यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जिसमें छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों द्वारा प्रेरित बंधन, साइटोटॉक्सिसिटी और सिग्नलिंग को निर्धारित करने के लिए लीशमैनिया प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स का उपयोग किया गया है। स्ट्रेप्टोलिसिन ओ के साथ एक प्रमाण-अवधारणा प्रदान की जाती है। अन्य विषाक्त पदार्थों का उपयोग विष प्रतिरोध के नए तंत्र को परिभाषित करने के लिए एल मेजर में उपलब्ध आनुवंशिक उत्परिवर्ती का लाभ उठाने के लिए भी किया जा सकता है।
छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों (पीएफटी) के कार्य और तंत्र को समझना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि कोशिकाएं पीएफटी के कारण झिल्ली क्षति का विरोध करती हैं। जबकि बायोफिज़िकल दृष्टिकोण छिद्र गठन को समझने में मदद करते हैं, वे अक्सर झिल्ली लिपिड और प्रोटीन के पूर्ण पूरक की कमी वाले न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोणों पर भरोसा करते हैं। सुसंस्कृत मानव कोशिकाएं एक वैकल्पिक प्रणाली प्रदान करती हैं, लेकिन मरम्मत तंत्र में उनकी जटिलता और अतिरिक्तता विशिष्ट तंत्र की पहचान करना मुश्किल बनाती है। इसके विपरीत, त्वचीय लीशमैनियासिस के लिए जिम्मेदार मानव प्रोटोजोआ रोगज़नक़, लीशमैनिया प्रमुख, जटिलता और शारीरिक प्रासंगिकता के बीच एक इष्टतम संतुलन प्रदान करता है। एल मेजर आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य है और इसे विट्रो में उच्च घनत्व के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, और संक्रमण पर गड़बड़ी के किसी भी प्रभाव को स्थापित मुराइन मॉडल में मापा जा सकता है। इसके अलावा, एल मेजर अपने स्तनधारी समकक्षों से अलग लिपिड को संश्लेषित करता है, जो झिल्ली की गतिशीलता को बदल सकता है। झिल्ली की गतिशीलता में इन परिवर्तनों को सबसे अच्छी विशेषता वाले विष परिवार, कोलेस्ट्रॉल-निर्भर साइटोलिसिन (सीडीसी) से पीएफटी के साथ जांच की जा सकती है। सीडीसी लीशमैनिया झिल्ली में एर्गोस्टेरॉल से जुड़ते हैं और एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को मार सकते हैं, यह दर्शाता है कि एल मेजर पीएफटी फ़ंक्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र को निर्धारित करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली है। यह काम एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स में पीएफटी फ़ंक्शन के परीक्षण के तरीकों का वर्णन करता है, जिसमें परजीवी संस्कृति, लिपिड संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए आनुवंशिक उपकरण, झिल्ली बाध्यकारी परख और कोशिका मृत्यु परख शामिल हैं। ये परख लिपिड संगठन में विकासवादी विविध जीवों और समानताओं की एक श्रृंखला में पीएफटी फ़ंक्शन को समझने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में एल मेजर के तेजी से उपयोग को सक्षम करेंगे।
पोर बनाने वाले विषाक्त पदार्थ (पीएफटी) जीवाणु विषाक्त पदार्थों का सबसे बड़ा परिवार हैं1, लेकिन जिन तंत्रों द्वारा वे कोशिकाओं को छिद्रित और नष्ट करते हैं, उन्हें खराब तरीके से समझा जाता है। छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों का सबसे अच्छा अध्ययन परिवार कोलेस्ट्रॉल-निर्भर साइटोलिसिन (सीडीसी) है। सीडीसी को मुख्य रूप से ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया द्वारा संश्लेषित किया जाता है, जिसमें नेक्रोटाइज़िंग फैसिसिटिस, स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस2 के प्रेरक एजेंट शामिल हैं। प्योगेनेस सीडीसी स्ट्रेप्टोलिसिन ओ (एसएलओ) का स्राव करता है, जो मेजबान कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में स्टेरोल्स को मोनोमर्स, ऑलिगोमेराइज्ड के रूप में बांधता है, और झिल्ली1 में ~ 20-30 एनएम छिद्र डालता है। इस प्रक्रिया में लिपिड की भूमिका खराब रूप से निर्धारित होती है।
लिपिड-सीडीसी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण रासायनिक रूप से परिभाषित लिपोसोम का उपयोग है। जबकि परिभाषित लिपोसोम विष बंधन और छिद्र गठन 3,4 को बनाए रखने के लिए लिपिड की आवश्यक सीमा पर जानकारी प्रदान करते हैं, वे सेलुलर कार्यों को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। उदाहरण के लिए, पुनर्गठित लिपोसोम में स्तनधारी मेजबानों की लिपिड विषमता और विषाक्त पदार्थों के जवाब में लिपिडसंशोधनों की कमी होती है। लिपोसोम का एक विकल्प स्तनधारी सेल लाइनों का उपयोग करना है। जबकि ये सेल लाइनें अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, टॉक्सिन सेंसिंग और प्रतिरोध तंत्र2 में अतिरेक की एक बड़ी डिग्री है। नतीजतन, सीडीसी का विरोध करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मरम्मत मार्ग खराब रूप से निर्धारित रहते हैं। विशेष रूप से, सीए2 + प्रवाह झिल्ली की मरम्मत का प्राथमिक उत्प्रेरक है। सीए2 + प्रवाह के डाउनस्ट्रीम में, कई रास्ते लगे हुए हैं, जिनमें सेरामाइड-निर्भर मरम्मत 6,7 और एमईके-निर्भर मरम्मत मार्ग6 शामिल हैं। ये मार्ग अन्य प्रोटीन प्रभावकों के साथ बातचीत करते हैं, जिसमें परिवहन के लिए आवश्यक एंडोसोमल सॉर्टिंग कॉम्प्लेक्स (ईएससीआरटी) 8, और एनेक्सिन 6,9,10 शामिल हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में इन मार्गों को विच्छेदित करना अतिरेक के कारण चुनौतीपूर्ण है, जो डेटा व्याख्या को अव्यवस्थित करता है।
मरम्मत मार्गों के विच्छेदन के लिए सरलता के साथ जटिलता को संतुलित करने का एक तरीका सरल जीवों का उपयोग है, जैसे कि जीनस लीशमैनिया में प्रोटोजोआ रोगजनकों। लीशमैनिया एसपी मनुष्यों और अन्य जानवरों में लीशमैनियासिस का कारण बनता है। लीशमैनियासिस प्रजातियों और अन्य कारकों के आधार पर त्वचीय लीशमैनियासिस (स्व-सीमित त्वचा घावों) से लेकर घातक आंत लीशमैनियासिस (हेपेटोस्प्लेनोमेगाली) तक होताहै। लीशमैनिया मेजर, त्वचीय लीशमैनियासिस का प्रेरक एजेंट, एक सैंडफ्लाई वेक्टर के माध्यम से मनुष्यों में प्रेषित होता है और इसका उपयोग लीशमैनिया फ़ंक्शन और संक्रमण12 को समझने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, लीशमैनिया एसपी डायजेनिक12 हैं। वे इंट्रासेल्युलर स्तनधारी मैक्रोफेज परजीवी के रूप में मौजूद हैं जिन्हें एमेस्टिगोट्स कहा जाता है और सैंडफ्लाई12 में फ्री-स्विमिंग, फ्लैगेलेटेड प्रोमेस्टिगोट्स के रूप में। एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को सीरम-पूरक मीडिया जैसे एम 199 से उच्च घनत्व13 में सुसंस्कृत किया जा सकता है। प्रोमेस्टिगोट्स आनुवंशिक रूप से भी वापस लेने योग्य हैं; कई जीन नॉकआउट मौजूद हैं, जिनमें लिपिड जैवसंश्लेषण मार्गों को लक्षित करनाशामिल है। इन नॉकआउट का मूल्यांकन बाल्ब / सी चूहों के संक्रमण के माध्यम से संक्रामकता और घाव के विकास में वृद्धि और अंतर के लिए किया जा सकताहै।
लीशमैनिया संस्कृति की सापेक्ष आसानी और लिपिड जैवसंश्लेषण नॉकआउट की सीमा के अलावा, परजीवी में स्तनधारियों की तुलना में एक सरल जीनोम है। लीशमैनिया की सबसे अच्छी विशेषता वाली प्रजाति एल मेजर है, जिसमें कई मौजूदा आनुवंशिक उपकरण हैं, जैसे कि दोषपूर्ण लिपिड चयापचय14 के साथ उत्परिवर्ती। विशेष रूप से, कई मरम्मत प्रोटीन अनुपस्थित हैं। एल मेजर में एनेक्सिन जैसे प्रमुख स्तनधारी मरम्मत प्रोटीन के लिए आज तक कोई होमोलॉग नहीं पहचाना गया है। यह स्तनधारी प्रणालियों की जटिलता के बिना क्रमिक रूप से संरक्षित मरम्मत मार्गों के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है। हालांकि, लीशमैनिया में आज तक मरम्मत मार्गों की विशेषता नहीं है। इसी समय, मरम्मत में शामिल प्रमुख सिग्नलिंग मार्ग, जैसे एमईके मार्ग6, लीशमैनिया एसपी 15,16 में संरक्षित हैं, हालांकि होमोलॉग को मान्य करने की आवश्यकता है। माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एमएपी) मार्ग एल मैक्सिकन में अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, जहां यह स्तनधारी कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर अस्तित्व और थर्मोस्टेबिलिटी में योगदान देता है और मेटासाइक्लोजेनेसिस16 को नियंत्रित करता है। लीशमैनिया एसपी में, 15 एमएपीके में से 10 को17 की विशेषता दी गई है। संरक्षित फॉस्फोराइलेशन होंठ अनुक्रम में पहचान के आधार पर LmMAPK9 और LmMAPK13 स्तनधारी ERK1/2 के समान होने की भविष्यवाणी की जाती है। फॉस्फोराइलेशन होंठ अनुक्रम स्तनधारी ERK1/2 और LmMAPK9 और LmMAPK13 दोनों के लिए TEY है। हालांकि, लीशमैनिया एमएपीके में से आठ में टीडीवाई फॉस्फोराइलेशन मोटिफ15 है। लीशमैनिया एसपी, एलएमएक्सएमकेके18 और एमईकेके-संबंधित किनेज (एमआरके 1)19 में एमईके के कम से कम दो होमोलॉग की पहचान की गई है। इससे पता चलता है कि लीशमैनिया में पहचानी गई अंतर्दृष्टि स्तनधारी प्रणालियों में अनुवाद कर सकती है। जहां वे स्तनधारी प्रणालियों में अनुवाद नहीं करते हैं, वे लीशमैनियासिस के इलाज के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
झिल्ली की मरम्मत और विषाक्त पदार्थों के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स का उपयोग करने के लिए, मध्यम-थ्रूपुट तकनीकों की आवश्यकता होती है। जबकि उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग वास्तविक समय में लेबल प्रोटीन और झिल्ली के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है, यह कम थ्रूपुट है और सेलुलर अस्तित्व को माप नहीं सकता है। मध्यम-थ्रूपुट व्यवहार्यता परख में फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया डाई अपटेक, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि का माप, या लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) जैसे सेलुलर प्रोटीन की रिहाई शामिल है। स्तनधारी कोशिकाओं में, एलडीएच परख मात्रात्मक रूप से कोशिका मृत्यु को मापते नहीं हैं। इसके अलावा, एलडीएच रिलीज या माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि जैसे जनसंख्या-आधारित परख मजबूत एकल-कोशिका या मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषणकी अनुमति नहीं देते हैं। इसके विपरीत, फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परख मल्टीपैरामीट्रिक सिंगल-सेल विश्लेषण20 को सक्षम करते हैं। हालांकि, इन परखों को विष जीव विज्ञान या एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स में विषाक्त पदार्थों की प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए लागू नहीं किया गया है।
इस अध्ययन में, एसएलओ का उपयोग दो अलग-अलग बफर में एल मेजर के स्फिंगोलिपिड नल उत्परिवर्ती के प्लाज्मा झिल्ली गड़बड़ी को समझने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जाता है- एम 199 मीडिया नियमित रूप से एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स और सरल टायरोड के बफर को कल्चर करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक मध्यम-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमेट्री परख का वर्णन किया गया है और विष खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रवाह साइटोमेट्रिक परख से डेटा को एलसी50 मानों को निर्धारित करने के लिए एक लॉजिस्टिक वक्र में मॉडलिंग किया जाता है। इस जानकारी के साथ, एसएलओ की एक सबलाइटिक खुराक निर्धारित की जा सकती है ताकि पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके एमएपी एंटीबॉडी को मान्य किया जा सके।
इस अध्ययन में, मानव रोगज़नक़ लीशमैनिया मेजर को एक मॉडल सिस्टम के रूप में उपयोग करते हुए, पीएफटी के आणविक तंत्र और कार्यों का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन किया गया था। एकल-सेल व्यवहार्यता को मापने क…
The authors have nothing to disclose.
लेखक पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए कील और झांग लैब्स के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक सुविधाओं के उपयोग के लिए कला और विज्ञान माइक्रोस्कोपी कॉलेज को धन्यवाद देते हैं।
1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
Ice bucket | |||
Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
Antibody | |||
Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |