Summary
Este manuscrito describe una forma consistente de realizar rápidamente orquiectomías y ovariectomías de supervivencia en roedores.
Abstract
La señalización de las hormonas sexuales desempeña un papel fundamental en múltiples sistemas de órganos, así como en la progresión de diversas enfermedades, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. La manipulación de los niveles de hormonas sexuales en el sistema modelo murino permite estudiar su impacto en los órganos/tejidos y en la progresión de la enfermedad. La orquiectomía (la extirpación quirúrgica de los testículos) y la ovariectomía (la extirpación quirúrgica de los ovarios) proporcionan un método para agotar las hormonas sexuales endógenas, de modo que se puedan proporcionar los niveles hormonales precisos a través de medicamentos u otros métodos de administración. Aquí, proporcionamos métodos rápidos y mínimamente invasivos tanto para la orquiectomía como para la ovariectomía en el sistema modelo murino para la reducción de hormonas sexuales. Este protocolo detalla la preparación quirúrgica y la extirpación de los testículos a través del saco escrotal, y la extirpación de los ovarios a través de dos incisiones en el dorso lateral derecho e izquierdo.
Introduction
Los testículos y los ovarios son los principales órganos responsables de la producción de hormonas sexuales. La cascada de comunicación hormonal que conduce a la producción de testosterona y estrógeno es un proceso bien caracterizado que comienza en el hipotálamo con la liberación de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH)1. La liberación de GnRH provoca la liberación de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) de la glándula pituitaria. A medida que estas hormonas ingresan al torrente sanguíneo, afectan a otros tejidos del cuerpo. El objetivo principal de la LH son los testículos (en los hombres) y los ovarios (en las mujeres)2. En respuesta a la LH, los testículos producen y liberan testosterona3. Del mismo modo, los ovarios producen estrógeno4. Si bien los efectos previstos de estas hormonas son preparar las células y el cuerpo para la fertilización y garantizar un sistema reproductivo funcional, muchos otros sistemas corporales pueden verse afectados.
Las hormonas sexuales se han relacionado con varias funciones fisiológicas. Por ejemplo, el estrógeno ayuda a mantener la homeostasis ósea al prevenir la reabsorción ósea por parte de los osteoclastos. Por esta razón, los modelos de ratón ovariectomizados se pueden utilizar para estudiar la fisiología de enfermedades óseas como la osteoporosis 5,6,7. La testosterona y el estrógeno también son objetivos de investigación para muchas enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Recientemente, la producción elevada de testosterona junto con una dieta alta en grasas se ha relacionadocon el estrés oxidativo vascular. En el cerebro, los cambios en la LH después de la ovariectomía han causado alteraciones en la memoria espacial9. La reducción de estrógenos después de la ovariectomía también se ha convertido en un sistema modelo para estudiar la muerte celular en el hipocampo, ya que esto puede inducir apoptosis, lo que resulta en déficits de memoria10. La testosterona también ha demostrado un papel en el crecimiento de los riñones tanto en modelos de ratón como en humanos después de un trasplante de riñón11.
La creación de un modelo murino privado de hormonas permite el estudio de las hormonas sexuales y sus cascadas hormonales en diversas enfermedades o tejidos. Esto se puede lograr mediante la extirpación quirúrgica de los testículos (orquiectomía) o los ovarios (ovariectomía). Este procedimiento se puede realizar en ratones de cualquier cepa cuando son tan jóvenes como la edad de destete (veintiún días) o cualquier edad adulta. La ovariectomía se realiza en ratones hembra, mientras que la orquiectomía se realiza en ratones macho. Al eliminar estos órganos, los niveles de estrógeno y testosterona, y muchos de sus derivados, como la progesterona, pueden reducirse considerablemente12,13. El proceso de realización de orquiectomías u ovariectomías en ratones puede ser rápido y mínimamente invasivo con la técnica adecuada. La escisión rápida de estos órganos de una manera segura y eficiente puede permitir un procesamiento quirúrgico rápido mientras se mantiene el número de ratones mínimo al tener una tasa de supervivencia del 100% cuando se realiza correctamente. A continuación, detallamos un protocolo para la extirpación rápida de los testículos y los ovarios y demostramos el seguimiento postquirúrgico adecuado para permitir a los investigadores realizar esta cirugía de forma rápida y segura. También incluimos ejemplos visuales de los órganos sexuales y los tejidos circundantes para proporcionar al cirujano puntos de referencia anatómicos al realizar este procedimiento.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UTSW (APN#2019-102840).
1. Orquiectomía murina
- Prepare un campo de trabajo aséptico y asegúrese de que los instrumentos quirúrgicos necesarios se hayan esterilizado y estén fácilmente disponibles. Siga las prácticas asépticas para la cirugía de supervivencia de roedores.
- Registrar el peso del ratón macho y administrar el método de anestesia preferido de acuerdo con las directrices institucionales. En este protocolo, se administró isoflurano al 2% a través de un vaporizador de precisión para mantener la anestesia. Antes del procedimiento, administre analgésicos de acuerdo con las pautas institucionales. En este protocolo, se administraron 1,0 mg/kg de buprenorfina SR y 5 mg/kg de Meloxicam por vía subcutánea.
- Una vez que el ratón esté bajo anestesia, cubra los ojos del animal con gel lubricante para los ojos para evitar la formación de lesiones oculares, desecación de la córnea o úlcera.
- Antes de continuar, asegúrese de que el plano adecuado de anestesia sea el adecuado realizando una prueba de respuesta de pellizco en los dedos de los pies.
- Prepare el área quirúrgica del animal antes de colocarlo en el campo quirúrgico aséptico y cubierto.
- A continuación, afeita las áreas inguinal y escrotal del ratón con un par de maquinillas.
NOTA: Afeitar la parte inferior del abdomen por encima del pene permitirá una mejor visualización durante la cirugía. - Con un aplicador con cinta adhesiva de algodón, aplique una capa delgada de crema depilatoria (ver Tabla de materiales) sobre la piel del animal, cubriendo el escroto y el área circundante que se acaba de afeitar. Espere 30 s y retire la crema con un trozo de gasa limpia.
- Use esponjas de gasa empapadas en etanol al 70% para limpiar cualquier resto de crema y cabello del área.
NOTA: El etanol al 70% en este paso es para ayudar en la eliminación completa de la crema depilatoria. La preparación antiséptica del sitio quirúrgico se lleva a cabo en el paso 1.8.
- A continuación, afeita las áreas inguinal y escrotal del ratón con un par de maquinillas.
- Transfiera el ratón al área quirúrgica y asegúrese de que haya una fuente de calor disponible para mantener la temperatura corporal del animal durante la operación. Coloque al animal en posición supina sobre un paño quirúrgico y use cinta adhesiva suave para adherir las patas del ratón a la alfombra quirúrgica.
- Si los testículos ascienden hacia el abdomen, palpe cuidadosamente el abdomen para que los testículos desciendan. Use una mano enguantada para aplicar una suave presión hacia abajo sobre el abdomen.
NOTA: Es más fácil realizar esta cirugía bajo un endoscopio de disección o usando un par de lupas para aumentar el aumento. Si realiza esto bajo un endoscopio de disección, tómese un momento para colocar el escroto del ratón debajo del campo visual del endoscopio. Se puede usar una cinta adhesiva suave para adherir las patas o el abdomen del ratón al campo quirúrgico para garantizar que permanezca en la ubicación correcta. - Frote la piel con el exfoliante quirúrgico Betadine (o un exfoliante antiséptico similar para la piel), seguido de un exfoliante con alcohol al 70% al menos tres veces para garantizar una desinfección adecuada de la piel. Para cada exfoliación, frote con un movimiento radial hacia afuera, de modo que primero se frote el centro del sitio de la incisión y termine con el borde exterior del área quirúrgica afeitada que se frote al final.
- En este momento, póngase guantes quirúrgicos estériles. Para los siguientes pasos del procedimiento, utilice técnicas asépticas. Cubra el ratón con un paño quirúrgico estéril con una pequeña incisión (cortada en un cuadrado de aproximadamente 0.5 a 1 pulgada para que quepa sobre el sitio quirúrgico) sobre el animal para cubrir el cuerpo con el material del paño.
- Realice una incisión en la línea media ventral en el escroto de aproximadamente 1 cm a 1,5 cm de longitud utilizando una hoja de bisturí quirúrgico o instrumentos similares siguiendo las pautas institucionales aprobadas por el bienestar animal.
- Agarrando el borde cortado de la piel, use un instrumento de punta roma para separar la piel del tejido inferior. Tómese el tiempo para hacer esto en los bordes lateral, superior e inferior de la incisión.
- Aísle un testículo usando la espátula y las pinzas para mover la incisión en la piel para centrarla en la parte superior de uno de los testículos. Si esto es difícil, regrese a 1.11 y separe aún más la piel de las capas inferiores.
- Tome un par de pinzas curvas y colóquelas a cada lado del testículo. Aplique una suave presión hacia abajo para exteriorizar el testículo. Agarra la capa delgada y transparente de músculo que está en la parte superior del testículo con unas pinzas. Este es el músculo cremaster. La verificación de la capa muscular correcta se realiza observando esta capa y su circulación, moviéndose independientemente del testículo debajo de ella.
NOTA: La identificación del tejido correcto se confirma por su transparencia y capacidad para moverse independientemente de los tejidos subyacentes.- Manipule el tejido muscular con fórceps hasta que se agarre el vértice del músculo. Esta debe ser la porción más baja, con los testículos y la cola epididimosa ubicados debajo.
- Agarre el músculo cremaster con fórceps y aléjese suavemente de los testículos y el epidídimo. Realice una incisión de 0,5 cm a través del músculo cremaster del primer testículo en su ápice con un par pequeño de tijeras de resorte Vannas.
- Coloque una abrazadera de bloqueo en el borde posterior del músculo cremaster cortado. Use un par estrecho de hemostáticos o un par de microportaagujas de bloqueo. Una vez que el tejido esté sujeto, coloque suavemente el instrumento en el lado lateral del ratón para mantener el tejido sujeto durante los siguientes pasos del procedimiento.
- Use fórceps para agarrar el borde superior de la incisión realizada en el paso 1.14. Mientras se retraen los dos extremos del músculo cremaster, use otro par de pinzas para alcanzar el interior de la cavidad y agarrar suavemente el testículo.
- Tira de él hacia afuera a través del orificio en el músculo. Tenga cuidado de estar atento a cualquier signo de vasos sanguíneos cortados y sangre en el campo quirúrgico.
- El testículo, el epidídimo, el cordón espermático adherido y el vaso sanguíneo serán evidentes cuando los tejidos se exterioricen adecuadamente.
- Cerca del extremo caudal-dorsal del epidídimo y el testículo, hay un punto fibroso de unión del testículo al músculo cremaster. Enrolle el tejido exteriorizado lateralmente para localizar este punto de inserción. Córtelo para evitar daños en el músculo y permitir un mayor aislamiento y visualización de los tejidos. Use dos pares de pinzas para realizar una técnica de pinza y desgarro.
- Busque tejido graso alrededor del testículo de la almohadilla de grasa inguinal. Use un par de pinzas para agarrar la almohadilla de grasa y tire suavemente para exteriorizarla.
- No agarre el vaso sanguíneo que viaja a lo largo de la almohadilla de grasa, ya que tirar de él puede provocar una hemorragia.
- Localice el cordón espermático, los vasos sanguíneos y la almohadilla de grasa restante que está proximal a los tejidos exteriorizados y use un par de hemostáticos para pinzarlo. Mientras mantiene una ligera tensión en el testículo distal, cauterice el cordón espermático y los vasos sanguíneos distales a la pinza hemostática.
- Una vez completado, suelte lentamente la pinza proximal al extremo cauterizado y verifique si hay signos de sangrado. Si está presente, repita este paso. Es útil usar un par de pinzas para mantener una tensión suave en el extremo distal del tejido que se va a cauterizar.
- Permita que el muñón cortado del cordón espermático se retraiga hacia el interior del cuerpo. Agarra los dos extremos cortados del músculo cremaster y júntalos. Evalúe el tamaño de la incisión en el tejido y cierre el tejido con suturas absorbibles 4-0 o 5-0. Dependiendo del tamaño de la incisión, se necesitarán 1 o 2 suturas. Recorte los extremos de la sutura a 0,5 cm con unas tijeras de sutura.
- Repita los pasos 1.13-1.20 en el otro lado del escroto para extirpar el segundo testículo.
- Prepárese para cerrar la incisión en la piel.
- Asegurar una buena hemostasia de ambos muñones de tejido. Una hemostasia deficiente dará lugar a una hemorragia residual en el campo quirúrgico. Si esto ocurre, localice el sangrado y cauterice. Esto se evita mediante una manipulación lenta y cuidadosa de los tejidos con instrumentos contundentes.
- Si se observa sangre en el campo quirúrgico, use un aplicador esterilizado con punta de algodón para secar el área y una mejor visualización. Use una jeringa para gotear solución salina sobre el área para irrigar la sangre o el líquido lejos del campo quirúrgico.
- Junte los dos lados de la incisión en la piel para prepararla para el cierre. Asegúrese de que los extremos suturados de las incisiones cremaster no sobresalgan en la incisión de la piel. Si es necesario, recorte aún más los extremos de la sutura.
- Cierre la piel.
- Si usa pinzas para heridas, use fórceps para evertir la piel y separarla del tejido subyacente. Coloque una pinza para heridas centrada sobre la incisión. Compruebe que la piel esté bien recortada. Si la incisión es un poco demasiado grande para que un clip de herida la cierre lo suficiente, se puede aplicar pegamento quirúrgico para la piel en las partes superior e inferior de la incisión.
- Si usa suturas, coloque la cantidad necesaria de suturas a través de la piel, sin agarrar el tejido subyacente. Este tipo de incisión requerirá 2-3 suturas interrumpidas simples utilizando material de sutura no absorbible 4-0.
- Limpie suavemente la piel alrededor del sitio quirúrgico con solución salina y un aplicador esterilizado con punta de algodón para eliminar la sangre seca o el exfoliante antiséptico residual.
2. Ovariectomía murina
- Prepare un campo de trabajo aséptico y asegúrese de que los instrumentos quirúrgicos necesarios se hayan esterilizado y estén fácilmente disponibles. Siga las prácticas asépticas para la cirugía de supervivencia de roedores.
- Registre el peso del ratón hembra y administre el método preferido de anestesia de acuerdo con sus pautas institucionales. En este protocolo, se administró isoflurano al 2% a través de un vaporizador de precisión para mantener la anestesia. Antes del procedimiento, administre analgésicos de acuerdo con sus pautas institucionales. En este protocolo, se administraron 1,0 mg/kg de buprenorfina SR y 5 mg/kg de Meloxicam por vía subcutánea.
- Administre gel lubricante para los ojos en los ojos del animal para evitar la formación de lesiones oculares, desecación de la córnea o úlcera. Asegúrese de que haya una fuente de calor disponible para mantener la temperatura corporal del animal durante la operación. Asegúrese de que el plano de anestesia sea el adecuado comprobando si hay una respuesta de pellizco en los dedos de los pies.
- Prepare el área quirúrgica del animal antes de colocarlo en el campo quirúrgico.
- Afeita suavemente el pelo de la región dorsolateral de la espalda del animal con una maquinilla. Retire el vello de la región por encima del borde superior de las caderas y por debajo del borde inferior de la caja torácica, así como de las áreas entre estos puntos de referencia.
- Con un aplicador con punta de algodón, aplique una capa de crema depilatoria sobre la piel del animal, cubriendo el área que acaba de afeitarse. Esperar 30 s y retirar la crema con un trozo de gasa, retirando los pelos finos que queden.
- Use una esponja de gasa empapada en etanol al 70% para limpiar cualquier resto de crema y cabello del área quirúrgica.
NOTA: El etanol al 70% en este paso es para ayudar a eliminar completamente la crema depilatoria. La preparación antiséptica del sitio quirúrgico se realiza en el paso 2.5.
- Coloque al animal en posición lateral (para la incisión para extirpar un ovario a la vez) en el campo quirúrgico y asegúrese de que haya una fuente de calor disponible. Frote el área operatoria con el exfoliante quirúrgico Betadine (o un exfoliante antiséptico similar para la piel), seguido de alcohol al 70% al menos tres veces para garantizar una desinfección adecuada de la piel. Para cada exfoliación, frote con un movimiento radial hacia afuera, de modo que primero se frote el centro de la incisión y el borde exterior del área quirúrgica afeitada al final.
- En este momento, póngase guantes quirúrgicos estériles. Para los siguientes pasos del procedimiento, utilice técnicas asépticas. Coloque un paño quirúrgico con una pequeña incisión (corte un cuadrado de aproximadamente 0.5 a 1 pulgada en el paño para que se ajuste al sitio quirúrgico) sobre el animal para que el cuerpo quede cubierto con material de cortina.
- Localice la ubicación ideal para la incisión quirúrgica encontrando el punto medio entre las caderas y las costillas del ratón (véase la figura 2). Agarre la piel con fórceps y haga una incisión de 1,0 cm en la piel en este lugar.
- Use un instrumento de punta roma (sonda, espátula quirúrgica o hemostáticos de punta roma) para separar la piel del tejido muscular inferior. Tómese el tiempo para hacer esto en los bordes lateral, superior e inferior de la incisión.
- Localiza la pared muscular dorsolateral del abdomen. Si es necesario, elimine el tejido graso que se encuentra entre la piel y las capas musculares. En ratones maduros, este tejido graso es más prominente. Mueva este tejido graso hacia el extremo caudal del ratón, exponiendo la pared muscular.
- El tejido graso se diferencia de la pared abdominal por el color: el tejido graso aparece de color blanco pálido y se encuentra más superficial, mientras que la pared abdominal aparece rosada y se encuentra más profunda que el tejido graso.
- Agarre la pared abdominal con pinzas de dientes de rata y haga una incisión de 0,5 cm en ella.
- Tome un borde de esta incisión con un par de fórceps, use un segundo par para llegar al interior de la cavidad corporal y encuentre el ovario, el cuerno uterino y la almohadilla de grasa. Tire suavemente de esto a través de la incisión en la pared muscular para separar el músculo del tejido subyacente y exteriorizarlo. Localiza la transición entre el cuerno uterino y el ovario.
- Corta el ovario realizando una técnica de aplastamiento y desgarro.
- Coloque una pinza en el extremo distal del cuerno uterino y coloque la segunda pinza justo distal a la primera. Mientras aplica una presión firme con ambas abrazaderas, aleje la más distal del cuerpo, rompiendo la conexión entre ellas. Para minimizar el sangrado y el daño tisular, mantenga la pinza proximal estacionaria durante este proceso y tenga cuidado de no separarla del cuerpo.
- Alternativamente, use un cauterio. Use un par de fórceps o hemostáticos para sujetar el cuerno uterino justo proximal al punto de cauterización deseado. Use una herramienta de cauterización para cortar los tejidos.
- Suelte suave y lentamente la pinza proximal y compruebe si hay signos de sangrado.
- Permita que el muñón de tejido se retire hacia la cavidad corporal. Agarra la pared abdominal y tira suavemente hacia arriba. No fuerce el muñón de tejido hacia adentro, ya que esto aumenta la probabilidad de sangrado.
- Ubique los bordes de la incisión en la pared muscular y júntelos para prepararse para suturarla.
- Coloque 1-2 suturas interrumpidas individuales en la pared del músculo abdominal utilizando material de sutura absorbible 4-0. Recorte los extremos de la sutura a 0,5 cm con unas tijeras de sutura.
- Cierre la incisión permitiendo que la piel vuelva a su estado de reposo natural y luego ejecútela hacia arriba, teniendo cuidado de no agarrar el tejido subyacente o los extremos del material de sutura. Coloque 1-2 pinzas para heridas en la piel evertida. De acuerdo con sus pautas institucionales, la piel también se puede cerrar con material de sutura no absorbible 4-0.
- Para extirpar el otro ovario, cambie la posición del ratón para que el otro lado lateral quede hacia arriba. Tenga cuidado al cambiar la posición del mouse para no ejercer demasiada presión sobre la piel cortada de la herida del paso 2.17.
- En este lado, repita los pasos 2.5 - 2.17.
- Limpie suavemente la piel alrededor del sitio quirúrgico con solución salina y un aplicador esterilizado con punta de algodón para eliminar la sangre seca o el exfoliante antiséptico residual.
3. Cuidados postoperatorios
- De acuerdo con sus pautas institucionales, administre analgésicos hasta 72 horas después de la operación. Documente el procedimiento quirúrgico de los animales, anotando la fecha, la hora, el anestésico y el analgésico utilizados. En este caso, la buprenorfina de liberación lenta y el meloxicam se administran antes de la operación.
- Después de completar la cirugía de los animales, transfiéralos a una jaula limpia forrada con una toalla de papel seca. Coloque esta jaula 2/3 sobre una fuente de calor, dejando el otro 1/3 de la jaula fuera del fuego. No coloque a los ratones juntos en una jaula hasta que se hayan recuperado de la anestesia.
- Permita que el animal recupere la capacidad de caminar libremente alrededor de la jaula antes de volver a colocarlo en una jaula limpia con ropa de cama normal. En este momento, los ratones pueden alojarse juntos si todos se han recuperado de la anestesia.
- Durante los primeros días después de la cirugía, asegúrese de que los alimentos y el agua húmedos sean fácilmente accesibles. Coloque un poco de comida humedecida en el fondo de la jaula. Revise con frecuencia el sitio quirúrgico del ratón y busque cualquier signo de infección o sangrado.
- Después de la cirugía, asegúrese de que los ratones se alojen solos o con otros animales que se hayan sometido al mismo procedimiento simultáneamente. Un ratón que se recupera de una cirugía ubicado en la misma jaula que uno sin cirugía puede presentar un peligro y debe evitarse.
- En el caso de los ratones que se han sometido a una ovariectomía y tienen pinzas en los lados dorsolaterales de la espalda, retire cualquier hábitat de iglú de roedores de la jaula para reducir la posibilidad de que la pinza de la herida del ratón quede atrapada en el iglú durante la primera semana de curación.
- Mantenga al animal monitoreando al animal para detectar signos de infección, dolor o complicaciones quirúrgicas cada 12 h durante las primeras 72 h del tiempo de curación.
- Retire los clips para heridas con una herramienta para quitar clips de heridas de 10 a 14 días después de la cirugía.
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Representative Results
El procedimiento presentado aquí se realiza en ratones de uno a tres meses de edad en el fondo C57BL/6J. Los ratones machos pesaban entre 16 y 28 g y las hembras entre 14 y 24 g en el momento del procedimiento. Este procedimiento se ha optimizado para ser aplicable a ratones de muchas edades, desde el destete hasta la edad adulta.
La orquiectomía quirúrgica implica una sola incisión en la piel del saco escrotal ventral, como se muestra en la Figura 1A. Ambos testículos se extirpan uno a la vez y se cortan a través de los conductos deferentes y los vasos sanguíneos espermáticos, lo que resulta en la extirpación del testículo y el epidídimo adjunto (Figura 1B). El contenido eliminado incluye el testículo, el epidídimo y la almohadilla de grasa inguinal, que se muestran en la Figura 1C. La extirpación exitosa de los testículos puede confirmarse mediante la observación visual de los tejidos extraídos y asegurando una buena hemostasia del muñón de tejido antes de cerrar la cavidad corporal. El éxito de la orquiectomía se puede medir mediante la observación de ratones bien recuperados que muestran sitios de incisión curados (Figura 1D). Los ratones que se han sometido a una orquiectomía también demostrarán una reducción en el nivel de testosterona medido en el suero de ratón tan pronto como una semana después del procedimiento (Figura 1E).
La ovariectomía bilateral quirúrgica se realiza mediante incisiones en el dorso izquierdo y derecho de ratones hembra (Figura 2A). El abordaje de la incisión lateral se puede utilizar si solo se va a extirpar un ovario. En este abordaje, se realiza una incisión en la pared abdominal y se localiza la almohadilla de grasa ovárica. La almohadilla grasa, el ovario, el conducto ovárico y el asta uterina distal, como se muestra en la Figura 2B, se exteriorizan, seguido de la extirpación del cuerno uterino distal. Esta técnica da como resultado la extirpación del ovario y el oviducto. El ovario y el conducto ovárico se pueden extirpar sin incluir el asta uterina distal, pero existe el riesgo de que las células ováricas restantes continúen manteniendo al ratón en ciclos estrales. Incluir el cuerno uterino distal asegura que se extirpen todos los ovarios y conductos, habrá un agotamiento de las hormonas sexuales y los ratones ya no tendrán ciclos. La Figura 2C muestra un ejemplo de los órganos reproductores femeninos murinos diseccionados del cuerpo. Se puede observar que los ovarios en sí son mucho más pequeños que los tejidos circundantes. Un endoscopio de disección o lupas ayuda en la identificación de estos tejidos. La figura 2D muestra la anatomía ovárica bajo un endoscopio de disección con tejido de la almohadilla de grasa uterina extraída, lo que permite una mejor visualización. El éxito de este procedimiento puede medirse mediante la observación de ratones bien recuperados que muestran sitios de incisión curados (Figura 2E).
La cirugía de ovariectomía es segura y eficaz cuando se realiza rápidamente y con una alteración mínima de los tejidos circundantes. Seguir el procedimiento descrito aquí logra esto asegurándose de que la incisión en la piel y la pared abdominal estén colocadas correctamente, lo que permite una rápida localización de los tejidos uterinos. Identificar el borde inferior de la caja torácica y el borde superior de los huesos de la pierna asegura que la incisión se realice cerca del tejido de interés. Hacer una incisión que esté aproximadamente a mitad de camino entre el borde inferior de las costillas y el borde superior de los huesos de la pierna y que esté ubicada aproximadamente 1,5 cm lateral a la columna vertebral permite un buen posicionamiento del sitio quirúrgico cuando se realiza un abordaje de incisión lateral (Figura 2A).
La confirmación de la ovariectomía quirúrgica se demuestra mediante la observación de la atrofia uterina. La Figura 2F muestra un cuerno uterino diseccionado de un ratón de 6 meses de edad, mientras que la Figura 2G muestra un cuerno uterino de un ratón de 6 meses de edad que se sometió a una ovariectomía quirúrgica a los tres meses de edad. El asta uterina ovariectomizada parece más delgada y carece de la unión al ovario en el extremo distal. Este método de confirmación de la técnica quirúrgica muestra efectivamente que la extirpación del ovario resultó en atrofia del tejido uterino.
Una vez que los tejidos han sido identificados y extirpados con éxito, la cirugía puede completarse con el cierre de las heridas y un cuidadoso seguimiento postoperatorio. Una técnica aséptica adecuada14 es importante para garantizar buenos resultados en la realización de la cirugía de supervivencia. A medida que el ratón comienza a sanar de las incisiones, se realiza un monitoreo para buscar signos de dolor y complicaciones quirúrgicas. Una posible complicación quirúrgica es la hemorragia interna debido a pinchazos o cortes en los vasos sanguíneos al intentar incidir o manipular el tejido. Esto se denota por una apariencia roja y enrojecida persistente debajo de la piel alrededor del sitio quirúrgico. Evitar complicaciones como estas se logra mediante la localización adecuada de los sitios de incisión y la ayuda a la visión del cirujano mediante el uso de un microscopio quirúrgico o lupas. Se recomienda un examen visual cada 12 horas durante los primeros tres días después de la cirugía. Una cirugía exitosa dará como resultado heridas limpias y cicatrizantes (Figura 1D, 2E).
Figura 1: Orquiectomía murina masculina . (A) Se muestra un ratón macho en posición supina con la ubicación de una incisión quirúrgica en el saco escrotal para la extirpación del testículo, que se muestra en rojo. (B) Imagen tomada durante el procedimiento quirúrgico de orquiectomía que muestra el punto de desprendimiento en verde. (C) Testículos, almohadillas de grasa y epidídimo disecados de un ratón macho. (D) Un ratón macho con una herida bien cicatrizada sobre la incisión escrotal después de la orquiectomía. (E) Concentración sérica de testosterona de ratón en ng/ml determinada por interpolación ELISA. Ambos grupos representan ratones de 9 semanas de edad. Las orquiectomías quirúrgicas se realizaron a las 8 semanas de edad. N = 3 ratones por grupo. Las muestras se analizaron por triplicado. Las muestras de suero se recogieron mediante punción cardíaca y se congelaron hasta el momento del análisis. *, p < 0,05. Barras de error = SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ovariectomía murina femenina . (A) Un ratón hembra que se muestra en posición lateral con el sitio de la incisión quirúrgica para la extirpación de un solo ovario del lado lateral dorsal, que se muestra en rojo. Se destacan otros hitos anatómicos importantes. (B) Imagen tomada durante la cirugía que muestra el ovario exteriorizado, el oviducto y el cuerno uterino distal con el punto de desprendimiento en verde. (C) Cuernos uterinos disecados, ovarios y almohadillas de grasa de una hembra de ratón. (D) Una vista de cerca del ovario disecado, el conducto ovárico y la porción distal del asta uterina con la grasa de la almohadilla de grasa extraída, lo que permite una mejor visualización del ovario. (E) Un ratón hembra con una herida bien cicatrizada sobre la incisión después de la ovariectomía. (F) Cuerno uterino de ratón disecado. (G) Cuerno uterino de ratón disecado 3 meses después del procedimiento de ovariectomía, que muestra atrofia uterina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resumen gráfico de la ovariectomía y orquiectomía murina. Una representación pictórica del procedimiento de orquiectomía para ratones machos que implica la extirpación de los testículos y el procedimiento de ovariectomía que implica la extirpación de los ovarios, los cuales dan como resultado un modelo de ratón con depleción de hormonas sexuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La extirpación quirúrgica de testículos y ovarios permite estudiar la fisiología murina bajo privación hormonal controlada. Esta técnica es importante para muchos campos de la ciencia, incluyendo la neurodegeneración, el metabolismo mineral, la salud cardiovascular y reproductiva 15,16,17,18,19,20,21. A continuación, detallamos un protocolo para la extirpación rápida, segura y eficaz de ovarios y testículos murinos mediante cirugía de supervivencia para agotar las hormonas sexuales. Cuando son realizados por un cirujano experimentado, estos procedimientos pueden durar tan solo 5 minutos, lo que resulta en una tasa de supervivencia muy alta en ratones.
Algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de planificar una cirugía con ratones son el mejor lugar de incisión y la fisiología del animal. En el caso de la orquiectomía, el testículo del ratón también puede ser extirpado a través del abdomen mediante una incisión ventral en la línea media13. Esta técnica no solo abre la cavidad peritoneal, sino que también se basa en la rápida identificación de las almohadillas de grasa inguinal. Para los cirujanos noveles, es difícil realizar rápidamente esta técnica. Cuando los ratones son muy jóvenes, las almohadillas de grasa también están menos desarrolladas y, por lo tanto, son más difíciles de localizar. El abordaje escrotal descrito en este protocolo es una opción adecuada para los investigadores que son nuevos en la cirugía de ratones, que operan en ratones pequeños y jóvenes, o que desean minimizar la posibilidad de perturbar otros órganos en la cavidad peritoneal mediante una incisión abdominal.
La ovariectomía quirúrgica implica la extirpación de uno o ambos ovarios. Al igual que para la mayoría de los procedimientos quirúrgicos, los métodos seguros y rápidos generalmente implican hacer que la incisión en la piel y la fascia subyacente sea lo más pequeña posible. Esto permite reducir las suturas y los clips de las heridas y una cicatrización más rápida. Si bien ser capaz de hacer las incisiones más pequeñas es una habilidad que viene con la práctica, tener confianza en la ubicación de la incisión es beneficioso. La Figura 2A muestra un ejemplo de cómo ubicar los mejores puntos de incisión. Debido a la anatomía del ratón pequeño, el ovario se encuentra cerca del hígado y en el lado izquierdo del ratón, cerca del bazo. Sondear y tirar accidentalmente de estos órganos puede provocar hemorragias o daños no deseados. Proporcionamos una guía detallada sobre la ubicación correcta de la incisión y la identificación de los puntos de referencia anatómicos circundantes para ayudar en esta técnica y reducir la probabilidad de complicaciones adversas.
Aquí, proporcionamos un ejemplo de cómo se puede usar este procedimiento para reducir de manera efectiva los niveles de hormonas circulantes en ratones menos de una semana después del procedimiento quirúrgico, así como también cómo el tejido gonadal restante se atrofia con el tiempo después del procedimiento. Los métodos e investigaciones anteriores detallan cómo se pueden hacer para generar modelos de ratones de menopausia o andropausia, pero muchos de estos se realizan en modelos de ratas en lugar de ratones12,22. Mientras que las ratas y los ratones tienen una anatomía similar, el sistema murino tiene estructuras anatómicas más pequeñas. Aquí, proporcionamos un método que funciona de manera confiable en modelos de ratón de tan solo 3 semanas de edad. En general, estos dos protocolos representan una forma consistente de realizar rápidamente orquiectomías y ovariectomías de supervivencia en roedores, reconocer la anatomía del ratón y minimizar las complicaciones quirúrgicas, creando una base para resultados consistentes y efectivos.
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Disclosures
Sin conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Centro de Recursos para Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas por su ayuda en la capacitación quirúrgica y la revisión del protocolo. Agradecemos al equipo de soporte de Wert Lab por su inestimable ayuda. Este trabajo ha sido apoyado por fondos del Instituto Nacional de Salud (NIH P30EY030413). Biorender.com utilizó para la creación de esquemas de dibujos animados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
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