Här presenteras ett protokoll som använder Leishmania major promastigotes för att bestämma bindning, cytotoxicitet och signalering inducerad av porbildande toxiner. Ett proof-of-concept med streptolysin O tillhandahålls. Andra toxiner kan också användas för att utnyttja de genetiska mutanter som finns i L. major för att definiera nya mekanismer för toxinresistens.
Att förstå funktionen och mekanismen för porbildande toxiner (PFT) är utmanande eftersom celler motstår membranskador orsakade av PFT. Medan biofysiska tillvägagångssätt hjälper till att förstå porbildning, förlitar de sig ofta på reduktionistiska tillvägagångssätt som saknar det fullständiga komplementet av membranlipider och proteiner. Odlade mänskliga celler utgör ett alternativt system, men deras komplexitet och redundanser i reparationsmekanismer gör det svårt att identifiera specifika mekanismer. Däremot erbjuder den mänskliga protozopatogenen som är ansvarig för kutan leishmaniasis, Leishmania major, en optimal balans mellan komplexitet och fysiologisk relevans. L. major är genetiskt lätthanterlig och kan odlas till hög densitet in vitro, och eventuella effekter av störningar på infektion kan mätas i etablerade murina modeller. Dessutom syntetiserar L. major lipider som skiljer sig från deras däggdjurs motsvarigheter, vilket kan förändra membrandynamiken. Dessa förändringar i membrandynamiken kan undersökas med PFT från den bäst karakteriserade toxinfamiljen, kolesterolberoende cytolysiner (CDC). CDC binder till ergosterol i Leishmania-membranet och kan döda L. major promastigotes, vilket indikerar att L. major är ett lämpligt modellsystem för att bestämma de cellulära och molekylära mekanismerna för PFT-funktionen. Detta arbete beskriver metoder för att testa PFT-funktion i L. major promastigotes, inklusive parasitkultur, genetiska verktyg för att bedöma lipidkänslighet, membranbindande analyser och celldödsanalyser. Dessa analyser kommer att möjliggöra snabb användning av L. major som ett kraftfullt modellsystem för att förstå PFT-funktion över en rad evolutionärt olika organismer och likheter i lipidorganisation.
Porbildande toxiner (PFT) är den största familjen av bakterietoxiner1, men mekanismerna genom vilka de perforerar och förstör celler är dåligt förstådda. Den bäst studerade familjen av porbildande toxiner är den av kolesterolberoende cytolysiner (CDC). CDC syntetiseras främst av grampositiva bakterier, inklusive orsaksmedlet för nekrotiserande fasciit, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes utsöndrar CDC-streptolysin O (SLO), som binder till steroler i plasmamembranet i värdceller som monomerer, oligomeriserar och sätter in ~ 20-30 nm porer i membranet1. Den roll som lipider spelar i denna process förblir dåligt bestämd.
Ett sätt att studera lipid-CDC-interaktioner är användningen av kemiskt definierade liposomer. Medan definierade liposomer ger information om de nödvändiga trösklarna för lipider för att upprätthålla toxinbindning och porbildning3,4, rekapitulerar de inte helt cellulära funktioner. Till exempel saknar rekonstituerade liposomer lipidasymmetrin hos däggdjursvärdar och lipidmodifieringar som svar på toxiner5. Ett alternativ till liposomer är att använda däggdjurscellinjer. Även om dessa cellinjer är mer fysiologiskt relevanta, finns det en stor grad av redundans i toxinavkännings- och resistensmekanismer2. Som en konsekvens förblir reparationsvägarna som används för att motstå CDC: er dåligt bestämda. I synnerhet är Ca2+ tillströmning den primära aktivatorn för membranreparation1. Nedströms Ca2+ tillströmning är flera vägar inkopplade, inklusive en ceramidberoende reparation 6,7 och en MEK-beroende reparationsväg6. Dessa vägar interagerar med andra proteineffektorer, inklusive det endosomala sorteringskomplex som krävs för transport (ESCRT)8 och bilagorna 6,9,10. Att dissekera dessa vägar i däggdjursceller är utmanande på grund av redundansen, vilket förvirrar datatolkningen.
Ett sätt att balansera komplexitet med enkelhet för att dissekera reparationsvägar är användningen av enklare organismer, såsom protozopatogener i släktet Leishmania. orsakar leishmaniasis hos människor och andra djur. Leishmaniasis sträcker sig från kutan leishmaniasis (självbegränsade hudskador) till den dödliga viscerala leishmaniasis (hepatosplenomegali), beroende på art och andra faktorer11. Leishmania major, orsaksmedlet för kutan leishmaniasis, överförs till människor via en sandflyvektor och används för att förstå Leishmania-funktion och infektion12. Dessutom är Leishmania sp. digenic12. De existerar som intracellulära däggdjursmakrofagparasiter som kallas amastigotes och som frisimmande, flagellerade promastigotes i sandflugan12. L. större promastigotes kan odlas i serumkompletterade medier såsom M199 till hög densitet13. Promastigotes är också genetiskt lätthanterliga; Många genknockouts finns, inklusive de som riktar sig mot lipidbiosyntesvägar13. Dessa knockouts kan utvärderas för tillväxt och skillnader i smittsamhet och lesionsutveckling via infektion av Balb / c möss13.
Förutom den relativa lättheten hos Leishmania-kulturen och utbudet av lipidbiosyntes knockouts, har parasiten ett enklare genom än däggdjur. Den bäst karakteriserade arten av Leishmania är L. major, som har många befintliga genetiska verktyg, såsom mutanter med defekt lipidmetabolism14. I synnerhet är många reparationsproteiner frånvarande. L. major har hittills inga homologer identifierade för viktiga däggdjursreparationsproteiner som annexiner. Detta möjliggör karakterisering av evolutionärt bevarade reparationsvägar utan komplexiteten hos däggdjurssystem. Reparationsvägar har dock hittills inte karakteriserats i Leishmania. Samtidigt bevaras viktiga signalvägar som är involverade i reparation, såsom MEK-vägen6, i Leishmania sp.15,16, även om homologer måste valideras. Den mitogenaktiverade proteinkinas (MAPK) -vägen är väl studerad i L. mexicana, där den bidrar till intracellulär överlevnad och termostabilitet i däggdjursceller och kontrollerar metacyklogenes16. I Leishmania sp., 10 av de 15 MAPKs har karakteriserats17. LmMAPK9 och LmMAPK13 förutspås vara de mest lika däggdjurs ERK1/2 baserat på identitet i den bevarade fosforyleringsläppsekvensen. Fosforyleringsläppsekvensen är TEY för både däggdjur ERK1/2 och LmMAPK9 och LmMAPK13. Åtta av Leishmania MAPKs har dock ett TDY-fosforyleringsmotiv15. Minst två homologer av MEK har identifierats i Leishmania sp., LmxMKK18 och MEKK-relaterat kinas (MRK1)19. Detta tyder på att insikter som identifierats i Leishmania kan översättas till däggdjurssystem. Där de inte översätts till däggdjurssystem representerar de terapeutiska mål för behandling av leishmaniasis.
För att kunna använda L. major promastigotes för att studera membranreparation och interaktioner med toxiner behövs tekniker för medelhög genomströmning. Medan högupplöst levande cellavbildning möjliggör visualisering av märkta proteiner och membran i realtid, är det låg genomströmning och kanske inte mäter cellulär överlevnad. Medelkapacitetsviabilitetsanalyser inkluderar färgupptag mätt med flödescytometri, mätning av mitokondriell aktivitet eller frisättning av cellulära proteiner som laktatdehydrogenas (LDH). I däggdjursceller mäter LDH-analyser inte kvantitativt celldöd20. Dessutom tillåter populationsbaserade analyser som LDH-frisättning eller mitokondriell aktivitet inte robust encells- eller multiparametrisk analys20. Däremot möjliggör flödescytometribaserade analyser multiparametrisk encellsanalys20. Emellertid, dessa analyser har inte tillämpats för att förstå toxin biologi eller svar på toxiner i L. större promastigotes.
I denna studie används SLO som ett verktyg för att förstå plasmamembranstörningen av sfingolipid null-mutanten av L. major i två olika buffertar – M199-mediet som rutinmässigt används för att odla L. major promastigotes och den enklare Tyrodes buffert . En cytometrianalys med medelhög genomströmning beskrivs och används för att generera toxindos-responskurvor. Data från flödescytometriska analysen modelleras till en logistisk kurva för att bestämma LC50-värdena . Med denna information kan en sublytisk dos av SLO bestämmas så att MAPK-antikroppar kan valideras med western blotting.
I denna studie beskrevs metoder för att studera PFT: s molekylära mekanismer och funktioner, med hjälp av den mänskliga patogenen Leishmania major som modellsystem. En cytometribaserad cytotoxicitetsanalys med medelhög genomströmning för att mäta encellsviabilitet utvecklades. Livskraften är kvantitativ på populationsnivå eftersom LC50-värden kan beräknas från dos-responskurvan med hjälp av logistisk modellering. Som ett principbevis användes en flödescytometrisk analys för att illus…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka medlemmarna i Keyel- och Zhang-laboratorierna för deras kritiska granskning av manuskriptet. Författarna tackar College of Arts and Sciences Microscopy för användningen av anläggningar.
1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
Ice bucket | |||
Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
Antibody | |||
Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |