Summary
В этой рукописи описывается последовательный способ быстрого выполнения орхиэктомии и овариэктомии грызунов, выживающих грызунов.
Abstract
Передача сигналов половых гормонов играет важнейшую роль в развитии нескольких систем органов, а также в прогрессировании различных заболеваний, включая нейродегенеративные заболевания. Манипуляции с уровнями половых гормонов в мышиной модельной системе позволяют изучать их влияние на органы/ткани и в рамках прогрессирования заболевания. Орхиэктомия - хирургическое удаление яичек - и овариоэктомия - хирургическое удаление яичников - представляют собой метод истощения эндогенных половых гормонов, чтобы точный уровень гормонов мог быть обеспечен с помощью лекарств или других методов доставки. Здесь мы предлагаем быстрые и минимально инвазивные методы как орхиэктомии, так и овариоэктомии в мышиной модельной системе для снижения уровня половых гормонов. В этом протоколе подробно описывается хирургическая подготовка и иссечение яичек через мошоночный мешок, а также иссечение яичников через два разреза в правой и левой боковой тыльной стороне.
Introduction
Яички и яичники являются основными органами, ответственными за выработку половых гормонов. Каскад гормональных коммуникаций, приводящих к выработке тестостерона и эстрогена, является хорошо охарактеризованным процессом, который начинается в гипоталамусе с высвобождения гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ)1. Высвобождение ГнРГ вызывает высвобождение лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из гипофиза. Когда эти гормоны попадают в кровоток, они затем влияют на другие ткани в организме. Основной мишенью ЛГ являются яички (у мужчин) и яичники (у женщин)2. В ответ на ЛГ яички вырабатывают и высвобождают тестостерон3. Аналогично яичники вырабатывают эстроген4. В то время как эти гормоны предназначены для подготовки клеток и организма к оплодотворению и обеспечения функционирования репродуктивной системы, многие другие системы организма могут быть затронуты.
Половые гормоны связаны с несколькими физиологическими функциями. Например, эстроген помогает поддерживать гомеостаз костей, предотвращая резорбцию кости остеокластами. По этой причине овариэктомированные мышиные модели могут быть использованы для изучения физиологии заболеваний костей, таких как остеопороз 5,6,7. Тестостерон и эстроген также являются объектами исследований многих сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. В последнее время повышенная выработка тестостерона в сочетании с диетой с высоким содержанием жиров была связана с сосудистым окислительнымстрессом. В головном мозге изменения ЛГ после овариоэктомии вызвали изменения в пространственной памяти9. Снижение уровня эстрогенов после овариоэктомии также стало модельной системой для изучения гибели клеток в гиппокампе, поскольку это может индуцировать апоптоз, приводящий кдефициту памяти. Тестостерон также показал свою роль в росте почек как у мышей, так и у людей послетрансплантации почки.
Создание лишенной гормонов мышиной модели позволяет изучать половые гормоны и их гормональные каскады на различных заболеваниях или тканях. Это может быть достигнуто путем хирургического удаления яичек (орхиэктомия) или яичников (овариоэктомия). Эта процедура может быть проведена на мышах любой линии в возрасте от отъема (21 день) или в любом взрослом возрасте. Овариоэктомия выполняется самкам мышей, в то время как орхиэктомия выполняется самцам мышей. Удаляя эти органы, можнозначительно снизить уровень эстрогена и тестостерона, а также многих их производных, таких как прогестерон. Процесс выполнения орхиэктомии или овариоэктомии у мышей может быть быстрым и минимально инвазивным при правильной технике. Быстрое иссечение этих органов безопасным и эффективным способом может обеспечить быструю хирургическую обработку, сохраняя при этом минимальное количество мышей за счет 100% выживаемости при правильном выполнении. Здесь мы подробно опишем протокол быстрого иссечения яичек и яичников и продемонстрируем надлежащий послеоперационный мониторинг, чтобы исследователи могли выполнить эту операцию быстро и безопасно. Мы также включаем визуальные примеры половых органов и окружающих тканей, чтобы предоставить хирургу анатомические ориентиры при выполнении этой процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в UTSW (APN#2019-102840).
1. Мышиная орхиэктомия
- Подготовьте асептическое рабочее поле и убедитесь, что необходимые хирургические инструменты стерилизованы и легко доступны. Соблюдайте асептические методы хирургического вмешательства при выживании грызунов.
- Запишите вес самца мыши и назначьте предпочтительный метод анестезии в соответствии с рекомендациями учреждения. В этом протоколе 2% изофлуран доставлялся через прецизионный испаритель для поддержания анестезии. Перед процедурой введите обезболивающее лекарство в соответствии с рекомендациями учреждения. В этом протоколе 1,0 мг/кг бупренорфина SR и 5 мг/кг мелоксикама вводили подкожно.
- После того, как мышь находится под наркозом, прикройте глаза животного смазывающим гелем для глаз, чтобы избежать образования травмы глаза, высыхания роговицы или язвы.
- Прежде чем продолжить, убедитесь в правильности анестезии, выполнив тест на защемление пальца ноги.
- Подготовьте прооперированную область животного, прежде чем поместить его на асептическое, задрапированное операционное поле.
- Далее побрейте паховую и мошоночную области мыши с помощью ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бритье нижней части живота выше пениса позволит улучшить визуализацию во время операции. - С помощью ватного аппликатора нанесите тонкий слой крема для депиляции (см. Таблицу материалов) на кожу животного, покрывая мошонку и прилегающую область, которая только что была выбрита. Подождите 30 с и снимите крем кусочком чистой марли.
- Используйте марлевые губки, пропитанные 70% этанолом, чтобы стереть остатки крема и волосы с этой области.
ПРИМЕЧАНИЕ: 70% этанола на этом этапе помогает полностью удалить крем для депиляции. Антисептическая подготовка операционного поля проводится на этапе 1.8.
- Далее побрейте паховую и мошоночную области мыши с помощью ножниц.
- Перенесите мышь в операционную область и убедитесь, что источник тепла доступен для поддержания температуры тела животного во время операции. Поместите животное в положение лежа на спине на хирургической простыне и используйте мягкую клейкую ленту, чтобы приклеить лапки мыши к хирургическому коврику.
- Если яички поднимаются в брюшную полость, осторожно пальпируйте брюшную полость, чтобы яички опустились. Рукой в перчатке слегка надавите вниз на живот.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эту операцию легче проводить под препарированием или с использованием пары луп для увеличения увеличения. Если вы выполняете эту операцию под эндоскопом для вскрытия, найдите время, чтобы расположить мошонку мыши под полем зрения эндоскопа. Мягкую ленту можно использовать для приклеивания лапок или живота мыши к операционному полю, чтобы гарантировать, что она останется в правильном положении. - Потрите кожу хирургическим скрабом Бетадин (или аналогичным антисептическим скрабом для подготовки кожи), а затем скрабом с 70% спиртом не менее трех раз, чтобы обеспечить надлежащую дезинфекцию кожи. Для каждого скраба скрабируйте радиальными движениями наружу, чтобы сначала очищалась середина места разреза, а в последнюю очередь очищалась внешняя граница выбритой хирургической области.
- В это время наденьте стерильные хирургические перчатки. Для следующих этапов процедуры используют асептические методики. Накройте мышь стерильной хирургической простыней с небольшим разрезом (разрезанным примерно до 0,5-1 дюйма квадрата, чтобы поместиться над местом операции) поверх животного, чтобы покрыть тело тканью драпировки.
- Сделайте вентральный срединный разрез в мошонке длиной примерно 1-1,5 см с помощью лезвия хирургического скальпеля или аналогичных инструментов в соответствии с утвержденными вами рекомендациями по защите животных.
- Взявшись за разрезанный край кожи, с помощью инструмента с тупым концом отделите кожу от нижней ткани. Потратьте время на то, чтобы сделать это на боковой, верхней и нижней границах разреза.
- Изолируйте яичко, используя шпатель и щипцы, чтобы переместить разрез на коже, чтобы он был сосредоточен на одном из яичек. Если это затруднительно, вернитесь к версии 1.11 и отделите кожу от нижних слоев.
- Возьмите пару изогнутых щипцов и поместите их по обе стороны от яичка. Слегка надавите вниз, чтобы экстериоризировать яичко. Захватите тонкий, прозрачный слой мышцы, который находится на верхней части яичка, с помощью щипцов. Это кремастерная мышца. Проверка правильности мышечного слоя производится путем наблюдения за этим слоем и его циркуляцией, движущейся независимо от яичка под ним.
ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификация правильной ткани подтверждается ее прозрачностью и способностью двигаться независимо от подлежащих тканей.- Манипулируйте мышечной тканью с помощью щипцов до тех пор, пока верхушка мышцы не будет захвачена. Это должна быть самая нижняя часть, под которой расположены яички и придаток хвоста.
- Захватите кремастерную мышцу щипцами и осторожно отойдите от яичек и придатка яичка. Сделайте разрез 0,5 см через кремастерную мышцу первого яичка на его вершине с помощью небольших пружинных ножниц Vannas.
- Наложите фиксирующий зажим на задний край разрезанной кремастерной мышцы. Используйте узкую пару гемостатов или пару фиксирующих микроиглодержателей. После того, как ткань будет пережата, осторожно положите инструмент на боковую сторону мыши, чтобы сохранить ткань зажатой во время следующих процедурных шагов.
- С помощью щипцов захватите верхнюю границу разреза, сделанного на шаге 1.14. В то время как два конца кремастерной мышцы втягиваются, используйте другую пару щипцов, чтобы проникнуть внутрь полости и осторожно захватить яичко.
- Потяните его наружу через отверстие в мышце. Будьте внимательны, следите за любыми признаками поврежденных кровеносных сосудов и крови в операционном поле.
- Яичко, придаток яичка, присоединенный семенной канатик и кровеносный сосуд будут видны, когда ткани будут должным образом экстернализированы.
- Возле каудально-дорсального конца придатка яичка и яичка находится фиброзная точка прикрепления яичка к кремастерной мышце. Сверните экстериоризованную ткань в сторону, чтобы найти эту точку введения. Отрежьте его, чтобы избежать повреждения мышцы и обеспечить дальнейшую изоляцию и визуализацию тканей. Используйте две пары щипцов для выполнения техники зажима и разрыва.
- Ищите жировую ткань вокруг яичка из паховой жировой подушки. Используйте щипцы, чтобы захватить жировую комок, и осторожно потяните, чтобы сделать ее экстериоризирующей.
- Не захватывайте кровеносный сосуд, который проходит вдоль жировой комки, так как потягивание за него может привести к кровоизлиянию.
- Найдите семенной канатик, кровеносные сосуды и оставшийся жировой пакет, который находится проксимальнее экстериоризированных тканей, и используйте пару гемостатов, чтобы пережать его. Удерживая небольшое напряжение на дистальном отделе яичка, прижигают семенной канатик и кровеносные сосуды дистальнее зажима гемостата.
- После завершения медленно отпустите зажим проксимальнее прижигаемого конца и проверьте наличие признаков кровотечения. Если присутствует, повторите этот шаг. Полезно использовать щипцы для удержания мягкого натяжения на дистальном конце прижигаемой ткани.
- Дайте отрезанному культе семенного канатика втянуться обратно в тело. Возьмитесь за два отрезанных конца кремастерной мышцы и соедините их вместе. Оцените размер разреза в ткани и закройте ткань с помощью рассасывающихся швов 4-0 или 5-0. В зависимости от размера разреза потребуется 1 или 2 шва. Обрежьте концы шва до 0,5 см с помощью шовных ножниц.
- Повторите шаги 1.13-1.20 с другой стороны мошонки, чтобы удалить второе яичко.
- Подготовьтесь закрыть разрез кожи.
- Обеспечивают хороший гемостаз обеих культей тканей. Плохой гемостаз приведет к остаточному кровотечению в операционном поле. Если это произошло, локализуйте кровотечение и прижгите. Этого можно избежать медленными и осторожными манипуляциями с тканями тупыми инструментами.
- Если в операционном поле видна кровь, используйте стерилизованный аппликатор с ватным наконечником, чтобы высушить область для лучшей визуализации. Используйте шприц, чтобы закапать физиологический раствор на эту область, чтобы промыть кровь или жидкость подальше от операционного поля.
- Стяните обе стороны разреза кожи, чтобы подготовить его к закрытию. Убедитесь, что зашитые концы разрезов кремастера не выступают в разрез кожи. При необходимости дополнительно обрежьте концы шва.
- Закройте кожу.
- При использовании зажимов для ран используйте щипцы, чтобы вывернуть кожу и оттянуть ее от подлежащих тканей. Поместите один зажим для раны по центру разреза. Убедитесь, что кожа хорошо подстрижена. Если разрез слишком велик для того, чтобы один зажим для раны мог его закрыть, хирургический кожный клей может быть нанесен на верхнюю и нижнюю части разреза.
- При наложении швов необходимо наложить необходимое количество швов через кожу, не захватывая подлежащие ткани. Этот тип разреза потребует наложения 2-3 одинарных прерывистых швов с использованием нерассасывающегося шовного материала 4-0.
- Осторожно очистите кожу вокруг места операции физиологическим раствором и стерилизованным аппликатором с ватным наконечником, чтобы удалить засохшую кровь или остатки антисептического скраба.
2. Мышиная овариоэктомия
- Подготовьте асептическое рабочее поле и убедитесь, что необходимые хирургические инструменты стерилизованы и легко доступны. Соблюдайте асептические методы хирургического вмешательства при выживании грызунов.
- Запишите вес самки мыши и назначьте предпочтительный метод анестезии в соответствии с рекомендациями вашего учреждения. В этом протоколе 2% изофлуран доставлялся через прецизионный испаритель для поддержания анестезии. Перед процедурой примите обезболивающее лекарство в соответствии с рекомендациями вашего учреждения. В этом протоколе 1,0 мг/кг бупренорфина SR и 5 мг/кг мелоксикама вводили подкожно.
- Нанесите смазывающий гель на глаза животного, чтобы избежать травмы глаза, высыхания роговицы или язвы. Убедитесь, что имеется источник тепла для поддержания температуры тела животного во время операции. Обеспечьте надлежащую плоскость анестезии, проверив реакцию на защемление пальца ноги.
- Подготовьте операционную область животного перед помещением его в операционное поле.
- Аккуратно сбрейте шерсть на дорсолатеральной области спины животного с помощью машинки для стрижки. Удалите волосы в области выше верхней границы бедер и ниже нижней границы грудной клетки, а также в областях между этими ориентирами.
- С помощью ватного аппликатора нанесите слой крема для депиляции на кожу животного, покрывая только что выбритую область. Подождите 30 с и снимите крем кусочком марли, удалив мелкие волоски, которые остались.
- Используйте марлевую губку, пропитанную 70% этанолом, чтобы вытереть остатки крема и волосы с прооперированной области.
ПРИМЕЧАНИЕ: 70% этанола на этом этапе помогает полностью удалить крем для депиляции. Антисептическая подготовка операционного поля выполняется на этапе 2.5.
- Поместите животное в боковое положение (для разреза для удаления одного яичника за раз) в операционном поле и убедитесь, что источник тепла доступен. Протрите операционную область хирургическим скрабом Бетадин (или аналогичным антисептическим скрабом для подготовки кожи) с последующим использованием 70% спирта не менее трех раз, чтобы обеспечить надлежащую дезинфекцию кожи. Для каждого скраба скрабируйте радиальными движениями наружу, чтобы сначала очищалась середина разреза, а затем зачищалась внешняя граница выбритой хирургической области.
- В это время наденьте стерильные хирургические перчатки. Для следующих этапов процедуры используют асептические методики. Наденьте хирургическую простыню с небольшим разрезом (вырежьте квадрат примерно 0,5-1 дюйма в простыне, чтобы она соответствовала месту операции) на животное так, чтобы тело было покрыто драповым материалом.
- Найдите идеальное место для хирургического разреза, найдя середину между бедрами и ребрами мыши (см. рисунок 2). Захватите кожу щипцами и сделайте надрез на коже в этом месте на 1,0 см.
- Используйте инструмент с тупым концом (зонд, хирургический шпатель или гемостаты с тупым наконечником), чтобы отделить кожу от нижней мышечной ткани. Потратьте время на то, чтобы сделать это на боковой, верхней и нижней границах разреза.
- Найдите дорсолатеральную мышечную стенку живота. При необходимости удалите жировую ткань, которая находится между кожным и мышечным слоями. У половозрелых мышей эта жировая ткань более заметна. Переместите эту жировую ткань к каудальному концу мыши, обнажив мышечную стенку.
- Жировая ткань дифференцируется от брюшной стенки по цвету: жировая ткань выглядит бледно-белой и лежит более поверхностно, в то время как брюшная стенка кажется розовой и залегает глубже, чем жировая ткань.
- Захватите брюшную стенку щипцами из крысиного зуба и сделайте в ней надрез 0,5 см.
- Захватите один край этого разреза одной парой щипцов, второй парой проникните внутрь полости тела и найдите яичник, рог матки и жировую подушку. Осторожно протяните его через разрез в мышечной стенке, чтобы отделить мышцу от подлежащей ткани и экстериоризировать ее. Найдите переход между рогом матки и яичником.
- Разрежьте яичник, выполнив технику раздавливания и разрыва.
- Наложите один зажим на дистальный конец рога матки, а второй зажим расположите дистальнее первого. При сильном надавливании обоими зажимами отодвиньте более дистальный от тела, разрывая соединение между ними. Чтобы свести к минимуму кровотечение и повреждение тканей, держите проксимальный зажим неподвижным во время этого процесса и будьте осторожны, чтобы не оттянуть его от тела.
- В качестве альтернативы можно использовать прижигание. Используйте щипцы или гемостатики, чтобы пережать рог матки чуть проксимальнее желаемой точки прижигания. Используйте инструмент для прижигания, чтобы разрезать ткани.
- Осторожно и медленно отпустите проксимальный зажим и проверьте наличие признаков кровотечения.
- Дайте культе ткани отступить в полость тела. Возьмитесь за брюшную стенку и осторожно потяните вверх. Не проталкивайте культю ткани внутрь, так как это увеличивает вероятность кровотечения.
- Найдите границы разреза в мышечной стенке и сведите их вместе, чтобы подготовиться к наложению швов.
- Наложите 1-2 одинарных прерывистых шва на стенку мышц брюшной полости, используя рассасывающийся шовный материал 4-0. Обрежьте концы шва до 0,5 см с помощью шовных ножниц.
- Закройте разрез, позволив коже вернуться в свое естественное состояние покоя, а затем выверните его вверх, стараясь не зацепить подлежащие ткани или концы шовного материала. Поместите 1-2 раневых зажима на вывернутую кожу. В соответствии с рекомендациями вашего учреждения, кожа также может быть закрыта с помощью нерассасывающегося шовного материала 4-0.
- Чтобы удалить другой завязь, поменяйте положение мыши так, чтобы другая боковая сторона была обращена вверх. Будьте осторожны при смене положения мыши, чтобы не оказывать слишком сильного давления на обрезанную рану кожу, начиная с шага 2.17.
- С этой стороны повторите шаги 2,5 - 2.17.
- Осторожно очистите кожу вокруг места операции физиологическим раствором и стерилизованным аппликатором с ватным наконечником, чтобы удалить засохшую кровь или остатки антисептического скраба.
3. Послеоперационный уход
- В соответствии с рекомендациями вашего учреждения, принимайте обезболивающие препараты в течение 72 часов после операции. Задокументируйте хирургическую процедуру животного, отметив дату, время, использованный анестетик и анальгетик. В этом случае перед операцией вводят бупренорфин с медленным высвобождением и мелоксикам.
- После завершения операции животным пересадите их в чистую клетку, застеленную сухим бумажным полотенцем. Поместите эту клетку на 2/3 к источнику тепла, оставив остальные 1/3 клетки выключенными от огня. Не помещайте мышей вместе в клетку до тех пор, пока они не оправятся от анестезии.
- Дайте животному восстановить способность свободно ходить по клетке, прежде чем поместить его обратно в чистую клетку с обычной подстилкой. В это время мышей можно содержать вместе, если все они оправились от анестезии.
- В течение первых нескольких дней после операции следите за тем, чтобы влажная пища и вода были легко доступны. Положите немного увлажненного корма на дно клетки. Часто проверяйте место операции мыши и ищите любые признаки инфекции или кровотечения.
- После операции убедитесь, что мыши содержатся либо отдельно, либо с другими животными, которые прошли ту же процедуру одновременно. Мышь, выздоравливающая после операции, находящаяся в той же клетке, что и мышь без операции, может представлять опасность, и ее следует избегать.
- Для мышей, перенесших овариоэктомию и имеющих раневые зажимы на дорсолатеральных сторонах спины, удалите из клетки все места обитания грызунов-иглу, чтобы уменьшить вероятность того, что зажим для раны мыши зацепится за иглу в течение первой недели заживления.
- Продолжайте наблюдать за животным на предмет признаков инфекции, боли или хирургических осложнений каждые 12 часов в течение первых 72 часов заживления.
- Через 10-14 дней после операции удалите зажимы для раны с помощью инструмента для удаления зажимов для раны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедура, представленная здесь, выполняется на мышах в возрасте от одного до трех месяцев на фоне C57BL/6J. Самцы мышей весили 16-28 г, а самки - 14-24 г на момент процедуры. Эта процедура была оптимизирована для мышей разных возрастов, от отъема до взрослого возраста.
Хирургическая орхиэктомия включает в себя один разрез кожи в вентральном мошоночном мешке, как показано на рисунке 1А. Оба семенника удаляются по одному и разрываются через семявыносящие протоки и семенные кровеносные сосуды, в результате чего удаляется яичко и прикрепленный придаток яичка (рис. 1B). Удаленное содержимое включает яичко, придаток яичка и паховую жировую подушку, показанную на рисунке 1C. Успешное удаление яичек может быть подтверждено визуальным наблюдением за удаленными тканями и обеспечением хорошего гемостаза культи ткани перед закрытием полости тела. Успешность орхиэктомии может быть измерена путем наблюдения за хорошо выздоровевшими мышами, у которых видны зажившие места разрезов (рис. 1D). Мыши, перенесшие орхиэктомию, также продемонстрируют снижение уровня тестостерона, измеренного в сыворотке крови мышей уже через неделю после процедуры (рис. 1E).
Хирургическая двусторонняя овариоэктомия выполняется через разрезы на левой и правой спинке самок мышей (рис. 2А). Боковой разрез можно использовать, если необходимо удалить только один яичник. При таком подходе делается разрез брюшной стенки, и располагается жировая подушка яичника. Жировая подушка, яичник, яичниковый проток и дистальный рог матки, как показано на рисунке 2B, экстериоризируются с последующим отсечением дистального рога матки. Эта методика приводит к удалению яичника и яйцевода. Яичник и яичниковый проток могут быть удалены, не включая дистальный рог матки, но существует риск того, что любые оставшиеся клетки яичников будут продолжать удерживать мышь в эстральных циклах. Включение дистального рога матки гарантирует, что полный яичник и проток будут удалены, произойдет истощение половых гормонов, и у мышей больше не будет цикла. На рисунке 2С изображен пример репродуктивных органов самки мышей, вырезанных из тела. Можно наблюдать, что сами яичники намного меньше, чем окружающие ткани. Эндоскоп или лупы помогают идентифицировать эти ткани. На рисунке 2D показана анатомия яичников под препарирующим эндоскопом с удаленной тканью из маточного жирового пакета, что позволяет лучше визуализировать. Об успешности этой процедуры можно судить по наблюдению за хорошо выздоровевшими мышами, у которых видны зажившие места разрезов (рис. 2E).
Операция овариоэктомии безопасна и эффективна, если выполняется быстро и с минимальным нарушением окружающих тканей. Следование процедуре, описанной здесь, достигается за счет того, что кожа и разрез брюшной стенки расположены правильно, что позволяет быстро обнаружить ткани матки. Идентификация нижней границы грудной клетки и верхней границы костей ног гарантирует, что разрез будет выполнен рядом с интересующей тканью. Разрез, который находится примерно на полпути между нижней границей ребер и верхней границей костей голени и расположен примерно в 1,5 см латеральнее позвоночника, позволяет хорошо расположить место операции при выполнении бокового разреза (Рисунок 2A).
Подтверждение хирургической овариоэктомии показано наблюдением атрофии матки. На рисунке 2F показан рог матки, иссеченный у 6-месячной мыши, а на рисунке 2G показан рог матки у 6-месячной мыши, которая перенесла хирургическую овариоэктомию в возрасте трех месяцев. Овариэктомированный рог матки выглядит тоньше и не имеет прикрепления к яичнику на дистальном конце. Этот метод подтверждения хирургической техники эффективно показывает, что удаление яичника привело к атрофии тканей матки.
После того, как ткани были успешно идентифицированы и иссечены, операция может быть завершена закрытием ран и тщательным послеоперационным наблюдением. Правильная асептическая техника14 важна для обеспечения хороших результатов при проведении операции по выживанию. По мере того, как мышь начинает заживать после разрезов, проводится мониторинг для поиска признаков боли и хирургических осложнений. Возможным хирургическим осложнением является внутреннее кровотечение из-за прокалывания или пореза кровеносных сосудов при попытке разрезать или манипулировать тканью. Это обозначается стойким красным, покрасневшим покровом под кожей вокруг места операции. Избежать подобных осложнений можно путем правильной локализации мест разрезов и улучшения зрения хирурга с помощью хирургического микроскопа или луп. Визуальный осмотр рекомендуется проводить каждые 12 часов в течение первых трех дней после операции. Успешная операция приведет к получению чистых, заживающих ран (рис. 1D, 2E).
Рисунок 1: Орхиэктомия самцов мышей . (А) Самец мыши показан в положении лежа на спине с расположением хирургического разреза в мошоночном мешке для удаления яичка, который показан красным цветом. (B) Изображение, сделанное во время хирургической процедуры орхиэктомии, на котором точка отслоения выделена зеленым цветом. (C) Рассеченные яички, жировые комки и придатки яичка самца мыши. (D) Самец мыши с хорошо зажившей раной, прикрепленной к разрезу мошонки после орхиэктомии. (E) Концентрация тестостерона в сыворотке крови мышей в нг/мл, определяемая методом ИФА-интерполяции. Обе группы представляют собой 9-недельных мышей. Хирургическая орхиэктомия проводилась в возрасте 8 недель. N = 3 мыши в группе. Образцы были запущены в трех экземплярах. Образцы сыворотки собирали путем пункции сердца и замораживали до момента анализа. *, стр < 0,05. Полосы ошибок = SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Овариэктомия у самки мыши . (A) Самка мыши, показанная в боковом положении с местом хирургического разреза для удаления одного яичника с дорсальной боковой стороны, показана красным цветом. Выделены и другие важные анатомические ориентиры. (B) Снимок, сделанный во время операции, на котором изображены экстериоризированный яичник, яйцевод и дистальный рог матки с точкой отслоения, показанной зеленым цветом. (C) Вскрытие рогов матки, яичников и жировых отложений самки мыши. (D) Крупный план рассеченного яичника, яичникового протока и дистальной части рога матки с удалением жира из жировой подушки, что позволяет лучше визуализировать яичник. (E) Самка мыши с хорошо зажившей раной, прикрепленной к разрезу после овариоэктомии. (F) Препарированный рог матки мыши. (G) Препарированный рог матки мыши через 3 месяца после процедуры овариоэктомии, показывающий атрофию матки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Графический реферат для мышиной овариоэктомии и орхиэктомии. Наглядное изображение процедуры орхиэктомии у самцов мышей, включающей удаление яичек, и процедуры овариоэктомии, включающей удаление яичников, в результате чего получается мышиная модель с истощением половых гормонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хирургическое удаление яичек и яичников позволяет изучать физиологию мышей в условиях контролируемой гормональной депривации. Этот метод важен для многих областей науки, включая нейродегенерацию, минеральный обмен, сердечно-сосудистое и репродуктивное здоровье 15,16,17,18,19,20,21. Здесь мы подробно опишем протокол быстрого, безопасного и эффективного удаления яичников и яичек мышей с помощью операции по выживанию для истощения половых гормонов. При выполнении опытным хирургом эти процедуры могут занять всего 5 минут, что приводит к очень высокой выживаемости у мышей.
Некоторые соображения при планировании операции на мышах включают лучшее место разреза и физиологию животного. В случае орхиэктомии семенник мыши также может быть удален через брюшную полость через срединный вентральный разрез13. Эта методика не только открывает брюшную полость, но и опирается на быстрое выявление паховых жировых пакетов. Начинающим хирургам сложно быстро выполнить эту методику. Когда мыши очень молоды, жировые комки также менее развиты и, следовательно, их труднее обнаружить. Мошоночный подход, описанный в этом протоколе, является подходящим вариантом для исследователей, которые являются новичками в хирургии мышей, оперируя на маленьких молодых мышах, или которые хотят свести к минимуму вероятность нарушения других органов в брюшной полости с помощью разреза брюшной полости.
Хирургическая овариоэктомия предполагает удаление одного или обоих яичников. Как и в случае с большинством хирургических процедур, безопасные и быстрые методы обычно включают в себя как можно меньший разрез на коже и подлежащей фасции. Это позволяет уменьшить количество швов и зажимов для ран и ускорить заживление. Несмотря на то, что умение делать разрезы меньшего размера — это навык, который приходит с практикой, уверенность в расположении разреза полезна. На рисунке 2А показан пример определения наилучших точек разреза. Из-за маленькой анатомии мыши яичник будет лежать рядом с печенью, а с левой стороны мыши, рядом с селезенкой. Случайное прощупывание и потягивание этих органов может привести к нежелательному кровотечению или повреждению. Мы предоставляем подробное руководство по правильному расположению разреза и определению окружающих анатомических ориентиров, чтобы помочь в этой технике и снизить вероятность неблагоприятных осложнений.
Здесь мы приводим пример того, как эта процедура может быть использована для эффективного снижения уровня циркулирующего гормона у мышей менее чем через неделю после хирургической процедуры, а также того, как оставшаяся гонадная ткань атрофируется со временем после процедуры. Предыдущие методы и исследования подробно описывают, как это может быть сделано для создания мышиных моделей менопаузы или андропаузы, но многие из них выполняются на крысах, а не на мышах12,22. В то время как крысы и мыши имеют схожую анатомию, мышиная система имеет меньшие анатомические структуры. Здесь мы предлагаем метод, который надежно работает на моделях мышей в возрасте от 3 недель. В целом, эти два протокола представляют собой последовательный способ быстрого выполнения орхиэктомии и овариэктомии грызунов, распознавания анатомии мышей и минимизации хирургических осложнений, создавая основу для последовательных и эффективных результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Центр ресурсов для животных Юго-Западного медицинского центра Техасского университета за помощь в обучении хирургов и пересмотре протокола. Благодарим службу поддержки Wert Lab за неоценимую помощь. Эта работа была поддержана средствами Национального института здравоохранения (NIH P30EY030413). Biorender.com использовалась для создания мультипликационных схем.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
