Summary
Este manuscrito descreve uma maneira consistente de realizar rapidamente orquiectomias e ovariectomias de roedores de sobrevivência.
Abstract
A sinalização de hormônios sexuais desempenha um papel crítico em vários sistemas de órgãos, bem como na progressão de várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas. A manipulação dos níveis de hormônios sexuais no sistema modelo murino permite o estudo de seu impacto em órgãos/tecidos e na progressão da doença. Orquiectomia - a remoção cirúrgica dos testículos - e ovariectomia - a remoção cirúrgica dos ovários - fornecem um método para esgotar os hormônios sexuais endógenos para que os níveis hormonais precisos possam ser fornecidos através de drogas ou outros métodos de entrega. Aqui, fornecemos métodos rápidos e minimamente invasivos para orquiectomia e ooforectomia no sistema modelo murino para a redução de hormônios sexuais. Este protocolo detalha o preparo cirúrgico e a excisão dos testículos através do saco escrotal, e a excisão dos ovários através de duas incisões no dorso lateral direito e esquerdo.
Introduction
Os testículos e ovários são os principais órgãos responsáveis pela produção de hormônios sexuais. A cascata de comunicação hormonal que leva à produção de testosterona e estrógeno é um processo bem caracterizado que se inicia no hipotálamo com a liberação do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH)1. A liberação de GnRH causa a liberação de hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo-estimulante (FSH) da glândula pituitária. Como esses hormônios entram na corrente sanguínea, eles então afetam outros tecidos do corpo. O alvo primário do LH são os testículos (no sexo masculino) e os ovários (no sexo feminino)2. Em resposta ao LH, os testículos produzem e liberam testosterona3. Da mesma forma, os ovários produzem estrogênio4. Enquanto os efeitos pretendidos desses hormônios são preparar as células e o corpo para a fertilização e garantir um sistema reprodutivo funcional, muitos outros sistemas corporais podem ser afetados.
Os hormônios sexuais têm sido associados a diversas funções fisiológicas. Por exemplo, o estrogênio ajuda a manter a homeostase óssea, impedindo a reabsorção óssea pelos osteoclastos. Por essa razão, modelos de camundongos ovariectomizados podem ser utilizados para estudar a fisiologia de doenças ósseas como a osteoporose 5,6,7. Testosterona e estrogênio também são alvos de pesquisa para muitas doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Recentemente, a produção elevada de testosterona aliada à dieta rica em gordura tem sido associada ao estresse oxidativo vascular8. No cérebro, alterações no LH após ooforectomia têm causado alterações na memória espacial9. A redução de estrógenos após ooforectomia também se tornou um sistema modelo para estudar a morte celular no hipocampo, pois pode induzir apoptose, resultando em déficits de memória10. A testosterona também tem demonstrado um papel no crescimento dos rins tanto em modelos de camundongos quanto em humanos após transplante renal11.
A criação de um modelo murino privado de hormônios permite o estudo de hormônios sexuais e suas cascatas hormonais em várias doenças ou tecidos. Isso pode ser realizado pela remoção cirúrgica dos testículos (orquiectomia) ou ovários (ooforectomia). Este procedimento pode ser realizado em camundongos de qualquer linhagem quando eles são tão jovens quanto a idade de desmame (vinte e um dias) ou qualquer idade adulta. A ooforectomia é realizada em camundongos fêmeas, enquanto a orquiectomia é realizada em camundongos machos. Com a remoção desses órgãos, os níveis de estrogênio e testosterona e muitos de seus derivados, como a progesterona, podem ser bastante reduzidos12,13. O processo de realização de orquiectomias ou ovariectomias em camundongos pode ser rápido e minimamente invasivo com a técnica adequada. A rápida excisão desses órgãos de forma segura e eficiente pode permitir um processamento cirúrgico rápido, mantendo o número mínimo de camundongos por ter uma taxa de sobrevivência de 100% quando realizada corretamente. Aqui, detalhamos um protocolo para a excisão rápida dos testículos e ovários e demonstramos o acompanhamento pós-cirúrgico adequado para permitir que os pesquisadores realizem essa cirurgia de forma rápida e segura. Também incluímos exemplos visuais dos órgãos sexuais e tecidos circundantes para fornecer ao cirurgião pontos de referência anatômicos ao realizar este procedimento.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UTSW (APN#2019-102840).
1. Orquiectomia murina
- Prepare um campo de trabalho asséptico e certifique-se de que os instrumentos cirúrgicos necessários foram esterilizados e estão prontamente disponíveis. Siga práticas assépticas para cirurgia de sobrevivência de roedores.
- Registrar o peso do camundongo macho e administrar o método de anestesia preferido de acordo com as diretrizes institucionais. Nesse protocolo, isoflurano a 2% foi administrado por vaporizador de precisão para manutenção da anestesia. Antes do procedimento, administrar medicamentos para dor de acordo com as diretrizes institucionais. Nesse protocolo, 1,0 mg/kg de Buprenorfina SR e 5 mg/kg de Meloxicam foram administrados por via subcutânea.
- Quando o rato estiver sob anestesia, cubra os olhos do animal com gel lubrificante para os olhos para evitar a formação de lesões oculares, dessecação da córnea ou úlcera.
- Antes de prosseguir, certifique-se do plano adequado de anestesia realizando um teste de resposta à pinça do dedo do pé.
- Preparar a área cirúrgica do animal antes de colocá-lo no campo cirúrgico asséptico e coberto.
- Em seguida, raspe as áreas inguinal e escrotal do mouse usando um par de cortadores.
OBS: Depilar o abdome inferior superior ao pênis permitirá melhor visualização durante a cirurgia. - Usando um aplicador colado em algodão, aplique uma fina camada de creme depilatório (ver Tabela de Materiais) na pele do animal, cobrindo o escroto e a área circundante que acabou de ser raspada. Aguarde 30 s e retire o creme com um pedaço de gaze limpa.
- Use esponjas de gaze embebidas em etanol a 70% para limpar qualquer creme e cabelo restante da área.
OBS: O etanol 70% nesta etapa é para auxiliar na remoção completa do creme depilatório. A preparação antisséptica do sítio cirúrgico é realizada na etapa 1.8.
- Em seguida, raspe as áreas inguinal e escrotal do mouse usando um par de cortadores.
- Transfira o rato para a área cirúrgica e certifique-se de que existe uma fonte de calor disponível para manter a temperatura corporal do animal durante a operação. Coloque o animal em decúbito dorsal sobre um pano cirúrgico e use fita adesiva macia para aderir os pés do rato ao tapete cirúrgico.
- Se os testículos ascenderem para o abdômen, palpar cuidadosamente o abdômen para que os testículos desçam. Use uma mão enluvada para aplicar uma pressão suave de rolamento para baixo no abdômen.
NOTA: É mais fácil realizar esta cirurgia sob um escopo de dissecção ou usando um par de lupas para aumentar a ampliação. Se estiver executando isso sob um escopo de dissecação, reserve um momento para posicionar o escroto do mouse sob o campo visual do escopo. Uma fita macia pode ser usada para aderir as pernas ou o abdômen do mouse ao campo cirúrgico para garantir que ele permaneça no posicionamento correto. - Esfregue a pele com esfoliação cirúrgica Betadine (ou uma esfoliação de preparação de pele antisséptica semelhante), seguida de esfoliação com álcool a 70% pelo menos três vezes para garantir a desinfecção adequada da pele. Para cada esfoliação, esfregue em um movimento radial para fora, de modo que o meio do local da incisão seja esfregado primeiro e terminando com a borda externa da área cirúrgica raspada sendo esfregada por último.
- Neste momento, coloque luvas cirúrgicas estéreis. Para os próximos passos do procedimento, utilize técnicas assépticas. Cubra o rato com um pano cirúrgico estéril com uma pequena incisão (cortada a aproximadamente 0,5-1 polegada quadrada para caber sobre o local cirúrgico) sobre o animal para cobrir o corpo no material do drape.
- Crie uma incisão ventral na linha média no escroto de aproximadamente 1 cm a 1,5 cm de comprimento usando uma lâmina de bisturi cirúrgico ou instrumentos semelhantes seguindo suas diretrizes institucionais de bem-estar animal aprovadas.
- Segurando a borda cortada da pele, use um instrumento de ponta romba para separar a pele do tecido inferior. Reserve um tempo para fazer isso nas bordas lateral, superior e inferior da incisão.
- Isole um testículo usando a espátula e a pinça para mover a incisão na pele para ser centralizada em cima de um dos testículos. Se isso for difícil, volte para 1.11 e separe ainda mais a pele das camadas inferiores.
- Pegue um par de pinças curvas e coloque-as em cada lado do testículo. Aplique uma pressão suave para baixo para exteriorizar o testículo. Pegue a camada fina e transparente de músculo que está em cima do testículo usando pinças. Este é o músculo cremaster. A verificação da camada muscular correta é feita observando-se essa camada e sua circulação, movendo-se independentemente do testículo abaixo dela.
NOTA: A identificação do tecido correto é confirmada pela sua transparência e capacidade de se mover independentemente dos tecidos subjacentes.- Manipular o tecido muscular usando pinças até que o ápice do músculo seja agarrado. Esta deve ser a porção mais baixa, com os testículos e cauda do epidídimo localizados abaixo.
- Segure o músculo cremaster com pinças e afaste-se suavemente dos testículos e do epidídimo. Crie uma incisão de 0,5 cm através do músculo cremaster do primeiro testículo em seu ápice usando um pequeno par de tesouras de mola Vannas.
- Coloque uma pinça de bloqueio na borda posterior do músculo cremaster cortado. Use um par estreito de hemostáticos ou um par de porta-microagulhas de bloqueio. Uma vez que o tecido é pinçado, coloque suavemente o instrumento no lado lateral do mouse para manter o tecido preso durante as etapas seguintes do procedimento.
- Utilizar pinça para agarrar a borda superior da incisão feita no passo 1.14. Enquanto as duas extremidades do músculo cremaster estão sendo retraídas, use outro par de pinças para alcançar dentro da cavidade e segure suavemente o testículo.
- Puxe-o para fora através do orifício no músculo. Tenha cuidado para observar quaisquer sinais de vasos sanguíneos cortados e sangue no campo cirúrgico.
- O testículo, o epidídimo, o cordão espermático anexado e o vaso sanguíneo serão aparentes quando os tecidos estiverem devidamente exteriorizados.
- Próximo à extremidade caudal-dorsal do epidídimo e testículo, há um ponto fibroso de fixação do testículo ao músculo cremaster. Enrole o tecido exteriorizado lateralmente para localizar esse ponto de inserção. Separar isso para evitar danos ao músculo e permitir maior isolamento e visualização dos tecidos. Use dois pares de pinças para realizar uma técnica de pinça e rasgo.
- Procure tecido gorduroso ao redor do testículo do coxim gorduroso inguinal. Use um par de pinças para agarrar a almofada de gordura e puxe suavemente para exteriorizá-la.
- Não pegue o vaso sanguíneo que viaja ao longo da almofada de gordura, pois puxar isso pode levar à hemorragia.
- Localize o cordão espermático, os vasos sanguíneos e o coxim adiposo remanescente que está proximal aos tecidos exteriorizados e use um par de hemostáticos para fixá-lo. Enquanto mantém uma leve tensão no testículo distal, cauterize o cordão espermático e os vasos sanguíneos distais à pinça do hemostático.
- Uma vez completa, solte lentamente a pinça proximal à extremidade cauterizada e verifique se há sinais de sangramento. Se presente, repita esta etapa. É útil usar um par de pinças para manter a tensão suave na extremidade distal do tecido que está sendo cauterizado.
- Permita que o coto cortado do cordão espermático se retraia de volta para o corpo. Pegue as duas pontas cortadas do músculo cremaster e junte-as. Avaliar o tamanho do corte no tecido e fechar o tecido com suturas absorvíveis 4-0 ou 5-0. Dependendo do tamanho da incisão, serão necessárias 1 ou 2 suturas. Aparar as extremidades da sutura até 0,5 cm usando tesoura de sutura.
- Repita os passos 1.13-1.20 do outro lado do escroto para remover o segundo testículo.
- Prepare-se para fechar a incisão na pele.
- Garantir boa hemostasia de ambos os cotos teciduais. Hemostasia deficiente resultará em sangramento residual no campo cirúrgico. Se isso ocorrer, localize o sangramento e cauterize. Isso é evitado pela manipulação lenta e cuidadosa dos tecidos com instrumentos contusos.
- Se houver sangue no campo cirúrgico, utilizar aplicador esterilizado com ponta de algodão para secar a área para melhor visualização. Use uma seringa para pingar soro fisiológico na área para irrigar qualquer sangue ou líquido longe do campo cirúrgico.
- Puxe os dois lados da incisão da pele juntos para prepará-la para o fechamento. Certifique-se de que as extremidades suturadas das incisões cremaster não estejam se projetando para a incisão da pele. Se necessário, corte ainda mais as extremidades da sutura.
- Feche a pele.
- Se estiver usando clipes de ferida, use pinças para evertar a pele e puxá-la para longe do tecido subjacente. Coloque um clipe da ferida centrado sobre a incisão. Verifique se a pele está bem cortada. Se a incisão for ligeiramente grande demais para que um clipe da ferida possa fechá-la suficientemente, a cola cirúrgica da pele pode ser aplicada nas porções superior e inferior da incisão.
- Se estiver usando suturas, coloque o número necessário de suturas através da pele, sem agarrar o tecido subjacente. Este tipo de incisão exigirá 2-3 suturas únicas interrompidas usando material de sutura inabsorvível 4-0.
- Limpe a pele ao redor do local cirúrgico suavemente com soro fisiológico e um aplicador esterilizado com ponta de algodão para remover qualquer sangue seco ou esfoliação antisséptica residual.
2. Ovariectomia murina
- Prepare um campo de trabalho asséptico e certifique-se de que os instrumentos cirúrgicos necessários foram esterilizados e estão prontamente disponíveis. Siga práticas assépticas para cirurgia de sobrevivência de roedores.
- Registre o peso do camundongo fêmea e administre o método de anestesia preferido de acordo com suas diretrizes institucionais. Nesse protocolo, isoflurano a 2% foi administrado por vaporizador de precisão para manutenção da anestesia. Antes do procedimento, administre medicamentos para dor de acordo com suas diretrizes institucionais. Nesse protocolo, 1,0 mg/kg de Buprenorfina SR e 5 mg/kg de Meloxicam foram administrados por via subcutânea.
- Administrar gel lubrificante nos olhos do animal para evitar a formação de lesões oculares, dessecação da córnea ou úlcera. Certifique-se de que uma fonte de calor esteja disponível para manter a temperatura corporal do animal durante a operação. Certifique-se do plano adequado de anestesia verificando se há uma resposta de pinça do dedo do pé.
- Preparar a área cirúrgica do animal antes de colocá-lo no campo cirúrgico.
- Faça a barba suave dos pelos na região dorsolateral das costas do animal usando um par de cortadores. Remova os pelos da região acima da borda superior dos quadris e abaixo da borda inferior da caixa torácica, bem como das áreas entre esses pontos de referência.
- Usando um aplicador com ponta de algodão, aplique uma camada de creme depilatório na pele do animal, cobrindo a área que acabou de ser raspada. Aguarde 30 s e retire o creme com um pedaço de gaze, retirando os pelos finos que restam.
- Use uma esponja de gaze embebida em etanol a 70% para limpar qualquer creme e cabelo restante da área cirúrgica.
OBS: O etanol 70% nesta etapa é para auxiliar na remoção completa do creme depilatório. O preparo antisséptico do sítio cirúrgico é realizado na etapa 2.5.
- Coloque o animal na posição lateral (para incisão para remover um ovário de cada vez) no campo cirúrgico e certifique-se de que uma fonte de calor está disponível. Esfregue a área operatória com esfoliação cirúrgica Betadine (ou uma esfoliação antisséptica semelhante à preparação da pele), seguida de álcool a 70% pelo menos três vezes para garantir a desinfecção adequada da pele. Para cada esfoliação, esfregue em um movimento radial para fora, de modo que o meio da incisão seja esfregado primeiro e a borda externa da área cirúrgica raspada seja esfregada por último.
- Neste momento, coloque luvas cirúrgicas estéreis. Para os próximos passos do procedimento, utilize técnicas assépticas. Coloque um pano cirúrgico com uma pequena incisão (corte um quadrado de aproximadamente 0,5-1 polegada no drape para caber no local cirúrgico) sobre o animal para que o corpo seja coberto com material de drape.
- Localize o local ideal para a incisão cirúrgica encontrando o ponto médio entre os quadris e as costelas do mouse (ver Figura 2). Segure a pele com pinça e faça uma incisão de 1,0 cm na pele neste local.
- Use um instrumento de ponta romba (sonda, espátula cirúrgica ou hemostáticos com ponta romba) para separar a pele do tecido muscular inferior. Reserve um tempo para fazer isso nas bordas lateral, superior e inferior da incisão.
- Localizar a parede muscular dorsolateral do abdome. Se necessário, remova o tecido adiposo que fica entre a pele e as camadas musculares. Em camundongos maduros, esse tecido adiposo é mais proeminente. Mova esse tecido adiposo em direção à extremidade caudal do camundongo, expondo a parede muscular.
- O tecido adiposo é diferenciado da parede abdominal pela cor: o tecido adiposo parece branco pálido e fica mais superficial, enquanto a parede abdominal aparece rósea e fica mais profunda do que o tecido adiposo.
- Segure a parede abdominal com pinça de dente de rato e faça uma incisão de 0,5 cm nela.
- Pegue uma borda dessa incisão com um par de pinças, use um segundo par para alcançar dentro da cavidade do corpo e encontre o ovário, o corno uterino e o coxim gorduroso. Puxe-o suavemente através da incisão na parede muscular para separar o músculo do tecido subjacente e exteriorizá-lo. Localize a transição entre o corno uterino e o ovário.
- Separe o ovário realizando uma técnica de esmagamento e rasgo.
- Coloque uma pinça na extremidade distal do corno uterino e coloque a segunda pinça apenas distal à primeira. Ao aplicar pressão firme com ambas as pinças, afaste a mais distal do corpo, rasgando a conexão entre elas. Para minimizar o sangramento e o dano tecidual, mantenha a pinça proximal estacionária durante esse processo e tenha cuidado para não afastá-la também do corpo.
- Alternativamente, use um cautério. Use um par de pinças ou hemostáticos para pinçar o corno uterino apenas proximal ao ponto de cautério desejado. Use uma ferramenta de cautério para cortar os tecidos.
- Solte suave e lentamente a pinça proximal e verifique se há sinais de sangramento.
- Permita que o coto de tecido recue para a cavidade do corpo. Agarre a parede abdominal e puxe suavemente para cima. Não force o coto de tecido para dentro, pois isso aumenta a probabilidade de sangramento.
- Localize as bordas da incisão na parede muscular e junte-as para se preparar para suturá-la.
- Coloque 1-2 suturas únicas interrompidas na parede muscular abdominal usando material de sutura absorvível 4-0. Aparar as extremidades da sutura até 0,5 cm usando tesoura de sutura.
- Fechar a incisão permitindo que a pele retorne ao seu estado natural de repouso e, em seguida, evertê-la para cima, tomando cuidado para não agarrar o tecido subjacente ou as extremidades do material de sutura. Coloque 1-2 clipes de ferida na pele evertida. Com base em suas diretrizes institucionais, a pele também pode ser fechada com material de sutura inabsorvível 4-0.
- Para remover o outro ovário, mude a posição do mouse para ter o outro lado voltado para cima. Seja suave ao mudar a posição do rato para não colocar muita pressão sobre a pele cortada da ferida a partir do passo 2.17.
- Neste lado, repita as etapas 2.5 - 2.17.
- Limpe a pele ao redor do local cirúrgico suavemente com soro fisiológico e um aplicador esterilizado com ponta de algodão para remover qualquer sangue seco ou esfoliação antisséptica residual.
3. Cuidados pós-operatórios
- De acordo com suas diretrizes institucionais, administre medicamentos para dor por até 72 h pós-operatório. Documentar o procedimento cirúrgico dos animais, anotando a data, hora, anestésico e analgésico utilizado. Aqui, a buprenorfina de liberação lenta e meloxicam é administrada no pré-operatório.
- Após a conclusão da cirurgia dos animais, transfira-os para uma gaiola limpa forrada com uma toalha de papel seca. Coloque esta gaiola 2/3 em uma fonte de calor, deixando o outro 1/3 da gaiola fora do fogo. Não coloque ratos juntos em uma gaiola até que eles tenham se recuperado da anestesia.
- Permita que o animal recupere a capacidade de andar livremente ao redor da gaiola antes de colocá-lo de volta em uma gaiola limpa com cama de animal normal. Neste momento, os ratos podem ser alojados juntos se todos tiverem se recuperado da anestesia.
- Nos primeiros dias após a cirurgia, certifique-se de que a comida e a água úmidas sejam facilmente acessíveis. Coloque alguns alimentos umedecidos no fundo da gaiola. Verifique frequentemente o local cirúrgico do mouse e procure sinais de infecção ou sangramento.
- Após a cirurgia, certifique-se de que os ratos sejam alojados sozinhos ou com outros animais que tenham sido submetidos ao mesmo procedimento simultaneamente. Um camundongo que se recupera de uma cirurgia localizada na mesma gaiola que um sem cirurgia pode apresentar um risco e deve ser evitado.
- Para camundongos que foram submetidos à ooforectomia e têm clipes de feridas nos lados dorsolaterais das costas, remova quaisquer habitats de iglu de roedores da gaiola para reduzir a chance de o clipe da ferida do rato ficar preso no iglu durante a primeira semana de cicatrização.
- Continue monitorando o animal em busca de sinais de infecção, dor ou complicações cirúrgicas a cada 12 h durante as primeiras 72 h do tempo de cicatrização.
- Remova clipes de ferida usando uma ferramenta de remoção de clipe de ferida 10-14 dias após a cirurgia.
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Representative Results
O procedimento aqui apresentado é realizado em camundongos de um a três meses de idade no fundo C57BL/6J. Camundongos machos pesavam 16-28 g, e camundongos fêmeas pesavam 14-24 g no momento do procedimento. Este procedimento foi otimizado para ser aplicável em camundongos de várias idades, desde o desmame até a idade adulta.
A orquiectomia cirúrgica envolve uma única incisão cutânea no saco escrotal ventral, como mostra a Figura 1A. Ambos os testículos são removidos um de cada vez e são seccionados através dos ductos deferentes e vasos sanguíneos espermáticos, resultando na remoção do testículo e epidídimo aderido (Figura 1B). O conteúdo removido inclui testículo, epidídimo e coxim gorduroso inguinal, mostrados na Figura 1C. A remoção bem-sucedida dos testículos pode ser confirmada pela observação visual dos tecidos removidos e pela garantia de boa hemostasia do coto tecidual antes do fechamento da cavidade corporal. O sucesso da orquiectomia pode ser medido pela observação de camundongos bem recuperados que demonstram locais de incisão cicatrizados (Figura 1D). Camundongos que foram submetidos à orquiectomia também demonstrarão uma redução no nível de testosterona medido no soro de camundongos já uma semana após o procedimento (Figura 1E).
A ooforectomia bilateral cirúrgica é feita por incisões no dorso esquerdo e direito de camundongos fêmeas (Figura 2A). A abordagem da incisão lateral pode ser usada se apenas um ovário for removido. Nessa abordagem, a parede abdominal é incisada e o coxim gorduroso ovariano é localizado. O coxim gorduroso, ovário, ducto ovariano e corno uterino distal, representados na Figura 2B, são exteriorizados, seguidos de corte do corno uterino distal. Esta técnica resulta na remoção do ovário e oviduto. O ovário e o ducto ovariano podem ser removidos sem incluir o corno uterino distal, mas há o risco de que as células ovarianas remanescentes continuem a manter a rata em ciclos estrais. Incluir o corno uterino distal garante que o ovário e o ducto completos sejam removidos, haverá uma depleção dos hormônios sexuais e os camundongos não circularão mais. A Figura 2C mostra um exemplo dos órgãos reprodutores femininos murinos dissecados para fora do corpo. Pode-se observar que os próprios ovários são muito menores do que os tecidos circundantes. Uma sonorização de dissecção ou lupas auxilia na identificação desses tecidos. A Figura 2D demonstra a anatomia ovariana sob um escopo dissecante com tecido do coxim adiposo uterino retirado, permitindo melhor visualização. O sucesso desse procedimento pode ser medido pela observação de camundongos bem recuperados que demonstram locais de incisão cicatrizados (Figura 2E).
A cirurgia de ooforectomia é segura e eficiente quando realizada rapidamente e com o mínimo de perturbação dos tecidos circundantes. Seguir o procedimento descrito aqui consegue garantir que a pele e a incisão da parede abdominal sejam posicionadas corretamente, permitindo a rápida localização dos tecidos uterinos. A identificação da borda inferior da caixa torácica e da borda superior dos ossos da perna garante que a incisão seja feita próxima ao tecido de interesse. A incisão que fica a meio caminho entre a borda inferior das costelas e a borda superior dos ossos da perna e está localizada cerca de 1,5 cm lateral à coluna vertebral permite um bom posicionamento do sítio cirúrgico ao realizar uma abordagem de incisão lateral (Figura 2A).
A confirmação da ooforectomia cirúrgica é demonstrada pela observação da atrofia uterina. A Figura 2F mostra um corno uterino dissecado de uma rata de 6 meses de idade, enquanto a Figura 2G mostra um corno uterino de uma rata de 6 meses de idade submetida à ooforectomia cirúrgica aos três meses de idade. O corno uterino ovariectomizado parece mais fino e não tem a fixação ao ovário na extremidade distal. Este método de confirmação da técnica cirúrgica mostra efetivamente que a remoção do ovário resultou em atrofia do tecido uterino.
Uma vez que os tecidos tenham sido identificados e excisados com sucesso, a cirurgia pode ser concluída com o fechamento das feridas e monitoramento pós-operatório cuidadoso. A técnica assépticaadequada14 é importante para garantir bons resultados na realização da cirurgia de sobrevida. À medida que o rato começa a cicatrizar a partir das incisões, o monitoramento é realizado para procurar sinais de dor e complicações cirúrgicas. Uma possível complicação cirúrgica é o sangramento interno por causa de cutucar ou cortar vasos sanguíneos ao tentar incisar ou manipular o tecido. Isso é denotado por uma aparência vermelha e ruborizada persistente sob a pele ao redor do local cirúrgico. Evitar complicações como essas é conseguido pela localização adequada dos locais de incisão e auxiliando a visão do cirurgião pelo uso de um microscópio cirúrgico ou lupas . O exame visual é recomendado a cada 12 horas nos primeiros três dias pós-operatórios. A cirurgia bem-sucedida resultará em feridas limpas e cicatrizantes (Figura 1D, 2E).
Figura 1: Orquiectomia murina masculina . (A) Um camundongo macho é mostrado na posição supina com a localização de uma incisão cirúrgica no saco escrotal para a remoção do testículo, que é mostrado em vermelho. (B) Imagem obtida durante o procedimento cirúrgico de orquiectomia mostrando o ponto de descolamento em verde. (C) Testículo dissecado, coxins gordurosos e epidídimo de camundongo macho. (D) Camundongo macho com clipe bem cicatrizado sobre a incisão escrotal após orquiectomia. (E) Concentração de testosterona sérica de camundongo em ng/mL determinada por interpolação por ELISA. Ambos os grupos representam camundongos de 9 semanas de idade. As orquiectomias cirúrgicas foram realizadas com 8 semanas de idade. N = 3 camundongos por grupo. As amostras foram executadas em triplicata. As amostras de soro foram coletadas por punção cardíaca e congeladas até o momento da análise. *, p < 0,05. Barras de erro = SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ooforectomia murina feminina . (A) Camundongo fêmea mostrado em decúbito lateral com o local da incisão cirúrgica para a retirada de um único ovário do lado dorsal lateral, mostrado em vermelho. Outros marcos anatômicos importantes são destacados. (B) Imagem obtida durante a cirurgia mostrando ovário exteriorizado, oviduto e corno uterino distal com o ponto de descolamento mostrado em verde. (C) Cornos uterinos dissecados, ovários e coxins gordurosos de uma rata. (D) Vista de perto do ovário dissecado, ducto ovariano e porção distal do corno uterino com retirada de gordura do coxim gorduroso, permitindo melhor visualização do ovário. (E) Camundongo fêmea com clipe de ferida bem cicatrizado sobre a incisão após ooforectomia. (F) Corno uterino de camundongo dissecado. (G) Corno uterino dissecado de camundongo 3 meses após ooforectomia, mostrando atrofia uterina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resumo gráfico para ooforectomia murina e orquiectomia. Uma representação pictórica do procedimento de orquiectomia para camundongos machos envolvendo a remoção do testículo e o procedimento de ooforectomia envolvendo a remoção dos ovários, ambos resultando em um modelo de camundongo com depleção de hormônio sexual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A remoção cirúrgica de testículos e ovários permite estudar a fisiologia murina sob privação hormonal controlada. Essa técnica é importante para vários campos da ciência, incluindo neurodegeneração, metabolismo mineral, saúde cardiovascular e reprodutiva 15,16,17,18,19,20,21. Aqui, detalhamos um protocolo para a remoção rápida, segura e eficaz de ovários murinos e testículos usando cirurgia de sobrevivência para esgotar os hormônios sexuais. Quando realizados por um cirurgião experiente, esses procedimentos podem levar apenas 5 minutos, resultando em uma taxa de sobrevivência muito alta em camundongos.
Algumas considerações ao planejar uma cirurgia em camundongo incluem o melhor local de incisão e a fisiologia do animal. No caso da orquiectomia, o testículo de camundongos também pode ser removido através do abdome por uma incisão ventral na linha média13. Essa técnica não só abre a cavidade peritoneal, mas também conta com a rápida identificação dos coxins gordurosos inguinais. Para os novos cirurgiões, é difícil realizar rapidamente esta técnica. Quando os ratos são muito jovens, as almofadas de gordura também são menos desenvolvidas e, portanto, mais difíceis de localizar. A abordagem escrotal descrita neste protocolo é uma opção adequada para pesquisadores que são novos na cirurgia de camundongos, operando em camundongos pequenos e jovens, ou que desejam minimizar a chance de perturbar outros órgãos na cavidade peritoneal por uma incisão abdominal.
A ooforectomia cirúrgica envolve a remoção de um ou ambos os ovários. Como para a maioria dos procedimentos cirúrgicos, os métodos seguros e rápidos geralmente envolvem tornar a incisão na pele e na fáscia subjacente o menor possível. Isso permite suturas e clipes de feridas reduzidos e cicatrização mais rápida. Embora ser capaz de tornar as incisões menores seja uma habilidade que vem com a prática, estar confiante sobre a localização da incisão é benéfico. A Figura 2A demonstra um exemplo de como localizar os melhores pontos de incisão. Devido à anatomia do pequeno rato, o ovário ficará perto do fígado, e no lado esquerdo do rato, perto do baço. Acidentalmente sondar e puxar esses órgãos pode resultar em sangramento indesejado ou danos. Fornecemos um guia detalhado para a localização correta da incisão e identificação dos pontos anatômicos circundantes para auxiliar nesta técnica e reduzir a probabilidade de complicações adversas.
Aqui, fornecemos um exemplo de como esse procedimento pode ser usado para efetivamente derrubar os níveis de hormônio circulante em camundongos menos de uma semana após o procedimento cirúrgico, bem como como o tecido gonadal remanescente atrofia ao longo do tempo após o procedimento. Métodos e pesquisas anteriores detalham como eles podem ser feitos para gerar modelos de menopausa ou andropausa em camundongos, mas muitos deles são realizados em modelos de ratas e não em camundongos12,22. Enquanto ratos e camundongos têm anatomia semelhante, o sistema murino tem estruturas anatômicas menores. Aqui, fornecemos um método que funciona de forma confiável em modelos de camundongos a partir de 3 semanas de idade. Em geral, esses dois protocolos representam uma maneira consistente de realizar rapidamente orquiectomias e ovariectomias de roedores de sobrevida, reconhecer a anatomia de camundongos e minimizar complicações cirúrgicas, criando uma base para resultados consistentes e eficazes.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Centro de Recursos Animais do Centro Médico do Sudoeste do Texas por sua ajuda no treinamento cirúrgico e revisão de protocolos. Agradecemos à equipe de suporte do Wert Lab por sua inestimável assistência. Este trabalho foi apoiado por fundos do National Institute of Health (NIH P30EY030413). Biorender.com foi usado para a criação de esquemas de desenhos animados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
