Summary
Dit manuscript beschrijft een consistente manier om snel overleving uit te voeren knaagdierorchidtomieën en ovariëctomieën.
Abstract
Geslachtshormoonsignalering speelt een cruciale rol in meerdere orgaansystemen en bij de progressie van verschillende ziekten, waaronder neurodegeneratieve ziekten. De manipulatie van geslachtshormoonspiegels in het muizenmodelsysteem maakt het mogelijk om hun impact op organen/weefsels en binnen ziekteprogressie te bestuderen. Orchiectomie - de chirurgische verwijdering van de teelballen - en ovariëctomie - de chirurgische verwijdering van de eierstokken - bieden een methode om de endogene geslachtshormonen uit te putten, zodat de precieze hormoonspiegels kunnen worden geleverd door middel van medicijnen of andere toedieningsmethoden. Hier bieden we snelle en minimaal invasieve methoden voor zowel orchidectomie als ovariëctomie in het muizenmodelsysteem voor de vermindering van geslachtshormonen. Dit protocol beschrijft de chirurgische voorbereiding en excisie van de teelballen door de scrotumzak en excisie van de eierstokken via twee incisies in het rechter en linker laterale dorsum.
Introduction
De teelballen en eierstokken zijn de primaire organen die verantwoordelijk zijn voor de productie van geslachtshormonen. De cascade van hormonale communicatie die leidt tot de productie van testosteron en oestrogeen is een goed gekarakteriseerd proces dat begint in de hypothalamus met de afgifte van gonadotropine-releasing hormoon (GnRH)1. De afgifte van GnRH veroorzaakt de afgifte van luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) uit de hypofyse. Als deze hormonen in de bloedbaan terechtkomen, beïnvloeden ze andere weefsels in het lichaam. Het primaire doelwit van LH zijn de teelballen (bij mannen) en de eierstokken (bij vrouwen)2. Als reactie op LH produceren de teelballen testosteronen geven het testosteron af. Evenzo produceren de eierstokken oestrogeen4. Hoewel de beoogde effecten van deze hormonen zijn om de cellen en het lichaam voor te bereiden op bevruchting en te zorgen voor een functionerend voortplantingssysteem, kunnen veel andere lichaamssystemen worden beïnvloed.
Geslachtshormonen zijn in verband gebracht met verschillende fysiologische functies. Oestrogeen helpt bijvoorbeeld de bothomeostase te handhaven door de resorptie van bot door osteoclasten te voorkomen. Om deze reden kunnen ovariëctomische muismodellen worden gebruikt om de fysiologie van botziekten zoals osteoporose te bestuderen 5,6,7. Testosteron en oestrogeen zijn ook onderzoeksdoelen voor veel cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten. Onlangs is een verhoogde testosteronproductie in combinatie met een vetrijk dieet in verband gebracht met vasculaire oxidatieve stress. In de hersenen hebben veranderingen in LH na ovariëctomie veranderingen in het ruimtelijk geheugen veroorzaakt9. Vermindering van oestrogenen na ovariëctomie is ook een modelsysteem geworden voor het bestuderen van celdood in de hippocampus, omdat dit apoptose kan induceren, wat resulteert in geheugenstoornissen10. Testosteron heeft ook een rol getoond bij de groei van de nieren, zowel in muismodellen als bij mensen na niertransplantatie11.
De creatie van een hormoonarm muizenmodel maakt het mogelijk om geslachtshormonen en hun hormooncascades op verschillende ziekten of weefsels te bestuderen. Dit kan worden bereikt door chirurgische verwijdering van de teelballen (orchidectomie) of eierstokken (ovariëctomie). Deze procedure kan worden uitgevoerd bij muizen van elke stam wanneer ze zo jong zijn als de speenleeftijd (eenentwintig dagen) of elke volwassen leeftijd. Ovariëctomie wordt uitgevoerd bij vrouwelijke muizen, terwijl orchidectomie wordt uitgevoerd bij mannelijke muizen. Door deze organen te verwijderen, kunnen de niveaus van oestrogeen en testosteron, en veel van hun derivaten, zoals progesteron, sterk worden verlaagd12,13. Het proces van het uitvoeren van orchidectomieën of ovariëctomieën bij muizen kan met de juiste techniek snel en minimaal invasief zijn. Snelle excisie van deze organen op een veilige en efficiënte manier kan een snelle chirurgische verwerking mogelijk maken, terwijl het aantal muizen minimaal wordt gehouden door een overlevingspercentage van 100% te hebben wanneer het correct wordt uitgevoerd. Hier beschrijven we een protocol voor de snelle excisie van de testikels en eierstokken en demonstreren we de juiste postoperatieve monitoring om onderzoekers in staat te stellen deze operatie snel en veilig uit te voeren. We voegen ook visuele voorbeelden toe van de geslachtsorganen en omliggende weefsels om de chirurg anatomische oriëntatiepunten te bieden bij het uitvoeren van deze procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van UTSW (APN#2019-102840).
1. Muizen orchidectomie
- Bereid een aseptisch werkveld voor en zorg ervoor dat de benodigde chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerd en direct beschikbaar zijn. Volg aseptische praktijken voor overlevingschirurgie bij knaagdieren.
- Noteer het gewicht van de mannelijke muis en dien de voorkeursmethode van anesthesie toe volgens de institutionele richtlijnen. In dit protocol werd 2% isofluraan toegediend via een precisieverdamper om de anesthesie te behouden. Dien vóór de procedure pijnstillers toe volgens de richtlijnen van de instelling. In dit protocol werden 1,0 mg/kg Buprenorfine SR en 5 mg/kg Meloxicam subcutaan toegediend.
- Zodra de muis onder narcose is, bedek je de ogen van het dier met smerende ooggel om de vorming van oogletsel, uitdroging van het hoornvlies of zweren te voorkomen.
- Voordat u verder gaat, moet u zorgen voor het juiste anesthesievlak door een teenknijpresponstest uit te voeren.
- Bereid het operatiegebied van het dier voor voordat u het op het aseptische, gedrapeerde operatieveld plaatst.
- Scheer vervolgens de lies- en scrotumgebieden van de muis met een tondeuse.
OPMERKING: Het scheren van de onderbuik boven de penis zorgt voor een betere visualisatie tijdens de operatie. - Breng met een wattenstaafapplicator een dunne laag ontharingscrème (zie Materiaaltabel) aan op de huid van het dier, waarbij u het scrotum en het omliggende gebied dat zojuist is geschoren bedekt. Wacht 30 s en verwijder de crème met een stuk schoon gaas.
- Gebruik 70% met ethanol doordrenkte gaassponzen om eventuele resterende crème en haar van het gebied te vegen.
OPMERKING: 70% ethanol in deze stap is om te helpen bij het volledig verwijderen van ontharingscrème. Antiseptische voorbereiding van de operatieplaats wordt uitgevoerd in stap 1.8.
- Scheer vervolgens de lies- en scrotumgebieden van de muis met een tondeuse.
- Breng de muis over naar het operatiegebied en zorg ervoor dat er een warmtebron beschikbaar is om de lichaamstemperatuur van het dier tijdens de operatie op peil te houden. Leg het dier in rugligging op een chirurgisch laken en gebruik zacht plakband om de poten van de muis aan de operatiemat te hechten.
- Als de teelballen opstijgen in de buik, palperen dan voorzichtig de buik om de teelballen te laten dalen. Gebruik een gehandschoende hand om lichte roldruk naar beneden op de buik uit te oefenen.
OPMERKING: Het is gemakkelijker om deze operatie uit te voeren onder een dissectiescoop of met behulp van een loepbril voor een betere vergroting. Als u dit onder een dissectiescoop uitvoert, neem dan even de tijd om het scrotum van de muis onder het gezichtsveld van de scoop te plaatsen. Een zachte tape kan worden gebruikt om de poten of buik van de muis aan het operatieveld te hechten om ervoor te zorgen dat deze op de juiste plaats blijft. - Scrub de huid met Betadine chirurgische scrub (of een vergelijkbare antiseptische scrub voor de huid), gevolgd door een scrub met 70% alcohol ten minste drie keer om een goede desinfectie van de huid te garanderen. Schrob voor elke scrub in een radiale beweging naar buiten, zodat het midden van de incisieplaats eerst wordt geschrobd en eindigt met de buitenrand van het geschoren operatiegebied dat als laatste wordt geschrobd.
- Trek op dit moment steriele chirurgische handschoenen aan. Gebruik voor de volgende stappen van de procedure aseptische technieken. Bedek de muis met een steriel chirurgisch laken met een kleine incisie (gesneden tot ongeveer 0,5-1 inch in het vierkant om over de operatieplaats te passen) over het dier om het lichaam in het afdekmateriaal te bedekken.
- Maak een ventrale middellijnincisie in het scrotum van ongeveer 1 cm -1,5 cm lang met behulp van een chirurgisch scalpelmesje of soortgelijke instrumenten volgens de door u goedgekeurde institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn.
- Pak de snijrand van de huid vast en gebruik een stomp instrument om de huid van het onderliggende weefsel te scheiden. Neem de tijd om dit te doen aan de laterale, superieure en inferieure randen van de incisie.
- Isoleer een testikel door de spatel en pincet te gebruiken om de incisie in de huid te verplaatsen om bovenop een van de testikels te worden gecentreerd. Als dit moeilijk is, ga dan terug naar 1.11 en scheid de huid verder van de onderste lagen.
- Neem een gebogen pincet en plaats deze aan weerszijden van de zaadbal. Oefen een zachte neerwaartse druk uit om de zaadbal naar buiten te brengen. Pak met een tang de dunne, transparante spierlaag vast die bovenop de zaadbal ligt. Dit is de cremaster-spier. Verificatie van de juiste spierlaag wordt gemaakt door deze laag en de circulatie ervan te observeren, onafhankelijk van de testikel eronder.
OPMERKING: De identificatie van het juiste weefsel wordt bevestigd door de transparantie en het vermogen om onafhankelijk van de onderliggende weefsels te bewegen.- Manipuleer het spierweefsel met een pincet totdat de top van de spier is vastgepakt. Dit moet het laagste deel zijn, met daaronder de teelballen en de cauda epididymis.
- Pak de cremaster-spier vast met een tang en beweeg voorzichtig weg van de teelballen en bijbal. Maak een incisie van 0,5 cm door de cremaster-spier van de eerste testikel aan de top met behulp van een kleine Vannas-veerschaar.
- Plaats een vergrendelingsklem op de achterrand van de gesneden cremasterspier. Gebruik een smal paar hemostaten of een paar vergrendelbare micronaaldhouders. Zodra het weefsel is vastgeklemd, legt u het instrument voorzichtig op de zijkant van de muis om het weefsel vastgeklemd te houden tijdens de volgende procedurele stappen.
- Gebruik een pincet om de bovenrand van de incisie die in stap 1.14 is gemaakt vast te pakken. Terwijl de twee uiteinden van de cremaster-spier worden ingetrokken, gebruik je een andere pincet om in de holte te reiken en pak je de zaadbal voorzichtig vast.
- Trek het naar buiten door het gat in de spier. Let goed op tekenen van ingescheurde bloedvaten en bloed in het operatieveld.
- De zaadbal, de bijbal, de aangehechte zaadstreng en het bloedvat zullen zichtbaar zijn wanneer de weefsels op de juiste manier worden geëxternaliseerd.
- In de buurt van het caudale-dorsale uiteinde van de bijbal en de zaadbal bevindt zich een vezelig aanhechtingspunt van de zaadbal aan de cremaster-spier. Rol het geëxterioriseerde weefsel zijwaarts om dit inbrengpunt te lokaliseren. Snijd dit door om schade aan de spier te voorkomen en verdere isolatie en visualisatie van weefsels mogelijk te maken. Gebruik twee pincetten om een klem- en scheurtechniek uit te voeren.
- Zoek naar vetweefsel rond de zaadbal van het liesvetkussentje. Gebruik een pincet om het vetkussen vast te pakken en trek er voorzichtig aan om het naar buiten te brengen.
- Pak het bloedvat dat langs het vetkussen loopt niet vast, omdat hieraan trekken kan leiden tot bloedingen.
- Lokaliseer de zaadstreng, bloedvaten en het resterende vetkussen dat zich proximaal van de geëxterioriseerde weefsels bevindt en gebruik een paar hemostaten om het vast te klemmen. Terwijl u lichte spanning op de distale zaadbal houdt, schroeit u de zaadstreng en bloedvaten distaal van de hemostaatklem dicht.
- Als u klaar bent, laat u de klem proximaal van het dichtgeschroeide uiteinde langzaam los en controleert u op tekenen van bloeding. Herhaal deze stap, indien aanwezig. Het is nuttig om een pincet te gebruiken om lichte spanning vast te houden op het distale uiteinde van het weefsel dat wordt dichtgeschroeid.
- Laat de afgesneden stomp van de zaadstreng zich terugtrekken in het lichaam. Pak de twee afgesneden uiteinden van de cremaster-spier vast en breng ze samen. Beoordeel de grootte van de snee in het weefsel en sluit het weefsel met 4-0 of 5-0 resorbeerbare hechtingen. Afhankelijk van de grootte van de incisie zijn 1 of 2 hechtingen nodig. Knip de hechtdraaduiteinden af tot 0,5 cm met een hechtschaar.
- Herhaal stap 1.13-1.20 aan de andere kant van het scrotum om de tweede zaadbal te verwijderen.
- Bereid je voor om de huidincisie te sluiten.
- Zorg voor een goede hemostase van beide weefselstompen. Slechte hemostase zal resulteren in resterende bloedingen in het chirurgische veld. Als dit gebeurt, lokaliseer dan de bloeding en schroei dicht. Dit wordt vermeden door langzame en zorgvuldige manipulatie van de weefsels met stompe instrumenten.
- Als er bloed wordt gezien in het operatieveld, gebruik dan een gesteriliseerde applicator met wattenstaafje om het gebied te drogen voor een betere visualisatie. Gebruik een spuit om zoutoplossing op het gebied te druppelen om bloed of vloeistof weg te irrigeren van het operatieveld.
- Trek de twee zijden van de huidincisie samen om deze voor te bereiden op sluiting. Zorg ervoor dat de gehechte uiteinden van de cremaster-incisies niet in de huidincisie uitsteken. Knip indien nodig de uiteinden van de hechting verder af.
- Sluit de huid.
- Als u wondklemmen gebruikt, gebruik dan een tang om de huid af te sluiten en weg te trekken van het onderliggende weefsel. Plaats een wondklem gecentreerd over de incisie. Controleer of de huid goed is geknipt. Als de incisie iets te groot is voor één wondclip om deze voldoende te sluiten, kan chirurgische huidlijm worden aangebracht op de bovenste en inferieure delen van de incisie.
- Als u hechtingen gebruikt, plaats dan het benodigde aantal hechtingen door de huid, zonder het onderliggende weefsel vast te pakken. Voor dit type incisie zijn 2-3 enkelvoudige onderbroken hechtingen nodig met 4-0 niet-resorbeerbaar hechtmateriaal.
- Reinig de huid rond de operatieplaats voorzichtig met zoutoplossing en een gesteriliseerde applicator met wattenstaafje om opgedroogd bloed of resterende antiseptische scrub te verwijderen.
2. Ovariëctomie bij muizen
- Bereid een aseptisch werkveld voor en zorg ervoor dat de benodigde chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerd en direct beschikbaar zijn. Volg aseptische praktijken voor overlevingschirurgie bij knaagdieren.
- Noteer het gewicht van de vrouwelijke muis en dien de gewenste anesthesiemethode toe volgens de richtlijnen van uw instelling. In dit protocol werd 2% isofluraan toegediend via een precisieverdamper om de anesthesie te behouden. Dien vóór de procedure pijnstillers toe volgens de richtlijnen van uw instelling. In dit protocol werden 1,0 mg/kg Buprenorfine SR en 5 mg/kg Meloxicam subcutaan toegediend.
- Breng smerende ooggel aan op de ogen van het dier om oogletsel, uitdroging van het hoornvlies of een maagzweer te voorkomen. Zorg ervoor dat er een warmtebron beschikbaar is om de lichaamstemperatuur van het dier tijdens de operatie op peil te houden. Zorg voor het juiste anesthesievlak door te controleren op een teenknijpreactie.
- Bereid het operatiegebied van het dier voor voordat u het in het operatieveld plaatst.
- Scheer het haar voorzichtig op het dorsolaterale gebied van de rug van het dier met een tondeuse. Verwijder haar uit het gebied boven de bovenste rand van de heupen en onder de onderste rand van de ribbenkast, evenals de gebieden tussen deze oriëntatiepunten.
- Breng met een wattenstaafje een laag ontharingscrème aan op de huid van het dier en bedek het zojuist geschoren gebied. Wacht 30 seconden en verwijder de crème met een stuk gaas, verwijder de fijne haartjes die overblijven.
- Gebruik een met 70% ethanol doordrenkte gaasspons om eventuele resterende crème en haar uit het operatiegebied te vegen.
OPMERKING: 70% ethanol in deze stap is om te helpen bij het volledig verwijderen van ontharingscrème. Antiseptische voorbereiding van de operatieplaats wordt uitgevoerd in stap 2.5.
- Plaats het dier in de zijligging (voor incisie om één eierstok tegelijk te verwijderen) in het operatieveld en zorg ervoor dat er een warmtebron beschikbaar is. Scrub het operatiegebied met Betadine chirurgische scrub (of een vergelijkbare antiseptische scrub voor de huid), gevolgd door 70% alcohol ten minste drie keer om een goede desinfectie van de huid te garanderen. Schrob voor elke scrub in een radiale beweging naar buiten, zodat het midden van de incisie eerst wordt geschrobd en de buitenrand van het geschoren operatiegebied als laatste wordt geschrobd.
- Trek op dit moment steriele chirurgische handschoenen aan. Gebruik voor de volgende stappen van de procedure aseptische technieken. Plaats een chirurgisch laken met een kleine incisie erin (knip een vierkant van ongeveer 0,5-1 inch in het laken om op de operatieplaats te passen) over het dier zodat het lichaam bedekt is met drapermateriaal.
- Lokaliseer de ideale locatie voor de chirurgische incisie door het midden tussen de heupen en ribben van de muis te vinden (zie figuur 2). Pak de huid vast met een pincet en maak op deze plaats een incisie van 1,0 cm in de huid.
- Gebruik een stomp instrument (sonde, chirurgische spatel of stompe hemostaten) om de huid van het onderliggende spierweefsel te scheiden. Neem de tijd om dit te doen aan de laterale, superieure en inferieure randen van de incisie.
- Lokaliseer de dorsolaterale spierwand van de buik. Verwijder indien nodig vetweefsel dat tussen de huid- en spierlagen ligt. Bij volwassen muizen is dit vetweefsel prominenter aanwezig. Verplaats dit vetweefsel naar het caudale uiteinde van de muis, waardoor de spierwand bloot komt te liggen.
- Vetweefsel onderscheidt zich van de buikwand door kleur: vetweefsel lijkt bleekwit en ligt oppervlakkiger, terwijl de buikwand roze lijkt en dieper ligt dan het vetweefsel.
- Pak de buikwand vast met een rattentandtang en maak er een incisie van 0,5 cm in.
- Pak een rand van deze incisie vast met één pincet, gebruik een tweede paar om in de lichaamsholte te reiken en zoek de eierstok, baarmoederhoorn en vetkussen. Trek dit voorzichtig door de incisie in de spierwand om de spier te scheiden van het onderliggende weefsel en naar buiten te brengen. Lokaliseer de overgang tussen de baarmoederhoorn en de eierstok.
- Snijd de eierstok door een verbrijzelings- en scheurtechniek uit te voeren.
- Plaats een klem op het distale uiteinde van de baarmoederhoorn en plaats de tweede klem net distaal van de eerste. Terwijl u stevige druk uitoefent met beide klemmen, beweegt u de meer distale weg van het lichaam, waarbij u de verbinding ertussen verscheurt. Om bloedingen en weefselbeschadiging tot een minimum te beperken, moet u de proximale klem tijdens dit proces stationair houden en oppassen dat u deze niet ook van het lichaam wegtrekt.
- U kunt ook een cauterisatie gebruiken. Gebruik een pincet of hemostaat om de baarmoederhoorn net proximaal van het gewenste cauterisatiepunt vast te klemmen. Gebruik een cauterisatietool om de weefsels door te snijden.
- Laat de proximale klem voorzichtig en langzaam los en controleer op tekenen van bloeding.
- Laat de weefselstomp zich terugtrekken in de lichaamsholte. Pak de buikwand vast en trek deze voorzichtig omhoog. Forceer de weefselstomp niet naar binnen, omdat dit de kans op bloedingen vergroot.
- Lokaliseer de randen van de incisie in de spierwand en breng ze samen om je voor te bereiden op het hechten.
- Plaats 1-2 enkelvoudige onderbroken hechtingen in de buikspierwand met behulp van 4-0 resorbeerbaar hechtmateriaal. Knip de hechtdraaduiteinden af tot 0,5 cm met een hechtschaar.
- Sluit de incisie door de huid terug te laten keren naar zijn natuurlijke rusttoestand en vervolgens naar boven te brengen, waarbij u ervoor zorgt dat u het onderliggende weefsel of de uiteinden van het hechtmateriaal niet vastpakt. Plaats 1-2 wondklemmen op de geëverteerde huid. Op basis van de richtlijnen van uw instelling kan de huid ook worden gesloten met 4-0 niet-resorbeerbaar hechtmateriaal.
- Om de andere eierstok te verwijderen, verandert u de positie van de muis zodat de andere zijkant naar boven wijst. Wees voorzichtig bij het veranderen van de positie van de muis om niet te veel druk uit te oefenen op de gewond geknipte huid uit stap 2.17.
- Herhaal aan deze kant stap 2.5 - 2.17.
- Reinig de huid rond de operatieplaats voorzichtig met zoutoplossing en een gesteriliseerde applicator met wattenstaafje om opgedroogd bloed of resterende antiseptische scrub te verwijderen.
3. Postoperatieve zorg
- Dien, volgens de richtlijnen van uw instelling, pijnstillers toe tot 72 uur na de operatie. Documenteer de chirurgische ingreep van de dieren en noteer de datum, tijd, verdoving en pijnstiller die zijn gebruikt. Hier worden buprenorfine met langzame afgifte en meloxicam preoperatief toegediend.
- Breng de dieren na voltooiing van de operatie over naar een schone kooi bekleed met een droge papieren handdoek. Plaats deze kooi 2/3 op een warmtebron en laat de andere 1/3 van de kooi van het vuur. Plaats muizen niet samen in een kooi totdat ze hersteld zijn van de anesthesie.
- Laat het dier weer vrij door de kooi lopen voordat u het terugplaatst in een schone kooi met normaal strooisel. Op dit moment kunnen muizen samen worden gehuisvest als ze allemaal zijn hersteld van anesthesie.
- Zorg er de eerste paar dagen na de operatie voor dat vochtig voedsel en water gemakkelijk toegankelijk is. Leg wat bevochtigd voedsel op de bodem van de kooi. Controleer regelmatig de operatieplaats van de muis en zoek naar tekenen van infectie of bloeding.
- Zorg er na de operatie voor dat muizen alleen worden gehuisvest of met andere dieren die tegelijkertijd dezelfde procedure hebben ondergaan. Een muis die herstelt van een operatie en zich in dezelfde kooi bevindt als een muis zonder operatie, kan een gevaar opleveren en moet worden vermeden.
- Voor muizen die een ovariëctomie hebben ondergaan en wondklemmen aan de dorsolaterale zijden van de rug hebben, verwijdert u alle knaagdieriglo uit de kooi om de kans te verkleinen dat de wondclip van de muis tijdens de eerste week van genezing vast komt te zitten aan de iglo.
- Blijf het dier elke 12 uur controleren op tekenen van infectie, pijn of chirurgische complicaties gedurende de eerste 72 uur van de genezingstijd.
- Verwijder wondklemmen 10-14 dagen na de operatie met behulp van een wondklemverwijderaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde procedure wordt uitgevoerd bij muizen van één tot drie maanden oud op de C57BL/6J-achtergrond. Mannelijke muizen wogen 16-28 g en vrouwelijke muizen wogen 14-24 g op het moment van de procedure. Deze procedure is geoptimaliseerd om toepasbaar te zijn voor muizen van vele leeftijden, van het spenen tot de volwassenheid.
Chirurgische orchidectomie omvat een enkele incisie in de ventrale scrotumzak, zoals afgebeeld in figuur 1A. Beide testikels worden één voor één verwijderd en worden doorgesneden via de zaadleider en zaadcellen, wat resulteert in de verwijdering van de testis en de aangehechte bijbal (Figuur 1B). De verwijderde inhoud omvat de testis, de bijbal en het liesvetkussentje, weergegeven in figuur 1C. Succesvolle verwijdering van de testikels kan worden bevestigd door visuele observatie van verwijderde weefsels en het zorgen voor een goede hemostase van de weefselstomp voordat de lichaamsholte wordt gesloten. Het succes van orchidectomie kan worden gemeten door observatie van goed herstelde muizen die genezen incisieplaatsen vertonen (Figuur 1D). Muizen die een orchidectomie hebben ondergaan, zullen ook al een week na de procedure een verlaging van het testosterongehalte in muizenserum vertonen (Figuur 1E).
Chirurgische bilaterale ovariëctomie wordt gedaan door incisies in het linker- en rechterdorsum van vrouwelijke muizen (Figuur 2A). De laterale incisiebenadering kan worden gebruikt als slechts één eierstok moet worden verwijderd. Bij deze benadering wordt de buikwand ingesneden en wordt het vetkussen van de eierstokken gelokaliseerd. Het vetkussentje, de eierstok, de ductus eierstokken en de distale baarmoederhoorn, zoals afgebeeld in figuur 2B, worden naar buiten gebracht, gevolgd door het doorsnijden van de distale baarmoederhoorn. Deze techniek resulteert in het verwijderen van de eierstok en eileider. De eierstok en het eierstokkanaal kunnen worden verwijderd zonder de distale baarmoederhoorn op te nemen, maar het risico bestaat dat eventuele resterende eierstokcellen de muis in oestrische cycli blijven houden. Het opnemen van de distale baarmoederhoorn zorgt ervoor dat de volledige eierstok en het kanaal worden verwijderd, er een uitputting van de geslachtshormonen zal zijn en de muizen niet meer zullen fietsen. Figuur 2C toont een voorbeeld van de vrouwelijke voortplantingsorganen van muizen die uit het lichaam zijn ontleed. Waargenomen kan worden dat de eierstokken zelf veel kleiner zijn dan de omliggende weefsels. Een dissectiescoop of loepen helpt bij de identificatie van deze weefsels. Figuur 2D toont de anatomie van de eierstokken onder een ontleedscoop waarbij weefsel van het baarmoedervetkussentje is verwijderd, waardoor een betere visualisatie mogelijk is. Het succes van deze procedure kan worden gemeten aan de hand van de observatie van goed herstelde muizen die genezen incisieplaatsen vertonen (Figuur 2E).
Ovariëctomiechirurgie is veilig en efficiënt wanneer het snel en met minimale verstoring van de omliggende weefsels wordt uitgevoerd. Door de hier beschreven procedure te volgen, wordt dit bereikt door ervoor te zorgen dat de incisie in de huid en de buikwand correct worden gepositioneerd, waardoor de baarmoederweefsels snel kunnen worden gelokaliseerd. Het identificeren van de onderrand van de ribbenkast en de superieure rand van de beenbotten zorgt ervoor dat de incisie wordt gemaakt in de buurt van het weefsel van belang. Het maken van een incisie die ongeveer halverwege is tussen de onderste rand van de ribben en de superieure rand van de beenbotten en die zich ongeveer 1,5 cm lateraal van de wervelkolom bevindt, zorgt voor een goede positionering van de operatieplaats bij het uitvoeren van een laterale incisiebenadering (Figuur 2A).
Bevestiging van chirurgische ovariëctomie wordt aangetoond door observatie van baarmoederatrofie. Figuur 2F toont een baarmoederhoorn die is ontleed van een muis van 6 maanden oud, terwijl figuur 2G een baarmoederhoorn toont van een muis van 6 maanden oud die op de leeftijd van drie maanden een chirurgische ovariëctomie onderging. De ovariëctomie van de baarmoederhoorn lijkt dunner en mist de aanhechting aan de eierstok aan het distale uiteinde. Deze methode van bevestiging van de chirurgische techniek toont effectief aan dat het verwijderen van de eierstok resulteerde in atrofie van het baarmoederweefsel.
Zodra weefsels met succes zijn geïdentificeerd en weggesneden, kan de operatie worden voltooid door de wonden te sluiten en zorgvuldige postoperatieve monitoring te volgen. De juiste aseptische techniek14 is belangrijk om goede resultaten te garanderen bij het uitvoeren van overlevingsoperaties. Terwijl de muis begint te genezen van de incisies, wordt monitoring uitgevoerd om te zoeken naar tekenen van pijn en chirurgische complicaties. Een mogelijke chirurgische complicatie is inwendige bloedingen als gevolg van het prikken of insnijden van bloedvaten tijdens het proberen het weefsel in te snijden of te manipuleren. Dit wordt aangegeven door een aanhoudend rood, rood uiterlijk onder de huid rond de operatieplaats. Het vermijden van complicaties zoals deze wordt bereikt door een goede lokalisatie van incisieplaatsen en het helpen van het gezichtsvermogen van de chirurg door het gebruik van een chirurgische microscoop of loepen. Visueel onderzoek wordt aanbevolen om de 12 uur gedurende de eerste drie dagen na de operatie. Een succesvolle operatie zal resulteren in schone, genezende wonden (Figuur 1D, 2E).
Figuur 1: Orchiectomie bij muizen bij mannen . (A) Een mannelijke muis wordt getoond in rugligging met de locatie van een chirurgische incisie in de scrotumzak voor het verwijderen van de testis, die in rood wordt weergegeven. (B) Afbeelding genomen tijdens de chirurgische ingreep van orchidectomie waarop het punt van loslating in groen is weergegeven. (C) Ontlede testis, vetkussentjes en bijbal van een mannelijke muis. (D) Een mannelijke muis met een goed genezen wondklem over de scrotumincisie na orchidectomie. (E) Serumtestosteronconcentratie bij muizen in ng/ml zoals bepaald door ELISA-interpolatie. Beide groepen vertegenwoordigen muizen van 9 weken oud. Chirurgische orchidectomieën werden uitgevoerd op de leeftijd van 8 weken. N = 3 muizen per groep. De steekproeven werden in drievoud uitgevoerd. Serummonsters werden verzameld door middel van een hartpunctie en ingevroren tot het moment van analyse. *, p < 0,05. Foutbalken = SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Ovariëctomie bij muizen bij vrouwen . (A) Een vrouwelijke muis afgebeeld in de laterale positie met de chirurgische incisieplaats voor het verwijderen van een enkele eierstok van de dorsale laterale zijde, weergegeven in rood. Andere belangrijke anatomische oriëntatiepunten worden uitgelicht. (B) Afbeelding gemaakt tijdens de operatie met de geëxterioriseerde eierstok, eileider en distale baarmoederhoorn met het punt van loslating in groen weergegeven. (C) Ontlede baarmoederhoorns, eierstokken en vetkussentjes van een vrouwelijke muis. (D) Een close-up van de ontlede eierstok, het eierstokkanaal en het distale deel van de baarmoederhoorn met vet uit het vetkussentje verwijderd, waardoor een betere visualisatie van de eierstok mogelijk is. (E) Een vrouwelijke muis met een goed genezen wondklem over de incisie na ovariëctomie. (F) Ontlede baarmoederhoorn van muizen. (G) Ontlede baarmoederhoorn van muizen 3 maanden na de ovariëctomieprocedure, die baarmoederatrofie aantoont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Grafische samenvatting voor ovariëctomie en orchidectomie bij muizen. Een geïllustreerde weergave van de orchidectomieprocedure voor mannelijke muizen waarbij de testis wordt verwijderd en de ovariëctomieprocedure waarbij de eierstokken worden verwijderd, die beide resulteren in een muismodel met geslachtshormoon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chirurgische verwijdering van testikels en eierstokken maakt het mogelijk om de fysiologie van muizen te bestuderen onder gecontroleerde hormoondeprivatie. Deze techniek is belangrijk voor veel wetenschapsgebieden, waaronder neurodegeneratie, mineraalmetabolisme, cardiovasculaire en reproductieve gezondheid 15,16,17,18,19,20,21. Hier beschrijven we een protocol voor de snelle, veilige en effectieve verwijdering van eierstokken en testikels van muizen met behulp van overlevingschirurgie om de geslachtshormonen uit te putten. Wanneer ze worden uitgevoerd door een ervaren chirurg, kunnen deze procedures slechts 5 minuten duren, wat resulteert in een zeer hoog overlevingspercentage bij muizen.
Enkele overwegingen bij het plannen van een muizenoperatie zijn de beste incisieplaats en de fysiologie van het dier. In het geval van orchidectomie kan de testis van de muis ook via de buik worden verwijderd door een ventrale incisie in de middellijn13. Deze techniek opent niet alleen de peritoneale holte, maar is ook afhankelijk van de snelle identificatie van de liesvetkussentjes. Voor nieuwe chirurgen is het moeilijk om deze techniek snel uit te voeren. Als muizen heel jong zijn, zijn de vetkussentjes ook minder ontwikkeld en dus moeilijker te lokaliseren. De scrotumbenadering die in dit protocol wordt beschreven, is een geschikte optie voor onderzoekers die nieuw zijn in muizenchirurgie, die kleine, jonge muizen opereren of die de kans op verstoring van andere organen in de peritoneale holte door een incisie in de buik willen minimaliseren.
Chirurgische ovariëctomie omvat het verwijderen van een of beide eierstokken. Zoals bij de meeste chirurgische ingrepen, houden veilige en snelle methoden meestal in dat de incisie in de huid en de onderliggende fascia zo klein mogelijk wordt gemaakt. Dit zorgt voor minder hechtingen en wondklemmen en een snellere genezing. Hoewel het kunnen verkleinen van de incisies een vaardigheid is die gepaard gaat met oefening, is het nuttig om vertrouwen te hebben in de locatie van de incisie. Figuur 2A toont een voorbeeld van hoe de beste incisiepunten kunnen worden gelokaliseerd. Vanwege de kleine anatomie van de muis ligt de eierstok in de buurt van de lever en aan de linkerkant van de muis, in de buurt van de milt. Per ongeluk sonderen en trekken aan deze organen kan leiden tot ongewenste bloedingen of schade. We bieden een gedetailleerde gids voor de juiste incisielocatie en identificatie van de omliggende anatomische oriëntatiepunten om te helpen bij deze techniek en de kans op nadelige complicaties te verkleinen.
Hier geven we een voorbeeld van hoe deze procedure kan worden gebruikt om de circulerende hormoonspiegels bij muizen minder dan een week na de chirurgische ingreep effectief neer te halen, en hoe het resterende gonadale weefsel in de loop van de tijd na de procedure atrofieert. Eerdere methoden en onderzoeken beschrijven hoe deze kunnen worden gedaan om muismodellen voor de menopauze of andropauze te genereren, maar veel van deze worden uitgevoerd in rattenmodellen in plaats van muizen12,22. Terwijl ratten en muizen een vergelijkbare anatomie hebben, heeft het muizensysteem kleinere anatomische structuren. Hier bieden we een methode die betrouwbaar werkt in muismodellen vanaf de leeftijd van 3 weken. Over het algemeen vertegenwoordigen deze twee protocollen een consistente manier om snel overlevingsorchiectomieën en ovariëctomieën bij knaagdieren uit te voeren, de anatomie van de muis te herkennen en chirurgische complicaties te minimaliseren, waardoor een basis wordt gelegd voor consistente en effectieve resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We danken het Animal Resource Center van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas voor hun hulp bij chirurgische training en protocolbeoordeling. We danken het ondersteuningsteam van Wert Lab voor hun onschatbare hulp. Dit werk is ondersteund door fondsen van het National Institute of Health (NIH P30EY030413). Biorender.com werd gebruikt voor het maken van cartoonschema's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
