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Bioengineering

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64368
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있어 인간 심장에 대한 더 나은 전임상 모델이 절실히 필요합니다. 조직 공학은 기초 과학 심장 연구에 매우 중요합니다. 체외 인간 세포 배양은 동물 모델의 종간 차이를 제거하는 반면, 조직과 유사한 3D 환경(예: 세포외 기질 및 이세포 결합)은 플라스틱 페트리 접시에 대한 기존의 2차원 배양보다 생체 내 조건을 더 많이 시뮬레이션합니다. 그러나 각 모델 시스템에는 맞춤형 바이오리액터 및 기능 평가 장치와 같은 특수 장비가 필요합니다. 또한 이러한 프로토콜은 종종 복잡하고 노동 집약적이며 작고 섬세한 조직의 결함으로 인해 어려움을 겪습니다.

이 논문은 조직 기능의 종단 측정을 위해 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 강력한 인간 공학 심장 조직(hECT) 모델 시스템을 생성하는 프로세스를 설명합니다. 선형 스트립 형상을 가진 6개의 hECT를 병렬로 배양하며, 각 hECT는 PDMS 랙에 부착된 한 쌍의 힘 감지 폴리디메틸실록산(PDMS) 포스트에 매달려 있습니다. 각 게시물은 사용 편의성, 처리량, 조직 보존 및 데이터 품질을 개선하는 새로운 기능인 검은색 PDMS SPoT(Stable Post Tracker)로 제한됩니다. 이 모양은 포스트 편향의 신뢰할 수 있는 광학 추적을 가능하게 하여 절대적인 능동 및 수동 장력으로 향상된 트위치 힘 추적을 제공합니다. 캡 형상은 포스트에서 미끄러지는 hECT로 인한 조직 손상을 제거하고, PDMS 랙 제조 후 두 번째 단계를 포함하므로 바이오리액터 제조 공정을 크게 변경하지 않고도 SPoT를 기존 PDMS 포스트 기반 설계에 추가할 수 있습니다.

이 시스템은 생리학적 온도에서 hECT 기능 측정의 중요성을 입증하는 데 사용되며 데이터 수집 중에 안정적인 조직 기능을 보여줍니다. 요약하면, 우리는 체외 응용을 위해 조작된 심장 조직의 생체 충실도, 효율성 및 엄격성을 발전시키기 위해 주요 생리학적 조건을 재현하는 최첨단 모델 시스템을 설명합니다.

Introduction

엔지니어링된 심장 조직 모델은 기존의 2차원 세포 배양으로는 달성하기 어려운 천연 심장 틈새의 다양한 측면을 재현하기 위해 다양한 형상과 구성으로 제공됩니다. 가장 일반적인 구성 중 하나는 선형 조직 스트립으로, 각 끝에 유연한 앵커가 있어 조직 자가 조립을 유도하고 조직에 정의된 예압과 결과 경련력 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27입니다. 생성된 힘은 조직 단축의 광학적 추적 및 탄성 빔 이론을 사용하여 앵커(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11)의 측정된 편향 및 스프링 상수로부터 힘을 계산함으로써 견고하게 측정될 수 있습니다. 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28입니다.

그러나 심장 조직 공학은 여전히 진화하는 분야이며 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 맞춤형 생물반응기 및 기능 평가 장치와 같은 특수 장비가 각 모델 시스템(10,29,30,31)에 필요합니다. 이러한 구성물의 미세환경의 크기와 복잡성은 노동 집약적인 프로토콜, 많은 수의 세포 및 조직 취약성으로 인한 낮은 처리량으로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 이 문제를 해결하기 위해 일부 그룹은 약물 발견에 유용한 고처리량 분석을 용이하게 하기 위해 수백 또는 수천 개의 세포만 포함하는 미세 조직 제조로 전환했습니다. 그러나, 이러한 축소된 규모는 기능(12)의 정확한 평가를 복잡하게 하고, 본래 심장 틈새의 주요 측면(예: 영양소/산소 확산 구배 및 복잡한 구조(36))을 제거하며, 후속 분자 및 구조 분석에 사용할 수 있는 물질의 양을 제한한다(종종 조직의 풀링이 필요함). 표 1은 문헌 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15에 있는 선형 조직 스트립 모델의 일부 구성을 요약 한 것이다. 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40입니다.

그룹 조직당 세포 수 접시당 조직 플레이트 형식 앵커링 기능 기능적 데이터 수집 방법 공유 미디어 목욕? 기능적 측정-
멘트 in situ?
요시다 (ECT)38 400만 6 수정된 6웰 플레이트* 힘 변환기 직접 힘 측정 아니요 아니요
챈 (hESC-CM-ECT)26 310의 케이 6 맞춤형 6웰 접시 PDMS 게시물 직접 힘 측정 예 아니요
파인버그(dyn-EHT)16 150만 6 맞춤형 6웰 접시 PDMS 와이어 조직 형태 아니요 예
RADISIC(바이오와이어)39, 40 110 케이 8 폴리머 와이어 와이어 형상 예 예
Costa(단일 HECT)1, 2 1-200만 4** 10cm 페트리 접시** PDMS 게시물 광학 편향(에지/물체 추적) 예 예
Costa (multi-hECT)3–9 500 K-100만 6 6cm 페트리 접시 PDMS 게시물 광학 편향(에지/물체 추적) 예 예
Costa(다중 hECT W/ SPoT) 100만 6 6cm 페트리 접시 검은색 대문자가 있는 PDMS 게시물 광학 편향(물체 추적) 예 예
파시어 (EHT)17 245 케이 36 12웰 플레이트 검은색 대문자가 있는 PDMS 게시물 광학 편향(물체 추적) 예 예
분작-노바코비치13, 18 100만 12 6cm 페트리 접시 캡이 있는 PDMS 포스트 광학 편향(가장자리 감지) 예 예
분작-노바코비치(MilliPillar)14 550의 케이 6 맞춤형 6웰 접시 캡이 있는 PDMS 포스트 광학 편향(물체 추적); 칼슘 이미징 아니요 예
에셴하겐 (EHT)10, 19–21 100만 12 12웰 플레이트 캡이 있는 PDMS 포스트 광학 편향(포스트 편향의 가장자리 감지); 칼슘 이미징 아니요 예
잔드스트라 (카미리)22 25-150 케이 96 96웰 플레이트 후크가 있는 PDMS 게시물 광학 편향(가장자리 감지) 아니요 예
머리23, 24 900 케이 24 24웰 플레이트 캡이 있는 PDMS 포스트, 통합 자석 마그네틱 센서 아니요 예
라이히 (μTUG)11, 12, 25 정의 156 156웰디쉬 캡이 있는 PDMS 포스트, 통합 자석 광학 추적(형광 비드) 예 예

표 1: 문헌에 있는 일부 선형 공학 심장 조직 모델의 특성. 선형 엔지니어링 심장 조직 모델은 크기, 처리량, 고정 기능 설계, 공유 배지 수조의 용이성뿐만 아니라 기능적 특성화를 위한 별도의 근육 수조 시스템에 대한 요구 사항이 다양합니다. * 연구원들은 표준 6웰 플레이트의 치수를 기반으로 상업적으로 이용 가능한 엔지니어링 조직 시스템을 사용했습니다. ** 단일 조직 바이오리액터가 원하는 수와 위치의 모든 플라스틱 배양 접시에 고정되는 모듈식 시스템.

이 논문은 선형 인간 공학 심장 조직(hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27의 확립된 모델을 제작하기 위한 최신 프로토콜을 설명합니다 및 hECT 수축 기능을 평가하는 방법. 각 다중 조직 바이오리액터는 공유 배지 수조에 최대 6개의 hECT를 수용할 수 있으며 견고한 폴리설폰 프레임에 장착된 실리콘 엘라스토머 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만들어진 2개의 "랙" 부품으로 구성됩니다. 각 PDMS 랙에는 직경 0.5mm, 길이 3.25mm의 유연한 통합 힘 감지 포스트 6개가 포함되어 있으며, 2개의 랙은 각각 1개의 hECT를 수용하는 6쌍의 포스트를 제공합니다. 바이오리액터의 반전은 배양 배지의 수분 응축 또는 공기-액체 계면의 반월상 연골로 인한 왜곡으로 인해 아래에서 hECT를 시각화하는 데 방해가 되는 것을 극복하는 데 도움이 됩니다. hECT의 각 수축은 통합 단부 포스트의 편향을 유발하고, 편향 신호의 광학 측정은 hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27의 수축 함수를 나타내는 힘 대 시간 추적으로 처리됩니다 . 이 크기의 조직에 일반적으로 사용되는 단일 조직 바이오리액터와 비교했을 때, 다중 조직 설계는 실험 처리량을 개선하고 잠재적으로 다른 세포 조성의 인접 조직 간의 파라크린 신호 연구를 가능하게 합니다. 이 시스템은 질병 모델링 4,8, 파라크린 신호 전달 6,7, 이세포 배양 5,9 및 치료 스크리닝 7,9의 응용 분야를 설명하는 발표된 연구에서 검증되었습니다.

이 시스템에서 hECT는 길이 약 6mm, 직경 0.5mm로 설계되어 노이즈가 적은 힘 측정에 대한 강력한 광학 추적을 용이하게 합니다. 또한 확산 구배 및 세포 조직과 같은 조직 복잡성의 측면은 조직당 100만 개의 세포라는 관리 가능한 요구 사항과 균형을 이룹니다. 표준 CCD 카메라 기술을 사용하면 1μN의 약한 힘(편향 후 5μm 미만을 나타냄)이 명확한 신호를 생성하여 일부 hECT 질병 모델에서 관찰되는 것처럼 극도로 약한 수축 기능도 정확하게 측정할 수 있습니다. 이것은 또한 경련력 곡선의 상세한 분석을 용이하게 하여, 발달된 힘, 수축률(+dF/dt) 및 이완률(-dF/dt) 및 박동 변동성을 포함한 최대 16개의 수축성 지표(41)에 대한 고함량 분석을 가능하게 한다.

이 프로토콜은 생물반응기 구성 요소를 제조하기 위한 지침으로 시작합니다. hECT 수율을 극대화하고, 조직 기능의 기술적 변동성을 줄이며, 조직 평가의 품질과 깊이를 최적화하기 위한 단계에 특별한 주의를 기울입니다. 대부분의 심장 조직 공학 연구는 제조 및 장기 테스트 중 조직 손실률을 보고하지 않지만, 이는 현장에서 잘 알려진 과제이며 연구의 처리량과 효율성을 감소시킨다27. 여기에 설명된 조직 공학 방법은 대부분의 바이오리액터에서 모든 hECT의 머무름을 보장하기 위해 수년에 걸쳐 개선되었습니다(PDMS 랙 제조 방법에 관계없이). 그러나, 5%-20%의 조직 손실조차도 통계적 검증력에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 특히 이용 가능한 심근세포의 수(예: 일부 병든세포주4 의 분화 문제 또는 상업적으로 구매된 심근세포의 높은 비용으로 인해) 또는 치료 조건(예: 다양한 처리 화합물의 제한된 가용성 또는 높은 비용)에 의해 제한되는 소규모 실험에서 유의하게 영향을 미칠 수 있습니다.

이 프로토콜은 hECTs(27)를 고정하는 힘-감지 포스트의 끝에서 캡 역할을 하는 PDMS 랙의 새로운 기능인 SPoT(Stable Post Tracker)의 제작을 설명한다. 캡 형상이 포스트에서 떨어지거나 당겨질 때 발생하는 hECT 손실을 크게 줄여 캡이 없는 포스트에서 배양하기 어려운 다양한 강성과 장력을 가진 hECT를 배양할 수 있는 새로운 기회를 열어주는 방법을 보여줍니다. 또한, SPoT는 일관되고 잘 정의된 형상(27)을 통해 hECT 수축의 광학적 추적을 개선하기 위해 고대비 물체를 제공한다. 그 다음에는 이전에 발표된 프로토콜 3,42,43에 기반한 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 배양 및 심근세포 분화에 대한 설명과 hECT 제조, 배양 및 기능 측정에 대한 설명이 이어집니다.

이 기사에서는 생리학적 온도에서 조직 기능을 측정해야 할 필요성에 대해서도 다룹니다. 인간 심근(태아 및 성인 건강 및 질병 조직)과 다양한 동물 종(쥐, 고양이, 생쥐, 페럿 및 토끼 포함)의 심장 조직(44,45)은 생리적 온도에 비해 28°C-32°C의 온도에서 주파수 일치 경련력의 현저한 증가를 나타내며, 이는 저체온성 수축으로 알려진 현상입니다45, 46. 그러나 조작된 심근 조직 기능에 대한 온도의 영향은 아직 연구가 부족합니다. 문헌에 있는 많은 최근의 공학적 심장 조직 모델은 생리학적 조건을 근사화하기 위해 37°C에서 기능적으로 평가되도록 설계되었다 13,14,37. 그러나 우리가 아는 한, 조작된 심장 조직에 의해 생성된 힘에 대한 온도에 따른 영향은 체계적으로 조사되지 않았습니다. 이 프로토콜은 테스트 중 열 손실을 최소화할 뿐만 아니라 무균성을 손상시키지 않고 hECT를 생리적 온도로 유지할 수 있는 기능 측정을 위한 설정에 절연된 발열체를 통합할 수 있도록 하는 페이싱 전극 설계를 설명합니다(27). 그런 다음 발달된 힘, 자발적 박동 주파수, +dF/dt 및 -dF/dt를 포함하여 hECT 기능에 대한 온도의 관찰된 영향 중 일부를 보고합니다. 전체적으로, 이 논문은 인간이 설계한 심장 조직을 제작하고 수축 기능을 평가하기 위해 이 다중 조직 힘 감지 생물 반응기 시스템을 제조하는 데 필요한 세부 정보를 제공하며, 실온 및 37°C에서 측정을 위한 비교를 위한 기초를 제공하는 일련의 데이터를 제공합니다27.

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Protocol

이 프로토콜은 비식별화된 iPSC 라인인 SkiPS 31.3(원래는 건강한 45세 남성의 피부 섬유아세포를 사용하여 재프로그래밍됨)47을 사용했으며, 따라서 기관의 인간 연구 윤리 위원회 지침에 따라 특정 기관 검토 위원회의 승인에서 면제되었습니다. HEPA 여과 클래스 II 생물 안전 캐비닛 또는 층류 작업대의 무균 조건에서 모든 세포 및 hECT 조작을 수행합니다. 0.22μm 필터를 통한 여과로 모든 비멸균 용액을 멸균하고 모든 세포와 hECT를 37°C, 95% 상대 습도 및 5%CO2에서 인큐베이터로 유지합니다.

1. 생물반응기 제작

  1. 바이오리액터 구성품 및 알루미늄 마스터 캐스트 제작
    참고: CAD(Computer-Aided Design) 파일은 보충 파일 1에 제공됩니다. 프로토콜은 이러한 단계 사이의 어느 곳에서나 일시 중지될 수 있습니다. 정확한 포스트 형상과 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 베이스 플레이트에 폴리설폰 프레임을 적절하게 압입하기 위해서는 높은 공차(≤5μm)와 매끄러운 마감이 필요하므로 이 섹션에 설명된 마스터 금형을 제조할 전문 기계공을 고용하는 것이 좋습니다(꼭 맞는 마찰 맞춤을 목표로 하지만 너무 꽉 조이지 않음).
    1. 컴퓨터 수치 제어(CNC) 밀을 사용하여 그림 1A의 회로도에 따라 PTFE로 베이스 플레이트를 가공합니다. hECT는 균일한 간격의 6개 웰(흰색 화살표)에 형성됩니다.
    2. CNC 밀을 사용하여 그림 1B의 회로도에 따라 알루미늄으로 주조된 폴리디메틸실록산(PDMS) 랙 네거티브 마스터 캐스트를 3개의 프레임 지지대(녹색 별표)로 가공합니다. PDMS 포스트를 생성하기 위해 직경 0.5mm의 균일한 간격의 구멍(자홍색 화살촉) 6개를 뚫습니다.
    3. CNC 밀을 사용하여 그림 1C의 회로도에 따라 폴리설폰으로 바이오리액터 프레임을 가공합니다. 프레임 지지대(녹색 별표)는 랙 캐스트에 표시된 프레임 지지대에 해당합니다(그림 1B, 녹색 별표).
    4. CNC 밀을 사용하여 그림 1D의 회로도에 따라 알루미늄으로 알루미늄 주조 홀더를 가공합니다. 각 슬롯에는 PDMS가 PDMS 랙 캐스트의 구멍을 통해 흐를 수 있는 데드 스페이스를 제공하기 위해 높이가 0.25mm인 삼각형 쉘프(주황색 삼각형)가 포함되어 있습니다(그림 1B, 자홍색 화살촉).
  2. 알루미늄 네거티브 마스터에서 PDMS 랙 주조
    1. 열가소성 용융 증착 모델링 3D 프린터를 사용하여 두 개의 PDMS 랙 주조 장치 브래킷을 인쇄합니다(보충 파일 1). 레이어 높이 0.1mm, 벽/하단/상단 두께 1mm, 삼각형이 있는 충전 밀도 90%, 인쇄 온도 230°C, 빌드 플레이트 온도 70°C, 접착용 챙과 같은 인쇄 설정을 사용합니다.
    2. 기둥 구멍이 삼각형 선반 반대쪽의 데드 스페이스와 정렬되도록 주조 홀더(그림 2AI)에 4개의 알루미늄 네거티브 마스터 캐스트를 놓습니다( 그림 1D 참조). 액체 PDMS의 누출을 방지하기 위해 0.5mm 두께의 실리콘 시트(그림 2B, 흰색 화살표)의 직사각형 조각으로 장치를 개스킷으로 감싸고 나사 클램프를 사용하여 두 개의 평행한 3D 프린팅 브래킷 사이에 클램핑합니다.
    3. 얕은 용기에 PDMS 엘라스토머 베이스 5mL(제조업체의 지침에 따라 1:10 비율)에 PDMS 경화제 0.5mL를 넣고 5분 동안 격렬하게 혼합합니다. 진공 챔버에서 PDMS 혼합물의 가스를 제거하고 실온에서 또는 기포가 사라질 때까지 20-1분 동안 강한 진공(0.1-1kPa)을 적용합니다.
    4. PDMS 혼합물을 주조 장치에 붓고 각 슬롯이 완전히 덮이도록 과도하게 채웁니다(그림 2AII). 원하는 경우 각 PDMS 랙의 고유한 식별을 위해 포스트가 있는 측면(그림 2B) 반대편에 PDMS 랙 본체(그림 2AII)에 작은 컬러 유리 구슬을 추가합니다. 주조 장치를 진공 챔버로 되돌리고(수평이 되도록 보장) 최소 12시간 동안 강한 진공을 적용합니다. PDMS가 먼지로부터 떨어진 실온에서 약 48시간 동안 경화되도록 하여 섬세한 포스트의 완전한 경화와 최대 강도를 가능하게 합니다. 오븐을 사용하면 3D 프린팅 부품이 휘어질 수 있으므로 사용하지 마십시오.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  3. 알루미늄 네거티브 마스터 캐스트에서 PDMS 랙 제거
    1. cl 제거amp, 브래킷 및 실리콘 시트를 주조 장치에서 제거합니다. 스테인리스 스틸 면도날을 사용하여 주조 장치 및 프레임 지지대 상단의 PDMS 필름을 잘라내고 손가락을 사용하여 주조 홀더 측면에서 PDMS 랙을 분리합니다. 무딘 스테인리스강 면도날을 주물과 주물 홀더 사이의 데드 스페이스에 삽입하고 들어 올려 분리하여(그림 2CI, II) 데드 스페이스를 채우는 PDMS가 캐스트 홀더와 함께 유지되도록 합니다(포스트에 부착됨). 날카로운 스테인리스강 칼날을 사용하여 남아 있는 PDMS 필름을 잘라내고 포스트 끝에서 데드 스페이스 PDMS를 자릅니다(그림 2C III-V).
    2. 중요 단계: 캐스트에서 PDMS 랙을 분리합니다(그림 2D). 기둥 반대쪽부터 시작하여 손가락을 사용하여 PDMS 랙을 캐스트에서 천천히 분리하고 기둥에 마스터 캐스트가 없어질 때까지 다른 측면에서 작업합니다.
    3. 모든 PDMS 랙과 모든 포스트가 해제될 때까지 이전 단계를 반복합니다. 날카로운 면도날을 사용하여 랙에 남아 있는 여분의 PDMS를 잘라냅니다. 그 결과 식별을 위한 6개의 온전한 기둥(주황색 화살촉)과 컬러 비드(파란색 화살표)가 있는 PDMS 랙(그림 2E)이 탄생했습니다.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  4. SPoT(Stable Post Tracker) 제작
    1. 열가소성 용융 증착 모델링 3D 프린터를 사용하여 SPoT 주조 장치의 구성 요소를 인쇄합니다(보충 파일 2 및 그림 3AI, II). 레이어 높이 0.1mm, 벽/하단/상단 두께 1mm, 삼각형 포함 충전 밀도 80%, 인쇄 온도 230°C, 빌드 플레이트 온도 70°C, 접착용 챙 인쇄 설정을 사용합니다.
    2. 3D 프린팅된 조각 사이, PDMS 랙과 세 갈래 지그 사이에 단단히 압입되도록 하고, PDMS 랙이 구부러지지 않고 웰 바닥에 닿는 포스트에 꼭 맞는지 확인합니다. 필요한 경우 플라스틱을 다듬거나 정리합니다.
    3. 0.5mL의 검은색 PDMS 파트 A와 파트 B의 0.5mL(제조업체의 지침에 따라 1:1 비율)를 소형 계량 보트(또는 이와 유사한 작고 얕은 용기)에 넣고 색상이 균일해질 때까지 완전히 혼합합니다. 혼합된 검은색 PDMS를 강한 진공 상태에서 진공 챔버에서 20분 동안 탈기합니다. 가스가 제거된 검은색 PDMS를 3D 프린팅 베이스에 부어 구멍을 채우고 기포가 남지 않도록 두드려 줍니다. 베이스에서 여분의 PDMS를 가능한 한 많이 긁어냅니다.
    4. 세 갈래 조각을 베이스에 끼우고 PDMS 랙을 세 갈래 지그의 홈에 놓고(그림 3AII, 청록색 직사각형) 포스트의 끝이 원형 웰의 검은색 PDMS에 담그도록 합니다(그림 3B, C). 검은색 PDMS는 실온에서 경화되고 48시간 동안 먼지로부터 보호됩니다.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
    5. 기둥의 장력을 최소화하면서 세 갈래 조각을 밀어냅니다. 작은 집게를 사용하여 각 SPoT를 둘러싸고 있는 검은색 PDMS의 박막을 긁어냅니다. 그런 다음 끝이 가늘고 구부러진 집게를 SPoT 웰에 삽입하여 3D 프린팅 베이스에서 분리합니다(그림 3D).
    6. SPoT(그림 3E)를 검사하고 미세한 Vannas 가위를 사용하여 1.4.5단계에서 제거하지 않은 주조 공정에서 남아 있는 검은색 PDMS 필름을 잘라냅니다. PDMS 랙을 폴리설폰 프레임에 장착한 다음 이를 검은색 베이스 플레이트에 밀어 넣어 완성된 포스트의 길이가 올바른지 확인합니다(그림 4A).
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
    7. PDMS 랙을 페어링하고 프레임 탭을 사용하여 프레임에 추가합니다(그림 4A). PTFE 베이스 플레이트가 있는 백에서 최소 30분 주기(뒤틀림을 줄이기 위해 <122°C) 동안 오토클레이브합니다.

Figure 1
그림 1: hECT 바이오리액터 구성 요소. (A) hECT(흰색 화살표)를 형성하기 위해 균일한 간격의 웰 6개가 있는 PTFE 베이스 플레이트의 평면도(왼쪽)와 측면도(오른쪽). (B) 6개의 균일한 간격의 기둥(자홍색 화살촉)과 바이오리액터 프레임에 부착하기 위한 3개의 간격(녹색 별표)이 있는 PDMS 랙용 알루미늄 네거티브 마스터 캐스트의 측면도(왼쪽)와 상단 모습(오른쪽). (C) PDMS 랙 캐스트(패널 B)의 프레임 지지대에 해당하는 3개의 균일한 간격의 프레임 지지대(녹색 별표)가 있는 PDMS 랙용 폴리설폰 프레임의 측면도(왼쪽)와 하단 모습(오른쪽). (D) PDMS 랙 캐스트를 위한 4개의 슬롯이 있는 알루미늄 캐스트 홀더의 상단 뷰(상단) 및 측면 뷰(하단)로, 각각 0.25mm 높이의 삼각형 선반(가장 왼쪽은 주황색으로 강조 표시됨)이 있습니다. 이 수치는 van Neste27에서 수정되었습니다. 약어: hECT = 인간 공학 심장 조직; Ø = 직경; PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌; PDMS = 폴리디메틸실록산; R = 반지름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: PDMS 랙의 제작. (A) CAD 렌더링은 주조 장치의 비스듬한 보기를 보여줍니다. (I) 네거티브 PDMS 랙 마스터 캐스트가 주조 홀더의 4개 슬롯 각각에 삽입되며, PDMS 기둥(자홍색 화살촉)을 형성하는 구멍이 삼각형 선반 반대쪽 데드 스페이스 위에 배치됩니다(그림 1D, 주황색 삼각형). (II) PDMS를 네거티브 마스터 캐스트의 각 캐비티에 붓습니다. (III) 컬러 비드는 컬러 코딩 식별 시스템으로 경화되지 않은 PDMS에 추가됩니다. (B) 나사 클램프로 고정된 두 개의 3D 프린팅 브래킷으로 양쪽을 고정하고 0.5mm 두께의 실리콘 시트(흰색 화살표)로 감싸 고정된 측면을 밀봉하는 조립된 PDMS 랙 주조 장치를 보여주는 사진. 유색 구슬은 기둥을 형성하는 0.5mm 직경의 구멍(자홍색 화살촉)을 덮지 않도록 배치됩니다. (C) PDMS가 경화되면 캐스트 홀더에서 캐스트를 제거합니다. (I) 무딘 스테인리스 스틸 면도날 또는 이와 유사한 얇은 금속 도구를 주물과 주물 홀더 사이에 삽입하여 주물 홀더(II)에서 주물을 들어 올립니다. (III) 기둥의 구멍을 통해 흐르는 PDMS에 의해 형성된 필름(청록색 브래킷)은 기둥의 끝에 부착되며 날카로운 칼날(IV,V)을 사용하여 잘라내야 합니다. (D) PDMS 랙이 캐스트에서 분리됩니다. (E) 식별을 위해 본체에 유리 구슬이 내장된 PDMS 랙의 비스듬한(위), 측면(가운데) 및 아래(아래) 모습을 보여주는 사진(파란색 화살표). 기둥 끝(주황색 화살촉)에는 검은색 잉크가 표시되어 있습니다. 눈금 막대 = 1cm. 이 수치는 van Neste27에서 수정되었습니다. 약어: CAD = Computer-Aided Design; PDMS = 폴리디메틸실록산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: SPoT 제작. (A) SPoT 주조 지그의 (I) 베이스와 (II) 세 갈래 조각의 주요 치수를 나타내는 CAD 렌더링. 원형 SPoT 형태(AI, 검은색 화살표)의 치수는 깊이 0.2mm x 직경 1.2mm로 설정되며, 각 형태는 개별 SPoT에 대한 검은색 PDMS를 보유합니다. 상단 뷰에서 볼 수 있는 11.1mm x 27mm 선반(AII, 상단, 청록색 직사각형)은 경화 중에 PDMS 랙을 제자리에 고정하기 위해 0.4mm 눌러져 있습니다(아래 측면 뷰 참조). (B) SPoT 주조 장치의 조립을 보여주는 CAD 렌더링. (C) 조립된 SPoT 주조 장치의 사진. (D) PDMS가 경화된 후 PDMS 랙 아래에서 세 갈래 지그를 밀어내고 미세한 겸자를 사용하여 SPoT를 웰에서 분리합니다. (E) SPoT가 없는 경우(위)와 있는 경우(아래) PDMS 랙의 사진. 삽입은 게시물의 확대된 보기를 보여줍니다. 축척 막대 = 1cm(E), 2.5cm( E의 확대 이미지). 이 수치는 van Neste27에서 수정되었습니다. 약어: CAD = Computer-Aided Design; Ø = 직경; PDMS = 폴리디메틸실록산; R = 반지름; SPoT = 안정적인 포스트 트래커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 세포 배양

  1. iPSC 배양
    참고: 다른 세포주는 배지 첨가제의 통로 희석 및 빈도 및/또는 적정에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.
    1. 세포 배양 처리된 6웰 플레이트를 적격한 기저막 매트릭스(제조업체의 지침에 따라 1:1 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F12 Nutrient Solution [DMEM/F12]로 희석)로 코팅하고 플레이트를 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 iPSC 배양 배지 500mL를 준비하고 페니실린-스트렙토마이신(10,000IU/mL - 10,000μg/mL) 원액 5mL를 추가합니다.
    2. iPSC를 통과시키려면 웰에서 배지를 흡인하고 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 각 웰을 한 번씩 세척합니다. 웰당 1mL의 iPSC 해리 용액을 추가하고 층류 후드에서 1분 동안 배양합니다.
    3. iPSC 해리 용액을 흡인하고 37°C(배지 없음)에서 5분 동안 세포를 배양합니다. iPSC 배지에 2μM 티아조비빈 1mL를 첨가하여 iPSC 해리 용액을 중화합니다.
    4. 2mL 혈청학적 피펫을 사용하여 콜로니를 약 10개 세포 덩어리로 해리하고 iPSC 배지에 추가로 1mL의 2μM 티아조비빈으로 각 세포를 잘 세척합니다. 기저막 매트릭스로 새로 코팅된 플레이트의 각 웰에 2mL의 세포 현탁액을 추가합니다(단계 2.1.1).
    5. 24시간 후 배지를 제거하고 신선한 iPSC 배지(티아조비빈 제외)를 추가합니다. 48시간마다 iPSC 배지 2mL 또는 72시간마다 iPSC 배지 4mL를 iPSC에 공급합니다. 세포를 1:6 희석으로 3일마다 또는 80% 합류에 도달할 때 다시 플레이트합니다.
      참고: 다른 세포주는 희석 및 통과 빈도의 조정이 필요할 수 있습니다.
  2. 심근세포 분화
    1. iPSC 단층이 80%-90% 합류할 때 분화를 시작합니다.
    2. Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(RPMI) 500mL에 인슐린이 없는 B27 보충제 10mL와 페니실린-스트렙토마이신 원액 5mL를 첨가하여 분화 배지를 준비합니다. RPMI 1640 500mL에 B27 보충제 10mL와 페니실린-스트렙토마이신 원액 5mL를 첨가하여 심근세포 유지 배지를 준비합니다.
      참고: 분화 배지 및 심근세포 유지 배지는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
    3. 0일차: 1mL의 DMEM/F12로 세포를 세척하고 2mL의 10μM CHIR99021와 희석된 기저막 매트릭스를 분화 배지에 추가합니다.
    4. 1일차: 24시간 후 또는 세포 밀도가 70% 미만으로 감소하면 1mL의 DMEM/F12로 세포를 세척하고 2mL의 분화 배지를 추가하고 48시간 동안 배양합니다.
    5. 3-4일차: 1mL의 DMEM/F12로 세포를 세척하고 분화 배지에 5μM IWR-1 2mL를 추가합니다. 4일째에 반복합니다.
    6. 5-6일차: DMEM/F12 1mL로 세포를 세척하고 분화 배지 2mL를 추가합니다. 6일째에 반복합니다.
    7. 7-10일: 1mL의 DMEM/F12로 세포를 세척하고 2mL의 심근세포 유지 배지를 추가합니다. 24시간마다 반복합니다.
    8. 11+일: 배지를 48-72시간마다 4mL의 신선한 심근세포 유지 배지로 교체합니다. 격렬하게 박동하는 단층이 손상되지 않도록 천천히 흡입하고 피펫팅합니다.

3. hECT 문화

  1. 심근세포 채취
    1. 분화 유도 후 8-60일 동안 hECT 제조에 사용하기 위해 심근세포 단층을 수확합니다. 웰당 2-500만 개의 세포를 예상할 수 있습니다.
      참고: 세포가 10일까지 박동을 시작하지 않으면 분화가 성공하지 못할 것입니다. 활발하게 두드리는 단층은 종종 분화로 11-15 일 후에 분리되고 조밀 한 조직으로 압축됩니다. 이때 이러한 셀을 사용하거나 다시 도금하는 것이 좋습니다.
    2. PBS 2mL로 심근세포의 각 웰을 2회 헹굽니다. 실온 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 추가합니다. 세포가 둥글게 보이고 플레이트를 가볍게 두드리면 분리될 때까지 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
    3. 해리를 중화하기 위해 심근세포 유지 배지에 10% FBS 1mL를 각 웰에 추가합니다. 5mL 혈청학적 피펫 팁을 사용하여 단층을 부드럽게 피펫팅하고 50mL 원뿔형 튜브로 옮겨 펠릿을 10-20개 세포 덩어리로 분해합니다.
    4. 10μL의 세포를 10μL의 트리판 블루로 옮기기 전에 원뿔형 튜브를 뒤집어 세포 현탁액을 혼합합니다. 자동 세포 계수기 또는 유리 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 모든 세포를 사용하지 않거나 일부 세포가 유세포 분석을 위해 따로 보관되는 경우 세포 현탁액을 적절하게 분리합니다.
      참고: 이 시점에서 보조 세포(예: 섬유아세포)를 추가할 수 있습니다.
    5. 세포를 250× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 즉시 흡입하고 얼음 위에 보관하십시오. 세포가 펠릿에서 보내는 시간을 최소화하기 위해 신속하게 작업하십시오.
  2. hECT 제작
    1. 표 2의 부피를 사용하고, 각 hECT가 100만 개의 세포를 포함하도록 펠릿의 세포 수에 따라 조정한다. 각 단계 후에 기포가 생기지 않도록 피펫팅으로 천천히 혼합합니다.
      알림: 일부 구성 요소는 빛에 민감하므로 직사광선으로부터 차폐된 3.2.2-3.2.3단계를 수행합니다.
    2. 13.442μL의 증류수, 4.4μL의 10x PBS, 0.638μL의 1M NaOH를 추가하여 1.7mL 마이크로튜브에 2.9g/mL type-1 콜라겐 용액을 준비합니다. 25.52μL의 5mg/mL 콜라겐 원액을 넣고 천천히 섞습니다.
    3. 세포외 기질 혼합물 제조(표 2의 ECM 혼합): 5.5μL의 0.2N pH 9 HEPES 용액을 첨가한 후 5.5μL의 10x MEM을 첨가합니다. 균일한 연한 노란색에서 연한 분홍색이 관찰될 때까지 잘 섞습니다. 35.2μL의 ECM 혼합 용액을 세포 펠릿에 옮기고 4.4μL의 기저막 매트릭스를 추가합니다.
    4. 바이오리액터 부품의 오토클레이브 백을 엽니다(단계 1.4.7, 그림 4A). 70% 에탄올로 멸균된 장갑을 착용한 상태에서 오토클레이브 백에서 검은색 베이스 플레이트를 제거하고 웰이 위를 향하도록 60mm 접시에 넣습니다. 기포가 유입되지 않도록 세포 혼합물 44μL를 각 웰에 천천히 피펫팅합니다. 필요한 경우 피펫을 사용하여 피펫팅에 의해 유입되거나 PTFE의 소수성으로 인해 형성된 기포를 제거합니다. 액체의 표면이 우물의 립과 같은 높이가 되도록 hECT의 부피를 복원합니다(그림 4BI).
    5. 멸균된 새 장갑을 착용하고 오토클레이브 백에서 PDMS 랙이 있는 폴리설폰 프레임을 제거합니다. 프레임의 끝이 베이스 플레이트 끝의 홈에 맞도록 프레임을 베이스 플레이트로 내립니다(그림 4BII, III). 60mm 접시에 넣기 전에 바이오리액터를 검사하여 기둥이 모두 직선이고 프레임이 기울어지지 않았는지 확인합니다.
    6. 심근세포 유지 배지에 10% FBS 1mL를 60mm 접시에 추가하여(hECT를 방해하지 않도록 주의) hECT가 응고됨에 따라 접시의 습도를 높입니다. 뚜껑이 없는 60mm 접시를 높은 프로파일(높이 20mm) 100mm 접시에 넣고 100mm 접시 뚜껑으로 덮은 다음 생물 반응기를 37°C, 5%CO2 인큐베이터로 되돌려 콜라겐이 현탁 세포와 함께 겔을 형성할 수 있도록 합니다.
    7. 2시간 후 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 심근세포 유지 배지에 10% FBS 13mL를 첨가하고 접시를 기울여 배지가 PTFE 베이스 플레이트와 PDMS 랙 사이를 흐르도록 합니다.
    8. PTFE 베이스 플레이트의 소수성 표면과 PDMS 랙 사이에 기포가 끼지 않도록 측면에서 바이오리액터를 검사하고 접시를 인큐베이터로 되돌립니다. 갇힌 공기가 있는 경우 바이오리액터를 배지 밖으로 기울여 기포가 끊어지도록 하고 천천히 다시 내리거나 젤 로딩 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 포스트를 방해하지 않도록 주의하면서 공기를 빼냅니다.
  3. 베이스 플레이트 제거
    1. 프레임의 틈을 통해 hECT 압축을 검사합니다. 24-96시간 동안 hECT는 압축되고 더 불투명해집니다(그림 4CI-III). hECT와 베이스 플레이트의 벽 사이에 눈에 띄는 간격이 생기면(그림 4CII) FBS가 없는 심근세포 유지 배지로 배지를 변경하기 위해 두 번의 절반 부피 배지 변경을 수행합니다. hECT가 원래 직경에 비해 30% 이상 압축되면 베이스 플레이트를 제거합니다(그림 4CIII). 액체가 접시의 가장자리와 같은 높이가 될 때까지 생물반응기가 들어 있는 60mm 접시에 심근세포 유지 배지를 채우고 새 60mm 접시에 14mL를 추가합니다.
    2. 중요 단계: 멸균 장갑을 착용한 상태에서 접시에서 생물반응기를 뒤집어 바닥판이 위에 오도록 합니다(그림 4BIV). 3.2.8단계에서와 같이 갇힌 기포가 있는지 검사합니다. 바닥판을 수평으로 유지하면서 천천히 들어 올립니다(그림 4BV).
    3. 베이스 플레이트를 제거하는 동안 hECT가 떨어져 나갔지만 베이스 플레이트에 남아 있는 경우 멸균 곡선 미세 겸자를 사용하여 hECT를 베이스 플레이트에서 60mm 접시로 옮깁니다. 집게를 사용하여 hECT의 끝을 포스트로 안내합니다. 두 번째 집게를 사용하여 포스트를 단단히 고정하고 hECT의 구멍에 끼웁니다. 필요한 경우 두 번째 게시물에 대해 반복합니다.
    4. 모든 hECT를 기둥에 부착한 상태에서 hECT가 있는 프레임을 새 60mm 접시로 옮기고 기둥이 아래를 향하도록 프레임을 놓습니다(그림 4BVI). 바이오리액터를 검사하여 hECT가 SPoT에 바로 근접한 위치에 남아 있는지 확인합니다.
    5. hECT가 표면 장력에 의해 기둥 바닥으로 밀려난 경우 한 쌍의 멸균 곡선 집게로 프레임을 안정화합니다. 프레임의 슬롯을 통해 다른 한 쌍의 집게를 삽입하고 닫은 상태로 유지합니다. 집게의 끝이 PDMS 랙을 지나 내려간 후 포스트에 도달하도록 비틀고 닫힌 팁을 사용하여 SPoT에 놓일 때까지 hECT를 포스트 끝 쪽으로 부드럽게 밉니다(그림 4BVI, 삽입).
  4. hECT 유지보수
    1. 24-48시간마다 심근세포 유지 배지로 절반 부피의 배지 교체를 수행합니다(배양 2주 후 빈도를 주당 두 번으로 줄일 수 있음).
    2. hECT가 일반적으로 3일째까지 자발적 박동 클러스터를 표시하고 5일째까지 눈에 띄는 사후 편향과 함께 조정된 박동을 표시하면 기능 측정을 시작하고 원하는 만큼 자주 반복합니다.
      참고: 7일째까지 조정된 박동을 시작하지 않은 hECT는 전혀 그렇게 할 가능성이 없습니다.
구성 요소 부피 (μL)
증류 H2O 13.442 2.9mg/mL 콜라겐 용액 "ECM 믹스" 최종 hECT 세포 혼합물
나오오 1N 0.638
PBS 10배 4.4
5mg/mL 콜라겐 스톡 25.52
0.2 N pH 9 헤페스 5.5
MEM 10개 5.5
세포 펠릿으로 옮기기 위한 ECM 혼합물의 부피 35.2
마트리겔의 부피 4.4

표 2: hECT 시약. 구성 요소는 나열된 순서대로 추가하고 얼음 위에 보관해야 합니다.

Figure 4
그림 4: 바이오리액터 조립 및 hECT 제조. (ᅡ) (I) 폴리설폰 프레임(오른쪽, 황갈색)에 장착된 두 개의 PDMS 랙(왼쪽, 하늘색). (II) PTFE 베이스 플레이트(검은색, 왼쪽)가 프레임(오른쪽)에 맞도록 각 기둥 쌍이 베이스 플레이트의 웰에 맞도록 합니다. (B) (I) 콜라겐 기반 세포외 기질에 있는 44 마이크로리터의 심근세포 현탁액을 6개의 기저판 웰 각각에 첨가한다. (II,III) PDMS 랙이 있는 프레임은 베이스 플레이트에 압입됩니다. 1-4일 후 hECT를 베이스 플레이트에서 제거할 수 있습니다. (IV) 먼저, (V) 베이스 플레이트가 프레임에서 들어 올려지기 전에 바이오리액터를 반전시킵니다. (VI) 6개의 hECT가 있는 바이오리액터의 측면도. 삽입: SPoT(삽입)를 기준으로 기둥의 hECT 위치를 보여주는 확대 보기입니다. (C) 폴리설폰 프레임의 틈을 통해 볼 수 있는 세 가지 수준의 hECT 압축([I] 낮음, [II] 중간, [III] 높음)을 보여주는 CAD 렌더링. 이 수치는 van Neste27에서 수정되었습니다. 약어: CAD = Computer-Aided Design; PDMS = 폴리디메틸실록산; PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌; SPoT = 안정적인 포스트 트래커; hECT = 인간 공학 심장 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. hECT 페이싱 장비

  1. 가열된 무대용 재킷
    1. 레이저 절단기를 사용하여 0.635cm 두께의 투명 아크릴 시트(보충 파일 3), 그림 5A-D 각 1개, 그림 5E, F 각 2개에서 아크릴 절연 재킷의 구성 요소를 절단합니다.
    2. 그림 5의 부품 (B), (C), (D) 및 (E) 중 하나를 조립하고 그림 5GI와 같이 아크릴 접착제를 사용하여 접착합니다. 상단 패널(그림 5GII)을 부착하고 접착제가 굳을 때까지 몇 시간 동안 기다린 다음 가열된 s를 밀어 넣습니다.tage 재킷 측면으로(그림 5GIII).
    3. 재킷이 제자리에 있으면 테이프를 사용하여 가열된 s의 다리 사이에 삽입물을 고정합니다.tage, 전면 패널(그림 5GIV)을 추가하여 조립을 완료합니다(그림 5GV).
  2. 흑연 전극 제작
    1. 띠톱을 사용하여 6.25mm 두께, 25mm 너비의 흑연 막대를 35mm 길이의 블록으로 자릅니다. 그런 다음 각 전극의 한쪽 끝이 13-16mm 높이이고 다른 쪽 끝이 8-10mm 높이가 되도록 각 블록을 곡선으로 세로로 자릅니다. 상단 모서리에 0.7mm 직경의 구멍 2개를 뚫습니다(그림 6AI). 종이 타월로 조각을 닦고 흑연 먼지를 제거하기 위해 20 분 동안 물에 초음파 처리합니다. 전극 사이의 거리가 일정하도록 접시 벽과 25mm 너비의 생물 반응기 사이에 전극이 쐐기를 박도록 합니다(그림 6AII).
    2. 길이 150mm x 직경 0.25mm의 강철 와이어를 전극의 구멍을 통해 끼우고 뚜껑을 닫을 수 있도록 60mm 접시의 가장자리와 100mm 접시의 벽 주위에 맞도록 구부립니다(그림 6AII).
    3. 사용 후 1-2시간 동안 증류수에 담가 흡수된 매체를 제거하고 밤새 건조시킨 다음 132°C에서 30분 동안 고압멸균하여 전극을 세척합니다. 측정을 시작하기 전에 바이오리액터의 양쪽에 하나의 전극을 놓습니다(그림 6AII). 100mm 접시 뚜껑을 닫을 수 있도록 와이어를 배치하고 바이오리액터를 인큐베이터로 되돌려 평형을 맞춥니다.

Figure 5
그림 5: 가열된 유리 스테이지를 단열하기 위한 아크릴 재킷. 유리 테이블용으로 설계된 아크릴 재킷 조각의 주요 치수를 보여주는 CAD 이미지. (A) 상단 패널에는 생물 반응기 접시가 발열체 위에 놓일 수 있도록 27cm x 18.5cm 구멍 컷아웃이 있습니다. 모서리의 주황색 직사각형은 재킷 상단과 발열체 사이의 공간을 제공하기 위해 작은 스페이서 조각의 제안된 배치를 나타냅니다. (B) 재킷의 바닥 부분에는 가열된 s의 다리를 허용하는 두 개의 컷아웃이 있습니다.tage(녹색 별표). (씨앤디) 두 개의 측면 패널이 상단 부품 아래에 맞습니다. (D) 왼쪽 패널에는 s용 3cm x 0.3cm 컷아웃(삽입)이 포함되어 있습니다.tage 전원 코드. (E) 긴 패널은 앞면과 뒷면에 맞습니다. (F) 테이블이 내부에 들어가면 틈을 메우기 위해 인서트가 추가됩니다. (G) (I) 측면 및 후면 패널을 하단 부분에 부착한 다음 (II) 상단 패널을 추가합니다. (III) 유리 테이블을 재킷 안으로 밀어 넣습니다(자홍색 화살표). (IV) 인서트는 테이블 다리 사이에 부착되고 뒷면은 상자를 닫기 위해 개구부에 맞습니다. (V) 완성된 재킷 조립. 이 수치는 van Neste27에서 수정되었습니다. 약어: CAD = Computer-Aided Design; R = 반지름; Ø = 직경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: hECT 수축의 데이터 수집. (ᅡ) (I) 흑연 막대에서 자른 전극의 사진. 자홍색 화살표는 스테인리스강 와이어를 연결하기 위한 구멍을 나타냅니다. 축척 막대 = 1cm. (II) 비스듬한 모습(왼쪽)과 상단 모습(오른쪽)은 바이오리액터에서 흑연 전극의 배치를 보여줍니다. 전극은 25mm 너비의 생물 반응기와 접시 벽 사이의 공간을 차지하여 전극 사이의 거리를 일정하게 유지합니다. 접시 뚜껑을 닫을 수 있도록 와이어가 구부러져 있습니다. (B) 층류 클린 벤치 내부의 hECT 페이싱 설정 사진 - 모든 장비는 클린 벤치의 진동 소음을 줄이기 위해 방진 테이블에 배치됩니다. 생물 반응기(자홍색 화살촉)는 재킷이 있는 가열된 스테이지에 있으며 위에서 LED 광원으로 조명됩니다. 해부 현미경은 직각 거울(주황색 별표)을 수평으로 향하게 하여 아래에서 생물 반응기를 볼 수 있으며 CCD 카메라(왼쪽)가 장착되어 있습니다. 청록색 브래킷은 폐쇄 루프 가열 스테이지 컨트롤러에 피드백을 제공하기 위해 지속적인 온도 모니터링을 위한 수조를 나타냅니다. 이 수치는 van Neste27에서 수정되었습니다. 약어: hECT = 인간 공학 심장 조직; LED = 발광 다이오드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. hECT 기능 측정

  1. 페이싱 작업 영역 설정
    1. 가열된 s를 켭니다.tage 39.5°C로 설정하고 그림 6B에 따라 층류 클린 벤치 내부의 방진 테이블에 페이싱 장비를 설정합니다. 해부 현미경을 붐 스탠드에 장착하고 유리 테이블 아래의 실험실 잭에 있는 직각 거울(그림 6B, 주황색 별표)을 가리키면 아래에서 생물 반응기를 볼 수 있습니다. 고속 CCD 카메라를 현미경에 부착하고 컴퓨터에 연결합니다. 작업 공간을 살균하기 위해 15분 동안 설정에 UV 광선을 조사합니다.
    2. 바이오리액터(그림 6B, 자홍색 화살촉)를 재킷 가열 스테이지에 놓고 위에서 듀얼 헤드 구즈넥 LED 광원으로 조명을 비춥니다(LED 램프의 넥은 광섬유 램프에 비해 본체에 더 안전하게 고정될 수 있음). 진동 테이블(및 테이블 자체)의 페이싱 장비가 층류 클린 벤치의 어떤 부분에도 닿지 않도록 하여 추가 소음을 최소화합니다.
    3. 60mm 접시 안에 미리 데워진 물로 채워진 두 번째 100mm 접시를 가열된 테이블에 추가하고(그림 6B, 청록색 브래킷) 지속적인 온도 모니터링을 위해 온도 프로브를 장착합니다. 가열된 s의 온도 설정을 조정합니다.tage 기준 접시의 온도를 36-37°C로 유지하기 위해 필요에 따라.
    4. 현미경 배율을 1.5x(또는 적절한 해상도로 hECT 전체를 시각화할 수 있는 다른 원하는 배율)로 설정합니다.
  2. 카메라 설정 조정
    1. 카메라 소프트웨어를 엽니다. 비디오 피드의 크기를 조정하여 전체 hECT를 시각화하면서 시야를 최대한 많이 자릅니다. 이렇게 하면 카메라 속도가 최대화됩니다.
    2. 캡처 속도를 초당 90프레임으로 설정합니다. 노출 시간과 광원 위치를 조정하여 시야 전반에 걸쳐 조명 조건의 균일성을 최적화하고 SPoT의 대비를 최대화합니다.
  3. 획득 소프트웨어 설정
    1. 사각 펄스 자극기를 켜고 컴퓨터에 연결합니다. 진폭이 12V이고 지속 시간이 5ms인 biphasic 펄스를 전달하도록 설정을 조정합니다.
    2. 데이터 수집 소프트웨어를 열고 "AutomatedPostTracking3.vi" 파일(보충 파일 4)을 엽니다. 로드되면 도구 모음 왼쪽에 있는 흰색 화살표를 클릭하여 프로그램을 초기화합니다(그림 7A).
    3. 가열된 스테이지에서 유리 혈구계를 사용하여 소프트웨어를 보정합니다. 도구 모음(그림 7B)에서 선 도구를 클릭하여 혈구계 표시(표시되지 않음)의 1mm를 가로질러 선을 그립니다. 거리 보정(픽셀/mm) 상자(그림 7C)에서 기준 길이(mm) 를 1로 설정한 다음 계산 버튼을 클릭합니다.
    4. 선 도구를 사용하여 조직 너비를 가로질러 선을 그려 hECT 단면적을 측정합니다. 단면적(mm^2) 상자(그림 7D)에서 1을 클릭하여 면적을 계산합니다(문헌 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,15,16,18,19,20,
      21,22,23,24,25,26,37,38)입니다. hECT의 다른 부분을 따라 반복하고 상자의 다른 두 버튼 아래에 값을 기록합니다. 출력 데이터 테이블 파일은 조직의 직경을 계산하기 위해 이 세 값의 평균을 보고합니다.
  4. hECT 기능 특성화
    1. 게시물 팁에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 임계값 스위치(그림 7E)를 켜고 SPoT(그림 7G)가 명확하게 구분되고 hECT가 수축할 때 모양이 변하지 않을 때까지 슬라이더(그림 7F)를 조정합니다.
    2. 사각형 도구를 사용하여 SpoT 중 하나(그림 7, 녹색 사각형) 주위에 사각형을 그리고 Post boundaries 상자(그림 7H) 내부의 Set 1 단추를 클릭하여 SPoT 주위의 사각형 위치를 설정하여 SPoT가 항상 사각형 경계 내에 유지되도록 합니다. 다른 게시물에 대해 반복하고 세트 2에 기록합니다.
    3. 개체 크기 설정(그림 7I)을 조정하여 프로그램이 더 작은 개체를 추적하지 않도록 합니다. 각 사각형에서 추적되는 개체 수가 일정하게 유지되는지 확인합니다. 인터페이스(그림 7J)는 추적된 물체 사이의 측정된 거리를 실시간으로 보여줍니다. 이 그래프를 사용하여 노이즈를 모니터링합니다.
    4. 파일을 저장할 디렉토리를 선택합니다(그림 7K). 다른 날짜의 데이터를 별도의 폴더에 저장합니다. 현재 조직 번호를 선택하고 설명 상자에 원하는 설명을 작성합니다.
    5. 페이싱 주파수(Hz) 헤더(그림 7L)에서 원하는 주파수 범위(최소 및 최대)와 최소에서 최대로 단계별로 이동하기 위해 원하는 간격을 나타냅니다. 전체 캡처 범위에서 hECT를 페이싱하는 경우 다양한 페이싱 주파수를 테스트하여 1:1 자극:피크 비율이 달성되는 가장 낮은 주파수를 찾고 해당 비율이 손실될 때까지 주파수를 계속 증가시킵니다. 임의의 주파수 범위(예: 0.01Hz - 0.01Hz)를 선택하고 사각 펄스 자극기 출력을 끈 상태로 유지하여 자발적 함수를 측정합니다.
    6. 오른쪽 상자에서 원하는 설정 시간( 주파수가 설정되었지만 데이터가 기록되지 않은 후 시간 간격)을 선택하여 hECT가 새 페이싱 주파수에 맞게 조정할 수 있도록 합니다. 녹음 시간(초) 및 페이싱 볼륨을 지정합니다.tage(V). 프로그램 시작 단추를 클릭하여 프로그램을 시작합니다(그림 7M).
      참고: 결과는 선택한 디렉토리에 자동으로 저장됩니다. 각 기록 후 스크립트에 데이터의 푸리에 변환이 표시되는지(그림 7N), 여기서 피크는 감지된 박동 주파수에 해당하는지 확인합니다.
    7. 원하는 경우 "여기 임계값 찾기" 프로그램을 실행하여 hECT를 자극하는 데 필요한 최소 전압을 찾습니다(그림 7O). 원하는 경우 기둥의 최대 및 최소 처짐을 계산합니다(그림 7P).

Figure 7
그림 7: 사후 편향 데이터 수집 인터페이스. (ᅡ) 소프트웨어를 실행하기 위한 버튼입니다. (B) 길이 측정 및 개체 선택을 위한 선 및 직사각형 도구가 각각 포함된 도구 모음. (C) 거리 보정 컨트롤. (D) 세 개의 다른 지점에서 hECT 단면적을 측정하기 위한 도구. (E) 임계값 설정 스위치 및 (F) 슬라이더는 비디오 피드를 실시간으로 고대비 이미지로 변환합니다. (G) 미리보기 창에 표시되는 SPoT입니다. (H) SPoT를 선택하기 위한 도구. (I) 크기별로 개체를 필터링하기 위한 슬라이더입니다. (J) 추적된 물체 사이의 측정된 거리를 실시간으로 보여주는 그래프. (K) 출력 파일을 저장할 디렉토리를 선택하는 옵션. (L) 포스트 트래킹 프로그램(M)의 주파수 범위, 주파수 간격, 녹화 시간 및 녹화 간 시간 설정 옵션을 설정합니다. (N) 마지막으로 저장된 기록의 처짐 곡선의 푸리에 변환의 그래프 출력. (O) hECT를 자극하는 데 필요한 최소 전압을 찾는 프로그램. (P) 포스트의 최대 및 최소 처짐을 계산하는 프로그램. 약어: hECT = 인간 공학 심장 조직; SPoT = 안정적인 포스트 트래커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. PDMS 랙 측정

  1. 무부하 거리
    1. hECT 제작 전에 원하는 PDMS 랙 쌍을 프레임에 장착합니다. 기능 측정을 위해 5.1단계에 설명된 페이싱 설정 및 소프트웨어를 사용하십시오. 기둥 끝에 있는 고정 SPoT를 선택합니다.
    2. 필요한 경우 광원 및/또는 임계값을 조정하여 노이즈 를 <2μm로 줄입니다. 스프레드시트의 그래프에 표시된 평균 라이브 y-값을 기록합니다.
  2. 포스트 높이 및 hECT 높이
    1. 5.2단계에 설명된 페이싱 설정에서 각진 거울과 가열된 s를 제거합니다.tag이자형. 바이오리액터를 실험실 잭에 직접 놓아 바이오리액터의 측면을 봅니다.
    2. 카메라 소프트웨어를 엽니다. 노출 시간과 광원 위치를 조정하여 시야 전체에서 조명 조건의 균일성을 최적화하고 기둥의 가시성을 최대화합니다.
    3. 데이터 수집 소프트웨어를 열고 "PostMeasurement_PB3.vi" 파일(보충 파일 5)을 엽니다. 로드되면 도구 모음 왼쪽에 있는 흰색 화살표를 클릭하여 프로그램을 초기화합니다.
    4. 유리 혈구계를 사용하여 소프트웨어를 보정합니다. 보기 창 왼쪽에 있는 수직 도구 모음에서 선 도구를 클릭하고 혈구계 표시의 1mm를 가로질러 선을 그립니다. 화면 왼쪽 하단의 거리 보정(픽셀/mm) 상자에서 기준 길이(mm)를 1로 설정한 다음 계산 버튼을 클릭합니다.
    5. 보정 필드 아래의 조직 번호 필드에 원하는 조직 번호(식별용)를 설정합니다. hECT의 왼쪽 포스트에 카메라 초점을 맞추고 포스트 사이드 상자에서 왼쪽을 선택합니다.
    6. 선 도구를 사용하여 기둥 바닥(위)에서 SPoT의 끝(아래)까지 선을 그리고 Measure Post Ht를 클릭하여 기록합니다.
    7. 포스트 바닥에서 hECT의 맨 가장자리까지 선을 그리고 Measure Tissue Top Ht를 클릭하여 기록합니다. 기둥 바닥에서 hECT의 가까운 가장자리까지 선을 그리고 조직 베이스 Ht 측정을 클릭하여 기록합니다.
    8. 이 시점에서 바이오리액터를 돌려 올바른 기둥 높이를 측정합니다. 동일한 측정값을 기록하려면 올바른 포스트 옵션을 선택하십시오. 추가 버튼을 클릭하여 스프레드시트를 측정값으로 채우고 7단계에서 사용할 hECT의 평균 높이를 자동으로 계산합니다.
    9. 조직 높이 기록이 완료되면 저장 버튼을 클릭하여 값을 텍스트 파일에 저장합니다.

7. 사용자 지정 분석 스크립트를 사용한 기능적 데이터 처리

  1. 스프레드시트 편집기에서 템플릿(보충 파일 6)을 사용하여 요약 파일을 작성합니다. 6.2단계에서 얻은 기둥 길이 및 평균 조직 높이 값을 사용합니다. 폴더에 데이터가 있는 모든 hECT가 요약 파일에 표시되는지 확인합니다. 파일 이름을 "summary #.csv"로 지정합니다. 여기서 #은 실험 기간(일)을 나타냅니다.
    알림: hECT 기능 데이터는 실험일에 따라 별도의 폴더에 있어야 합니다.
  2. AnalyzeLogsGUI 스크립트(보충 파일 7)가 포함된 폴더와 hECT 기록이 있는 폴더가 모두 경로에 추가되었는지 확인합니다.
  3. 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다. 디렉터리 표시줄 왼쪽에서 폴더 찾아보기 단추를 클릭하여 AnalyzeLogsGUI 폴더와 hECT 기능 데이터가 모두 포함된 상위 폴더로 이동합니다. 현재 창 사이드바에서 이 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Add to Path(경로에 추가) | 선택한 폴더 및 하위 폴더를 추가합니다.
  4. "AnalyzeLogsGui_SC.m" 파일을 엽니다. 편집기 탭에서 실행 버튼을 누르고 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)가 새 창에 나타날 때까지 기다립니다.
    1. 로그 선택 상자(그림 8AI)에서 디렉터리 선택 단추를 클릭하고 hECT 기능 데이터가 포함된 폴더로 이동합니다. 조직 드롭다운 메뉴에서 처리할 hECT를 선택합니다.
    2. 데이터 입력 상자(그림 8AII)의 이완기 거리 필드에 6.1단계에서 기록된 포스트 사이의 언로드된 거리를 입력합니다. 포스트 반경(mm) 필드에 0.25를 입력합니다.
    3. 해석 구속조건 상자(그림 8AIII)에서 해석에서 생략할 주파수를 선택하거나 포함할 특정 주파수를 선택합니다(쉼표로 구분). 시작 시간과 종료 시간은 기본적으로 각각 0과 −1로 설정되어 기록의 전체 길이를 처리합니다. 필요한 경우 이 값을 변경하여 녹음을 트리밍합니다.
    4. 다항식 차수(Polynomial Order) 및 프레임 크기(Frame Size)의 필터 파라미터(그림 8AIV)를 변경하여 필터링 프로세스 중 평활화 수준을 변경하고, 피크 검출 임계값(Peak Detection Threshold) 슬라이더를 변경하여 스크립트에서 인식할 수 있는 최소 피크 크기를 설정합니다.
      참고: 스크립트에는 아티팩트로 인한 높은 피크를 클리핑하는 Spike Removal 옵션이 포함되어 있습니다. 그러나 이것은 경련의 모양을 바꾸기 때문에 권장하지 않습니다. 대신 기록 트리밍을 통해 아티팩트를 제거합니다(그림 8AIII).
    5. 추가 데이터 분석 출력을 위해 추가 옵션(그림 8AV)을 사용합니다(그림 8AV). 편향 후 분석을 통해 추가 피크 감지 알고리즘 실행, 확대/축소 플롯의 y축 자동 크기 조정 을 통해 트위치 힘 곡선의 축을 자동으로 조정(그림 8B), 힘-추적 곡선을 저장 하여 각 트위치 힘 수치를 .fig 파일로 저장, 힘 시간 데이터 저장 Twitch Force 곡선 그림에 표시된 필터링된 데이터의 x 및 y 좌표를 저장합니다.
    6. Run Analysis(분석 실행)를 클릭하여 전체 녹화에서 평균화된 트위치 힘 곡선(보충 파일 8)의 속성이 포함된 .txt 파일을 생성합니다.

Figure 8
그림 8: Twitch 힘 곡선 계산. (ᅡ) 데이터 처리 소프트웨어에서 "AnalyzeLogsGUI.m" 파일을 실행하면 GUI 창이 열립니다. (I) 로그 선택 상자에서는 hECT 기능 데이터가 포함된 폴더의 디렉토리를 선택할 수 있습니다. Day Num 필드는 프로토콜 단계 7.1에서 생성된 요약 파일의 제목에서 자동으로 채워집니다. 처리할 hECT는 조직 드롭다운 메뉴를 사용하여 선택합니다. (II) 데이터 입력 상자에는 무부하 거리(프로토콜 단계 6.1에서 얻음) 및 포스트 반경(0.25mm)과 같이 hECT를 지원하는 한 쌍의 PDMS 포스트에 대한 정보가 포함되어 있습니다. (III) 분석 제약 조건 상자를 사용하면 사용자가 생략하거나 포함할 주파수를 선택하고 녹음을 트리밍할 수 있습니다. (IV) 필터 파라미터 상자에는 원시 트위치 포스 커브를 필터링하는 방법을 선택할 수 있는 옵션이 포함되어 있습니다. 다항식 차수(Polynomial Order)와 프레임 크기(Frame Size)는 필터링 과정에서 스무딩 정도를 변경합니다. Peak Detection Threshold(피크 감지 임계값) 슬라이더는 스크립트에서 인식할 수 있는 최소 피크 크기를 결정합니다. 스파이크 제거 옵션은 아티팩트로 인해 높은 피크를 클리핑합니다. (V) 추가 옵션으로는 추가 피크 감지 알고리즘을 실행하는 사후 편향 분석, 트위치 힘 곡선에 작용하는 확대/축소 플롯의 y축 자동 크기 조정, 트위치 힘 수치를 저장하는 힘-추적 곡선 저장, 플롯된 트위치 힘 데이터를 저장하는 힘-시간 데이터 저장이 있습니다. (B) 패널 A의 GUI 스크린샷에 의해 생성된 1Hz 페이스의 hECT의 30초 녹화의 트위치 포스 곡선의 예. 빨간색 트위치 힘 곡선은 AIV의 매개변수에 의해 생성된 필터링된 힘을 원시 트위치 힘 곡선에 겹쳐서 보여줍니다(AV에서 필터링되지 않은 데이터 표시 옵션을 선택하면 진한 파란색 곡선이 나타남). 약어: hECT = 인간 공학 심장 조직; GUI = 그래픽 사용자 인터페이스; PDMS = 폴리디메틸실록산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Representative Results

위의 프로토콜에 따라, 심근세포는 이전에 우리 그룹 9,15에서 사용했던 건강한 iPSC 라인에서 생성되었으며 배양 8-61일 후에 hECT로 제조되었습니다. 그림 9A는 아래에서 본 hECT의 대표 이미지를 보여주며, SPoT를 사용하지 않고(위) SPoT를 사용하지 않고(아래) 만든 것입니다. 기능 측정은 hECT 제조 후 37일에서 52일 사이에 실온(23°C) 및 생리학적 온도(36°C)에서 수행되었습니다. PDMS 랙을 제작할 때 숙련된 사용자는 6개의 포스트가 모두 손상되지 않은 상태에서 PDMS 랙에서 80%의 수율을 기대할 수 있으며, 최소 5개의 포스트(당사 실험실의 3명의 사용자 기준)에서 전체 95%의 수율을 기대할 수 있으며, 포스트 높이의 변동성은 <3%입니다.

SPoT는 PDMS 포스트의 팁에 잘 접착되지 않는 마커 잉크의 조각난 모양과 비교하여 데이터 수집 중에 추적할 수 있는 정의된 단일 형상을 제공했습니다(그림 9B 및 보충 비디오 S1)(보충 비디오 S2)27. 일부 극단적인 경우에는 추적 개체가 가려질 수도 있습니다(그림 9C, 맨 윗줄). 이러한 불규칙성은 트위칭력 곡선을 흐리게 하는 많은 노이즈를 발생시켜 10μN 미만에서 발생하는 힘의 정확한 측정을 방해합니다. 이를 수정하고 이러한 모양을 일관되게 추적하려면 일반적으로 대비와 선명도를 최적화하기 위해 조명 각도와 위치를 많이 조정해야 합니다. SPoT 형상의 어둡고 규칙적인 특성은 이 프로세스를 간소화하여 획득 시간을 약 50% 단축합니다(1Hz에서 4Hz의 일반적인 캡처 범위에서 hECT당 ~12-30분에서 5-10분으로). 또한 이 연구에서 SPoT는 광학 추적을 위한 보다 신뢰할 수 있는 형태를 제공했으며, 노이즈 감소로 인해 5μm 미만의 사후 편향을 나타내는 1μN의 낮은 전개력으로 약한 조직을 측정할 수 있을 뿐만 아니라(그림 9D) 동일한 hECT27의 측정 간 변동성을 줄일 수 있었습니다.

경험에 비추어 볼 때, 종단 실험에서 시료 손실은 일반적으로 hECTS가 반전된 PDMS 포스트의 끝에서 미끄러지기 때문에 발생합니다. hECT의 이러한 미끄러짐은 일반적으로 hECT가 조밀화되고 성숙함에 따라 베이스 플레이트에서 hECT를 제거할 때(그림 4BV, hECT 제조 후 1-4일) 또는 실험 후반부(hECT 제조 후 1-3주)에 발생합니다. hECT의 이러한 성숙은 때때로 유연한 포스트에 충분한 수동 및 능동 장력을 가하여 hECT가 포스트 끝에서 스스로 당겨지도록 하여 반대쪽 포스트 주위에 쓸모없는 조직 덩어리가 압축됩니다(그림 9E). SPoT는 그림 9G에서 정량화된 대로 hECT 손실을 방지하는 캡 형상을 제공합니다(그림 9F). 2년 동안 생성된 103개의 바이오리액터(각 바이오리액터는 시작 시 3-6개의 hECT가 있음)의 경우, SPoT가 없는 PDMS 랙은 66개의 바이오리액터에서 평균 95%의 hECT를 유지했습니다. 그러나 대부분의 바이오리액터는 조직 손실이 없었지만 일부 바이오리액터는 hECT의 30%-100%를 손실하여(종종 단일 바이오리액터가 전체 실험 그룹을 나타내는 경우) 상당한 비효율성을 초래했습니다. 이 연구에서 SPoT는 hECT 손실을 효과적으로 제거하여 37개의 바이오리액터에서 머무름율을 100%로 크게 개선했습니다(p = 0.038)27.

Figure 9
그림 9: PDMS 포스트에 SPoT를 추가하여 사후 편향 데이터 품질 개선 및 hECT 유지율 증가. (A) SPoT가 없는 경우(위) 또는 있는 hECT의 밑면 모습. (나,씨) 바이오리액터 아래에서 본 포스트에 있는 hECT의 한쪽 끝을 클로즈업한 이미지로, 오른쪽 컬럼 임계값 설정은 데이터 수집 시와 동일합니다. 빨간색 상자는 게시물 추적 소프트웨어로 추적할 수 있는 개체를 나타냅니다. (B) 마커 잉크가 있는 게시물의 추적 가능한 기준 마커와 SPoT의 비교. (C) 마커 잉크(상단 2행) 또는 SPoT(하단 2행)가 있는 포스트의 이완 및 수축된 hECT. (D) 5μm 미만의 편향에 해당하는 1μN의 전개된 힘으로 1Hz 박동으로 전기적으로 페이스를 맞춘 hECT의 트위치 힘 추적의 예(청록색: 필터링되지 않은 트레이스, 마젠타: 필터링된 트레이스). (E) SPoT가 없는 바이오리액터의 비스듬한 모습으로, hECT가 기둥 중 하나에서 미끄러져 반대쪽 기둥 주위에 조직 덩어리가 형성된 결과(청록색 화살촉). (F) 100% hECT 머무름을 보여주는 SPoT가 있는 바이오리액터 사진. (G) SPoT가 없는 PDMS 랙(각각 3-6개의 hECT가 있음)(n = 322 hECT, 66개의 바이오리액터)과 SPoT가 있는 PDMS 랙(n = 134 hECT, 37개의 바이오리액터)에 대한 바이오리액터당 조직 보유를 보여주는 점도표(베이스플레이트 제거(1-4일) 및 배양 과정 후반(4-15일) 중 조직 고장이 있는 바이오리액터의 데이터를 포함합니다. *p = 0.038; 다이아몬드는 평균을 나타냅니다. 축척 막대 = 1mm(A,C), 1cm(E). 이 수치는 van Neste27에서 수정되었습니다. 약어: hECT = 인간 공학 심장 조직; SPoT = 안정적인 포스트 트래커; GUI = 그래픽 사용자 인터페이스; PDMS = 폴리디메틸실록산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

위 방법의 적용 예로, 실온(23°C)이 아닌 생리적 온도(36°C)에서 hECT 기능을 측정하는 것의 중요성도 입증합니다. hECT 기능은 가열된 스테이지를 사용한 전류 페이싱 설정에서 확장된 배양 시간에 걸쳐 안정적인 것으로 확인되었습니다(그림 10A)27. 생리학적 온도에서의 측정과 비교했을 때, hECT는 실온에서 수축 역학이 변경되어 수축 및 이완 속도가 느려졌습니다( 그림 10B에서 피크의 기울기로 표시됨).

이 연구에서 10 개 중 1 hECT는 저체온성 수축 (발생 된 힘이 36 °C보다 23 °C에서 더 높았음)을 나타 냈지만 저주파에서만 나타 났습니다. hECT를 1.5Hz로 측정했을 때, 36°C(저체온성 수축 없음)에서 더 강한 전개력을 보였고 경련 사이의 완전한 이완(경련력 곡선의 평평한 피크 간 영역, 오른쪽 패널)을 보였지만 23°C에서 수축 사이의 불완전한 이완(피크 간 수동력 증가, 왼쪽 패널)을 보였습니다(그림 10BI). hECT가 0.75Hz로 진행되었을 때 저체온성 수축이 나타났고(그림 10BII), hECT는 23°C(왼쪽 패널)에서도 수축 사이에 완전히 이완되는 것으로 관찰되었습니다. 그러나 대부분의 hECT의 포획 범위가 온도에 따라 최소한의 겹침을 보였기 때문에 hECT 기능의 명확한 주파수 일치 비교는 어려웠습니다(그림 10C). 이는 주로 23°C(대부분 ≤1.5Hz)에서 최대 캡처 주파수가 낮고 36°C(대부분 ≥ 1.5Hz)에서 hECT의 최소 캡처 주파수가 높기 때문입니다(그림 10D). 이러한 한계는 본래 심실심근이 자발적으로 박동하지 않기 때문에 본태 심근(28°C 및 37°C에서 검사)에서는 나타나지 않는다46. 주파수 중첩을 갖는 hECT 중 하나만이 주파수 정합 저체온 수축을 나타냈다(그림 10D). 그림 10B의 경련력 곡선에서 알 수 있듯이 36°C에서 페이스를 유지한 hECT는 23°C(점선)에서 페이스를 유지했을 때보다 +dF/dt 및 -dF/dt(그림 10E, 실선)의 크기가 더 높았습니다. 저체온성 이노트로피(빨간색 선)를 나타낸 hECT에서는 낮은 힘에도 불구하고 36°C에서 수축과 이완이 훨씬 빨랐습니다. 36°C에서 페이스를 조절할 때 hECT는 더 높은 자발적 박동률(그림 10F)(쌍체 t-검정의 경우 n = 10, p = 0.000016)과 더 광범위한 포획 주파수 범위(그림 10G)(쌍체 t-검정의 경우 n = 9, p = 0.0000061)를 보이므로 4.5Hz에서 6.75Hz의 초생리학적 주파수48에서 1:1 캡처를 달성했습니다(그림 10C).

Figure 10
그림 10: 온도 의존성을 보여주는 hECT 수축 역학. (A) hECT의 트위치 포스 트레이싱은 시간 경과에 따른 기능의 안정성을 보여주기 위해 30분 동안 1Hz로 진행되었으며(상단), 삽입물(하단)은 5분 간격으로 상단을 확대하여 보여줍니다. (B) 저체온성 수축이 없는 경우와 있는 경우 각각 (I) 1.5Hz 및 (II) 0.75Hz에서 진행된 hECT의 Twitch 포스 트레이싱. 좌측 패널 트레이싱은 23°C에서, 우측 패널 트레이싱은 36°C에서 수득하였다. (C) 23°C(점선) 및 36°C(실선)에서 hECT의 힘-주파수 관계(2개의 바이오리액터에서 제조 후 37일째에 n = 6hECT, 2개의 바이오리액터에 걸쳐 제조 후 52일째에 n = 4). 각 색상은 하나의 hECT를 나타냅니다. (D) 두 온도에서 주파수 중첩을 보여주는 패널 C의 3개 hECT의 힘-주파수 관계, 그 중 하나는 주파수 일치 저체온 수축(검은색 화살촉)을 보여줍니다. 패널 D에서 동일한 hECT의 +dF/dt 및 −dF/dt는 23°C(점선) 및 36°C(실선)의 주파수에 걸쳐 표시됩니다. (F) 두 가지 온도 조건(n = 10, p = 0.000016)에서 hECT의 자발적 박동률. (G) 1:1 자극을 사용한 주파수 범위: 각 온도(n = 9, p = 0.000006.1)에서 피크 캡처(이 그래프에서 최대 캡처 주파수 - 최소 캡처 주파수로 정의된 주파수 범위). 쌍을 이룬 스튜던트 t-검정의 p-값. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 수치는 van Neste27에서 수정되었습니다. 약어: hECT = Human Engineered Cariac Tissue. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 가공된 바이오리액터 부품에 대한 CAD 파일. 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 3D 프린팅 SPoT 주조 장치용 CAD 파일. 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 가열 스테이지용 절연 아크릴 재킷용 CAD 파일. 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: hECT 편향을 추적하기 위한 AutomatedPostTracking3.vi 파일(프로토콜 단계 5.3). 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 5: 포스트 길이 및 조직 높이를 측정하기 위한 PostMeasurement_PB3.vi 파일(프로토콜 단계 6.2). 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 6: 사후 편향 데이터를 처리하는 데 사용되는 "요약 #.csv"(프로토콜 7.1단계)에 대한 템플릿입니다. 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 7: 사후 편향 데이터를 처리하기 위한 MatLab 스크립트가 포함된 AnalyzeLogsGUI 폴더(프로토콜 단계 7). 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 8: MatLab 스크립트 출력 "_datatable.txt" 파일의 변수에 대한 설명입니다. 10-24행은 기록 기간 동안 모든 피크에서 평균을 낸 트위치 힘 곡선의 매개변수화입니다(25행에 표시). 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 동영상 S1: SPoT가 있는 게시물에서 자발적으로 hECT를 때리는 동영상. 이 파일은 van Neste27에서 각색되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

문헌에 발표된 수많은 선형 공학 심장 조직 모델이 있으며, 그 중 일부는 표 1에 설명되어 있습니다. 일부 모델은 조직력의 직접 측정을 수반하지만, 이들은 전형적으로 작제물을 별도의 근육 욕조(38)로 이송할 것을 요구한다. 대부분의 모형은 PDMS 포스트 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16에 영구히 정박된 조직으로, 일반적으로 디자인됩니다 ,17,18,19,20,21,
도 22,25,26(또는 와이어(39))을 참조하면, 조직 조작의 필요성이 제거되고, 조직에 의해 생성된 힘은 엔드 앵커 특징부의 광학 추적을 통해 정확하게 계산될 수 있다. 당사 그룹 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27에서 개발한 PDMS 포스트는 중간 크기의 조직을 지원하도록 설계되었으며, 이러한 포스트는 처리량, 정확한 기능 측정 및 기본 심장 틈새의 주요 측면 유지의 균형을 유지합니다. 포스트가 너무 작아서 분할 주조 방법 10,13,14,18,19,20,21,24를 사용할 수 없었고, 통합 캡으로 인해 중요한 프로토콜 단계 1.3.2 중에 포스트가 스냅되었습니다. 캡이 없으면 hECT가 포스트에서 미끄러질 수 있습니다. 조직 머무름이 100%가 아닌 경우, 이러한 바이오리액터는 종종 hECT의 상당 부분을 손실하여 양자택일의 문제를 야기한다27. 이는 중요한 프로토콜 단계 3.3.2에서 hECT가 베이스 플레이트 웰에서 제거될 때 가장 자주 발생했습니다. hECT는 때때로 포스트의 각 끝이 hECT의 구멍을 통해 조심스럽게 끼워진 상태에서 포스트에 물리적으로 다시 조작될 수 있습니다. 이는 기술적으로 어려웠을 뿐만 아니라 후속 수축 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 중요한 손상의 원인이었습니다.

PDMS 포스트 설계에 추가된 SPoT는 더 넓은 범위의 장력을 가진 hECT 배양을 가능하게 합니다. 따라서, 낮은 압축/수동 장력의 표현형을 갖는 hECTs(예: 낮은 비근세포 함량 또는 확장성 심근병증모델4)는 SPoT로 배양 및 평가할 수 있습니다. 반대로, 캡 기하구조는 매끄러운 PDMS 포스트를 떼어내는 경향이 있는 높은 수동 장력(예를 들어, 높은 비근세포 함량 또는 손상된 이완기 이완(49)을 갖는 질병 모델)을 갖는 hECT가 제자리에 고정되도록 보장한다(27). 또한, SPoT는 두 번째 제조 단계에서 PDMS 포스트에 추가된다는 점에서 상대적으로 독특한데, 이는 상당히 작은 조직(17)을 가진 하나의 다른 모델에서만 볼 수 있다. SPoT는 이러한 별도의 제조 단계가 필요하지만 캡에 불투명한 검정색, 자석 또는 형광 비드와 같은 다양한 재료를 통합할 수 있는 기회와 함께 캡 형상을 동시에 추가할 수 있습니다. 이것들은 일부 다른 그룹에 의해 탐구되었지만 추가 제작 단계 23,25,26도 필요합니다.

이 논문의 또 다른 초점은 hECT 기능에 대한 온도의 영향을 탐구하는 것이었습니다. 심장 공학 조직은 생체 내 심장 기능의 여러 측면(예: 질병 모델링 4,8,50,51 및 약물 반응 15,21,52)을 모델링하는 데 사용되었지만, 우리가 아는 한 이러한 모델에서 온도에 따른 영향은 체계적으로 탐구되지 않았습니다. 빈도 일치 저체온증은 수많은 포유류 종(쥐 46,53,54, 흰족제비 54, 토끼55, 고양이54)뿐만 아니라 다양한 연령의 건강한 심근과 쇠약해진 인간 심근44에서 볼 수 있듯이 발달된 힘이 5배 증가하는 것으로 뚜렷하며(때로는 5배 증가) 어디에나 있다. hECT 자발적 박동률과 포획 주파수의 범위가 더 낮은 온도에서 훨씬 더 낮은 주파수로 이동했지만, 주파수에 맞는 저체온성 이노트로피가 항상 존재하는 것은 아니었다27. 성숙13,18 및 생체 복잡성56의 발전을 통해 조작된 심장 조직을 개선하려는 노력의 일환으로, 저체온성 이노트로피는 심장 생체 충실도의 벤치마크로 사용할 수 있는 천연 심장 근육의 또 다른 기능적 표현형을 제공합니다.

본래 심근의 온도 의존성에 비추어 볼 때, 그리고 본래 심장 틈새 환경을 재현하기 위한 노력의 일환으로, 공학적 조직 기능은 종종 생리적 온도에서 특징지어집니다. 그러나 무균 상태를 유지하면서 조직 기능 데이터를 수집하기 위한 일부 시스템은 가열에 도움이 되지 않기 때문에 이것이 항상 가능한 것은 아닙니다. 따라서, 상이한 온도에서 측정된 조직(또는 조직 모델) 간의 기능 비교는 적절하지 않을 수 있다. 실제로, 체외 조직 공학 분석을 위한 시험 조건의 표준화는 재생 의학(57)과 미국 식품의약국(FDA)과 같은 규제 기관(58,59)에 의해 필요한 것으로 간주된다. 본 논문에 기술된 방법들은 hECT 함수27에 대한 온도의 영향에 대한 추가 연구를 가능하게 하는 것 외에도 이러한 표준화를 달성하는 데 도움이 될 수 있다.

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Disclosures

K.D.C.는 Novoheart의 공동 창립자이자 최고 과학 책임자이며 지주 회사인 Medera Biopharmaceutical의 지분을 보유하고 있습니다. Novoheart는 이 연구의 자금 지원, 계획 또는 실행에 기여하지 않았습니다. 그러나 이 연구 결과는 잠재적으로 노보하트와 메데라에 재정적 영향을 미칠 수 있다. 다른 저자들은 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 이 방법에 대한 이전 연구에 대해 Timothy Cashman 박사를 인정합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)(R01-HL132226 및 K01 HL133424)과 Leducq Foundation International Networks of Excellence Program(CURE-PLaN)의 자금 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire McMaster Carr 6517K61 
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.7 mL Microtubes Axygen MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall) Corning 353003
10 mL Serological Pipette Drummond 6-000-010
10 N NaOH Fisher Scientific SS225-1 dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium Sigma Aldrich M0275
20 - 200 μL Micropipette Eppendorf 3123000055
200 μL MicroPipette Tips VWR 76322-150
5 mL Serological Pipette Drummond 6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon 352070
6 cm Petri Dish Corning 353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator AmScope  LED-6W 
6-Well Plates Corning 353046
90 degree angle mirror Edmund Optics 45-594
Acrylic bonding glue SCIGRIP #4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack Fisher Scientific 14-673-50
Aluminum 6061 McMaster Carr 9008K82
A-Plan 10X Objective Lens ZEISS 1020-863
Autoclave Bags Propper 21002
B-27 supplement ThermoFisher 17504044
B-27 supplement (without insulin) ThermoFisher A1895601
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810 R
Black ABS Ultimaker 2.85 mm wide
Bovine Collagen I Gibco A1064401
CHIR99021 Tocris 4423
Class II Biosafety Cabinet Labconco 3430009
Clear Acrylic Sheeting estreetplastics 1002502436 6.25 mm thick
CNC Vertical Mill Haas VF-1
Conductive Graphite Bars McMaster Carr 1763T33
Dissection microscope Olympus SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix ThermoFisher 11330032
Ethanol Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter NanoEntek E1000
EVE Cell Counting Slide NanoEntek EVS-050
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10438026
Fine Curved Forceps Fine Science Tools 11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Electron Corporation 3110 AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software Autodesk AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer Reichert 1475 0.1 mm deep
HEPES Sigma Aldrich H3784
hESC qualified matrigel Corning 354277 AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera PixelLINK P7410
Inverted Microscope Carl Zeiss Werk Axiovert 40 CFL 10X phase contrast objective
IWR-1 Selleck Chem S7086
LabView Software National Instruments 2016
Laminar flow clean bench NuAire NU-201-330 necessary for hECT functional analysis
Laptop AsusTek Strix Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine Epilog Helix 24
Magnification headset ExcelBlades 70020 Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab Mathworks Version 2019b or later AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade WPI Instruments 501839
Microscope Boom Stand Olympus SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution ThermoFisher 15140122 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations Sigma Aldrich P3813 Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller Drummond 4-000-100
PixelLINK Capture OEM PixelLINK 10.2.1.6 AKA "Camera Software"
Polysulfone McMaster Carr 86735K73 translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE) McMaster Carr 8545K176  Black, molded
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media ThermoFisher 11875135
Silicone Sheeting SMI manufacturing glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads Michael's color should withstand autoclaving
Spatula Fisher Scientific 14-373 used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator  Astro-Med / Grass Technologies S88X
Stainless Steel Razoblades GEM 62-0179-CTN preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex ThermoFisher A3349401 AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water ThermoFisher 5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit Dow DOWSIL 170 2LB KIT AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit Dow DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage Okolab H401-HG-SMU Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer Ultimaker Ultimaker 3
Thiazovivin Selleck Chem S1459
Trypan Blue NanoEntek EBT-001
Vacuum Chamber Bel-Art Parts F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw Micro-Mark 82203
Variable Speed Miniature Drill Press Micro-Mark 82959
Vibration Isolation Table Labconco 3618000
Weighing Boats VWR 10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp VWR 97035-528 AKA screw clamp

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생물 반응기 데이터 수집 공학적 심장 조직 인간 심장 조직 공학 3D 환경 세포외 기질 이세포 결합 맞춤형 설계 생물 반응기 기능 평가 장치 견고한 인간 공학 심장 조직(hECT) 모델 시스템 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포 조직 기능의 종단 측정 힘 감지 폴리디메틸실록산(PDMS) 포스트 안정 포스트 추적기(SPoT) 광학 추적

Erratum

Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 01/10/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

to:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계
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van Neste, C. C., Wiley, K. A.,… More

van Neste, C. C., Wiley, K. A., Chang, S. W., Borrello, J., Turnbull, I. C., Costa, K. D. Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues. J. Vis. Exp. (196), e64368, doi:10.3791/64368 (2023).

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