Summary
Ce manuscrit décrit une façon cohérente d’effectuer rapidement des orchiectomies et des ovariectomies de rongeurs de survie.
Abstract
La signalisation des hormones sexuelles joue un rôle essentiel dans plusieurs systèmes d’organes ainsi que dans la progression de diverses maladies, y compris les maladies neurodégénératives. La manipulation des niveaux d’hormones sexuelles dans le système modèle murin permet d’étudier leur impact sur les organes/tissus et dans la progression de la maladie. L’orchidectomie - l’ablation chirurgicale des testicules - et l’ovariectomie - l’ablation chirurgicale des ovaires - fournissent une méthode pour épuiser les hormones sexuelles endogènes afin que les niveaux d’hormones précis puissent être fournis par des médicaments ou d’autres méthodes d’administration. Ici, nous fournissons des méthodes rapides et peu invasives pour l’orchidectomie et l’ovariectomie dans le système modèle murin pour la réduction des hormones sexuelles. Ce protocole détaille la préparation chirurgicale et l’excision des testicules à travers le sac scrotal, et l’excision des ovaires par deux incisions dans le dos latéral droit et gauche.
Introduction
Les testicules et les ovaires sont les principaux organes responsables de la production d’hormones sexuelles. La cascade de communication hormonale conduisant à la production de testostérone et d’œstrogènes est un processus bien caractérisé qui commence dans l’hypothalamus avec la libération de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH)1. La libération de GnRH provoque la libération de l’hormone lutéinisante (LH) et de l’hormone folliculo-stimulante (FSH) par l’hypophyse. Lorsque ces hormones pénètrent dans la circulation sanguine, elles affectent ensuite d’autres tissus du corps. La cible principale de la LH est les testicules (chez les hommes) et les ovaires (chez les femmes)2. En réponse à la LH, les testicules produisent et libèrent de la testostérone3. De même, les ovaires produisent de l’œstrogène4. Bien que les effets escomptés de ces hormones soient de préparer les cellules et le corps à la fécondation et d’assurer le bon fonctionnement du système reproducteur, de nombreux autres systèmes corporels peuvent être affectés.
Les hormones sexuelles ont été associées à plusieurs fonctions physiologiques. Par exemple, l’œstrogène aide à maintenir l’homéostasie osseuse en empêchant la résorption de l’os par les ostéoclastes. Pour cette raison, des modèles murins ovariectomisés peuvent être utilisés pour étudier la physiologie des maladies osseuses telles que l’ostéoporose 5,6,7. La testostérone et les œstrogènes sont également des cibles de recherche pour de nombreuses maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Récemment, une production élevée de testostérone associée à un régime riche en graisses a été liée au stress oxydatif vasculaire8. Dans le cerveau, les modifications de la LH après une ovariectomie ont provoqué des altérations de la mémoire spatiale9. La réduction des œstrogènes après une ovariectomie est également devenue un système modèle pour l’étude de la mort cellulaire dans l’hippocampe, car cela peut induire l’apoptose, entraînant des déficits de mémoire10. La testostérone a également montré un rôle dans la croissance des reins à la fois chez la souris et chez l’homme après une transplantation rénale11.
La création d’un modèle murin privé d’hormones permet d’étudier les hormones sexuelles et leurs cascades hormonales sur diverses maladies ou tissus. Cela peut être accompli par l’ablation chirurgicale des testicules (orchidectomie) ou des ovaires (ovariectomie). Cette procédure peut être effectuée chez des souris de n’importe quelle souche lorsqu’elles sont aussi jeunes que l’âge du sevrage (vingt et un jours) ou à tout âge adulte. L’ovavariectomie est pratiquée chez les souris femelles, tandis que l’orchidectomie est pratiquée chez les souris mâles. En enlevant ces organes, les niveaux d’œstrogène et de testostérone, et bon nombre de leurs dérivés, tels que la progestérone, peuvent êtreconsidérablement réduits. Le processus d’orchiectomie ou d’ovariectomie chez la souris peut être rapide et peu invasif avec la technique appropriée. L’excision rapide de ces organes de manière sûre et efficace peut permettre un traitement chirurgical rapide tout en maintenant un nombre minimal de souris en ayant un taux de survie de 100% lorsqu’il est effectué correctement. Ici, nous détaillons un protocole d’exérèse rapide des testicules et des ovaires et démontrons le suivi post-chirurgical approprié pour permettre aux chercheurs d’effectuer cette chirurgie rapidement et en toute sécurité. Nous incluons également des exemples visuels des organes sexuels et des tissus environnants pour fournir au chirurgien des repères anatomiques lors de l’exécution de cette procédure.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’UTSW (APN#2019-102840).
1. Orchidectomie murine
- Préparez un champ de travail aseptique et assurez-vous que les instruments chirurgicaux nécessaires ont été stérilisés et sont facilement accessibles. Suivez les pratiques aseptiques pour la chirurgie de survie des rongeurs.
- Enregistrez le poids de la souris mâle et administrez la méthode d’anesthésie préférée conformément aux directives de l’établissement. Dans ce protocole, 2 % d’isoflurane ont été administrés via un vaporisateur de précision pour maintenir l’anesthésie. Avant l’intervention, administrez des analgésiques conformément aux directives de l’établissement. Dans ce protocole, 1,0 mg/kg de buprénorphine SR et 5 mg/kg de méloxicam ont été administrés par voie sous-cutanée.
- Une fois que la souris est sous anesthésie, couvrez les yeux de l’animal avec un gel lubrifiant pour les yeux afin d’éviter la formation de lésions oculaires, d’une dessiccation cornéenne ou d’un ulcère.
- Avant de procéder, assurez-vous que le plan d’anesthésie est approprié en effectuant un test de réponse au pincement des orteils.
- Préparez la zone chirurgicale de l’animal avant de le placer sur le champ chirurgical aseptique et drapé.
- Ensuite, rasez les zones inguinale et scrotale de la souris à l’aide d’une paire de tondeuses.
REMARQUE : Le rasage du bas-ventre supérieur au pénis permettra une meilleure visualisation pendant la chirurgie. - À l’aide d’un applicateur collé en coton, appliquez une fine couche de crème dépilatoire (voir le tableau des matériaux) sur la peau de l’animal, en couvrant le scrotum et la zone environnante qui vient d’être rasée. Attendez 30 s et retirez la crème avec un morceau de gaze propre.
- Utilisez des éponges de gaze imbibées d’éthanol à 70 % pour essuyer la crème et les cheveux restants de la zone.
REMARQUE : 70% d’éthanol dans cette étape est pour aider à l’élimination complète de la crème dépilatoire. La préparation antiseptique du site chirurgical est effectuée à l’étape 1.8.
- Ensuite, rasez les zones inguinale et scrotale de la souris à l’aide d’une paire de tondeuses.
- Transférez la souris dans la zone chirurgicale et assurez-vous qu’une source de chaleur est disponible pour maintenir la température corporelle de l’animal pendant l’opération. Placez l’animal en décubitus dorsal sur un champ chirurgical et utilisez du ruban adhésif souple pour faire adhérer les pattes de la souris au tapis chirurgical.
- Si les testicules remontent dans l’abdomen, palpez soigneusement l’abdomen pour faire descendre les testicules. Utilisez une main gantée pour appliquer une légère pression roulante vers le bas sur l’abdomen.
REMARQUE : Il est plus facile d’effectuer cette chirurgie sous une lunette de dissection ou à l’aide d’une paire de loupes pour un grossissement accru. Si vous effectuez cette opération sous une lunette de dissection, prenez un moment pour positionner le scrotum de la souris sous le champ visuel de la lunette. Un ruban adhésif souple peut être utilisé pour coller les pattes ou l’abdomen de la souris au champ chirurgical afin de s’assurer qu’il reste dans le bon emplacement. - Frottez la peau avec un gommage chirurgical à la bétadine (ou un gommage antiseptique similaire à la préparation de la peau), suivi d’un gommage à l’alcool à 70 % au moins trois fois pour assurer une bonne désinfection de la peau. Pour chaque gommage, frottez dans un mouvement radial vers l’extérieur, de sorte que le milieu du site d’incision soit frotté en premier et se terminant par le bord extérieur de la zone chirurgicale rasée en dernier.
- À ce moment-là, mettez des gants chirurgicaux stériles. Pour les étapes suivantes de la procédure, utilisez des techniques aseptiques. Couvrez la souris avec un champ chirurgical stérile avec une petite incision (coupée à environ 0,5 à 1 pouce carré pour s’adapter au site chirurgical) sur l’animal pour couvrir le corps dans le matériau du drapeau.
- Créez une incision médiane ventrale dans le scrotum d’environ 1 cm à 1,5 cm de longueur à l’aide d’une lame de scalpel chirurgical ou d’instruments similaires en suivant les directives approuvées par l’établissement en matière de bien-être animal.
- En saisissant le bord coupé de la peau, utilisez un instrument à pointe émoussée pour séparer la peau du tissu inférieur. Prenez le temps de le faire sur les bords latéraux, supérieurs et inférieurs de l’incision.
- Isolez un testicule à l’aide de la spatule et de la pince pour déplacer l’incision dans la peau afin qu’elle soit centrée sur l’un des testicules. Si cela est difficile, revenez à 1.11 et séparez davantage la peau des couches inférieures.
- Prenez une paire de pinces courbées et placez-les de chaque côté du testicule. Appliquez une légère pression vers le bas pour extérioriser le testicule. Saisissez la fine couche transparente de muscle qui se trouve au-dessus du testicule à l’aide d’une pince. C’est le muscle crémaster. La vérification de la bonne couche musculaire se fait en observant cette couche et sa circulation, en se déplaçant indépendamment du testicule situé en dessous.
REMARQUE : L’identification du bon tissu est confirmée par sa transparence et sa capacité à se déplacer indépendamment des tissus sous-jacents.- Manipulez le tissu musculaire à l’aide d’une pince jusqu’à ce que l’apex du muscle soit saisi. Il devrait s’agir de la partie la plus basse, avec les testicules et l’épididyme de la caudale situés en dessous.
- Saisissez le muscle crémaster avec des pinces et éloignez-vous doucement des testicules et de l’épididyme. Faites une incision de 0,5 cm à travers le muscle crémaster du premier testicule à son sommet à l’aide d’une petite paire de ciseaux à ressort Vannas.
- Placez une pince de verrouillage sur le bord postérieur du muscle crémaster coupé. Utilisez une paire d’hémostatiques étroits ou une paire de porte-aiguilles micro verrouillables. Une fois le tissu serré, posez doucement l’instrument sur le côté latéral de la souris pour maintenir le tissu serré pendant les étapes procédurales suivantes.
- Utilisez une pince pour saisir le bord supérieur de l’incision pratiquée à l’étape 1.14. Pendant que les deux extrémités du muscle crémaster sont rétractées, utilisez une autre paire de pinces pour atteindre l’intérieur de la cavité et saisir doucement le testicule.
- Tirez-le vers l’extérieur à travers le trou dans le muscle. Veillez à surveiller tout signe de vaisseaux sanguins entaillés et de sang dans le champ chirurgical.
- Le testicule, l’épididyme, le cordon spermatique attaché et le vaisseau sanguin seront apparents lorsque les tissus seront correctement extériorisés.
- Près de l’extrémité caudale-dorsale de l’épididyme et du testicule, il y a un point d’attache fibreux du testicule au muscle crémaster. Roulez le tissu extériorisé latéralement pour localiser ce point d’insertion. Coupez-le pour éviter d’endommager le muscle et permettre un isolement et une visualisation plus poussés des tissus. Utilisez deux paires de pinces pour effectuer une technique de serrage et de déchirure.
- Recherchez le tissu adipeux autour du testicule à partir du coussinet adipeux inguinal. Utilisez une paire de pinces pour saisir le coussinet adipeux et tirez doucement pour l’extérioriser.
- Ne saisissez pas le vaisseau sanguin qui se déplace le long du coussinet adipeux, car tirer dessus peut entraîner une hémorragie.
- Localisez le cordon spermatique, les vaisseaux sanguins et le coussinet adipeux restant qui se trouve à proximité des tissus extériorisés et utilisez une paire d’hémostatiques pour le serrer. Tout en maintenant une légère tension sur le testicule distal, cautérisez le cordon spermatique et les vaisseaux sanguins distaux à la pince hémostatique.
- Une fois terminé, relâchez lentement la pince proximale à l’extrémité cautérisée et vérifiez s’il y a des signes de saignement. Le cas échéant, répétez cette étape. Il est utile d’utiliser une paire de pinces pour maintenir une légère tension sur l’extrémité distale du tissu cautérisé.
- Laissez le moignon sectionné du cordon spermatique se rétracter dans le corps. Saisissez les deux extrémités coupées du muscle crémaster et rapprochez-les. Évaluez la taille de la coupure dans le tissu et fermez le tissu à l’aide de sutures résorbables 4-0 ou 5-0. Selon la taille de l’incision, 1 ou 2 sutures seront nécessaires. Coupez les extrémités de la suture à 0,5 cm à l’aide de ciseaux de suture.
- Répétez les étapes 1.13-1.20 de l’autre côté du scrotum pour retirer le deuxième testicule.
- Préparez-vous à fermer l’incision cutanée.
- Assurer une bonne hémostase des deux moignons tissulaires. Une mauvaise hémostase entraînera des saignements résiduels dans le champ chirurgical. Si cela se produit, localisez le saignement et cautérisez. Ceci est évité par une manipulation lente et soigneuse des tissus avec des instruments contondants.
- Si du sang est vu dans le champ chirurgical, utilisez un applicateur stérilisé à embout de coton pour sécher la zone afin d’améliorer la visualisation. Utilisez une seringue pour faire couler une solution saline sur la zone afin d’irriguer le sang ou le liquide loin du champ chirurgical.
- Tirez les deux côtés de l’incision cutanée ensemble pour la préparer à la fermeture. Assurez-vous que les extrémités suturées des incisions cremaster ne dépassent pas de l’incision cutanée. Si nécessaire, coupez davantage les extrémités de la suture.
- Fermez la peau.
- Si vous utilisez des pinces à plaies, utilisez des pinces pour inverser la peau et l’éloigner du tissu sous-jacent. Placez une pince à plaie centrée sur l’incision. Vérifiez que la peau est bien coupée. Si l’incision est légèrement trop grande pour qu’un clip de plaie puisse la fermer suffisamment, de la colle cutanée chirurgicale peut être appliquée sur les parties supérieure et inférieure de l’incision.
- Si vous utilisez des sutures, placez le nombre nécessaire de sutures à travers la peau, sans saisir le tissu sous-jacent. Ce type d’incision nécessitera 2 à 3 sutures interrompues simples à l’aide d’un matériau de suture non résorbable 4-0.
- Nettoyez doucement la peau autour du site chirurgical avec une solution saline et un applicateur à embout en coton stérilisé pour éliminer tout sang séché ou gommage antiseptique résiduel.
2. Ovariectomie murine
- Préparez un champ de travail aseptique et assurez-vous que les instruments chirurgicaux nécessaires ont été stérilisés et sont facilement accessibles. Suivez les pratiques aseptiques pour la chirurgie de survie des rongeurs.
- Enregistrez le poids de la souris femelle et administrez la méthode d’anesthésie préférée conformément aux directives de votre établissement. Dans ce protocole, 2 % d’isoflurane ont été administrés via un vaporisateur de précision pour maintenir l’anesthésie. Avant l’intervention, administrez des analgésiques conformément aux directives de votre établissement. Dans ce protocole, 1,0 mg/kg de buprénorphine SR et 5 mg/kg de méloxicam ont été administrés par voie sous-cutanée.
- Administrez un gel lubrifiant pour les yeux sur les yeux de l’animal pour éviter la formation de lésions oculaires, d’une dessiccation cornéenne ou d’un ulcère. Assurez-vous qu’une source de chaleur est disponible pour maintenir la température corporelle de l’animal pendant l’opération. Assurez-vous que le plan d’anesthésie est approprié en vérifiant la réponse de pincement des orteils.
- Préparez la zone chirurgicale de l’animal avant de le placer dans le champ opératoire.
- Rasez délicatement les poils de la région dorsolatérale du dos de l’animal à l’aide d’une paire de tondeuses. Enlevez les poils de la région située au-dessus du bord supérieur des hanches et au-dessous du bord inférieur de la cage thoracique, ainsi que des zones situées entre ces points de repère.
- À l’aide d’un applicateur à embout de coton, appliquez une couche de crème dépilatoire sur la peau de l’animal, en recouvrant la zone qui vient d’être rasée. Attendez 30 s et retirez la crème avec un morceau de gaze, en enlevant les poils fins qui restent.
- Utilisez une éponge de gaze imbibée d’éthanol à 70 % pour essuyer la crème et les cheveux restants de la zone chirurgicale.
REMARQUE : 70% d’éthanol dans cette étape est pour aider à éliminer complètement la crème dépilatoire. La préparation antiseptique du site chirurgical est effectuée à l’étape 2.5.
- Placez l’animal en position latérale (pour l’incision afin d’enlever un ovaire à la fois) dans le champ chirurgical et assurez-vous qu’une source de chaleur est disponible. Frottez la zone opératoire avec un gommage chirurgical à la bétadine (ou un gommage antiseptique similaire pour la préparation de la peau), suivi d’alcool à 70% au moins trois fois pour assurer une bonne désinfection de la peau. Pour chaque gommage, frottez dans un mouvement radial vers l’extérieur, de sorte que le milieu de l’incision soit frotté en premier et le bord extérieur de la zone chirurgicale rasée soit frotté en dernier.
- À ce moment-là, mettez des gants chirurgicaux stériles. Pour les étapes suivantes de la procédure, utilisez des techniques aseptiques. Placez un champ chirurgical avec une petite incision (coupez un carré d’environ 0,5 à 1 pouce dans le champ pour s’adapter au site chirurgical) sur l’animal afin que le corps soit recouvert d’un tissu.
- Localisez l’emplacement idéal pour l’incision chirurgicale en trouvant le point à mi-chemin entre les hanches et les côtes de la souris (voir Figure 2). Saisissez la peau avec une pince et faites une incision de 1,0 cm dans la peau à cet endroit.
- Utilisez un instrument à pointe émoussée (sonde, spatule chirurgicale ou hémostatiques à pointe émoussée) pour séparer la peau du tissu musculaire inférieur. Prenez le temps de le faire sur les bords latéraux, supérieurs et inférieurs de l’incision.
- Localisez la paroi musculaire dorsolatérale de l’abdomen. Si nécessaire, retirez le tissu adipeux qui se trouve entre la peau et les couches musculaires. Chez les souris matures, ce tissu adipeux est plus important. Déplacez ce tissu adipeux vers l’extrémité caudale de la souris, exposant ainsi la paroi musculaire.
- Le tissu adipeux se différencie de la paroi abdominale par sa couleur : le tissu adipeux apparaît blanc pâle et se trouve plus superficiellement, tandis que la paroi abdominale apparaît rose et se trouve plus profondément que le tissu adipeux.
- Saisissez la paroi abdominale avec une pince à dents de rat et faites-y une incision de 0,5 cm.
- Saisissez un bord de cette incision avec une paire de pinces, utilisez une deuxième paire pour atteindre l’intérieur de la cavité corporelle et trouvez l’ovaire, la corne utérine et le coussinet adipeux. Tirez-le doucement à travers l’incision de la paroi musculaire pour séparer le muscle du tissu sous-jacent et l’extérioriser. Localisez la transition entre la corne utérine et l’ovaire.
- Sectionnez l’ovaire en effectuant une technique d’écrasement et de déchirure.
- Placez une pince sur l’extrémité distale de la corne utérine et placez la deuxième pince juste à l’extrémité distale de la première. Tout en appliquant une pression ferme avec les deux pinces, éloignez la plus distale du corps, en déchirant la connexion entre elles. Pour minimiser les saignements et les lésions tissulaires, gardez la pince proximale immobile pendant ce processus et veillez à ne pas l’éloigner également du corps.
- Vous pouvez également utiliser un cautère. Utilisez une pince ou des hémostatiques pour serrer la corne utérine juste à proximité du point de cautérisation souhaité. Utilisez un outil de cautérisation pour couper les tissus.
- Relâchez doucement et lentement la pince proximale et vérifiez s’il y a des signes de saignement.
- Laissez le moignon de tissu se retirer dans la cavité corporelle. Saisissez la paroi abdominale et tirez doucement vers le haut. Ne forcez pas le moignon de tissu vers l’intérieur, car cela augmente le risque de saignement.
- Localisez les bords de l’incision dans la paroi musculaire et rassemblez-les pour vous préparer à la suturer.
- Placez 1 à 2 sutures interrompues simples dans la paroi musculaire abdominale à l’aide d’un matériau de suture résorbable 4-0. Coupez les extrémités de la suture à 0,5 cm à l’aide de ciseaux de suture.
- Fermez l’incision en permettant à la peau de revenir à son état de repos naturel, puis retournez-la vers le haut, en prenant soin de ne pas saisir les tissus sous-jacents ou les extrémités du matériau de suture. Placez 1 à 2 pinces à enroulement sur la peau éversée. Sur la base des directives de votre établissement, la peau peut également être fermée à l’aide d’un matériau de suture non résorbable 4-0.
- Pour retirer l’autre ovaire, changez la position de la souris pour que l’autre côté latéral soit orienté vers le haut. Soyez doux lorsque vous changez la position de la souris afin de ne pas exercer trop de pression sur la peau coupée de la plaie à partir de l’étape 2.17.
- De ce côté, répétez les étapes 2.5 à 2.17.
- Nettoyez doucement la peau autour du site chirurgical avec une solution saline et un applicateur à embout en coton stérilisé pour éliminer tout sang séché ou gommage antiseptique résiduel.
3. Soins post-opératoires
- Selon les directives de votre établissement, administrez des analgésiques jusqu’à 72 heures après l’opération. Documentez l’intervention chirurgicale des animaux, en notant la date, l’heure, l’anesthésique et l’analgésique utilisés. Ici, la buprénorphine à libération lente et le méloxicam sont administrés en préopératoire.
- Une fois l’opération chirurgicale terminée, transférez-les dans une cage propre recouverte d’une serviette en papier sèche. Placez cette cage aux 2/3 sur une source de chaleur, en laissant l’autre 1/3 de la cage hors du feu. Ne placez pas les souris ensemble dans une cage tant qu’elles ne se sont pas remises de l’anesthésie.
- Permettez à l’animal de retrouver la capacité de se promener librement dans la cage avant de le replacer dans une cage propre avec une litière normale. À l’heure actuelle, les souris peuvent être logées ensemble si elles se sont toutes rétablies de l’anesthésie.
- Pendant les premiers jours suivant la chirurgie, assurez-vous que les aliments humides et l’eau sont facilement accessibles. Placez de la nourriture humidifiée au fond de la cage. Vérifiez fréquemment le site chirurgical de la souris et recherchez tout signe d’infection ou de saignement.
- Après la chirurgie, assurez-vous que les souris sont logées seules ou avec d’autres animaux qui ont subi la même intervention simultanément. Une souris qui se remet d’une intervention chirurgicale et qui se trouve dans la même cage qu’une souris qui n’a pas subi de chirurgie peut présenter un danger et doit être évitée.
- Pour les souris qui ont subi une ovariectomie et qui ont des clips de plaie sur les côtés dorsolatéraux du dos, retirez tous les habitats d’igloo de rongeurs de la cage pour réduire le risque que le clip de la souris se coince dans l’igloo pendant la première semaine de guérison.
- Continuez à surveiller l’animal pour détecter des signes d’infection, de douleur ou de complications chirurgicales toutes les 12 heures pendant les 72 premières heures du temps de guérison.
- Retirez les clips à l’aide d’un outil de décapage 10 à 14 jours après la chirurgie.
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Representative Results
La procédure présentée ici est réalisée chez des souris âgées d’un à trois mois dans le fond C57BL/6J. Les souris mâles pesaient de 16 à 28 g et les souris femelles pesaient de 14 à 24 g au moment de la procédure. Cette procédure a été optimisée pour être applicable aux souris de différents âges, du sevrage à l’âge adulte.
L’orchidectomie chirurgicale consiste en une seule incision cutanée dans le sac scrotal ventral, comme le montre la figure 1A. Les deux testicules sont enlevés l’un après l’autre et sont sectionnés par le canal déférent et les vaisseaux sanguins spermatiques, ce qui entraîne l’ablation du testicule et de l’épididyme attaché (Figure 1B). Le contenu retiré comprend le testicule, l’épididyme et le coussinet adipeux inguinal, illustrés à la figure 1C. L’ablation réussie des testicules peut être confirmée par l’observation visuelle des tissus enlevés et par l’assurance d’une bonne hémostase du moignon tissulaire avant la fermeture de la cavité corporelle. Le succès de l’orchidectomie peut être mesuré par l’observation de souris bien récupérées qui présentent des sites d’incision cicatrisés (Figure 1D). Les souris qui ont subi une orchidectomie présenteront également une réduction du niveau de testostérone mesuré dans le sérum de souris dès une semaine après l’intervention (Figure 1E).
L’ovariectomie bilatérale chirurgicale est réalisée par des incisions dans le dos gauche et droit des souris femelles (Figure 2A). L’approche par incision latérale peut être utilisée si un seul ovaire doit être enlevé. Dans cette approche, la paroi abdominale est incisée et le coussinet adipeux ovarien est situé. Le coussinet adipeux, l’ovaire, le canal ovarien et la corne utérine distale, comme illustré à la figure 2B, sont extériorisés, suivis de la section de la corne utérine distale. Cette technique entraîne l’ablation de l’ovaire et de l’oviducte. L’ovaire et le canal ovarien peuvent être enlevés sans inclure la corne utérine distale, mais il existe un risque que les cellules ovariennes restantes continuent à maintenir la souris dans des cycles œstrals. L’inclusion de la corne utérine distale garantit que l’ovaire et le canal complets sont enlevés, qu’il y aura un épuisement des hormones sexuelles et que les souris n’auront plus de cycle. La figure 2C représente un exemple d’organes reproducteurs féminins murins disséqués hors du corps. On peut observer que les ovaires eux-mêmes sont beaucoup plus petits que les tissus environnants. Une lunette de dissection ou une loupe aide à l’identification de ces tissus. La figure 2D montre l’anatomie ovarienne sous une lunette de dissection avec le tissu du coussinet adipeux utérin retiré, ce qui permet une meilleure visualisation. Le succès de cette procédure peut être mesuré par l’observation de souris bien récupérées qui présentent des sites d’incision cicatrisés (Figure 2E).
La chirurgie de l’ovarectomie est sûre et efficace lorsqu’elle est effectuée rapidement et avec une perturbation minimale des tissus environnants. En suivant la procédure décrite ici, vous vous assurez que la peau et l’incision de la paroi abdominale sont correctement positionnées, ce qui permet une localisation rapide des tissus utérins. L’identification du bord inférieur de la cage thoracique et du bord supérieur des os de la jambe permet de s’assurer que l’incision est pratiquée près du tissu d’intérêt. La réalisation d’une incision qui se trouve à peu près à mi-chemin entre le bord inférieur des côtes et le bord supérieur des os de la jambe et qui est située à environ 1,5 cm latéralement de la colonne vertébrale permet un bon positionnement du site chirurgical lors de l’exécution d’une approche d’incision latérale (Figure 2A).
La confirmation de l’ovariectomie chirurgicale est démontrée par l’observation de l’atrophie utérine. La figure 2F montre une corne utérine disséquée d’une souris âgée de 6 mois, tandis que la figure 2G montre une corne utérine d’une souris de 6 mois qui a subi une ovariectomie chirurgicale à l’âge de trois mois. La corne utérine ovariectomisée semble plus mince et n’a pas d’attache à l’ovaire à l’extrémité distale. Cette méthode de confirmation de la technique chirurgicale montre effectivement que l’ablation de l’ovaire a entraîné une atrophie du tissu utérin.
Une fois que les tissus ont été identifiés et excisés avec succès, la chirurgie peut être complétée par la fermeture des plaies et une surveillance postopératoire attentive. Une technique d’asepsie appropriée14 est importante pour assurer de bons résultats lors de la chirurgie de survie. Au fur et à mesure que la souris commence à guérir des incisions, une surveillance est effectuée pour rechercher des signes de douleur et de complications chirurgicales. Une complication chirurgicale possible est une hémorragie interne due à la piqûre ou à l’entaille des vaisseaux sanguins lors de la tentative d’inciser ou de manipuler le tissu. Ceci est indiqué par un aspect rouge persistant et rougi sous la peau autour du site chirurgical. Pour éviter de telles complications, il faut bien localiser les sites d’incision et aider la vision du chirurgien à l’aide d’un microscope chirurgical ou de loupes. Un examen visuel est recommandé toutes les 12 heures pendant les trois premiers jours suivant la chirurgie. Une intervention chirurgicale réussie se traduira par des plaies propres et cicatrisantes (Figure 1D, 2E).
Figure 1 : Orchidectomie murine masculine. (A) Une souris mâle est représentée en décubitus dorsal avec l’emplacement d’une incision chirurgicale dans le sac scrotal pour l’ablation du testicule, qui est indiqué en rouge. (B) Image prise lors de l’intervention chirurgicale d’orchidectomie montrant le point de décollement en vert. (C) Testicules, coussinets adipeux et épididymes disséqués d’une souris mâle. (D) Une souris mâle avec une plaie bien cicatrisée se clipse sur l’incision du scrotum après une orchidectomie. (E) Concentration sérique de testostérone chez la souris en ng/mL déterminée par interpolation ELISA. Les deux groupes représentent des souris âgées de 9 semaines. Les orchidectomies chirurgicales ont été réalisées à l’âge de 8 semaines. N = 3 souris par groupe. Les échantillons ont été analysés en trois exemplaires. Des échantillons de sérum ont été prélevés par ponction cardiaque et congelés jusqu’au moment de l’analyse. *, p < 0,05. Barres d’erreur = SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Ovariectomie chez la femme chez la souris. (A) Une souris femelle représentée en position latérale avec le site d’incision chirurgicale pour l’ablation d’un seul ovaire de la face latérale dorsale, représentée en rouge. D’autres repères anatomiques importants sont mis en évidence. (B) Image prise lors de la chirurgie montrant l’ovaire extériorisé, l’oviducte et la corne utérine distale avec le point de décollement en vert. (C) Disséquer les cornes utérines, les ovaires et les coussinets adipeux d’une souris femelle. (D) Une vue rapprochée de l’ovaire, du canal ovarien et de la partie distale de la corne utérine disséqués avec la graisse du coussinet adipeux enlevée, permettant une meilleure visualisation de l’ovaire. (E) Une souris femelle avec une plaie bien cicatrisée se clipse sur l’incision après l’ovariectomie. (F) Corne utérine de souris disséquée. (G) Corne utérine de souris disséquée 3 mois après l’ovariectomie, montrant une atrophie utérine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résumé graphique de l’ovariectomie et de l’orchidectomie chez la souris. Une représentation picturale de la procédure d’orchidectomie pour les souris mâles impliquant l’ablation du testicule et la procédure d’ovariectomie impliquant l’ablation des ovaires, qui aboutissent toutes deux à un modèle de souris appauvri en hormones sexuelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’ablation chirurgicale des testicules et des ovaires permet d’étudier la physiologie murine en privation hormonale contrôlée. Cette technique est importante pour de nombreux domaines scientifiques, notamment la neurodégénérescence, le métabolisme minéral, le système cardiovasculaire et la santé reproductive 15,16,17,18,19,20,21. Ici, nous détaillons un protocole pour l’ablation rapide, sûre et efficace des ovaires et des testicules murins à l’aide d’une chirurgie de survie pour épuiser les hormones sexuelles. Lorsqu’elles sont effectuées par un chirurgien expérimenté, ces procédures peuvent prendre aussi peu que 5 minutes, ce qui entraîne un taux de survie très élevé chez la souris.
Parmi les éléments à prendre en compte lors de la planification d’une chirurgie chez la souris, citons le meilleur site d’incision et la physiologie de l’animal. Dans le cas d’une orchidectomie, le testicule de souris peut également être enlevé par l’abdomen par une incision ventrale médiane13. Cette technique permet non seulement d’ouvrir la cavité péritonéale, mais repose également sur l’identification rapide des coussinets adipeux inguinaux. Pour les nouveaux chirurgiens, il est difficile d’effectuer rapidement cette technique. Lorsque les souris sont très jeunes, les coussinets adipeux sont également moins développés et, par conséquent, plus difficiles à localiser. L’approche scrotale décrite dans ce protocole est une option appropriée pour les chercheurs qui débutent dans la chirurgie de la souris, qui opèrent sur de petites souris jeunes ou qui souhaitent minimiser le risque de perturber d’autres organes de la cavité péritonéale par une incision abdominale.
L’ovariectomie chirurgicale implique l’ablation d’un ou des deux ovaires. Comme pour la plupart des interventions chirurgicales, les méthodes sûres et rapides consistent généralement à rendre l’incision dans la peau et le fascia sous-jacent aussi petite que possible. Cela permet de réduire le nombre de sutures et d’attaches aux plaies et d’accélérer la cicatrisation. Bien que la capacité de réduire la taille des incisions soit une compétence qui vient avec la pratique, il est bénéfique d’avoir confiance en l’emplacement de l’incision. La figure 2A montre un exemple de la façon de localiser les meilleurs points d’incision. En raison de la petite anatomie de la souris, l’ovaire se trouvera près du foie et sur le côté gauche de la souris, près de la rate. Le fait de sonder et de tirer accidentellement sur ces organes peut entraîner des saignements indésirables ou des dommages. Nous fournissons un guide détaillé sur l’emplacement correct de l’incision et l’identification des points de repère anatomiques environnants pour aider à cette technique et réduire la probabilité de complications indésirables.
Ici, nous fournissons un exemple de la façon dont cette procédure peut être utilisée pour réduire efficacement les niveaux d’hormones circulantes chez la souris moins d’une semaine après l’intervention chirurgicale, ainsi que de la façon dont le tissu gonadique restant s’atrophie au fil du temps après l’intervention. Des méthodes et des recherches antérieures détaillent comment elles peuvent être effectuées pour générer des modèles murins de ménopause ou d’andropause, mais beaucoup d’entre eux sont effectués sur des modèles de rats plutôt que sur des souris12,22. Alors que les rats et les souris ont une anatomie similaire, le système murin a des structures anatomiques plus petites. Ici, nous proposons une méthode qui fonctionne de manière fiable dans des modèles de souris dès l’âge de 3 semaines. Dans l’ensemble, ces deux protocoles représentent un moyen cohérent d’effectuer rapidement des orchidectomies et des ovariectomies de survie chez les rongeurs, de reconnaître l’anatomie de la souris et de minimiser les complications chirurgicales, créant ainsi une base pour des résultats cohérents et efficaces.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions le Centre de ressources animales du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas pour son aide dans la formation chirurgicale et la révision des protocoles. Nous remercions l’équipe d’assistance de Wert Lab pour son aide inestimable. Ces travaux ont été financés par l’Institut national de la santé (NIH P30EY030413). Biorender.com a été utilisé pour la création de schémas de dessins animés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
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