Bestemmelse av in vitro og cellulær turn-on kinetikk for fluorogene RNA aptamerer
Summary
Protokollen presenterer to metoder for å bestemme kinetikken til de fluorogene RNA-aptamerene Spinat2 og Broccoli. Den første metoden beskriver hvordan man måler fluorogen aptamerkinetikk in vitro med en plateleser, mens den andre metoden beskriver måling av fluorogen aptamerkinetikk i celler ved flowcytometri.
Abstract
Fluorogene RNA-aptamerer har blitt brukt i levende celler for å merke og visualisere RNA, rapportere om genuttrykk og aktivere fluorescerende biosensorer som oppdager nivåer av metabolitter og signalmolekyler. For å studere dynamiske endringer i hvert av disse systemene er det ønskelig å oppnå sanntidsmålinger, men nøyaktigheten av målingene avhenger av at kinetikken til den fluorogene reaksjonen er raskere enn samplingsfrekvensen. Her beskriver vi metoder for å bestemme in vitro og cellulær turn-on kinetikk for fluorogene RNA-aptamerer ved hjelp av en plateleser utstyrt med henholdsvis en prøveinjektor og et flowcytometer. Vi viser at in vitro-kinetikken for fluorescensaktiveringen av spinat2- og brokkoli-aptamerene kan modelleres som tofaseassosiasjonsreaksjoner og har forskjellige raske fasehastighetskonstanter på henholdsvis 0,56 s−1 og 0,35 s−1. I tillegg viser vi at den cellulære kinetikken for fluorescensaktiveringen av spinat2 i Escherichia coli, som ytterligere begrenses av fargestoffdiffusjon i de gramnegative bakteriene, fortsatt er tilstrekkelig rask til å muliggjøre nøyaktig prøvetakingsfrekvens på minutttidsskalaen. Disse metodene for å analysere fluorescensaktiveringskinetikk gjelder for andre fluorogene RNA-aptamerer som er utviklet.
Introduction
Fluorogene reaksjoner er kjemiske reaksjoner som genererer et fluorescenssignal. Fluorogene RNA-aptamerer utfører vanligvis denne funksjonen ved å binde et lite molekylfargestoff for å forbedre fluorescenskvanteutbyttet (figur 1A)1. Ulike fluorogene RNA-aptamersystemer er utviklet og består av spesifikke RNA-aptamersekvenser og de tilsvarende fargeligandene1. Fluorogene RNA-aptamerer er lagt til RNA-transkripsjoner som fluorescerende koder som muliggjør levende celleavbildning av mRNA og ikke-kodende RNA 2,3,4. De har også blitt plassert etter promotorsekvenser som fluorescerende reportere av genuttrykk, i likhet med bruken av grønt fluorescerende protein (GFP) som reporter, bortsett fra at rapporteringsfunksjonen er på RNA-nivå 5,6. Endelig har fluorogene RNA-aptamerer blitt innlemmet i RNA-baserte fluorescerende biosensorer, som er utformet for å utløse den fluorogene reaksjonen som respons på et bestemt lite molekyl. RNA-baserte fluorescerende biosensorer er utviklet for levende celleavbildning av forskjellige ikke-fluorescerende metabolitter og signalmolekyler 7,8,9,10,11.
Det er økende interesse for utvikling av fluorogene RNA-aptamerer for å visualisere dynamiske endringer i RNA-lokalisering, genuttrykk og små molekylsignaler. For hver av disse applikasjonene er det ønskelig å oppnå sanntidsmålinger, men nøyaktigheten av målingene avhenger av at kinetikken til den fluorogene reaksjonen er raskere enn samplingsfrekvensen. Her beskriver vi metoder for å bestemme in vitro-kinetikken for fluorogene RNA-aptamerer Spinat2 12 og Brokkoli13 ved hjelp av en plateleser utstyrt med en prøveinjektor og for å bestemme den cellulære turn-on-kinetikken forSpinat2 uttrykt i Escherichia coli ved hjelp av et flowcytometer. Disse to RNA-aptamerene ble valgt fordi de har blitt brukt til å studere RNA-lokalisering 2,3,4, de har blitt brukt i reportere5,6 og biosensorer 7,8,9,10,11, og de tilsvarende fargestoffene (DFHBI eller DFHBI-1T) er kommersielt tilgjengelige. Et sammendrag av deres in vitro-egenskaper bestemt i litteraturen er gitt i tabell 1 4,13,14, som informerte protokollutviklingen (f.eks. bølgelengder og fargestoffkonsentrasjoner som ble brukt). Disse resultatene viser at de fluorogene reaksjonene som påvirkes av RNA-aptamerer er raske og ikke bør hindre nøyaktige målinger for de ønskede cellebiologiske applikasjonene.
Protocol
Representative Results
Discussion
For in vitro-kinetikkeksperimentet kan den samme generelle protokollen modifiseres for å måle in vitro-kinetikken til en RNA-basert fluorescerende biosensor som inneholder både et ligandbindende og fluoroforbindende domene8. I dette tilfellet bør RNA inkuberes med fluoroforen før målinger ved injeksjon av liganden for å oppnå ligandresponskinetikk. Hvis det observeres høy variabilitet mellom replikaene, kan man feilsøke ved å kontrollere at hver prøve får lov til å …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til MCH: NSF-BSF 1815508 og NIH R01 GM124589. MRM ble delvis støttet av opplæringsstipend NIH T32 GM122740.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
- Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
- Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
- Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
- Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
- Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
- Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
- Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
- Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
- Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
- Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
- Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
- Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
- Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
- Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
- Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
- Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).
