aan elke put van een V-bodemplaat met 96 putten of 1,2 ml microtiterbuizen (figuur 1). Plaats de plaat of het buisrek op ijs in een hoek van ongeveer 45° ten opzichte van het zicht. Voer het werk uit in een bioveiligheidskast bij het hanteren van Leishmania promastigoten.
- Voeg 100 μL testbuffer met PI toe aan elke no-toxinecontrole (laatste rij). Controleer of het besturingselement correct is toegevoegd door visueel te identificeren welke buizen met een totaal volume van 200 μL donkerder van kleur lijken.
- Verwijder de toxine aliquots van −80°C, ontdooi op ijs en pool indien nodig. Voeg het in stap 2.1.5 berekende toxinevolume toe aan de hoogste verdunning (bereid in stap 2.1.10). Verdun vervolgens het toxine serieel (figuur 1). Pipetteer minstens 8x op en neer om mengen te garanderen.
OPMERKING: Presteren op ijs omdat CDC's snel inactiveren bij kamertemperatuur. - Begin bij de laagste toxineconcentratie en voeg snel 100 μL toxine toe aan de juiste rij (figuur 1 en figuur 2) en ga door totdat al het toxine aan de cellen is toegevoegd.
- Sluit de plaat af met afdichtingstape. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Na de incubatietijd, verpak en transporteer de plaat naar de flowcytometer.
- Reserveer 0,5 ml verwerkte promastigoten uit stap 1.8 in een aparte buis als "Niet-gekleurde controle".
- Data-acquisitie
- Stel de flowcytometer (zie Materiaaltabel) en acquisitiesoftware in volgens de instructies van de fabrikant en per facilitair beleid. Voer de flowcytometrieprocedure niet uit zonder voorafgaande training op de cytometer.
OPMERKING: In dit voorbeeld is een 4-laser Attune NxT gebruikt. PI werd verzameld op het YL-1-kanaal (opgewonden door een 561 nm-laser, door een 577 LP, gereflecteerd vanaf 600 DLP en gefilterd door 585/16 bandpass), hoewel het brede spectrum van PI verzameling op andere kanalen mogelijk maakt. - Stel met behulp van het niet-gekleurde L. major promastigote monster de poorten in voor voorwaartse en zijwaartse spreiding en de initiële fluorescerende parameters op basis van de gekozen kleurstoffen.
- Voeg indien gewenst een extra parameter toe voor dot plots om autofluorescentie te controleren (bijv. "geen vlek") (figuur 3).
OPMERKING: In dit voorbeeld werd het BL-1-kanaal (opgewonden door een 488 nm-laser, door 495 DLP en 503 LP gegaan, gereflecteerd van 555 DLP en gefilterd via 530/30 bandpass) gebruikt. - Stel met behulp van enkele gekleurde controles de poorten in voor de levensvatbaarheidskleurstof (PI in deze studie) en eventuele fluorescerend gelabelde toxines. Monitor voorwaartse spreiding versus tijd voor micro-klompen.
OPMERKING: PI zal alle cellen boven niet-gekleurde besturingselementen vaag kleuren. Dode cellen zullen gemakkelijk te scheiden zijn, met tijdelijk permeabiliseerde cellen tussen populaties. - Verkrijg > 10.000 gated events voor elk monster op de cytometer.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te lezen van meest gevoelig naar minst gevoelig, maar de volgorde van verwerving kan worden omgekeerd om de impact van de leesvolgorde op de monsterresultaten te bepalen. - Sla de gegevens op en exporteer indien nodig voor analyse.
- Stel de flowcytometer (zie Materiaaltabel) en acquisitiesoftware in volgens de instructies van de fabrikant en per facilitair beleid. Voer de flowcytometrieprocedure niet uit zonder voorafgaande training op de cytometer.
- Data-analyse
OPMERKING: In dit onderzoek is excel met oplosser plug-in (zie Materiaaltabel) werd gebruikt voor gegevensanalyse (zie Aanvullend bestand 1).- Gate totaal, eencellige L. major promastigoten door gating op voorwaartse en zijwaartse spreiding en tijd indien nodig (figuur 3). Gebruik hoogte of gebied zoals aanbevolen voor de flowcytometer.
OPMERKING: Voor de hier gebruikte flowcytometer is hoogte de aanbevolen parameter in plaats van het gebied. - Identificeer en gate dode cellen als "PI hoog". Gate tussenliggende cellen als "PI laag". PI-hoge cellen zijn dode cellen, terwijl PI-lage cellen tijdelijk permeabiliseerd zijn26.
OPMERKING: PI-hoge cellen vertonen meestal een 2-3 logverschuiving van negatieve cellen. - Exporteer de gegevens naar Excel. Verkrijg de monsternaam/ID en %PI hoog om het doden te bepalen.
OPMERKING: Als fluorescerende toxines werden gebruikt, zal de mediane fluorescerende intensiteit (MFI) van levende, tijdelijk permeabiliseerde en negatieve populaties nodig zijn. %PI low mag worden geëxporteerd voor transiënte permeabilisatie. - Bepaal het gemiddelde %PI hoog voor elke voorwaarde tussen de twee technische replicaten.
OPMERKING: Als gemiddelde MFI nodig is voor fluorescerende toxines, bereken dit dan ook. - Bereken %Specifieke Lysis uit de %PI high met behulp van de volgende formule24,25:
(Eq 3)
waarbij PIhighxpt het %PI-hoog is voor de experimentele toestand; en PIhighctl is de %PI hoog voor de no-toxine controle. - Grafiek %Specifieke Lysis tegen toxineconcentratie voor de dosis-responscurve (figuur 4).
- Organiseer de dosis-responscurve in Excel voor logistieke modellering. Inclusief toxineconcentratie en gemiddelde %specifieke lysis, samen met experimentele details en/of ruwe %PI-hoge berekeningen (tabel 2).
- Controleer of de invoegtoepassing Oplosser is ingeschakeld.
OPMERKING: Als u de Oplosser wilt inschakelen in de bureaubladversie van Excel, gaat u naar Opties voor bestand > > invoegtoepassingen en schakelt u het selectievakje Oplosser in. Start Excel opnieuw. - Label nog vier kolommen als "gemodelleerd", "restanten", "parameters" en "parameterwaarden". Controleer of de eerste kolommen overeenkomen met de experimentele parameters, de toxineconcentratie en %Specifieke Lysis (tabel 2).
- Voeg de volgende parameters toe in de kolom "parameters": L, k, c, SUM en LC50. Initialiseer de parameters L, k en c door de volgende waarden in de kolom "parameterwaarden" in te voeren: 100, 0,05, 1.000.
- Maak in de kolom "gemodelleerd" het logistieke model met behulp van de volgende formule:
(Eq 4)
Stel L, k en c in op de cellen met deze parameters in de kolom 'parameterwaarden'.
Stel x in op de cel die de toxineconcentratie bevat.
OPMERKING: Voor tabel 2, cel G4, is de formule als volgt: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5))) - Pas deze vergelijking toe op alle %Specifieke Lysis-waarden, behalve de controle zonder toxine.
- Bereken in de kolom "resten" het kwadraat van het verschil tussen het gemodelleerde getal en de werkelijke specifieke lysis met behulp van de volgende vergelijking:
(Eq. 5)
waarbij y de experimentele %Specifieke Lysis is; en m is de overeenkomstige waarde in de kolom "gemodelleerd", berekend in de stappen 2.4.10-2.4.11. - In de kolom "parameterwaarden" naast "SOM" somt u alle waarden in de kolom restwaarden op.
- Initialiseer in de kolom "parameterwaarden" naast "LC50" de vergelijking om de LC50 te berekenen op basis van de bepaalde waarden. Dit is het oplossen van Eq 4 voor x wanneer m = 50.
(Eq 6)
Voor tabel 2 is de Excel-formule als volgt: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4 - Open de oplosser op het tabblad Gegevens. Selecteer doelstelling instellen als de cel die de som van de berekende restwaarden bevat. Stel het in op Min.
- Wijzig de variabele cellen voor de parameterwaarden L, k en c.
OPMERKING: De oplosser kan zich beter gedragen als "Maak ongelimiteerde variabelen niet-negatief" is aangevinkt. - Voor negatieve k-waarden wijzigt u Eq 4 en Eq 6 door −1 van k te berekenen om k in positief te veranderen. Gebruik de GRG Nonlinear solving methode. Klik op Oplossen.
- Controleer de curve en dat de LC50 automatisch wordt berekend met behulp van Eq 6 (tabel 2). Controleer de pasvorm door zowel %Specifieke lyse als modellering tegen toxineconcentratie grafisch uit te zetten.
OPMERKING: Het kan ook worden gecontroleerd door de R2 voor de curve te berekenen.
- Gate totaal, eencellige L. major promastigoten door gating op voorwaartse en zijwaartse spreiding en tijd indien nodig (figuur 3). Gebruik hoogte of gebied zoals aanbevolen voor de flowcytometer.
(Eq 2)
(Eq 3)
(Eq 4)
(Eq. 5)
(Eq 6)3. Eiwitanalyse van toxine-uitgedaagde L. major promastigoten
- Bereid L. major promastigoten zoals beschreven in rubriek 1.
- Resuspendeer 2 x 107 WT, spt2-, en spt2-/+SPT2 L. belangrijke promastigoten in 2 ml van de gewenste testbuffer met behulp van een pipet van 5 ml (bijv. serumvrij M199). Voeg toxine toe aan een uiteindelijke sublytische concentratie en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Een sublytische dosis SLO voor spt2-promastigoten is bijvoorbeeld 500 HU /ml. - Neem andere genotypen en controles zonder toxine op.
- Centrifugeer de promastigoten bij 1.500 x g gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren. Gooi het supernatant weg met een pipet van 10 ml. Laat de gesloten buis met de celpellet drie keer snel over een onregelmatig oppervlak lopen, zoals de grill van de bioveiligheidskast, om de celpellet te breken.
OPMERKING: De celkorrel is bijna onzichtbaar voor het blote oog. - Reconstitueer 1x SDS-PAGE monsterbuffer met 2-mercaptoethanol onmiddellijk voor gebruik en verwarm tot 95 °C gedurende 10 minuten voordat u het aan de celpellet toevoegt. Resuspendeer de celpellet in hete 1x SDS-PAGE monsterbuffer en meng goed door op en neer te pipetteren. Verwarm de resuspended cel pellet in 1x monster buffer op 95 °C gedurende 10 min.
OPMERKING: Bewaar de monsters na oplosbaarheid in de monsterbuffer indien nodig langdurig bij −20 °C. - Bereid de oplossende gel voor. Ontgas alle componenten behalve ammoniumpersulfaat (APS) en TEMED gedurende 15 minuten.
- Voeg APS en TEMED toe vlak voordat u de gel giet. Leg de oplossende gel voorzichtig over met water. Laat de oplossende gel polymeriseren, ~30-45 min.
- Decanteer het water en bereid de stapelgel voor. Voeg de stapelgel toe en zorg ervoor dat bubbels worden vermeden. Plaats een kam met het relevante aantal putjes en laat gedurende 5 minuten polymeriseren. Controleer de polymerisatie met behulp van overgebleven stapelgel.
- Monteer de gel voor het uitvoeren van SDS-PAGE en voeg reservoirbuffer toe aan de kamer.
- Laad 10 μL van elk monster per put, of 8 μL van de eiwitladder. Voer op 180 V totdat de monsters in de oplossende gel komen en verlaag vervolgens de spanning tot ~ 160 V en loop totdat de kleurstof voorkant ~ 0,5 cm van de rand van de plaat is.
OPMERKING: De tijd die nodig is voordat de monsters de bodem bereiken, kan variëren tussen 1-1,5 uur. De tijd kan worden verlengd door de spanning te verlagen. Verlaag de spanning nooit tot nul. Hogere spanningen kunnen het "glimlachen" van de gel verhogen en de platen kraken. - Breng de gel over op Coomassie-vlek (voor eiwitkleuring) of op 1x transferbuffer (voor western blotting). Voor Coomassie-kleuring, 's nachts vlekken en vervolgens vasthouden, beeld en droog.
- Voor western blot, bereid het transfersysteem voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik voor een natte overdracht koude 1x transferbuffer en voorvochtige pads, filterpapier en nitrocellulose. Voor het bio-rad Protean III-systeem (zie hier gebruikte materiaaltabel) mag het filterpapier worden gesneden tot 10 cm x 7,5 cm. Snijd de nitrocellulose tot 9 cm x 6,75 cm.
LET OP: Nitrocellulose is licht ontvlambaar. Vermijd open vuur en andere potentiële ontstekingsbronnen. - Leg de transfercassette op met pads, filtreerpapier en nitrocellulose. Rol luchtbellen uit. Voeg de gel voorzichtig toe.
- Voeg het filtreerpapier toe en rol luchtbellen uit. Voeg de pad toe, sluit de cassette en steek in de houder in de juiste richting (zorg ervoor dat nitrocellulose naar de rode pool is gericht). Voeg een roerstaaf en een ijspak toe aan de zijkant en vul het reservoir af met koude 1x transferbuffer. Transfer bij 110 V gedurende 90 min.
OPMERKING: De warmte die tijdens de overdracht wordt gegenereerd, kan de overdracht nadelig beïnvloeden. Gebruik voor een goede overdracht altijd koude 1x overdrachtsbuffer. - Verwijder de nitrocellulose en vlek met Ponceau-oplossing gedurende ~ 5 min. Spoel af met ultrapuur water. Markeer de eiwitladder met potlood en snijd de vlek indien nodig bij. Houd de vlek vast met behulp van overgebleven overdrachtsbuffer.
OPMERKING: Ponceau kan vele malen worden hergebruikt. - Blokkeer de nitrocellulose in 25 ml van 5% BSA in 1x TBST bij 4 °C, met schudden, 's nachts. Gooi vervolgens de blokkerende oplossing weg en voeg primair antilichaam (1: 1.000) toe in 1% BSA in 1x TBST. Eén nacht op 4 °C.
OPMERKING: Het primaire antilichaam kan worden opgeslagen bij −20 °C en meerdere keren worden hergebruikt. - Was de nitrocellulose 3x gedurende 10 min elk in 1x TBST met schudden. Gooi de was weg en voeg 10 ml HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:10.000) toe aan 1% BSA in 1x TBST. Schud op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de nitrocellulose 3x gedurende 10 min elk in 1x TBST met schudden.
- Bereid ECL-reagens onmiddellijk voordat u de nitrocellulose in beeld brengt. Decanteer vlak voor de beeldvorming de TBST en voeg het ECL-reagens toe aan de nitrocellulose. Schud gedurende 1 min. Stel je de gel voor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verhoogde promastigotengevoeligheid voor SLO in de buffer van Tyrode in vergelijking met M199
De SLO-gevoeligheid van L. major promastigoten werd vergeleken tussen verschillende assaybuffers. Wild-type, spt2-, en spt2-/+SPT2 promastigoten werden uitgedaagd met SLO in serumvrije M199 of Tyrode's buffer aangevuld met 2 mM CaCl2 gedurende 30 minuten voorafgaand aan de analyse op een flowcytometer. Geschikte parasieten voor analyse waren afzonderlijke cellen geïdentificeerd door voorwaartse/ zijdelingse spreidingsprofielen (figuur 3A, B). Gegevens werden verzameld met behulp van kanalen BL1 (488 excitatie, 530/30 emissiefilter) als een autofluorescentieregeling en YL1 (561 nm excitatie, 585/16 emissiefilter) voor PI. BL1 werd gebruikt om potentiële autofluorescentie- of compensatieproblemen te identificeren (x-as in figuur 3C-E). Het gebruik van de 561 nm-lijn verminderde de doorbloeding van PI naar het BL1-kanaal. De fractie van dode cellen werd bepaald voor elke aandoening en %Specifieke Lysis werd bepaald. Wildtype- en spt2-/+SPT2-promastigoten waren resistent tegen SLO in serumvrij M199, maar hadden lichte (<20%) specifieke lysis in de buffer van Tyrode (figuur 4A). De sfingolipide-deficiënte spt2- promastigoten waren gevoelig voor SLO in zowel serumvrije M199 als Tyrode's buffer (figuur 4). Om de toename van de gevoeligheid van tyrodebuffer in vergelijking met serumvrij M199 te kwantificeren, werd de dosis-responscurve aangepast aan een logistiek model en werd de LC50 berekend voor elke aandoening (figuur 4B). De spt2-promastigoten waren in de buffer van Tyrode ongeveer acht keer gevoeliger voor SLO dan in M199 (figuur 4B). Deze gegevens tonen aan dat de toxinegevoeligheid kan variëren op basis van de gebruikte buffer. Curve fitting maakt het mogelijk om veranderingen in de gehele dosis-responscurve te vergelijken. Flowcytometrie maakt dus een medium-throughput assay mogelijk om de toxinegevoeligheid van L. major promastigoten onder verschillende omstandigheden te vergelijken.
MEK-routeactivering in L. major onafhankelijk van toxine-uitdaging
De eencellige gegevens over cellulaire overleving van de cytotoxiciteitstest maken downstream-assays mogelijk bij sublytische toxinedosis. L. major kan bijvoorbeeld worden getest op biochemische routes door western blotting na toxine-uitdaging. De MEK-route wordt geactiveerd tijdens membraanherstel in zoogdiercellen6. Het is onbekend of deze route wordt geactiveerd na SLO-challenge in L. major of dat de commercieel beschikbare antilichamen L. major MAPK-homologen herkennen. WT, spt2- en spt2-/+SPT2-promastigoten werden uitgedaagd met een sublytische (500 HU/ml) dosis SLO en geanalyseerd door western blotting. Een ~120 kDa band werd waargenomen voor fosfo-MEK in de L. major promastigoten (Figuur 5). Voor totale MEK werden banden van ~120 kDa en ~55 kDa waargenomen (figuur 5), die overeenkomen met de maten van respectievelijk MRK1 en LmxMKK. Fosfo-ERK detecteerde vergelijkbare banden, terwijl de ERK-antilichaamkleuring niet robuust was in deze test (figuur 5). Lipofosfosfaliek (LPG) en tubuline werden ook uitgewist als belastingscontroles. Deze gegevens onthullen het belang van het valideren van antilichamen voor gebruik in L. major.
Figuur 1: 96-well platen maken een geordende opstelling voor cytotoxiciteitstests mogelijk. De cytotoxiciteitstest is verdeeld in zes kolommen van elk twee technische replicaties. Met controles maakt dit het mogelijk om twee voorwaarden per plaat te testen. In dit voorbeeld worden L.major promastigoten geresuspendeerd in serumvrije M199 vergeleken met die in de buffer van Tyrode. De genotypen volgen de volgorde van wild-type (WT) (groen), spt2- (rood) en spt2-/+SPT2 (blauw). Het toxine (SLO) wordt zodanig toegevoegd dat de concentratie loopt van de hoogste concentratie aan de bovenkant van de plaat naar de bodem, waardoor de laatste rij overblijft als een controle zonder toxine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Consistente opstelling maakt reproduceerbare cytotoxiciteitsresultaten mogelijk. Na het berekenen van de benodigde hoeveelheid toxine, wordt het volume van de testbuffer bereid dat nodig is voor een 2x-oplossing. De levensvatbaarheidskleurstof (PI) en CaCl2 worden indien nodig toegevoegd en de buffer wordt in buizen van 1,5 ml afgegeven. Na het wassen en resuspenderen in de testbuffer worden gelijke aantallen L. major promastigoten in elk putje van de 96-well plaat gedoseerd. Het toxine wordt toegevoegd aan de testbuffer en serieel verdund van de hoogste toxinedosis (1e buis) tot de laagste dosis (7e buis) onmiddellijk voor toevoeging aan de cellen. Het toxine wordt toegevoegd aan cellen in de 96-well plaat beginnend vanaf de bodem van de plaat bij de laagste toxinedosis (7e rij) en werkend tot de hoogste dosis (1e rij). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De gatingstrategie onderscheidt levende en dode populaties van cellen. L. belangrijke promastigoten gekleurd met PI en uitgedaagd met SLO werden geanalyseerd door flowcytometrie. (A,B) De gatingstrategie identificeert enkele cellen uit totaal L. major op basis van voorwaartse en zijwaartse spreiding. (C-E) PI-kleuring wordt vervolgens beoordeeld en cellen worden afgesloten in PI-hoge, PI-lage en PI-negatieve populaties. Representatieve gegevens voor (C) geen toxine, (D) 1.000 HU/ml en (E) 4.000 HU/ml SLO worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De buffer van Tyrode verhoogt de gevoeligheid van L. major promastigoten in vergelijking met M199. Wildtype (WT), spt2- en spt2-/+SPT2 L. belangrijke promastigoten in serumvrije M199 of Tyrode's buffer aangevuld met 2 mM CaCl2 werden uitgedaagd met SLO bij de aangegeven concentraties bij 37 °C gedurende 30 minuten, en PI-opname werd geanalyseerd door flowcytometrie. De %Specifieke Lysis werd berekend. Er werd een logistiek model geconstrueerd en de LC50 berekend voor de spt2-mutanten. Grafieken tonen (A) gemiddelde ± SEM of (B) individuele experimenten van drie onafhankelijke experimenten. De ongepaarde t-test van een student met de correctie van Welch werd gebruikt voor de LC50-waarden. ** p < 0.01 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Fosfo-ERK en fosfo-MEK1/2 detecteren L. major eiwitten onafhankelijk van sfingolipiden of toxine-uitdaging. Wildtype (WT), spt2- en spt2-/+SPT2 L. belangrijke promastigoten werden gedurende 30 minuten uitgedaagd bij 37 °C met of zonder 500 HU/ml SLO in serumvrij M199 aangevuld met 2 mM CaCl2. De cellysaten werden opgelost door SDS-PAGE, overgebracht naar nitrocellulose en onderzocht op fosfo-MEK (pMEK), totaal MEK, fosfo-ERK (pERK), totaal ERK, lipofosfosklycaan (LPG) of tubuline, gevolgd door HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen en ECL. In elk geval wordt een representatieve vlek uit twee onafhankelijke experimenten getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Buffer- en mediasamenstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Voorbeeldlay-out voor Excel-berekeningen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Excel-spreadsheet met formules. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werden methoden beschreven om de moleculaire mechanismen en functies van PFT's te bestuderen, met behulp van de menselijke ziekteverwekker Leishmania major als modelsysteem. Er werd een op medium-throughput flowcytometrie gebaseerde cytotoxiciteitstest ontwikkeld om de levensvatbaarheid van eencellige cellen te meten. De levensvatbaarheid is kwantitatief op populatieniveau omdat LC50-waarden kunnen worden berekend op basis van de dosis-responscurve met behulp van logistieke modellering. Als proof-of-principle werd een flowcytometrische test gebruikt om te illustreren dat de keuze van media wild-type en sfingolipide-deficiënte L.major gevoeligheid voor SLO kan veranderen en om de sublytische toxinedosis in elk medium te bepalen. Als een proof-of-principle in downstream assays werden fosfo-MAPK en fosfo-ERK antilichamen getest in L. major promastigoten tijdens toxine challenge. Over het algemeen zijn L. major promastigoten een pathogeen relevant en genetisch hanteerbaar modelsysteem dat kan worden gebruikt om de mechanismen en functies van toxine-gemedieerde schade aan cellen beter te begrijpen.
De flowcytometrietest biedt een hoge flexibiliteit. Andere levensvatbaarheidskleurstoffen kunnen desgewenst worden vervangen door PI. In zoogdiercellen werden geen verschillen waargenomen in het rapportagevermogen voor een reeks levensvatbaarheidskleurstoffen20. De keuze van toxine, L. major genotype, de toevoeging van eventuele behandelingen en de keuze van de testbuffer kunnen indien nodig worden gevarieerd. Toxinebinding kan parallel met of in plaats van cytotoxiciteit worden beoordeeld als het gebruikte toxine wordt geconjugeerd aan een fluorofoor, zoals Cy5. Voor L. major genotypen is het belangrijk om aangevulde stammen op te nemen om ervoor te zorgen dat het fenotype te wijten is aan het gen dat is uitgeschakeld. In deze proof-of-concept studie bood het basismedium dat werd gebruikt voor het kweken van L. major, M199, meer bescherming aan L. major promastigoten dan de buffer van Tyrode. De buffer van Tyrode verhoogde de gevoeligheid van de spt2-mutant van L. major promastigoten in vergelijking met het gebruik van serumvrij M199, een basaal medium dat wordt gebruikt om L. major promastigoten in vitro te vermeerderen. Dit suggereert dat er een of meer cytoprotectieve componenten in M199 zitten. Twee potentiële cytoprotectieve middelen zijn glycine of alanine, die cytoprotectief zijn in andere zoogdiersystemen27,28. Over het algemeen biedt de flowcytometriecytotoxiciteitstest een flexibel platform voor het analyseren van verschillende toxines, aandoeningen en parasietgenotypes.
De koppeling van de flowcytometrische test met logistieke modellering levert verbeterde informatie op over de gevoeligheid van cellen voor PFT's. Ten eerste werden hemolytische eenheden gebruikt in plaats van massa voor actieve toxines. Dit maakte normalisatie van de gegevens over verschillende toxinepreparaten en consistente testresultaten mogelijk en maakte een directe vergelijking van het doden tussen toxines en doelen mogelijk. Hoewel specifieke lysis werd gebruikt om de bijdrage van het toxine aan de letaliteit te analyseren, bieden de controles die nodig zijn voor elke aandoening informatie over het doden bij baseline. Als een middel specifiek giftig is, verschijnt het in deze controles. Specifieke lysis over meerdere concentraties maakt het mogelijk om een dosis-responscurve te creëren. Dosis-responscurves zijn essentieel voor het interpreteren van toxine-activiteit. In veel gevallen zullen laboratoria verschillen in toxinegevoeligheid bij een enkele concentratie rapporteren. Afhankelijk van het gekozen deel van de dosis-responscurve kan dit verschil worden vervormd om een indruk van gewenste gevoeligheid of weerstand te geven. Het analyseren van de volledige dosis-responscurves kan worden gedaan door middel van logistieke modellering. Logistieke modellering is eenvoudig met behulp van direct beschikbare software en biedt meer informatie over LC50, de steilheid van de curve (k) en de maximale lysis (L). Verschillen in al deze parameters kunnen worden gebruikt om de statistische significantie tussen de curven te bepalen. Veranderingen in maximale lysis kunnen nuttig zijn voor gedeeltelijk actieve toxines, inactieve toxines of resistente celtypen. Over het algemeen werden kwantitatieve methoden verstrekt om veranderingen in cytotoxiciteit te meten.
Ondanks de voordelen van het gebruik van een kwantitatieve, medium-throughput flow cytometrische cytotoxiciteitstest, zijn er kanttekeningen bij het gebruik van deze test. Met name het gebrek aan serum beperkt de incubatietijden tot 1-2 uur. Op latere tijdstippen bemoeilijkt een hogere achtergronddood de interpretatie van de resultaten. De verwijdering van serum is noodzakelijk voor CDC's omdat het cholesterol in het serum CDC's24 remt. Andere serumfactoren kunnen ook de celgevoeligheid voor toxines veranderen. Een andere uitdaging is de concentratie van calcium die in de test wordt gebruikt. Terwijl membraanreparatietests meestal 2 mM Ca2+ gebruiken om extracellulaire Ca2+ na te bootsen, kunnen calciumrijke buffers calciumafzetting in de flowcytometer riskeren, wat celklontering kan veroorzaken en / of de microfluïdica kan verstoppen. Het reinigen van de cytometer met 2 mM EDTA voorafgaand aan het reinigen met Hellmanex III (zie Materiaaltabel) en/of bleekmiddel vermindert Ca2+ opbouw. Een laatste kanttekening is de logistieke modellering. De Solver-plug-in zal soms "vastlopen" in een lokale minimumwaarde die geen optimale pasvorm biedt. In deze gevallen kan het handmatig wijzigen van de parameters en het opnieuw uitvoeren van de Oplosser het model verbeteren. Wanneer de volledige logistieke curve niet wordt verstrekt, kan de Oplosser ook grote waarden voor L extrapoleren. Het is belangrijk om voldoende datapunten te verzamelen om een complete logistieke curve te genereren. Als de dosis-responscurve niet gemakkelijk kan worden gemodelleerd met een logistieke curve, kunnen de LC50-waarden ongedefinieerd blijven (bijvoorbeeld > 4.000 HU/ml), of kan een andere curve op de gegevens worden aangepast.
Zodra de sublytische dosis SLO was bepaald, konden cellulaire reacties op SLO worden getest. Een proof-of-principle werd geleverd door antilichamen te testen in de MEK-ERK-route in L. major , omdat MEK-activering ~ 70% van de reparatie tegen SLO in zoogdiercellencontroleert 6. Het fosfo-MEK-antilichaam detecteerde een ~120 kDa-band die consistent is met MRK1. Robuuste fosforylering van de LmxMKK-homoloog, verwacht bij 55 kDa, werd niet gedetecteerd. Het MEK-antilichaam detecteerde echter banden die consistent zijn met zowel MRK1 als LmxMKK. Het fosfo-ERK-antilichaam detecteerde ook banden bij ~120 kDa en 55 kDa. De 55 kDa-band komt overeen met de grootte van MAPK5. Het ERK-antilichaam was niet robuust in deze test. Massaspectrometrie of andere methoden zouden nodig zijn om de identiteit van deze eiwitten te bevestigen. De fosforylering van leishmaniale homologen van MEK1/2 en ERK1/2 werd onafhankelijk van de toxine-uitdaging gedetecteerd. Over het algemeen werd een sublytische dosis toxine bepaald door flowcytometrie gebruikt om kinasen te detecteren in een downstream-test, zoals western blotting.
Er zijn ook kanttekeningen bij de western blot-analyses. Met name de meeste commerciële antilichamen worden niet specifiek tegen leishmaniale eiwitten opgewekt. In plaats daarvan moeten antilichamen die zich richten op homologen in andere organismen eerst worden gevalideerd en getitreerd. Monstervoorbereiding kan van invloed zijn op de uiteindelijke vlekuitkomst. Het reductiemiddel in de monsterbuffer, 2-mercaptoethanol, moet onmiddellijk vóór de toevoeging van de SDS-monsterbuffer aan de celpellet worden toegevoegd. Hoewel geresuspendeerde celpellets kunnen worden opgeslagen bij −20 ° C, overleven ze niet veel vries- / dooicycli. Primaire antilichamen die zich richten op homologe eiwitten zoals MAPK in Leishmania moeten 's nachts met de vlekken worden geïncubeerd voor banden van hogere kwaliteit op western blots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd ondersteund door het National Institute Of Allergy And Infectious Diseases van de National Institutes of Health subsidie R21AI156225 aan PAK en KZ (co-I) en R01AI139198 aan KZ (co-I). CH wil graag het Departement Biologische Wetenschappen erkennen voor het Onderwijsassistentschap dat tijdens deze studie wordt verstrekt.
De subsidieverstrekkers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript; noch in het besluit om de resultaten te publiceren. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financieringsagentschappen. De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen de leden van de Laboratoria Keyel en Zhang bedanken voor hun kritische beoordeling van het manuscript. De auteurs bedanken het College of Arts and Sciences Microscopy voor het gebruik van faciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2-/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
- Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531 (2020).
- Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease. Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).
- Farrand, A. J., et al. The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion. Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).
- Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).
- Schoenauer, R., et al. Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins. FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).
- Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK. Science Advances. 8 (11), (2022).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells. Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).
- Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).
- Wolfmeier, H., et al. Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).
- Bravo, F., Sanchez, M. R. New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas. Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).
- Manfredi, M., Iuliano, S. Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer. Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).
- Zhang, K., et al. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).
- Zhang, K. Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes. Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).
- Kaur, P., Goyal, N. Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites. Biochimie. 193, 78-89 (2022).
- Wiese, M. Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).
- Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens. Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).
- Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. Protein kinase involved in flagellar-length control. Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).
- Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. An essential, putative MEK kinase of Leishmania major. Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).
- Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins. Toxins. 11 (1), (2018).
- Beneke, T., et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major. Scientific Reports. 9, 7602 (2019).
- Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).
- Romero, M., et al. Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding. Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).
- Keyel, P. A., et al. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).
- Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine. Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).
- Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis. Cell Death & Disease. 10 (4), 326 (2019).
