Summary
O protocolo apresenta dois métodos para determinar a cinética dos aptâmeros de RNA fluorogênico Espinafre2 e Brócolis. O primeiro método descreve como medir a cinética do aptâmero fluorogênico in vitro com um leitor de placas, enquanto o segundo método detalha a medição da cinética do aptâmero fluorogênico nas células por citometria de fluxo.
Abstract
Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido aplicados em células vivas para marcar e visualizar RNAs, relatar a expressão gênica e ativar biossensores fluorescentes que detectam níveis de metabólitos e moléculas de sinalização. Para estudar as mudanças dinâmicas em cada um desses sistemas, é desejável obter medições em tempo real, mas a precisão das medições depende da cinética da reação fluorogênica ser mais rápida do que a frequência de amostragem. Aqui, descrevemos métodos para determinar a cinética de ativação in vitro e celular para aptâmeros de RNA fluorogênicos usando um leitor de placas equipado com um injetor de amostra e um citômetro de fluxo, respectivamente. Mostramos que a cinética in vitro para a ativação por fluorescência dos aptâmeros Espinafre2 e Brócolis pode ser modelada como reações de associação bifásica e tem diferentes constantes de taxa de fase rápida de 0,56 s−1 e 0,35 s−1, respectivamente. Além disso, mostramos que a cinética celular para a ativação por fluorescência do Espinafre2 em Escherichia coli, que é ainda mais limitada pela difusão do corante nas bactérias Gram-negativas, ainda é suficientemente rápida para permitir uma frequência de amostragem precisa na escala de tempo minuto. Esses métodos para analisar a cinética de ativação por fluorescência são aplicáveis a outros aptâmeros de RNA fluorogênicos que foram desenvolvidos.
Introduction
Reações fluorogênicas são reações químicas que geram um sinal de fluorescência. Os aptâmeros de RNA fluorogênicos normalmente desempenham essa função ligando um corante de molécula pequena para aumentar seu rendimento quântico de fluorescência (Figura 1A)1. Diferentes sistemas de aptâmeros de RNA fluorogênicos foram desenvolvidos e consistem em sequências específicas de aptâmeros de RNA e os ligantes corantes correspondentes1. Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido anexados a transcritos de RNA como etiquetas fluorescentes que permitem a imagem de células vivas de mRNAs e RNAs não codificantes 2,3,4. Eles também foram colocados após sequências promotoras como repórteres fluorescentes de expressão gênica, semelhante ao uso de proteína fluorescente verde (GFP) como repórter, exceto que a função de relato está no nível de RNA 5,6. Finalmente, os aptâmeros de RNA fluorogênicos foram incorporados em biossensores fluorescentes baseados em RNA, que são projetados para desencadear a reação fluorogênica em resposta a uma pequena molécula específica. Biossensores fluorescentes baseados em RNA foram desenvolvidos para imagens de células vivas de vários metabólitos não fluorescentes e moléculas sinalizadoras 7,8,9,10,11.
Há um interesse crescente no desenvolvimento de aptâmeros de RNA fluorogênicos para visualizar mudanças dinâmicas na localização do RNA, expressão gênica e sinais de moléculas pequenas. Para cada uma dessas aplicações, é desejável obter medições em tempo real, mas a precisão das medições depende da cinética da reação fluorogênica ser mais rápida do que a frequência de amostragem. Aqui, descrevemos métodos para determinar a cinética in vitro para os aptâmeros de RNA fluorogênico Espinafre2 12 e Brócolis13 usando um leitor de placas equipado com um injetor de amostra e para determinar a cinética de ativação celular para Espinafre2 expressa em Escherichia coli usando um citômetro de fluxo. Esses dois aptâmeros de RNA foram escolhidos por terem sido aplicados para estudar a localização do RNA 2,3,4, terem sido utilizados em repórteres 5,6 e biossensores 7,8,9,10,11, e os ligantes corantes correspondentes (DFHBI ou DFHBI-1T) estarem comercialmente disponíveis. Um resumo de suas propriedades in vitro determinadas na literatura é apresentado na Tabela 1 4,13,14, que informou o desenvolvimento do protocolo (por exemplo, os comprimentos de onda e as concentrações de corantes utilizados). Esses resultados demonstram que as reações fluorogênicas afetadas pelos aptâmeros de RNA são rápidas e não devem impedir medições precisas para as aplicações biológicas celulares desejadas.
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Protocol
1. Experimento de cinética in vitro
- Preparação de moldes de ADN por PCR
- Configurar reação(ões) de PCR: Para preparar reações de PCR, combine os seguintes reagentes em um tubo de PCR de paredes finas:
33 μL de água duplamente destilada (ddH2O)
10 μL de tampão 5x para DNA polimerase de alta fidelidade
5 μL de 2 mM de cada trifosfato desoxirribonucleosídeo (dNTP)
0,5 μL de 40 μM de primer para a frente
0,5 μL de primer reverso de 40 μM
0,5 μL (10-100 ng) de molde de DNA (apenas para Spinach2 PCR; Sobreposição de primers de brócolis)
0,5 μL de DNA polimerase de alta fidelidade (adicionar por último)
NOTA: Os oligonucleotídeos sintéticos são frequentemente enviados secos. Para preparar soluções-estoque, adicione um volume conhecido (recomenda-se 100 μL) de ddH2O e meça o A260 dessa solução para determinar a concentração pela lei de Beer, onde o coeficiente de extinção pode ser calculado pelas regras do vizinho mais próximo on-line. Esta solução-mãe pode então ser utilizada para efectuar diluições adequadas para utilização em PCR. - Execute o protocolo do termociclador.
- Use o seguinte protocolo termociclador para amplificar modelos completos de DNA de espinafre2 e brócolis:
Desnaturação inicial: 98 °C por 2 min
35 ciclos:
Desnaturação: 98 °C desnaturação para 15 s
Recozimento: 72 °C por 30 s
Extensão: 72 °C para 30 s
Extensão final: 72 °C por 5 min. - Após a reação, analise uma pequena alíquota do produto em gel de agarose a 2%, juntamente com uma escada de baixo peso molecular (faixa de tamanho: 25-766 nucleotídeos) para confirmar a presença do produto de DNA desejado.
- Purificar o produto através de kits de extracção em gel ou de limpeza por PCR comercialmente disponíveis e eluítar com ddH2O ou com o tampão fornecido pelo fabricante.
NOTA: Certifique-se de que, ao escolher um kit de limpeza de PCR, o ponto de corte do peso molecular da coluna seja baixo o suficiente para reter T7-Brócolis (81 nucleotídeos), ou então o produto de PCR será perdido.
NOTA: Ponto de pausa opcional: armazene o DNA a -20 °C.
- Use o seguinte protocolo termociclador para amplificar modelos completos de DNA de espinafre2 e brócolis:
- Configurar reação(ões) de PCR: Para preparar reações de PCR, combine os seguintes reagentes em um tubo de PCR de paredes finas:
- Preparação de RNA de espinafre2 e brócolis por transcrição in vitro (IVT)
- Configure a(s) reação(ões) de transcrição.
- Para preparar uma reação de transcrição de 100 μL, combine os seguintes reagentes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL: 10 μL de tampão de transcrição 10x + 20 μL de trifosfatos ribonucleosídeos de 10 mM (rNTPs) + 1-64 μL de molde de DNA (total de 1 μg) + 2 μL de pirofosfatase inorgânica + ddH 2 O a 98 μL +2μL de RNA polimerase T7 (adicionar por último).
- Incubar esta reacção durante 4 h a 37 °C. Apague a reação adicionando 100 μL de 2x tampão de carga de gel de ureia (2x ULB), composto de 20% de sacarose, 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 1x tampão Tris-Borato-EDTA (1x TBE) e ~18 M de ureia.
NOTA: Ponto de pausa opcional: armazene a reação extinta a -20 °C.
- Configure a(s) reação(ões) de transcrição.
- Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) purificação de RNA
- PAGE purificação de Espinafre2 e RNA de Brócolis
CUIDADO: A acrilamida não polimerizada (líquida ou em pó) é extremamente tóxica. Se pesar a acrilamida em pó, faça-o em um exaustor. Use sempre o equipamento de proteção adequado e remova imediatamente as luvas contaminadas com acrilamida em pó ou solução, lavando bem as mãos. Se a acrilamida entrar em contato direto com a pele, lave a área exposta por pelo menos 15 minutos com água e sabão. Se a acrilamida entrar em contato direto com os olhos, lave-os com água por 15 minutos.- Prepare o gel PAGE: Para remover transcritos abortivos indesejados e rNTPs não reagidos do produto de comprimento total, prepare um gel de ureia-poliacrilamida a 6%. Em geral, géis de 28 cm x 16,5 cm x 1,5 mm podem ser usados com um pente de 8 poços. Configure o equipamento de gel e eletroforese, usando 1x tampão TBE para encher os reservatórios.
- Carregar amostra(s) de RNA no gel PAGE: Carregue o gel com uma reação de 200 μL extinta por pista. Em uma pista separada, carregue 2x ULB com corantes rastreadores xileno cianol e azul de bromofenol, que migram no gel em 106 nucleotídeos e 26 nucleotídeos, respectivamente15. Deixe uma faixa vazia entre cada amostra para evitar possíveis contaminações nas próximas etapas.
- Execute o gel PAGE: Para separar o espinafre 95-nt 2 e o brócolis 49-nt de seus respectivos produtos truncados, execute o gel por 1,5-2 h a 25 W, momento em que o corante azul de bromofenol terá migrado ~ 5/6 do comprimento do gel.
- Visualize a(s) amostra(s) de RNA no gel PAGE: Desmonte as placas de vidro ao redor do gel e cubra o gel em filme plástico em ambos os lados, rotulando as faixas no invólucro. Visualize bandas de RNA em uma sala escura por sombreamento UV, colocando o gel embrulhado em uma placa TLC fluorescente sob luz UV. Contorne rapidamente a borda das bandas de RNA correspondentes ao produto com um marcador e desligue a lâmpada UV para minimizar os danos causados pela exposição aos raios UV.
- Extraia a(s) amostra(s) de RNA do gel PAGE: Com uma lâmina de barbear fresca para cada amostra, expiregue as bandas de produto desejadas, cubos de ~1 mm e adicione os pedaços de gel a um tubo de microcentrífuga de 2 mL com 500 μL de tampão de imersão de esmagamento para extrair RNA em um rotador por 2 h à temperatura ambiente (RT) ou durante a noite a 4 °C.
NOTA: Ponto de pausa opcional: a amostra pode ser armazenada a -20 °C. - Precipitar o RNA
- Para separar os pedaços de gel do RNA extraído em tampão, centrifugar a amostra a 13.000 x g por 20 min a 4 °C e, em seguida, usar uma pipeta de ponta estreita para extrair o sobrenadante e carregá-lo em um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL.
- Para precipitar o RNA, adicione 1,5 mL de etanol gelado e 1 μL de 20 mg/mL de glicogênio, vórtice, e armazene por pelo menos 1 h a -20 °C ou -80 °C.
NOTA: Ponto de pausa opcional: o RNA pode ser armazenado a -20 °C por alguns meses.
- Coleta de precipitado de RNA: Pellet o RNA precipitado por centrifugação a 13.000 x g por 20 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e deixe o etanol restante evaporar ao ar livre (~1 h) antes de ressuspender o pellet em 30 μL de ddH2O ou 1x TE buffer.
NOTA: Este processo normalmente resulta em uma concentração final de RNA de ~10 μM.
NOTA: Ponto de pausa opcional: a amostra de ARN pode ser armazenada a -20 °C durante alguns meses.
- Determine as concentrações de estoque de RNA.
- Prepare uma alíquota de RNA para a reação de hidrólise.
- Para realizar este ensaio, primeiro, use um nano espectrofotômetro UV/Vis para determinar o A260 da amostra de RNA estoque e faça uma alíquota diluída da amostra para ~10 unidades de absorbância (UA) em ddH2O.
- Preparar a seguinte reação em um tubo de PCR de 0,5 mL: 16 μL de ddH 2 O + 2 μL de 10x Na 2 CO3 tampão+2μL de alíquota de RNA diluída a ~10 UA. Incubar a reacção durante 90 min a 95 °C e, em seguida, deixar arrefecer até ao RT.
- Determinar a concentração de ARN utilizando absorvâncias de nucleótidos: Medir o A260 desta amostra com um nanoespectrofotómetro UV/Vis e calcular a concentração de ARN utilizando a seguinte fórmula:
onde c é a concentração de RNA, b é o comprimento do caminho, i é o nucleotídeo específico (A, C, G ou U), n i é a frequência do nucleotídeo i na sequência de RNA e ε i é o coeficiente de extinção molar do nucleotídeo i. Para determinar a concentração de ARN de reserva original, multiplicar c pelo factor de diluição.
NOTA: Ponto de pausa opcional: O RNA pode ser armazenado a -20 °C por alguns meses.
- Prepare uma alíquota de RNA para a reação de hidrólise.
- PAGE purificação de Espinafre2 e RNA de Brócolis
- Executando um in vitro ensaio de cinética do leitor de placas
- Configure o programa de renaturação de RNA: Crie o seguinte protocolo de termociclador selecionando Criar Novo Programa > Adicionar Nova Fase > Adicionar Nova Etapa várias vezes para adicionar cada uma das seguintes etapas antes de pressionar Salvar:
70 °C durante 3 min
65 °C por 45 s
60 °C por 45 s
55 °C por 45 s
50 °C por 45 s
45 °C por 45 s
40 °C por 45 s
35 °C por 45 s
30 °C por 45 s - Renaturalizar o RNA: Para renaturalizar os RNAs de espinafre2 e brócolis, prepare 2 μM de cada RNA em ddH 2 O emum tubo de PCR de parede fina de 0,5 mL e, em seguida, adicione um volume igual de 2x tampão de renaturação (80 mM HEPES, pH 7,5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl2) para fazer soluções de RNA de 1 μM. Adicione os tubos ao termociclador, abra o programa de renaturação salvo e pressione Executar.
NOTA: Se um termociclador não estiver disponível, os ARN podem ser incubados num bloco de calor de 70 °C durante 3 minutos e, em seguida, deixados arrefecer lentamente para RT na bancada. - Preparar o tampão de reação de ligação: Para preparar o tampão para uma reação de ligação aptâmero-corante, faça uma mistura mestra contendo componentes tampão (69,5 μL de ddH2 O + 4 μL de 1 M HEPES, pH 7,5 [KOH] + 6,2 μL de 2 M KCl + 0,3 μL de 1 M MgCl2). Dependendo de quantas amostras e replicações são necessárias, multiplique esses valores pelo número de amostras mais uma. Geralmente, três repetições por amostra de RNA são satisfatórias.
- Prepare o leitor de placas.
- Configure o programa injetor do leitor de placas: No leitor de placas de fluorescência, selecione Temp e defina a temperatura desejada para 37 °C, certificando-se de que a temperatura tenha se equilibrado para esse valor bem antes de iniciar experimentos de cinética. Abra o software leitor de placas, selecione Configurações > Visualização de aquisição e insira o seguinte programa para medições cinéticas:
Loop: Para cada poço
Configuração da linha de base: 60 leituras da linha de base
Configurações do SmartInject: injeção de 10 μL (o que acontecerá após a leitura da linha de base)
A fluorescência (ou FL) diz:
Excitação: 448 nm (largura de banda: 9 nm)
Emissão: 506 nm (largura de banda: 15 nm)
Cartucho: MONO (s/n 3297)
Timing:
Tempo total de leitura: 10 min
Intervalo de leitura: 0,5 s
PMT e Óptica: 6 flashes por leitura
Loop: Próximo poço - Prepare o injetor
- Lave e aspirar o injetor: Para preparar o injetor leitor de placas, primeiro selecione Injetar no leitor de placas, forneça uma placa de coleta de resíduos ao leitor de placas quando solicitado e, em seguida, selecione Lavar e limpe o tubo de injeção seguindo as instruções no leitor de placas com 1 mL de volumes de ddH 2 O, etanol a 75% em ddH2O, e depois ddH2O. Em seguida, selecione Aspirar, permitindo que o injetor ejete o excesso de líquido.
- Prepare o injetor: Depois de sair para a tela anterior, selecione Prime para preparar o injetor com dois volumes de 260 μL de ligante a serem injetados para garantir que o ligante puro e concentrado seja adicionado às amostras durante os experimentos - neste caso, primo com 100 μM DFHBI em ddH2O.
- Configure o programa injetor do leitor de placas: No leitor de placas de fluorescência, selecione Temp e defina a temperatura desejada para 37 °C, certificando-se de que a temperatura tenha se equilibrado para esse valor bem antes de iniciar experimentos de cinética. Abra o software leitor de placas, selecione Configurações > Visualização de aquisição e insira o seguinte programa para medições cinéticas:
- Realizar experimentos de cinética in vitro : Para realizar um experimento de cinética, primeiro adicione 80 μL de mistura mestre de tampão de ligação previamente preparada a um poço de uma placa de fundo claro de 96 poços, seguida por 10 μL de RNA renaturado. Deixar que esta placa e a solução de DFHBI no injector se equilibrem a 37 °C durante 15 minutos no leitor de placas.
- Nas Configurações do software leitor de placas em Área de leitura, selecione o poço a ser analisado e, na guia Página Inicial , selecione Executar para executar o programa de cinética descrito anteriormente. Repita esse processo até que todos os experimentos estejam completos.
NOTA: Criticamente, os experimentos cinéticos devem ser realizados um poço de cada vez para garantir que a cinética do RNA seja medida em condições idênticas entre replicações e amostras. - Lavar o injetor: Para remover a solução DFHBI restante do tubo de injeção, lave o tubo de injeção conforme descrito na etapa 1.4.4.2.1 com 1 mL de volumes de ddH 2 O, etanol a 75% em ddH 2 Oe, em seguida, ddH2O.
NOTA: Ponto de pausa opcional.
- Configure o programa de renaturação de RNA: Crie o seguinte protocolo de termociclador selecionando Criar Novo Programa > Adicionar Nova Fase > Adicionar Nova Etapa várias vezes para adicionar cada uma das seguintes etapas antes de pressionar Salvar:
- Análise da cinética in vitro de aptâmeros de RNA fluorogênico.
- Insira dados no software de análise: exporte dados experimentais como uma planilha para copiar facilmente os dados para processamento. No software de análise, crie uma nova tabela de dados no formato XY. Na coluna X, insira cada ponto de tempo de leitura, com t = 0 sendo o tempo de injeção de DFHBI. Na coluna Y, insira os valores médios de fluorescência entre as replicações nesse respectivo ponto de tempo a partir de t = 0.
- Normalizar e representar graficamente os dados: Para normalizar os valores de fluorescência, clique em Analisar > Processamento de Dados > Normalizar e, em seguida, clique em OK. Escolha usar os menores e maiores valores do conjunto de dados para normalização, para apresentar os resultados como frações e para representar graficamente os resultados e, em seguida, clique em OK. Para criar um gráfico da fluorescência média normalizada ao longo do tempo, clique no ícone Normalizar de [Nome do Conjunto de Dados] e selecione Família de Gráficos: XY com Somente Pontos.
NOTA: As barras de erro podem ser úteis para ver nos casos em que um pequeno número de pontos de tempo são representados graficamente. Se desejar, ao escolher uma tabela de dados no formato XY, selecione a opção em "Y" para inserir valores de replicação em colunas lado a lado. Representar graficamente a tabela resultante com as opções padrão selecionadas produzirá um gráfico com barras de erro. - Realizar ajuste de curva para obter parâmetros cinéticos: Para ajustar uma curva aos dados cinéticos, clique em Analisar > Analisar Dados e selecione Regressão Não Linear (Ajuste de Curva) na guia Análises XY . Na guia Modelo , clique em Associação Exponencial > Duas Fases para ajustar os dados cinéticos com a seguinte equação de associação de duas fases:
onde Y é a fluorescência no tempo X, Y 0 é a fluorescência em t = 0, K Fast e K Slow são constantes de taxa rápida e lenta, respectivamente, e SpanFast e SpanSlow são as faixas de ativação de fluorescência contabilizadas pelas taxas rápidas e lentas, respectivamente (ver resultados representativos, Figura 1). Clique na guia Nonlin Fit para exibir constantes de taxa, valores t1/2 e valores PercentFast.
NOTA: Para obter um desvio padrão para todos esses valores, replicações individuais do experimento do leitor de placas podem ser processadas da mesma maneira descrita acima.
2. Experimento de cinética celular
- Preparação de estirpes de E. coli
- Transforme células de E. coli BL21 Star (DE3) com ~100 ng de pET31b tRNA-Espinafre2 construindo seguindo o protocolo do fabricante.
NOTA: A construção do plasmídeo está comercialmente disponível (Plasmídeo #79783). - Chapear as células em placas de ágar LB contendo carbenicilina (Carb: 50 mg/mL) e incubar a 37 °C durante 12-16 h. As células que contêm plasmídeos crescerão como colônias na placa.
NOTA: Ponto de pausa opcional: As células BL21 Star transformadas em placas podem ser armazenadas a 4 °C envoltas em parafilme durante 1 semana.
- Transforme células de E. coli BL21 Star (DE3) com ~100 ng de pET31b tRNA-Espinafre2 construindo seguindo o protocolo do fabricante.
- Células em crescimento e indução da expressão do aptâmero de RNA fluorogênico
- Inocular uma cultura de 2 mL de meio não indutor (NI) contendo carbenicilina (Carb: 50 mg/mL) com uma única colônia das células BL21 Star transformadas. Repita isso por pelo menos três replicações biológicas. Incubar as culturas a 37 °C numa incubadora/agitadora a 250 rpm durante 22-24 h.
NOTA: Ponto de pausa opcional: As células cultivadas em meios de NI retêm o plasmídeo e podem ser armazenadas a 4 °C durante 1 semana. - Após o crescimento em meios de NI, diluir a cultura 100x em um novo 3 mL de meio de autoindução (IA) ZYP-5052 contendo carbenicilina (Carb: 50 mg/mL). Cultivar as células a 37 °C numa incubadora/agitadora a 250 rpm durante 16-18 h para induzir a expressão.
NOTA: O OD600 típico para culturas variará de 2,0-3,3 após 18 h de crescimento. A faixa de densidade celular ideal está entre 2,5-3,0.
- Inocular uma cultura de 2 mL de meio não indutor (NI) contendo carbenicilina (Carb: 50 mg/mL) com uma única colônia das células BL21 Star transformadas. Repita isso por pelo menos três replicações biológicas. Incubar as culturas a 37 °C numa incubadora/agitadora a 250 rpm durante 22-24 h.
- Realização do experimento de cinética celular
- Configure o citômetro de fluxo.
- Ligue o citômetro de fluxo e o computador conectado ao instrumento. Uma vez logado no software para o citômetro de fluxo, na guia Instrumento , clique no ícone Inicialização . Siga as etapas indicadas na tela do software para garantir a inicialização adequada da instrumentação.
NOTA: Alguns citômetros de fluxo chamam a sequência de inicialização do instrumento de Priming. Certifique-se de seguir o protocolo do fabricante para o citômetro de fluxo que estará em uso para o experimento. - Execute um teste de desempenho (se aplicável). Na guia Menu Principal , clique em Teste de Desempenho. Em um tubo de cultura, adicione três gotas das esferas de rastreamento de desempenho do fabricante em 3 mL de fluido de foco.
- Coloque o tubo de cultura no elevador do tubo de amostra e levante o elevador. Antes de clicar em Executar Teste de Desempenho, verifique se o Lote # do tubo dos grânulos de rastreamento é o mesmo indicado na tela Configuração do Teste de Desempenho . Clique em Teste de Desempenho para executar o teste.
- Configure o software do citômetro de fluxo para este experimento com os seguintes parâmetros de aquisição para fluorescência unicelular:
Laser de excitação: 488 nm
Canal de emissão: GFP (também chamado de FITC)
Volume de aquisição: 40 μL (com um volume total de desenho de 90 μL)
Taxa de fluxo: 200 μL / min
Contagens de células para cada medição: 30.000
Configurações do instrumento:
Voltagem:
FSC: 480 V
CCS: 400 V
BL1: 540 V
BL2: 392 V
BL3: 422 V
- Ligue o citômetro de fluxo e o computador conectado ao instrumento. Uma vez logado no software para o citômetro de fluxo, na guia Instrumento , clique no ícone Inicialização . Siga as etapas indicadas na tela do software para garantir a inicialização adequada da instrumentação.
- Configure os arquivos experimentais.
- Crie um novo arquivo de experimento na guia Explorador de Experimentos clicando com o botão direito do mouse no nome de usuário do citômetro de fluxo. Selecione Novo experimento na janela suspensa. Quando uma nova janela na tela do computador aparecer, selecione OK.
- No novo arquivo de experimento, clique com o botão direito do mouse na pasta "Grupo" e selecione Adicionar Novo Tubo de Amostra. Rotule os tubos de amostra para cada ponto de tempo específico e replique clicando com o botão direito do mouse em Amostra e selecionando Renomear no menu suspenso. Repita esta etapa para o número total de replicações e pontos de tempo para o curso de tempo pretendido do estudo.
- Preparar uma solução de células diluídas: Em um novo tubo de cultura, adicione 1,5 mL de 1x solução de PBS. Em seguida, adicione 3 μL de células induzidas em meios de IA na solução PBS 1x para fazer uma solução de célula diluída. Repita esta etapa para cada replicação biológica em diferentes tubos de cultura.
- Meça a fluorescência de fundo das células: Antes de adicionar corante, faça leituras de cada tubo de cultura biológico replicado contendo células em 1x solução de PBS. Isso é para que o fundo fluorescente das células seja medido para observar a dobra se ligar ao longo do tempo, uma vez que o corante é adicionado.
- Para fazer uma leitura, coloque o tubo de cultura no elevador do tubo de amostra e levante o elevador manualmente até a agulha de injeção de amostra. Selecione o arquivo de exemplo adequado na guia Painel de Coleta e clique em Gravar.
- Quando a corrida estiver concluída, abaixe o elevador do tubo de amostra com o tubo de cultura à mão. Isso iniciará uma etapa de enxágue que liberará o sistema fluídico e minimizará o transporte entre cada amostra replicada biológica. Os dados serão salvos automaticamente no computador após a conclusão da execução.
- Repetir os passos referidos no ponto 2.3.4 para medir o fundo fluorescente celular para pelo menos três repetições biológicas. Para ir para o próximo arquivo de exemplo, selecione o próximo arquivo de exemplo clicando no ícone de seta para a direita próximo ao nome do tubo de exemplo abaixo do ícone Gravar .
- Meça a fluorescência em pontos de tempo para células com corante.
- Adicionar 1,4 μL de um corante concentrado (50 mM DFHBI-1T em DMSO) em 1x solução de PBS com células para obter uma concentração final de 50 μM DFBHI-1T. Em seguida, prenda a tampa do tubo de cultura e, em seguida, inverta os tubos de cultura 3x-5x para misturar a solução uniformemente antes de fazer a primeira leitura do ponto de tempo.
NOTA: A porcentagem total de DMSO dentro dos tubos de cultura para E. coli não deve exceder 10%, pois isso pode afetar a viabilidade celular16. - Retire a tampa e coloque o tubo de cultura no elevador do tubo de amostra. Levante o suporte manualmente até a agulha de injeção de amostra e, sob o arquivo de amostra adequado, clique no ícone Gravar . Além disso, inicie um temporizador pressionando Iniciar para o experimento.
- Abaixe o elevador de tubos manualmente após a conclusão da corrida e repita as etapas 2.3.5.1-2.3.5.2. (com o temporizador ligado) adicionando 1,4 μL do DFHBI-1T concentrado, invertendo os tubos de cultura e fazendo leituras para todas as restantes replicações biológicas. Esses primeiros registros serão as leituras obtidas em 0 min para todas as replicações biológicas. Faça isso um de cada vez para cada replicação biológica.
NOTA: Anote o momento em que a aquisição da citometria de fluxo de registro é pressionada. Siga esse tempo escalonando para pontos de tempo ao longo do experimento. - Continue a fazer leituras elevando os tubos de cultura no elevador do tubo de amostra até a agulha de injeção de amostra, selecionando o arquivo de amostra adequado, clicando em Gravar e abaixando o elevador manualmente após a conclusão de cada execução. Faça isso para todos os pontos de tempo adicionais e replicações biológicas que estão sendo testadas. Repita as etapas até que o experimento seja concluído.
NOTA: Mantenha as amostras fora de luz para evitar o fotobranqueamento de DFHBI-1T em solução, cobrindo as amostras com papel alumínio.
- Adicionar 1,4 μL de um corante concentrado (50 mM DFHBI-1T em DMSO) em 1x solução de PBS com células para obter uma concentração final de 50 μM DFBHI-1T. Em seguida, prenda a tampa do tubo de cultura e, em seguida, inverta os tubos de cultura 3x-5x para misturar a solução uniformemente antes de fazer a primeira leitura do ponto de tempo.
- Meça a fluorescência em pontos de tempo para células sem corante (Controle).
- Execute os protocolos de limpeza apropriados para o citômetro de fluxo antes de repetir o experimento novamente com controles negativos seguindo o protocolo do fabricante. Isso é feito para minimizar qualquer transferência do experimento anterior para o experimento de análise do ponto de tempo de controle. Abaixo estão os passos seguidos para o citômetro de fluxo entre os experimentos:
- Coloque um tubo de cultura vazio no elevador do tubo à mão, levante o suporte do tubo e clique no ícone Desobstruir na guia Instrumento . Isso executará um backflush no sistema fluídico para limpar todas as amostras pegajosas. Abaixe o suporte do tubo à mão e remova o tubo assim que a sequência de desentupimento estiver concluída.
- Com um novo tubo de cultura, adicione 3 mL de uma solução de água sanitária a 10%, coloque o tubo de cultura no suporte do tubo e levante o suporte à mão até a agulha de injeção da amostra. Além disso, coloque uma placa limpa de 96 poços no amostrador automático, se aplicável ao citômetro de fluxo.
- Clique no ícone Sanitize SIP /Sanitize Autosampler SIP para executar uma sequência de limpeza com 10% de água sanitária em todo o sistema fluídico. Abaixe o suporte do tubo para completar a sequência de limpeza.
- Defina os arquivos de exemplo para a análise de ponto de tempo de controle executar seguindo as instruções dentro da etapa 2.3.3.
- Em um novo tubo de cultura, preparar uma solução de célula diluída em 1,5 mL de 1x solução de PBS. Adicione 3 μL das células induzidas em meios de IA na solução PBS 1x para fazer uma solução de célula diluída. Repita esta etapa para cada replicação biológica.
- Adicionar 1,4 μL de DMSO no tubo de cultura, um de cada vez, à solução de PBS 1x com células e testar os mesmos pontos de tempo. Prenda a tampa do tubo de cultura e, em seguida, inverta os tubos de cultura 3x-5x para misturar a solução uniformemente antes de fazer a primeira leitura pontual. Faça isso um de cada vez para cada replicação biológica.
- Siga o mesmo protocolo para a análise de células de controle como para células com corante, usando as etapas 2.3.5.2-2.3.5.4.
- Execute os protocolos de limpeza apropriados para o citômetro de fluxo antes de repetir o experimento novamente com controles negativos seguindo o protocolo do fabricante. Isso é feito para minimizar qualquer transferência do experimento anterior para o experimento de análise do ponto de tempo de controle. Abaixo estão os passos seguidos para o citômetro de fluxo entre os experimentos:
- Desligue o citômetro de fluxo: Siga o protocolo do fabricante para o desligamento adequado da instrumentação. Para o citômetro de fluxo, o instrumento é preparado para o desligamento da seguinte maneira:
- Execute o protocolo de limpeza inicial para o citômetro de fluxo seguindo as etapas 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3.
- Substitua o tubo de cultura por solução de água sanitária a 10% por um tubo de cultura com 3 mL de fluido de foco. Levante o suporte do tubo à mão e, sob o ícone Desligar , clique no menu suspenso e selecione Completo.
NOTA: Ponto de pausa opcional.
- Configure o citômetro de fluxo.
- Análise dos dados da citometria de fluxo
- Exporte todos os arquivos FCS para análise. Abra os arquivos FCS com um software de análise de citometria de fluxo.
- Usando um dos arquivos FCS somente de célula, gere uma porta a partir do gráfico de pontos de dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral (SSC) (FSC-Area/SSC-Area), usando ambos os eixos de log para excluir quaisquer sinais de detritos. Para criar esse portão, clique no ícone AutoGate no software de análise de citometria de fluxo e nomeie-o Portão 1. Aplique essa mesma porta a todos os exemplos testados na guia Todos os Exemplos no espaço de trabalho de processamento de dados. Isso resultará no Portão 1 abaixo de todos os arquivos FCS sendo processados.
- Crie um novo arquivo de subconjunto com o arquivo FCS somente de célula usado na etapa 2.4.2 clicando duas vezes nele. Altere as configurações do eixo para FSC-Area/FSC-Height, com ambos usando eixos de log. Clique no ícone AutoGate no software de análise de citometria de fluxo para gerar um portão oval, nomeando-o Portão 2. Aplicar esta porta como um subconjunto por baixo da porta definida no passo 2.4.2 a todas as amostras testadas. Isso resultará em todas as amostras com o Portão 1 > o Portão 2 associados a cada arquivo FCS.
- Crie outro arquivo de subconjunto com ambas as portas definidas na etapa 2.4.2 e na etapa 2.4.3 aplicadas clicando duas vezes na Porta 2. Altere as configurações do eixo para FSC-Area/Histogram. Aplique esta porta de histograma como um subconjunto a todas as amostras testadas, resultando em todas as amostras com a Porta 1 > a Porta 2 > a Porta 2 associadas a cada arquivo FCS.
NOTA: Os histogramas podem ser renomeados de Porta 2 para Histograma para ajudar a mover os histogramas para a janela de layout, bem como para criar mais organização com o processamento de dados. - Para analisar os valores médios de intensidade de fluorescência (IFM), abra a janela de layout. Clique e arraste as portas do histograma para cada ponto de tempo para a janela de layout.
- Execute uma análise estatística para "∑ Média: BL1-A" (GFP) para cada amostra testada para exibir os resultados da IFM na janela de layout.
- Calcular o desvio-padrão para os valores de IFM por análise de ponto de tempo para pelo menos três repetições biológicas independentes.
- Salve os histogramas e os valores de IFM para cada ponto de tempo exportando a janela de layout como um arquivo PDF.
NOTA: Ponto de pausa opcional.
- Dados de citometria de fluxo gráfica
- Abra o arquivo PDF que contém os histogramas e os valores de IFM para cada ponto de tempo. Os valores das IFM serão copiados para um software de análise de dados. No software de gráficos de dados, crie uma nova tabela de dados no formato XY.
- Selecione para criar uma Tabela XY com o seguinte selecionado:
Tabela de dados: insira ou importe dados para uma nova tabela
Opções:
X: Tempos decorridos
Y: Insira (três a quatro) valores de replicação em subcolunas lado a lado - Rotule no eixo X todos os pontos de tempo para as execuções do experimento e do controle.
- No Grupo A, insira os valores de IFM para todas as replicações biológicas em cada ponto de tempo para análise de fluorescência das células com o corante adicionado.
- No Grupo B, insira os valores de IFM para todas as replicações biológicas em cada ponto de tempo para análise das células sem adição de corante (DMSO).
- Para observar os resultados, clique em [Inserir Nome do Conjunto de Dados] na guia Gráficos . Isso exibirá os pontos de dados como médias, com barras de erro representando o desvio padrão (s.d.) em cada ponto de tempo. O eixo X representa o tempo decorrido e o eixo Y representa os valores de IFM.
- Selecione para criar uma Tabela XY com o seguinte selecionado:
- Abra o arquivo PDF que contém os histogramas e os valores de IFM para cada ponto de tempo. Os valores das IFM serão copiados para um software de análise de dados. No software de gráficos de dados, crie uma nova tabela de dados no formato XY.
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Representative Results
Cinética in vitro
As sequências dos moldes e primers de DNA, que são adquiridos como oligonucleotídeos sintéticos, são mostradas na Tabela 2, e as receitas de reagentes são mostradas no Arquivo Suplementar 1. A amplificação por PCR é usada para aumentar a quantidade de molde de DNA com o promotor T7, que é necessário para a reação subsequente de transcrição in vitro (IVT). Além disso, a amplificação por PCR pode ser usada para dois propósitos na mesma reação: para gerar o molde de DNA de brócolis de comprimento total por extensão de primer, bem como para ampliar o modelo de DNA.
Após a reação IVT para sintetizar RNA, a purificação PAGE removerá quaisquer transcritos truncados indesejados, produtos degradados e rNTPs não reagidos do produto de RNA de comprimento total. Este tipo de purificação é preferido porque os RNAs truncados ou degradados causarão a determinação imprecisa das concentrações de RNA. Como as bases de nucleotídeos absorvem a luz UV, as bandas de RNA e os rNTPs no gel podem ser visualizados sob UV como sombras contra uma placa TLC fluorescente. Assim, bandas correspondentes ao tamanho correto do produto podem ser extraídas seletivamente.
O método do vizinho mais próximo superestima os coeficientes de extinção e, portanto, as concentrações de RNAs estruturados, uma vez que não leva em conta a hipocromicidade devido ao emparelhamento de bases17. Portanto, para determinar concentrações precisas de RNA, ensaios de hidrólise térmica de pH neutro foram realizados para hidrolisar o RNA para NMPs individuais18. O coeficiente de extinção exato foi calculado como uma soma dos coeficientes de extinção dos NMPs na sequência de RNA.
A cinética da ligação do DFHBI ao espinafre2 e ao brócolis foi determinada por meio de um ensaio de leitor de placas. O RNA foi primeiro renaturado para garantir que estaria na conformação correta para a ligação do corante. As condições de reação para o ensaio cinético do leitor de placas consistiram em 40 mM HEPES, pH 7,5 (KOH), 125 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 nM de RNA renaturado e 10 μM DFHBI, e a reação foi medida a 37 °C. Essa temperatura e concentração de MgCl 2 foram escolhidas para imitar condições fisiológicas 19, embora condições de 28 °C e10 mM de MgCl2 também possam ser usadas para melhorar o dobramento do aptâmero.
Tanto os aptâmeros fluorogênicos Espinafre2 quanto o Brócolis apresentam cinética de associação bifásica para ligação ao corante DFHBI (Figura 2). Os dados cinéticos foram mais bem ajustados pela associação bifásica do que pela associação unifásica para ambos os aptâmeros (Figura 1 Suplementar). As constantes de taxa e os valores de t1/2 para as associações rápida e lenta foram determinados pela curva de melhor ajuste (Tabela 3). O PercentFast, que descreve qual porcentagem da magnitude do turn-on de fluorescência é explicada pela população de RNA de ligação DFHBI mais rápida, também foi determinado.
O espinafre2 no estado de ligação competente mostra um turn-on mais rápido do que o brócolis (t 1/2 = 1,2 s vs.2,0 s). A cinética da segunda fase para ambos os aptâmeros é semelhante (t1/2 = 180 s) e provavelmente corresponde a uma etapa comum de limitação de taxa para uma subpopulação da amostra (PercentFast = 68% e 60% para Espinafre2 e Brócolis, respectivamente). No geral, esses resultados mostram que os aptâmeros de espinafre2 e brócolis bem dobrados exibem cinética de ativação muito rápida, com o turn-on inicial meio máximo dentro de 1-2 s de adição de corante.
Cinética celular
As sequências dos construtos de DNA, que são clonados no plasmídeo pET31b, são mostradas na Tabela 2, e as receitas de reagentes são mostradas no Arquivo Suplementar 1. As construções de DNA de aptâmeros de RNA fluorogênicos estão tipicamente contidas dentro de um andaime de RNAt para experimentos celulares. A cepa BL21 Star (DE3) E. coli é uma cepa de expressão com uma mutação na RNase E que aumenta a estabilidade do RNA.
As medidas do ponto de tempo de fluorescência foram registradas a cada 5 min durante os primeiros 45 minutos, seguidas por leituras em 1 h, 1,5 h e 2 h, dando um total de 12 pontos de tempo mais a leitura somente celular. Ter o menor intervalo de tempo de 5 min permitiu que múltiplas replicações biológicas fossem medidas em cada ponto de tempo, com espaçamento regular entre as medições replicadas de 30 s a 1 min. O volume total de células diluídas em solução de PBS 1x utilizada para o experimento de curso de tempo foi de 1,5 mL.
As células foram fechadas antes da determinação da intensidade média de fluorescência (IFM) da população de células únicas. Gating seleciona uma área no gráfico de dispersão para determinar a população de células que será analisada. Esse processo impede que quaisquer detritos ou leituras múltiplas sejam incluídos na análise. Para a análise de citometria de fluxo mostrada, foram registrados 30.000 eventos, o que resultou em 10.000-20.000 eventos analisados após o gating.
A cinética de fluorescência celular é uma função da difusão do corante em E. coli e da cinética de ligação do corante ao aptâmero de RNA dentro do ambiente celular (Figura 1B). Para as células que expressam Espinafre2-tRNA, observou-se que a intensidade média de fluorescência (IFM) aumenta imediatamente no ponto de tempo "0", devido ao curto intervalo de tempo (em segundos) entre a adição do corante e a análise da amostra (Figura 3A). Além disso, a fluorescência celular já atingiu seu valor máximo equilibrado de IFM (40.441 ± 990) no primeiro ponto de tempo de 5 min. Em contraste, as células de controle apresentam baixa fluorescência de fundo (416) e nenhuma alteração no valor da IFM com adição de DMSO (Figura 3B). Uma comparação entre células com corante e células sem corante revela que a ativação por fluorescência é de 98 vezes ± 2 nas células. No geral, esses resultados mostram que o Espinafre2-tRNA expresso em células de E. coli exibe cinética de ativação rápida, com ativação máxima dentro de menos de 5 minutos da adição do corante.
Figura 1: Esquema da ativação por fluorescência. A ativação por fluorescência ocorre após a ligação de aptâmeros de RNA a moléculas de corante (A) in vitro e (B) em células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cinética in vitro dos aptâmeros fluorogênicos. Cinética in vitro representativa dos aptâmeros fluorogênicos (A,B) Espinafre2 ou (C,D) Brócolis modelados por associação bifásica, sendo t = 0 s o ponto de tempo da adição de DFHBI (concentração final de DFHBI: 10 μM). Os experimentos foram realizados em triplicata. Todas as barras de erro representam desvios padrão da média. A partir do ajuste, foram obtidos valores de t1/2 para os componentes da reação de associação rápida e lenta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cinética celular representativa do espinafre2 em um andaime de tRNA. (A) Análise do ponto de tempo da captação do corante tRNA-Espinafre2 ao longo de 2 h. Uma linha de base somente celular foi tomada antes da adição de DFHIB-1T ou DMSO. Os pontos de tempo foram tomados a cada 5 min durante os primeiros 45 minutos, seguidos por uma leitura do ponto de tempo em 1 h, 1,5 h e 2 h. Seta representa quando o DFHBI-1T ou DMSO foi adicionado em solução PBS 1x com células BL21 Star. A concentração final de DFHBI-1T para análise é de 50 μM. Para o controle DMSO, a adição de DMSO foi em igual volume (1,4 μL) utilizado para a adição de corante DFHBI-1T. (B) Um close-up da análise do ponto de tempo de controle DMSO com células BL21 Star E. coli. A intensidade média de fluorescência (IFM) indica a leitura fluorescente geral das células BL21 Star com corante ou DMSO. Os dados representam a média ± desvio padrão de três replicações biológicas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Par Aptâmero-Corante | Comprimento (nt) | Máximo abs (nm) | Max em (nm) | Coeficiente de extinção (M-1· cm-1) | Rendimento quântico | Brilho | Kd (nm) | Tm (°C) | Referência |
| Espinafre2-DFHBI | 95 | 445 | 501 | 26100 | 0.7 | 63 | 1450 | 37 | 4 |
| Espinafre2-DFHBI-1T | 95 | 482 | 505 | 31000 | 0.94 | 100 | 560 | 37 | 13, 14 |
| Brócolis-DFHBI-1T | 49 | 472 | 507 | 29600 | 0.94 | 96 | 360 | 48 | 13 |
Tabela 1: Propriedades fotofísicas e bioquímicas previamente publicadas de Espinafre2-DFHBI4, Espinafre2-DFHBI-1T 13,14 e Brócolis-DFHBI-1T 13.
| Promotor Espinafre2 + T7 | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAA GGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCC GTAACTAGTTACATC-3' |
||
| Brócolis + T7 promotor | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgggg gtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctc-3' |
||
| Construto tRNA-Espinafre2 (em plasmídeo pET31b) | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCCCGGATAGCTCAGTCGGT AGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGTAGGCT GCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGG CCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTTTG-3' |
||
| Espinafre2 Primer para a frente | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG-3' | ||
| Espinafre2 Primer Reverso | 5'-GATGTAACTAGTTACGGAGC-3' | ||
| Brócolis Primer Avançado | 5'-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGgagacggtcgggtccagatattcgtatctg-3' | ||
| Primer reverso de brócolis | 5'-gagcccacactctactcgacagatacgaatatctggacccgaccgtctc-3' | ||
Tabela 2: Tabela de sequências de ADN contendo sequências de ADN e primers utilizados para estudos in vitro e cinéticos celulares. Negrito= promotor T7; Sublinhado = andaime de RNAt; Caps = Espinafre2; minúsculas = Brócolis; Negrito itálico = terminador T7.
| Aptamer | Rápido t1/2 (s) | Lento t1/2 (s) | KRápido (s-1) | KLento (s-1) | Porcentagem Rápida |
| Espinafre2 | 1,2 ± 0,2 | 180 ± 10 anos | 0,56 ± 0,07 | 0,0039 ± 0,0002 | 68 ± 5 anos |
| Brócolis | 2,0 ± 0,2 | 180 ± 30 anos | 0,35 ± 0,05 | 0,0039 ± 0,0006 | 60 ± 3 anos |
Tabela 3: Valores cinéticos in vitro dos aptâmeros Espinafre2 e Brócolis derivados de dados ajustados. Os dados são relatados como a média ± desvio padrão de três repetições.
Figura suplementar 1: Cinética in vitro representativa dos aptâmeros fluorogênicos. Cinética in vitro representativa dos aptâmeros fluorogênicos (A,C) Espinafre2 ou (B,D) Brócolis modelados por associação unifásica nos tempos de medição (A,B) 600 s ou (C,D) 20 s, com setas indicando o ponto de tempo da adição de DFHBI (concentração final de DFHBI: 10 μM). Os experimentos foram realizados em triplicata. No geral, esses dados são menos bem ajustados por um modelo de associação de uma fase do que um modelo de associação de duas fases quando o sinal de fluorescência é monitorado por um período mais longo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Receitas para experimento de cinética in vitro. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Para o experimento de cinética in vitro , o mesmo protocolo geral pode ser modificado para medir a cinética in vitro de um biossensor fluorescente baseado em RNA contendo um domínio de ligação ao ligante e de ligação ao fluoróforo8. Neste caso, o RNA deve ser incubado com o fluoróforo antes das medições após a injeção do ligante, a fim de obter cinética de resposta do ligante. Se for observada alta variabilidade entre as replicações, pode-se solucionar problemas verificando se cada amostra pode se equilibrar pela mesma quantidade de tempo na placa de 96 poços antes da medição. Cada amostra ou réplica deve ser preparada individualmente em um poço e medida logo após a etapa de equilíbrio de 15 minutos, em vez de preparar todas as amostras de uma só vez.
Para o experimento de cinética celular, o protocolo pode ser modificado para cursos de tempo mais curtos ou mais longos, mas é fundamental planejar o número de replicações biológicas e ajustar o volume de solução celular necessário. Recomenda-se espaçar cada leitura de replicação biológica entre 30 s a 1 min para ter tempo adequado para executar as etapas com cuidado. Outra modificação é testar um corante fluorogênico diferente que não se ligue ao aptâmero de RNA como um controle negativo alternativo, que não deve mostrar ativação por fluorescência ao fundo. Se resultados inconsistentes forem observados, pode-se solucionar problemas verificando se o citômetro de fluxo está devidamente limpo seguindo o protocolo do fabricante entre diferentes execuções experimentais para evitar qualquer sangramento de células ou corantes da execução anterior para a próxima.
Embora o método in vitro apresentado seja útil para comparar a cinética entre aptâmeros fluorogênicos ou biossensores fluorogênicos à base de RNA, os valores cinéticos obtidos podem mudar dependendo da temperatura, concentração de magnésio ou outros componentes tampão utilizados. Além disso, embora este método forneça condições bem definidas que foram usadas anteriormente para caracterizar diferentes sistemas de RNA fluorogênico, o ambiente intracelular não pode ser perfeitamente representado devido à presença de outras macromoléculas biológicas.
Enquanto o leitor de placas de fluorescência equipado com um injetor programável não tem tempo morto para aquisição de dados, o instrumento de citômetro de fluxo tem precisão temporal limitada devido ao tempo morto observável. Há um atraso de ~ 5 s entre quando o botão "Gravar" é clicado e quando a aquisição de dados é iniciada. Um atraso adicional de ~5 s ocorre para o instrumento medir 30.000 eventos; este tempo de aquisição da amostra irá variar ligeiramente dependendo de quão diluídas as células estão em 1x PBS.
Outra limitação potencial para experimentos celulares é a viabilidade celular em 1x PBS. Para análises de ponto de tempo prolongado, a viabilidade celular pode ser verificada usando iodeto de propídio para corar células mortas20. A agregação de corantes também pode limitar a precisão das medições de fluorescência feitas pelo citômetro de fluxo. Corantes com solubilidade muito limitada em soluções aquosas podem se agregar e aparecer como partículas grandes o suficiente para serem contadas como células no citômetro de fluxo. Assim, é importante executar controles experimentais somente de corantes para verificar se há agregados na região fechada.
Anteriormente, foi demonstrado que o brócolis tem brilho comparável ao Espinafre2 a 1 mM Mg2 + in vitro, mas o brócolis-tRNA exibe uma intensidade de fluorescência ~ duas vezes maior em E. coli viva em comparação com o espinafre2-tRNA13. Até onde sabemos, a cinética de ligação ao corante para aptâmeros fluorogênicos de espinafre2 e brócolis não foi comparada antes e modelada por uma associação de duas fases. As constantes iniciais de taxa rápida para ambos os aptâmeros de RNA sustentam que a bolsa de ligação do corante é pré-dobrada e não são necessárias mudanças estruturais para que o corante se ligue, o que é consistente com a cristalografia de raios-X e os experimentos de fusão UV21,22. A segunda fase com uma constante de taxa mais lenta não foi relatada anteriormente, pois outros experimentos, como medições de tempo de vida de fluxo interrompido e fluorescência, analisaram o aptâmero de espinafre por um período mais curto (20 s e 300 s)23,24. A segunda fase muito mais lenta resulta em um aumento biexponencial observado na fluorescência quando os dados são analisados por 600 s. Este passo lento pode ser atribuído a um passo de redobramento de limitação de taxa de um estado de RNA incompetente de ligação para um estado de RNA competente de ligação ou a um passo de fotoconversão de limitação de taxa de formas trans para cis do corante ligado. Este último mecanismo foi previamente modelado para dar um perfil de fluorescência biexponencial24 e é apoiado por uma análise recente da diferença entre os espectros de absorção e excitação no aptâmero relacionado, Baby Spinach25.
O significado geral dos achados in vitro é que eles mostram que a associação do corante ao aptâmero de RNA fluorogênico não limita a localização de RNA em tempo real e os estudos de expressão gênica. Para biossensores fluorescentes baseados em RNA que empregam Espinafre2, a cinética de ativação medida é semelhante à cinética de segunda fase medida aqui10 porque os biossensores exigem uma etapa de redobramento e, portanto, devem ser suficientemente rápidos para permitir estudos de sinalização quase em tempo real.
Esperava-se que a cinética celular fosse diferente da cinética in vitro observada para o espinafre2. Uma diferença fundamental é que há uma etapa adicional de difusão de corante nas células de E. coli , que envolve o cruzamento das membranas externas e internas. Além disso, o ambiente celular apresenta diferentes condições para a associação corante-aptâmero em termos de apinhamento molecular, composição iônica e concentrações, bem como concentrações de RNA e corante.
A significância geral dos resultados é que a fluorescência celular atinge o sinal máximo em menos de 5 min e permanece estável por pelo menos 2 h, o que permite a localização de RNA em tempo real e estudos de expressão gênica nessa faixa de tempo. Para um biossensor baseado em RNA que emprega espinafre2, mostramos anteriormente que uma resposta de fluorescência significativa poderia ser observada dentro de 4-5 min da adição do ligante, mas que atingir o sinal máximo leva mais tempo (15-30 min)8. Tomados em conjunto, esses achados indicam que a difusão de corantes nas células não é o passo prático de limitação de taxa para experimentos in vivo com biossensores baseados em RNA. Finalmente, este protocolo experimental pode ser aplicado para analisar outros sistemas de RNA fluorogênico em células.
Os protocolos experimentais aqui apresentados podem ser aplicados para analisar outros sistemas de RNA fluorogênico. Além dos dois aptâmeros analisados neste estudo, Espinafre2 e Brócolis, outros sistemas de RNA fluorogênico foram desenvolvidos que fornecem diferentes perfis de emissão, fotoestabilidade melhorada, afinidades de ligação mais apertadas e a capacidade de alterar fluoróforos (recentemente revisado1). Além de suas propriedades de fluorescência, o benchmarking da cinética ativada para esses sistemas in vitro e em células é importante para avaliar sua adequação a diferentes aplicações biológicas celulares. Os resultados também podem suportar o pré-dobramento estrutural ou o rearranjo do aptâmero. Como discutido, com algumas modificações, esses protocolos também têm sido aplicados para analisar biossensores baseados em RNA8.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções à MCH: NSF-BSF 1815508 e NIH R01 GM124589. O MRM foi parcialmente apoiado pela bolsa de treinamento NIH T32 GM122740.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
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