Summary
تصف هذه المخطوطة طريقة متسقة لإجراء عمليات استئصال خصية القوارض واستئصال المبيض بسرعة للبقاء على قيد الحياة.
Abstract
تلعب إشارات هرمون الجنس دورا مهما في أنظمة الأعضاء المتعددة وكذلك في تطور الأمراض المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية. يسمح التلاعب بمستويات هرمون الجنس في نظام نموذج الفئران بدراسة تأثيرها على الأعضاء / الأنسجة وضمن تطور المرض. يوفر استئصال الخصية - الاستئصال الجراحي للخصيتين - واستئصال المبيض - الاستئصال الجراحي للمبيض - طريقة لاستنفاد الهرمونات الجنسية الداخلية بحيث يمكن توفير مستويات هرمون دقيقة من خلال الأدوية أو طرق التوصيل الأخرى. هنا ، نقدم طرقا سريعة وطفيفة التوغل لكل من استئصال الخصية واستئصال المبيض في نظام نموذج الفئران لتقليل الهرمونات الجنسية. يفصل هذا البروتوكول التحضير الجراحي واستئصال الخصيتين من خلال كيس الصفن ، واستئصال المبيضين عن طريق شقين في الظهر الجانبي الأيمن والأيسر.
Introduction
الخصيتان والمبيضان هما الجهازان الأساسيان المسؤولان عن إنتاج الهرمونات الجنسية. سلسلة الاتصالات الهرمونية التي تؤدي إلى إنتاج هرمون التستوستيرون والإستروجين هي عملية مميزة بشكل جيد تبدأ في منطقة ما تحت المهاد مع إطلاق هرمون إفراز الغدد التناسلية (GnRH)1. يؤدي إطلاق GnRH إلى إفراز الهرمون اللوتيني (LH) والهرمون المنبه للجريب (FSH) من الغدة النخامية. عندما تدخل هذه الهرمونات إلى مجرى الدم ، فإنها تؤثر بعد ذلك على الأنسجة الأخرى في الجسم. الهدف الأساسي ل LH هو الخصيتين (عند الذكور) والمبيضين (عند الإناث)2. استجابة ل LH ، تنتج الخصيتان وتطلق هرمون التستوستيرون3. وبالمثل ، تنتج المبايض هرمون الاستروجين4. في حين أن الآثار المقصودة لهذه الهرمونات هي إعداد الخلايا والجسم للإخصاب وضمان عمل الجهاز التناسلي ، يمكن أن تتأثر العديد من أجهزة الجسم الأخرى.
تم ربط الهرمونات الجنسية بالعديد من الوظائف الفسيولوجية. على سبيل المثال، يساعد الإستروجين في الحفاظ على الاتزان الداخلي للعظام عن طريق منع ارتشاف العظام بواسطة الخلايا الآكلة للعظم. لهذا السبب ، يمكن استخدام نماذج الفئران المبيضة لدراسة فسيولوجيا أمراض العظام مثل هشاشة العظام5،6،7. التستوستيرون والإستروجين هي أيضا أهداف بحثية للعديد من أمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض التنكسية العصبية. في الآونة الأخيرة ، تم ربط إنتاج هرمون التستوستيرون المرتفع إلى جانب النظام الغذائي عالي الدهون بالإجهاد التأكسدي الوعائي8. في الدماغ ، تسببت التغيرات في LH بعد استئصال المبيض في حدوث تغييرات في الذاكرة المكانية9. أصبح الحد من هرمون الاستروجين بعد استئصال المبيض أيضا نظاما نموذجيا لدراسة موت الخلايا في الحصين ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى موت الخلايا المبرمج ، مما يؤدي إلى عجز في الذاكرة10. أظهر التستوستيرون أيضا دورا في نمو الكلى في كل من نماذج الفئران والبشر بعد زرع الكلى11.
يسمح إنشاء نموذج الفئران المحرومة من الهرمونات بدراسة الهرمونات الجنسية وشلالات هرموناتها على الأمراض أو الأنسجة المختلفة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق الاستئصال الجراحي للخصيتين (استئصال الخصية) أو المبايض (استئصال المبيض). يمكن إجراء هذا الإجراء في الفئران من أي سلالة عندما تكون صغيرة مثل سن الفطام (واحد وعشرون يوما) أو أي عمر بالغ. يتم إجراء استئصال المبيض في إناث الفئران ، بينما يتم إجراء استئصال الخصية في ذكور الفئران. عن طريق إزالة هذه الأعضاء ، يمكن تخفيض مستويات هرمون الاستروجين والتستوستيرون ، والعديد من مشتقاتها ، مثل البروجسترون ، بشكل كبير12,13. يمكن أن تكون عملية إجراء استئصال الخصية أو استئصال المبيض في الفئران سريعة وطفيفة التوغل باستخدام التقنية المناسبة. يمكن أن يسمح الاستئصال السريع لهذه الأعضاء بطريقة آمنة وفعالة بالمعالجة الجراحية السريعة مع الحفاظ على الحد الأدنى من أعداد الفئران من خلال الحصول على معدل بقاء بنسبة 100٪ عند إجرائها بشكل صحيح. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول للاستئصال السريع للخصيتين والمبيضين ونوضح المراقبة المناسبة بعد الجراحة لتمكين الباحثين من إجراء هذه الجراحة بسرعة وأمان. نقوم أيضا بتضمين أمثلة مرئية للأعضاء التناسلية والأنسجة المحيطة بها لتزويد الجراح بمعالم تشريحية عند إجراء هذا الإجراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في UTSW (APN # 2019-102840).
1. استئصال الخصية الفئران
- قم بإعداد حقل عمل معقم وتأكد من تعقيم الأدوات الجراحية اللازمة وتوافرها بسهولة. اتبع الممارسات المعقمة لجراحة بقاء القوارض.
- تسجيل وزن الفأر الذكر وإدارة طريقة التخدير المفضلة وفقا للإرشادات المؤسسية. في هذا البروتوكول ، تم توصيل 2٪ إيزوفلوران عبر مبخر دقيق للحفاظ على التخدير. قبل الإجراء ، قم بإعطاء دواء الألم وفقا للإرشادات المؤسسية. في هذا البروتوكول ، تم إعطاء 1.0 ملغم / كغم من البوبرينورفين SR و 5 ملغ / كغ من ميلوكسيكام تحت الجلد.
- بمجرد أن يكون الفأر تحت التخدير ، قم بتغطية عيون الحيوان بجل العين المزلق لتجنب تكوين إصابة العين أو جفاف القرنية أو القرحة.
- قبل المتابعة ، تأكد من مستوى التخدير المناسب عن طريق إجراء اختبار استجابة قرصة إصبع القدم.
- قم بإعداد المنطقة الجراحية للحيوان قبل وضعها على المجال الجراحي المعقم المغطى بالفراء.
- بعد ذلك ، احلق المناطق الأربية وكيس الصفن في الماوس باستخدام زوج من كليبرز .
ملاحظة: حلق أسفل البطن أعلى من القضيب سيسمح برؤية أفضل أثناء الجراحة. - باستخدام قضيب مسجل بالقطن ، ضع طبقة رقيقة من كريم مزيل الشعر (انظر جدول المواد) على جلد الحيوان ، مع تغطية كيس الصفن والمنطقة المحيطة به التي تم حلقها للتو. انتظر لمدة 30 ثانية وقم بإزالة الكريم بقطعة من الشاش النظيف.
- استخدم 70٪ من إسفنجات الشاش المبللة بالإيثانول لمسح أي كريم وشعر متبقي من المنطقة.
ملاحظة: 70٪ إيثانول في هذه الخطوة هو للمساعدة في الإزالة الكاملة لكريم مزيل الشعر. يتم التحضير المطهر لموقع الجراحة في الخطوة 1.8.
- بعد ذلك ، احلق المناطق الأربية وكيس الصفن في الماوس باستخدام زوج من كليبرز .
- نقل الفأر إلى منطقة الجراحة والتأكد من توفر مصدر حرارة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء العملية. ضع الحيوان في وضع ضعيف على ستارة جراحية واستخدم شريطا لاصقا ناعما للصق أقدام الفأر بالحصيرة الجراحية.
- إذا صعدت الخصيتان إلى البطن، فجس البطن بحذر حتى تنزل الخصيتان. استخدم يدك التي ترتدي قفازا لتطبيق ضغط التدحرج اللطيف لأسفل على البطن.
ملاحظة: من الأسهل إجراء هذه الجراحة تحت نطاق تشريح أو باستخدام زوج من العدسات لتحسين التكبير. في حالة إجراء ذلك تحت نطاق تشريح ، خذ لحظة لوضع كيس الصفن للماوس تحت المجال البصري للنطاق. يمكن استخدام شريط ناعم للصق أرجل الفأر أو بطنه بالمجال الجراحي لضمان بقائه في الموضع الصحيح. - افرك الجلد باستخدام مقشر بيتادين الجراحي (أو مقشر مطهر مماثل للبشرة) ، متبوعا بفرك الكحول بنسبة 70٪ ثلاث مرات على الأقل لضمان تطهير الجلد بشكل صحيح. لكل فرك ، افرك بحركة شعاعية للخارج ، بحيث يتم تنظيف منتصف موقع الشق أولا وينتهي بتنظيف الحد الخارجي للمنطقة الجراحية المحلوقة أخيرا.
- في هذا الوقت ، ارتد قفازات جراحية معقمة. للخطوات التالية من الإجراء ، استخدم تقنيات التعقيم. قم بتغطية الفأر بستارة جراحية معقمة بشق صغير (مقطوع إلى حوالي 0.5-1 بوصة مربعة لتناسب موقع الجراحة) فوق الحيوان لتغطية الجسم في مادة الستارة.
- قم بإنشاء شق خط الوسط البطني في كيس الصفن بطول 1 سم -1.5 سم تقريبا باستخدام شفرة مشرط جراحي أو أدوات مماثلة وفقا لإرشادات رعاية الحيوان المؤسسية المعتمدة.
- أمسك بالحدود المقطوعة للجلد ، استخدم أداة حادة مائلة لفصل الجلد عن الأنسجة السفلية. خذ بعض الوقت للقيام بذلك على الحدود الجانبية والعلوية والسفلية للشق.
- اعزل الخصية باستخدام الملعقة والملقط لتحريك الشق في الجلد ليتم توسيطه فوق إحدى الخصيتين. إذا كان ذلك صعبا ، فارجع إلى 1.11 وافصل الجلد عن الطبقات السفلية.
- خذ زوجا من الملقط المنحني وضعه على جانبي الخصية. ضع ضغطا هبوطيا لطيفا لإضفاء الطابع الخارجي على الخصية. أمسك بالطبقة الرقيقة والشفافة من العضلات الموجودة أعلى الخصية باستخدام الملقط. هذه هي عضلة المشرقة. يتم التحقق من طبقة العضلات الصحيحة من خلال مراقبة هذه الطبقة ودورانها ، وتتحرك بشكل مستقل عن الخصية تحتها.
ملاحظة: يتم تأكيد تحديد الأنسجة الصحيحة من خلال شفافيتها وقدرتها على التحرك بشكل مستقل عن الأنسجة الكامنة.- تعامل مع الأنسجة العضلية باستخدام الملقط حتى يتم الإمساك بقمة العضلات. يجب أن يكون هذا هو الجزء الأدنى ، مع وجود الخصيتين والبربخ الذيلي تحتها.
- أمسك عضلة المشمرة بالملقط وتحرك برفق بعيدا عن الخصيتين والبربخ. قم بعمل شق 0.5 سم من خلال عضلة المشمرة في الخصية الأولى عند قمتها باستخدام زوج صغير من مقص زنبرك فاناس.
- ضع مشبك قفل على الحافة الخلفية لعضلة المشمرة المقطوعة. استخدم زوجا ضيقا من مرقئ الرؤوس أو زوجا من حوامل الإبر الدقيقة المقفلة. بمجرد تثبيت الأنسجة ، ضع الأداة برفق على الجانب الجانبي للماوس للحفاظ على الأنسجة مثبتة أثناء الخطوات الإجرائية التالية.
- استخدم الملقط للاستيلاء على الحد العلوي للشق الذي تم إجراؤه في الخطوة 1.14. أثناء سحب طرفي عضلة المشمرة ، استخدم زوجا آخر من الملقط للوصول إلى داخل التجويف وإمساك الخصية برفق.
- اسحبه للخارج من خلال الفتحة الموجودة في العضلات. احرص على مراقبة أي علامات على الأوعية الدموية والدم في المجال الجراحي.
- ستظهر الخصية والبربخ والحبل المنوي المتصل والأوعية الدموية عندما يتم إخراج الأنسجة بشكل صحيح.
- بالقرب من النهاية الذيلية الظهرية للبربخ والخصية ، هناك نقطة ليفية من ربط الخصية إلى عضلة المشمرة. لف الأنسجة الخارجية بشكل جانبي لتحديد نقطة الإدخال هذه. اقطع هذا لتجنب تلف العضلات والسماح بمزيد من العزلة والتصور للأنسجة. استخدم زوجين من الملقط لأداء تقنية المشبك والتمزق.
- ابحث عن الأنسجة الدهنية حول الخصية من وسادة الدهون الأربية. استخدم زوجا من الملقط للإمساك بوسادة الدهون واسحبها برفق لإضفاء الطابع الخارجي عليها.
- لا تمسك بالأوعية الدموية التي تنتقل على طول وسادة الدهون ، لأن سحب هذا يمكن أن يؤدي إلى نزيف.
- حدد موقع الحبل المنوي والأوعية الدموية ووسادة الدهون المتبقية القريبة من الأنسجة الخارجية واستخدم زوجا من مرقئ لتثبيتها. أثناء الاحتفاظ بتوتر طفيف على الخصية البعيدة ، قم بكي الحبل المنوي والأوعية الدموية البعيدة عن مشبك المرقئ.
- بمجرد الانتهاء ، حرر ببطء المشبك القريب من الطرف المكوي وتحقق من علامات النزيف. إذا كان موجودا ، كرر هذه الخطوة. من المفيد استخدام زوج من الملقط لتثبيت التوتر اللطيف على الطرف البعيد للنسيج الذي يتم كيه.
- اسمح للجذع المقطوع للحبل المنوي بالتراجع مرة أخرى إلى الجسم. أمسك طرفي العضلة المشرقة واجمعهما معا. تقييم حجم القطع في الأنسجة ، وإغلاق الأنسجة باستخدام 4-0 أو 5-0 خيوط قابلة للامتصاص. اعتمادا على حجم شق ، ستكون هناك حاجة إلى 1 أو 2 الغرز. تقليم أطراف خياطة إلى 0.5 سم باستخدام مقص خياطة.
- كرر الخطوات 1.13-1.20 على الجانب الآخر من كيس الصفن لإزالة الخصية الثانية.
- استعد لإغلاق شق الجلد.
- ضمان الارقاء الجيد لكل من جذوع الأنسجة. سيؤدي ضعف الإرقاء إلى نزيف متبقي في المجال الجراحي. إذا حدث هذا ، حدد موقع النزيف والكي. يتم تجنب ذلك عن طريق التلاعب البطيء والدقيق للأنسجة بأدوات حادة.
- إذا شوهد الدم في المجال الجراحي ، فاستخدم أداة تطبيق معقمة ذات رأس قطني لتجفيف المنطقة للحصول على تصور أفضل. استخدم حقنة لتقطير محلول ملحي على المنطقة لري أي دم أو سائل بعيدا عن المجال الجراحي.
- اسحب جانبي شق الجلد معا لإعداده للإغلاق. تأكد من أن الأطراف المخيطة لشقوق المشمرة لا تبرز في شق الجلد. إذا لزم الأمر ، قم بقص نهايات الخيط.
- أغلق الجلد.
- في حالة استخدام مشابك الجرح ، استخدم الملقط لتحريك الجلد وسحبه بعيدا عن الأنسجة الكامنة. ضع مشبك جرح واحد في المنتصف فوق الشق. تأكد من أن الجلد مقطوع جيدا. إذا كان الشق كبيرا جدا بحيث لا يمكن لمقطع جرح واحد إغلاقه بشكل كاف ، فيمكن تطبيق غراء الجلد الجراحي على الأجزاء العلوية والسفلية من الشق.
- في حالة استخدام الغرز ، ضع العدد المطلوب من الغرز عبر الجلد ، دون الإمساك بالأنسجة الكامنة. سيتطلب هذا النوع من الشق 2-3 خيوط متقطعة مفردة باستخدام 4-0 مادة خياطة غير قابلة للامتصاص.
- نظف الجلد حول موقع الجراحة بلطف باستخدام محلول ملحي وأداة تطبيق معقمة ذات رأس قطني لإزالة أي دم جاف أو فرك مطهر متبقي.
2. استئصال المبيض الفئران
- قم بإعداد حقل عمل معقم وتأكد من تعقيم الأدوات الجراحية اللازمة وتوافرها بسهولة. اتبع الممارسات المعقمة لجراحة بقاء القوارض.
- سجل وزن أنثى الفأر وقم بإدارة طريقة التخدير المفضلة وفقا لإرشاداتك المؤسسية. في هذا البروتوكول ، تم توصيل 2٪ إيزوفلوران عبر مبخر دقيق للحفاظ على التخدير. قبل الإجراء ، قم بإعطاء دواء الألم وفقا للإرشادات المؤسسية الخاصة بك. في هذا البروتوكول ، تم إعطاء 1.0 ملغم / كغم من البوبرينورفين SR و 5 ملغ / كغ من ميلوكسيكام تحت الجلد.
- تطبيق جل العين المزلق على عيون الحيوان لتجنب تكوين إصابة العين أو جفاف القرنية أو القرحة. تأكد من توفر مصدر حرارة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء العملية. تأكد من مستوى التخدير المناسب عن طريق التحقق من استجابة قرصة إصبع القدم.
- تحضير المنطقة الجراحية للحيوان قبل وضعها في المجال الجراحي.
- حلق الشعر بلطف على المنطقة الظهرية الجانبية من ظهر الحيوان باستخدام زوج من كليبرز . قم بإزالة الشعر من المنطقة فوق الحدود العلوية للوركين وأسفل الحد السفلي للقفص الصدري ، وكذلك المناطق الواقعة بين هذه المعالم.
- باستخدام قضيب ذو رأس قطني ، ضع طبقة من كريم مزيل الشعر على جلد الحيوان ، تغطي المنطقة التي تم حلقها للتو. انتظر لمدة 30 ثانية وأزل الكريم بقطعة من الشاش ، وأزل الشعر الناعم المتبقي.
- استخدم إسفنجة شاش مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪ لمسح أي كريم وشعر متبقيين من منطقة الجراحة.
ملاحظة: 70٪ إيثانول في هذه الخطوة هو المساعدة في إزالة كريم مزيل الشعر تماما. يتم إجراء التحضير المطهر لموقع الجراحة في الخطوة 2.5.
- ضع الحيوان في الوضع الجانبي (للشق لإزالة مبيض واحد في كل مرة) في المجال الجراحي وتأكد من توفر مصدر للحرارة. افرك منطقة الجراحة باستخدام مقشر بيتادين الجراحي (أو مقشر مطهر مماثل للجلد) ، متبوعا بنسبة 70٪ كحول ثلاث مرات على الأقل لضمان تطهير الجلد بشكل صحيح. لكل فرك ، فرك في حركة شعاعية للخارج ، بحيث يتم فرك منتصف الشق أولا ويتم تنظيف الحد الخارجي للمنطقة الجراحية المحلوقة أخيرا.
- في هذا الوقت ، ارتد قفازات جراحية معقمة. للخطوات التالية من الإجراء ، استخدم تقنيات التعقيم. ضع ستارة جراحية بها شق صغير (قطع ما يقرب من 0.5-1 بوصة مربعة في الستارة لتناسب موقع الجراحة) فوق الحيوان بحيث يتم تغطية الجسم بمادة الستارة.
- حدد الموقع المثالي للشق الجراحي من خلال إيجاد نقطة المنتصف بين الوركين وأضلاع الفأر (انظر الشكل 2). أمسك الجلد بالملقط وقم بعمل شق 1.0 سم في الجلد في هذا الموقع.
- استخدم أداة ذات رأس غير حاد (مسبار أو ملعقة جراحية أو مرقئ غير حاد) لفصل الجلد عن الأنسجة العضلية السفلية. خذ بعض الوقت للقيام بذلك على الحدود الجانبية والعلوية والسفلية للشق.
- حدد موقع جدار العضلات الظهرية الجانبية للبطن. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية التي تقع بين الجلد وطبقات العضلات. في الفئران الناضجة ، يكون هذا النسيج الدهني أكثر بروزا. حرك هذا النسيج الدهني نحو الطرف الذيلي للفأر ، وكشف جدار العضلات.
- يتم تمييز الأنسجة الدهنية عن جدار البطن حسب اللون: تظهر الأنسجة الدهنية بيضاء شاحبة وتكمن أكثر سطحية ، بينما يظهر جدار البطن ورديا وأعمق من الأنسجة الدهنية.
- أمسك جدار البطن بملقط أسنان الفئران وقم بعمل شق 0.5 سم فيه.
- أمسك حدا واحدا من هذا الشق بزوج واحد من الملقط ، واستخدم زوجا ثانيا للوصول إلى داخل تجويف الجسم ، وابحث عن المبيض وقرن الرحم ووسادة الدهون. اسحب هذا برفق من خلال شق في جدار العضلات لفصل العضلات عن الأنسجة الكامنة وإخراجها من الخارج. حدد الانتقال بين قرن الرحم والمبيض.
- قطع المبيض عن طريق إجراء تقنية السحق والتمزق.
- ضع مشبكا واحدا على الطرف البعيد من قرن الرحم وضع المشبك الثاني بعيدا عن الأول. أثناء الضغط بقوة مع كلا المشبكين ، حرك المشبك البعيد بعيدا عن الجسم ، وتمزيق الاتصال بينهما. لتقليل النزيف وتلف الأنسجة ، حافظ على المشبك القريب ثابتا أثناء هذه العملية واحرص على عدم سحبه بعيدا عن الجسم.
- بدلا من ذلك ، استخدم الكي. استخدم زوجا من الملقط أو مرقئ لتثبيت قرن الرحم بالقرب من نقطة الكي المطلوبة. استخدم أداة الكي لقطع الأنسجة.
- حرر المشبك القريب برفق وببطء وتحقق من علامات النزيف.
- اسمح لجذع الأنسجة بالتراجع إلى تجويف الجسم. أمسك جدار البطن واسحب برفق لأعلى. لا تجبر جذع الأنسجة على الداخل ، لأن هذا يزيد من احتمال حدوث نزيف.
- حدد حدود الشق في جدار العضلات واجمعهم معا للتحضير لخياطته.
- ضع 1-2 خيوط متقطعة مفردة في جدار عضلات البطن باستخدام 4-0 مادة خياطة قابلة للامتصاص. تقليم أطراف خياطة إلى 0.5 سم باستخدام مقص خياطة.
- أغلق الشق عن طريق السماح للجلد بالعودة إلى حالة الراحة الطبيعية ثم تحريكه لأعلى ، مع الحرص على عدم الإمساك بالأنسجة الكامنة أو نهايات مادة الخياطة. ضع 1-2 مشابك جرح على الجلد المقطوع. بناء على الإرشادات المؤسسية الخاصة بك ، يمكن أيضا إغلاق الجلد باستخدام 4-0 مادة خياطة غير قابلة للامتصاص.
- لإزالة المبيض الآخر ، قم بتبديل موضع الماوس بحيث يكون الجانب الجانبي الآخر متجها لأعلى. كن لطيفا عند تبديل موضع الماوس حتى لا تضغط كثيرا على الجلد المقطوع بالجرح من الخطوة 2.17.
- على هذا الجانب ، كرر الخطوات 2.5 - 2.17.
- نظف الجلد حول موقع الجراحة بلطف باستخدام محلول ملحي وأداة تطبيق معقمة ذات رأس قطني لإزالة أي دم جاف أو فرك مطهر متبقي.
3. رعاية ما بعد الجراحة
- وفقا للإرشادات المؤسسية الخاصة بك ، قم بإعطاء دواء الألم لمدة تصل إلى 72 ساعة بعد العملية. توثيق الإجراء الجراحي للحيوانات ، مع ملاحظة التاريخ والوقت والتخدير والمسكن المستخدم. هنا ، يتم إعطاء البوبرينورفين بطيء الإطلاق وميلوكسيكام قبل الجراحة.
- بعد الانتهاء من جراحة الحيوانات ، قم بنقلها إلى قفص نظيف مبطن بمنشفة ورقية جافة. ضع هذا القفص 2/3 على مصدر حرارة ، مع ترك 1/3 الآخر من القفص بعيدا عن النار. لا تضع الفئران معا في قفص حتى تتعافى من التخدير.
- اسمح للحيوان باستعادة القدرة على المشي بحرية حول القفص قبل وضعه مرة أخرى في قفص نظيف مع فراش عادي. في هذا الوقت ، يمكن إيواء الفئران معا إذا تعافت جميعها من التخدير.
- في الأيام القليلة الأولى بعد الجراحة ، تأكد من سهولة الوصول إلى الطعام والماء الرطب. ضع بعض الطعام المبلل في قاع القفص. تحقق بشكل متكرر من موقع جراحة الفأر وابحث عن أي علامات للعدوى أو النزيف.
- بعد الجراحة ، تأكد من إيواء الفئران بمفردها أو مع أخرى خضعت لنفس الإجراء في وقت واحد. يمكن للفأر الذي يتعافى من الجراحة الموجودة في نفس القفص مثل الفأر بدون جراحة أن يشكل خطرا ويجب تجنبه.
- بالنسبة للفئران التي خضعت لاستئصال المبيض ولديها مشابك جرح على الجانبين الظهري الجانبي للظهر ، قم بإزالة أي موائل كوخ الإسكيمو القوارض من القفص لتقليل فرصة وقوع مشبك جرح الفأر على كوخ الإسكيمو خلال الأسبوع الأول من الشفاء.
- استمر في مراقبة الحيوان بحثا عن علامات العدوى أو الألم أو المضاعفات الجراحية كل 12 ساعة خلال أول 72 ساعة من وقت الشفاء.
- قم بإزالة مشابك الجرح باستخدام أداة إزالة مشبك الجرح بعد 10-14 يوما من الجراحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تنفيذ الإجراء المعروض هنا على الفئران التي تتراوح أعمارها بين شهر وثلاثة أشهر في خلفية C57BL / 6J. وزن الفئران الذكور 16-28 جم ، ووزن الفئران الإناث 14-24 جم في وقت الإجراء. تم تحسين هذا الإجراء ليكون قابلا للتطبيق على الفئران من العديد من الأعمار ، من الفطام حتى مرحلة البلوغ.
يتضمن استئصال الخصية الجراحي شقا جلديا واحدا في كيس الصفن البطني، كما هو موضح في الشكل 1 أ. تتم إزالة كلتا الخصيتين واحدة تلو الأخرى ويتم قطعهما من خلال الأسهر والأوعية الدموية المنوية ، مما يؤدي إلى إزالة الخصية والبربخ المتصل (الشكل 1 ب). تتضمن المحتويات التي تمت إزالتها الخصية والبربخ ووسادة الدهون الأربية الموضحة في الشكل 1 ج. يمكن تأكيد الإزالة الناجحة للخصيتين من خلال الملاحظة البصرية للأنسجة التي تمت إزالتها وضمان الإرقاء الجيد لجذع الأنسجة قبل إغلاق تجويف الجسم. يمكن قياس نجاح استئصال الخصية من خلال مراقبة الفئران التي تم استردادها جيدا والتي تظهر مواقع شق ملتئمة (الشكل 1 د). ستظهر الفئران التي خضعت لاستئصال الخصية أيضا انخفاضا في مستوى هرمون التستوستيرون المقاس في مصل الفأر في وقت مبكر بعد أسبوع من الإجراء (الشكل 1E).
يتم استئصال المبيض الثنائي الجراحي عن طريق شقوق في الظهر الأيسر والأيمن لإناث الفئران (الشكل 2 أ). يمكن استخدام نهج الشق الجانبي إذا كان سيتم إزالة مبيض واحد فقط. في هذا النهج ، يتم شق جدار البطن ، وتقع وسادة الدهون المبيض. وسادة الدهون والمبيض وقناة المبيض وقرن الرحم البعيد، كما هو موضح في الشكل 2 ب، خارجية ، تليها قطع قرن الرحم البعيد. هذه التقنية تؤدي إلى إزالة المبيض وقناة البيض. يمكن إزالة المبيض وقناة المبيض دون تضمين قرن الرحم البعيد ، ولكن هناك خطر من أن أي خلايا مبيض متبقية ستستمر في إبقاء الفأر في دورات شهوانية. بما في ذلك قرن الرحم البعيد يضمن إزالة المبيض والقناة بالكامل ، وسيكون هناك نضوب للهرمونات الجنسية ، ولن تعود الفئران تدور بعد الآن. يوضح الشكل 2 ج مثالا للأعضاء التناسلية الأنثوية للفأر التي تم تشريحها خارج الجسم. يمكن ملاحظة أن المبايض نفسها أصغر بكثير من الأنسجة المحيطة. يساعد منظار التشريح أو العدسات في تحديد هذه الأنسجة. يوضح الشكل 2D تشريح المبيض تحت نطاق تشريح مع إزالة الأنسجة من وسادة الدهون الرحمية ، مما يسمح بتصور أفضل. يمكن قياس نجاح هذا الإجراء من خلال ملاحظة الفئران التي تم استردادها جيدا والتي تظهر مواقع شق ملتئمة (الشكل 2E).
تعتبر جراحة استئصال المبيض آمنة وفعالة عند إجراؤها بسرعة وبأقل قدر من الاضطراب في الأنسجة المحيطة. يؤدي اتباع الإجراء الموضح هنا إلى تحقيق ذلك من خلال التأكد من وضع شق الجلد وجدار البطن بشكل صحيح ، مما يسمح بتحديد موقع أنسجة الرحم بسرعة. يضمن تحديد الحد السفلي للقفص الصدري والحد العلوي لعظام الساق إجراء الشق بالقرب من الأنسجة محل الاهتمام. يسمح إجراء شق في منتصف المسافة تقريبا بين الحد السفلي للأضلاع والحدود العلوية لعظام الساق ويقع على بعد حوالي 1.5 سم من العمود الفقري بوضع جيد لموقع الجراحة عند إجراء نهج شق جانبي (الشكل 2 أ).
يظهر تأكيد استئصال المبيض الجراحي من خلال ملاحظة ضمور الرحم. يوضح الشكل 2F قرنا رحميا تم تشريحه من فأر عمره 6 أشهر ، بينما يوضح الشكل 2G قرنا رحميا من فأر يبلغ من العمر 6 أشهر خضع لعملية استئصال المبيض الجراحية في عمر ثلاثة أشهر. يبدو قرن الرحم المبيض أرق ويفتقر إلى الارتباط بالمبيض في الطرف البعيد. تظهر طريقة تأكيد التقنية الجراحية هذه بشكل فعال أن إزالة المبيض أدت إلى ضمور أنسجة الرحم.
بمجرد تحديد الأنسجة واستئصالها بنجاح ، يمكن إكمال الجراحة عن طريق إغلاق الجروح والمراقبة الدقيقة بعد الجراحة. تقنية التعقيم المناسبة14 مهمة في ضمان نتائج جيدة عند إجراء جراحة البقاء على قيد الحياة. عندما يبدأ الفأر في الشفاء من الشقوق ، يتم إجراء المراقبة للبحث عن علامات الألم والمضاعفات الجراحية. المضاعفات الجراحية المحتملة هي النزيف الداخلي بسبب وخز أو وخز الأوعية الدموية أثناء محاولة شق الأنسجة أو التلاعب بها. يشار إلى ذلك من خلال مظهر أحمر مستمر تحت الجلد حول موقع الجراحة. يتم تجنب مثل هذه المضاعفات عن طريق التوطين المناسب لمواقع الشق ومساعدة رؤية الجراح باستخدام المجهر الجراحي أو العدسات. يوصى بالفحص البصري كل 12 ساعة خلال الأيام الثلاثة الأولى بعد الجراحة. ستؤدي الجراحة الناجحة إلى جروح نظيفة وشافية (الشكل 1D ، 2E).
الشكل 1: استئصال الخصية الذكري. (أ) يظهر فأر ذكر في وضع الاستلقاء مع تحديد موقع شق جراحي في كيس الصفن لإزالة الخصية، كما هو موضح باللون الأحمر. (ب) صورة تم التقاطها أثناء العملية الجراحية لاستئصال الخصية تصور نقطة الانفصال باللون الأخضر. ج: تشريح الخصية، والضمادات الدهنية، والبربخ من ذكر الفأر. د: فأر ذكر مشبك جرح ملتئم جيدا فوق شق كيس الصفن بعد استئصال الخصية. (ه) تركيز هرمون التستوستيرون في مصل الفأر في نانوغرام / مل على النحو المحدد بواسطة استيفاء ELISA. تمثل كلتا المجموعتين الفئران البالغة من العمر 9 أسابيع. تم إجراء عمليات استئصال الخصية الجراحية في عمر 8 أسابيع. N = 3 فئران لكل مجموعة. تم تشغيل العينات في ثلاث نسخ. تم جمع عينات المصل عن طريق ثقب القلب وتجميدها حتى وقت التحليل. *، ص < 0.05. أشرطة الخطأ = التسويق عبر محرك البحث. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استئصال المبيض الأنثوي . (أ) أنثى فأر موضحة في الموضع الجانبي مع موقع الشق الجراحي لإزالة مبيض واحد من الجانب الظهري الجانبي، كما هو موضح باللون الأحمر. يتم تسليط الضوء على المعالم التشريحية الهامة الأخرى. (ب) صورة التقطت أثناء الجراحة تصور المبيض الخارجي وقناة البيض وقرن الرحم البعيد مع نقطة الانفصال الموضحة باللون الأخضر. ج: تشريح قرون الرحم والمبيضين والوسادات الدهنية من أنثى الفأر. د: منظر عن قرب للمبيض المقطوع وقناة المبيض والجزء البعيد من قرن الرحم مع إزالة الدهون من وسادة الدهون، مما يسمح بتصور أفضل للمبيض. ه: أنثى فأر مشبك جرح ملتئم جيدا فوق الشق بعد استئصال المبيض. (و) تشريح قرن رحم الفأر. (ز) تشريح قرن رحم الفأر بعد 3 أشهر من إجراء استئصال المبيض ، مما يدل على ضمور الرحم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ملخص بياني لاستئصال المبيض واستئصال الخصية. تمثيل تصويري لإجراء استئصال الخصية للفئران الذكور التي تنطوي على إزالة الخصية وإجراء استئصال المبيض الذي ينطوي على إزالة المبيضين ، وكلاهما يؤدي إلى نموذج فأر مستنفد لهرمون الجنس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح الاستئصال الجراحي للخصيتين والمبيضين بدراسة فسيولوجيا الفئران تحت الحرمان الهرموني الخاضع للرقابة. هذه التقنية مهمة للعديد من مجالات العلوم ، بما في ذلك التنكس العصبي ، والتمثيل الغذائي المعدني ، والقلب والأوعية الدموية ، والصحة الإنجابية15،16،17،18،19،20،21. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول للإزالة السريعة والآمنة والفعالة لمبيض الفئران والخصية باستخدام جراحة البقاء على قيد الحياة لاستنفاد الهرمونات الجنسية. عندما يقوم بها جراح متمرس ، يمكن أن تستغرق هذه الإجراءات أقل من 5 دقائق ، مما يؤدي إلى معدل بقاء مرتفع للغاية في الفئران.
تتضمن بعض الاعتبارات عند التخطيط لجراحة الفئران أفضل موقع شق وفسيولوجيا الحيوان. في حالة استئصال الخصية ، يمكن أيضا إزالة خصية الفأر من خلال البطن عن طريق شق بطني في خط الوسط13. لا تفتح هذه التقنية التجويف البريتوني فحسب ، بل تعتمد أيضا على التحديد السريع لمنصات الدهون الأربية. بالنسبة للجراحين الجدد ، من الصعب إجراء هذه التقنية بسرعة. عندما تكون الفئران صغيرة جدا ، تكون منصات الدهون أيضا أقل تطورا ، وبالتالي يصعب تحديد موقعها. يعد نهج كيس الصفن الموضح في هذا البروتوكول خيارا مناسبا للباحثين الجدد في جراحة الفئران ، أو الذين يعملون على الفئران الصغيرة والصغيرة ، أو الذين يرغبون في تقليل فرصة إزعاج الأعضاء الأخرى في التجويف البريتوني عن طريق شق في البطن.
يتضمن استئصال المبيض الجراحي إزالة أحد المبيضين أو كليهما. كما هو الحال بالنسبة لمعظم العمليات الجراحية ، عادة ما تتضمن الطرق الآمنة والسريعة جعل الشق في الجلد واللفافة الكامنة أصغر ما يمكن. هذا يسمح بتقليل الغرز ومشابك الجروح والشفاء بشكل أسرع. في حين أن القدرة على تصغير الشقوق هي مهارة تأتي مع الممارسة ، فإن الثقة في موقع الشق مفيدة. يوضح الشكل 2 أ مثالا على كيفية تحديد أفضل نقاط الشق. بسبب تشريح الفأر الصغير ، سيقع المبيض بالقرب من الكبد ، وعلى الجانب الأيسر من الماوس ، بالقرب من الطحال. يمكن أن يؤدي فحص هذه الأعضاء وسحبها عن طريق الخطأ إلى نزيف أو ضرر غير مرغوب فيه. نحن نقدم دليلا مفصلا لموقع الشق الصحيح وتحديد المعالم التشريحية المحيطة للمساعدة في هذه التقنية وتقليل احتمالية حدوث مضاعفات سلبية.
هنا ، نقدم مثالا على كيفية استخدام هذا الإجراء لهدم مستويات الهرمون المنتشرة بشكل فعال في الفئران بعد أقل من أسبوع من الإجراء الجراحي ، وكذلك كيفية ضمور أنسجة الغدد التناسلية المتبقية بمرور الوقت بعد العملية. الطرق السابقة وتفاصيل البحث كيف يمكن القيام بذلك لتوليد نماذج الفئران انقطاع الطمث أو إياس الذكور ، ولكن يتم تنفيذ العديد منها في نماذج الفئران بدلا من الفئران12،22. في حين أن الجرذان والفئران لها تشريح مماثل ، فإن نظام الفئران له هياكل تشريحية أصغر. هنا ، نقدم طريقة تعمل بشكل موثوق في نماذج الماوس التي لا يتجاوز عمرها 3 أسابيع. بشكل عام ، يمثل هذان البروتوكولان طريقة متسقة لإجراء عمليات استئصال خصية القوارض واستئصال المبيض بسرعة ، والتعرف على تشريح الفأر ، وتقليل المضاعفات الجراحية ، مما يخلق أساسا لنتائج متسقة وفعالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر مركز الموارد الحيوانية التابع للمركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس على مساعدتهم في التدريب الجراحي ومراجعة البروتوكول. نشكر فريق دعم Wert Lab على مساعدتهم التي لا تقدر بثمن. تم دعم هذا العمل بأموال من المعهد الوطني للصحة (NIH P30EY030413). تم استخدام Biorender.com لإنشاء مخططات الرسوم المتحركة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
