Summary
Detta manuskript beskriver ett konsekvent sätt att snabbt utföra överlevnadsrodgare orkidektomier och ovariektomier.
Abstract
Könshormonsignalering spelar en avgörande roll i flera organsystem samt i utvecklingen av olika sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Manipulering av könshormonnivåer i det murina modellsystemet gör det möjligt att studera deras inverkan på organ/vävnader och inom sjukdomsprogression. Orkidektomi - kirurgiskt avlägsnande av testiklarna - och ovariektomi - kirurgiskt avlägsnande av äggstockarna - ger en metod för att tömma de endogena könshormonerna så att de exakta hormonnivåerna kan tillhandahållas genom läkemedel eller andra leveransmetoder. Här tillhandahåller vi snabba och minimalt invasiva metoder för både orkidektomi och ovariektomi i det murina modellsystemet för reduktion av könshormoner. Detta protokoll beskriver den kirurgiska förberedelsen och excisionen av testiklarna genom pungsäcken och excision av äggstockarna via två snitt i höger och vänster laterala dorsum.
Introduction
Testiklarna och äggstockarna är de primära organen som ansvarar för produktionen av könshormoner. Kaskaden av hormonell kommunikation som leder till produktion av testosteron och östrogen är en välkarakteriserad process som börjar i hypotalamus med frisättningen av gonadotropinfrisättande hormon (GnRH)1. Frisättningen av GnRH orsakar frisättning av luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH) från hypofysen. När dessa hormoner kommer in i blodomloppet påverkar de sedan andra vävnader i kroppen. Det primära målet för LH är testiklarna (hos män) och äggstockarna (hos kvinnor)2. Som svar på LH producerar och frigör testiklarna testosteron3. På samma sätt producerar äggstockarna östrogen4. Medan de avsedda effekterna av dessa hormoner är att förbereda cellerna och kroppen för befruktning och säkerställa ett fungerande reproduktionssystem, kan många andra kroppsliga system påverkas.
Könshormoner har kopplats till flera fysiologiska funktioner. Till exempel hjälper östrogen till att upprätthålla benhomeostas genom att förhindra resorption av ben av osteoklaster. Av denna anledning kan ovariektomerade musmodeller användas för att studera fysiologin hos bensjukdomar som osteoporos 5,6,7. Testosteron och östrogen är också forskningsmål för många kardiovaskulära och neurodegenerativa sjukdomar. Nyligen har förhöjd testosteronproduktion i kombination med fettrik kost kopplats till vaskulär oxidativ stress8. I hjärnan har förändringar i LH efter ovariektomi orsakat förändringar i det spatiala minnet9. Minskning av östrogener efter ovariektomi har också blivit ett modellsystem för att studera celldöd i hippocampus, eftersom detta kan inducera apoptos, vilket resulterar i minnesbrister10. Testosteron har också visat sig spela en roll i tillväxten av njurar både i musmodeller och hos människor efter njurtransplantation11.
Skapandet av en hormonberövad musmodell gör det möjligt att studera könshormoner och deras hormonkaskader på olika sjukdomar eller vävnader. Detta kan åstadkommas genom kirurgiskt avlägsnande av testiklarna (orkidektomi) eller äggstockarna (ovariektomi). Denna procedur kan utföras på möss av vilken stam som helst när de är så unga som avvänjningsålder (tjugoen dagar) eller vilken vuxen ålder som helst. Ovariektomi utförs på honmöss, medan orkidektomi utförs på hanmöss. Genom att ta bort dessa organ kan nivåerna av östrogen och testosteron och många av deras derivat, såsom progesteron, minskas kraftigt12,13. Processen att utföra orkidektomier eller ovariektomier på möss kan vara snabb och minimalt invasiv med rätt teknik. Snabb excision av dessa organ på ett säkert och effektivt sätt kan möjliggöra snabb kirurgisk bearbetning samtidigt som antalet möss hålls minimalt genom att ha en överlevnadsgrad på 100 % när det utförs korrekt. Här beskriver vi ett protokoll för snabb excision av testiklarna och äggstockarna och visar korrekt postoperativ övervakning för att göra det möjligt för forskare att utföra denna operation snabbt och säkert. Vi inkluderar också visuella exempel på könsorganen och omgivande vävnader för att ge kirurgen anatomiska landmärken när han utför denna procedur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid UTSW (APN#2019-102840).
1. Mus orkidektomi
- Förbered ett aseptiskt arbetsområde och se till att nödvändiga kirurgiska instrument har steriliserats och är lättillgängliga. Följ aseptiska rutiner för överlevnadskirurgi hos gnagare.
- Anteckna hanmusens vikt och administrera den föredragna anestesimetoden enligt de institutionella riktlinjerna. I detta protokoll levererades 2 % isofluran via en precisionsförångare för att upprätthålla anestesi. Före ingreppet ska smärtstillande läkemedel administreras i enlighet med institutionens riktlinjer. I detta protokoll administrerades 1,0 mg/kg buprenorfin SR och 5 mg/kg meloxikam subkutant.
- När musen är nedsövd, täck djurets ögon med smörjande ögongel för att undvika att det bildas ögonskador, uttorkning av hornhinnan eller sår.
- Innan du fortsätter, säkerställ rätt anestesiplan genom att utföra ett tåklämningsresponstest.
- Förbered djurets operationsområde innan du placerar det på det aseptiska, draperade operationsområdet.
- Raka sedan ljumsk- och pungområdena på musen med en sax.
OBS: Att raka nedre delen av buken ovanför penis möjliggör bättre visualisering under operationen. - Använd en bomullstejpad applikator och applicera ett tunt lager hårborttagningskräm (se Materialtabell) på djurets hud, som täcker pungen och det omgivande området som just rakades. Vänta i 30 sekunder och ta bort grädden med en bit ren gasbinda.
- Använd 70 % etanolindränkta gasbindor för att torka bort eventuell kvarvarande kräm och hår från området.
OBS: 70 % etanol i detta steg är till för att hjälpa till att helt ta bort hårborttagningskräm. Antiseptisk beredning av operationsstället utförs i steg 1.8.
- Raka sedan ljumsk- och pungområdena på musen med en sax.
- Överför musen till operationsområdet och se till att en värmekälla finns tillgänglig för att bibehålla djurets kroppstemperatur under operationen. Placera djuret på rygg på ett operationsdraperi och använd mjuk tejp för att fästa musens fötter på operationsmattan.
- Om testiklarna stiger upp i buken, palpera försiktigt buken för att få testiklarna att sjunka. Använd en handskbeklädd hand för att applicera ett lätt rullande tryck nedåt på buken.
OBS: Det är lättare att utföra denna operation under ett dissektionsomfång eller med hjälp av ett par luppar för ökad förstoring. Om du utför detta under ett dissektionsomfång, ta en stund för att placera musens pung under kikarsiktets synfält. En mjuk tejp kan användas för att fästa musens ben eller buk på det kirurgiska området för att säkerställa att den stannar på rätt plats. - Skrubba huden med Betadine kirurgisk skrubb (eller en liknande antiseptisk hudförberedande skrubb), följt av 70 % alkoholskrubb minst tre gånger för att säkerställa korrekt huddesinfektion. För varje skrubbning, skrubba i en radiell rörelse utåt, så att mitten av snittstället skrubbas först och slutar med att den yttre kanten av det rakade kirurgiska området skrubbas sist.
- Ta nu på dig sterila operationshandskar. Använd aseptisk teknik för nästa steg i proceduren. Täck musen med ett sterilt kirurgiskt draperi med ett litet snitt (skuret till cirka 0,5-1 tum i fyrkant för att passa över operationsstället) över djuret för att täcka kroppen i draperingsmaterialet.
- Skapa ett ventralt mittlinjesnitt i pungen som är cirka 1 cm -1,5 cm långt med hjälp av ett kirurgiskt skalpellblad eller liknande instrument enligt dina godkända riktlinjer för djurskydd.
- Ta tag i den skurna kanten av huden och använd ett trubbigt spetsinstrument för att separera huden från den undre vävnaden. Ta dig tid att göra detta på snittets laterala, överlägsna och nedre gränser.
- Isolera en testikel genom att använda spateln och pincetten för att flytta snittet i huden så att det centreras ovanpå en av testiklarna. Om detta är svårt, gå tillbaka till 1.11 och separera huden ytterligare från de undre lagren.
- Ta en böjd pincett och placera dem på vardera sidan av testikeln. Applicera ett lätt tryck nedåt för att exteriorisera testikeln. Ta tag i det tunna, genomskinliga muskellagret som ligger ovanpå testikeln med hjälp av en pincett. Detta är cremastermuskeln. Verifiering av rätt muskellager görs genom att observera detta lager och dess cirkulation, som rör sig oberoende av testikeln under det.
OBS: Identifiering av korrekt vävnad bekräftas av dess transparens och förmåga att röra sig oberoende av de underliggande vävnaderna.- Manipulera muskelvävnaden med en pincett tills toppen av muskeln greppas. Detta bör vara den lägsta delen, med testiklarna och cauda bitestiklarna placerade under.
- Ta tag i cremastermuskeln med en pincett och rör dig försiktigt bort från testiklarna och bitestiklarna. Skapa ett 0,5 cm snitt genom cremastermuskeln i den första testikeln vid dess spets med hjälp av en liten Vannäs fjädersax.
- Placera en låsning clamp på den bakre kanten av den skurna cremastermuskeln. Använd ett par smala hemostater eller ett par låsbara mikronålshållare. När vävnaden är fastspänd, lägg försiktigt instrumentet på musens lateralsida för att hålla vävnaden fastklämd under följande procedursteg.
- Använd en pincett för att ta tag i den övre kanten av snittet som gjordes i steg 1.14. Medan de två ändarna av cremastermuskeln dras tillbaka, använd en annan pincett för att nå in i hålrummet och ta försiktigt tag i testikeln.
- Dra den utåt genom hålet i muskeln. Var noga med att hålla utkik efter tecken på hackade blodkärl och blod i det kirurgiska området.
- Testikeln, bitestiklarna, den fästa sädessträngen och blodkärlet kommer att vara uppenbara när vävnaderna är ordentligt externaliserade.
- Nära den kaudala-dorsala änden av bitestiklarna och testikeln finns en fibrös fästpunkt för testikeln till cremastermuskeln. Rulla den yttre vävnaden i sidled för att lokalisera denna insättningspunkt. Skär av detta för att undvika skador på muskeln och möjliggöra ytterligare isolering och visualisering av vävnader. Använd två par pincetter för att utföra en kläm- och rivteknik.
- Leta efter fettvävnad runt testikeln från ljumskfettkudden. Använd en pincett för att ta tag i fettkudden och dra försiktigt för att exteriorisera den.
- Ta inte tag i blodkärlet som färdas längs fettkudden, eftersom det kan leda till blödning om du drar i den.
- Leta reda på sädessträngen, blodkärlen och den kvarvarande fettkudden som är proximal till de yttre vävnaderna och använd ett par hemostater för att klämma fast den. Medan du håller en lätt spänning på den distala testikeln, bränn sädessträngen och blodkärlen distalt om hemostatklämman.
- När du är klar, släpp långsamt clamp proximalt till den kauteriserade änden och kontrollera om det finns tecken på blödning. Upprepa detta steg om det finns. Det är bra att använda en pincett för att hålla en mild spänning på den distala änden av vävnaden som kauteriseras.
- Låt den avskurna stumpen av sädessträngen dra sig tillbaka in i kroppen. Ta tag i de två skurna ändarna av cremastermuskeln och för ihop dem. Bedöm storleken på snittet i vävnaden och stäng vävnaden med 4-0 eller 5-0 absorberbara suturer. Beroende på snittstorleken kommer 1 eller 2 suturer att behövas. Klipp av suturändarna till 0,5 cm med en sutursax.
- Upprepa steg 1.13-1.20 på andra sidan av pungen för att ta bort den andra testikeln.
- Förbered dig på att stänga hudsnittet.
- Säkerställ god hemostas av båda vävnadsstumparna. Dålig hemostas kommer att resultera i kvarvarande blödning i det kirurgiska området. Om detta inträffar, lokalisera blödningen och bränn den. Detta undviks genom långsam och noggrann manipulation av vävnaderna med trubbiga instrument.
- Om blod ses i det kirurgiska området, använd en steriliserad applikator med bomullsspets för att torka området för bättre visualisering. Använd en spruta för att droppa saltlösning på området för att spola bort blod eller vätska från det kirurgiska området.
- Dra ihop de två sidorna av hudsnittet för att förbereda det för stängning. Se till att de suturerade ändarna av cremaster-snitten inte sticker ut i hudsnittet. Om det behövs, trimma suturens ändar ytterligare.
- Stäng huden.
- Om du använder sårklämmor, använd en pincett för att ta bort huden och dra bort den från den underliggande vävnaden. Placera en sårklämma centrerad över snittet. Kontrollera att huden är välklippt. Om snittet är något för stort för att en sårklämma ska kunna stänga det tillräckligt, kan kirurgiskt hudlim appliceras på de övre och nedre delarna av snittet.
- Om du använder suturer, placera det nödvändiga antalet suturer genom huden, utan att ta tag i den underliggande vävnaden. Denna typ av snitt kommer att kräva 2-3 enstaka avbrutna suturer med 4-0 icke-absorberbart suturmaterial.
- Rengör huden runt operationsområdet försiktigt med koksaltlösning och en steriliserad applikator med bomullsspets för att ta bort eventuellt torkat blod eller kvarvarande antiseptisk skrubb.
2. Murin ovariektomi
- Förbered ett aseptiskt arbetsområde och se till att nödvändiga kirurgiska instrument har steriliserats och är lättillgängliga. Följ aseptiska rutiner för överlevnadskirurgi hos gnagare.
- Registrera mushonans vikt och administrera den föredragna anestesimetoden enligt dina institutionella riktlinjer. I detta protokoll levererades 2 % isofluran via en precisionsförångare för att upprätthålla anestesi. Före ingreppet ska du administrera smärtstillande läkemedel enligt institutionens riktlinjer. I detta protokoll administrerades 1,0 mg/kg buprenorfin SR och 5 mg/kg meloxikam subkutant.
- Administrera smörjande ögongel på djurets ögon för att undvika bildandet av ögonskador, uttorkning av hornhinnan eller sår. Se till att en värmekälla finns tillgänglig för att bibehålla djurets kroppstemperatur under operationen. Säkerställ rätt anestesiplan genom att kontrollera om tån klämmer ihop.
- Förbered djurets operationsområde innan du placerar det på det kirurgiska området.
- Raka försiktigt håret på den dorsolaterala delen av djurets rygg med hjälp av en sax. Ta bort hår från området ovanför höfternas övre gräns och under bröstkorgens nedre gräns, såväl som områdena mellan dessa landmärken.
- Använd en applikator med bomullsspets och applicera ett lager hårborttagningskräm på djurets hud och täck det område som just rakats. Vänta i 30 sekunder och ta bort krämen med en bit gasbinda och ta bort de fina hårstrån som finns kvar.
- Använd en 70 % etanolindränkt gasbinda för att torka bort eventuell kvarvarande kräm och hår från operationsområdet.
OBS: 70 % etanol i detta steg är till för att hjälpa till att helt ta bort hårborttagningskräm. Antiseptisk beredning av operationsstället utförs i steg 2.5.
- Placera djuret i sidoläge (för snitt för att ta bort en äggstock i taget) i det kirurgiska området och se till att en värmekälla finns tillgänglig. Skrubba operationsområdet med Betadine kirurgisk skrubb (eller en liknande antiseptisk hudförberedande skrubb), följt av 70 % alkohol minst tre gånger för att säkerställa korrekt huddesinfektion. För varje skrubbning, skrubba i en radiell rörelse utåt, så att mitten av snittet skrubbas först och den yttre kanten av det rakade kirurgiska området skrubbas sist.
- Ta nu på dig sterila operationshandskar. Använd aseptisk teknik för nästa steg i proceduren. Placera ett kirurgiskt draperi med ett litet snitt i det (skär en cirka 0,5-1 tums fyrkant i draperiet för att passa operationsstället) över djuret så att kroppen täcks av draperingsmaterial.
- Lokalisera den idealiska platsen för det kirurgiska snittet genom att hitta halvvägs mellan musens höfter och revben (se figur 2). Ta tag i huden med en pincett och gör ett 1,0 cm snitt i huden på denna plats.
- Använd ett trubbigt spetsinstrument (sond, kirurgisk spatel eller trubbiga hemostater) för att separera huden från den underliggande muskelvävnaden. Ta dig tid att göra detta på snittets laterala, överlägsna och nedre gränser.
- Lokalisera den dorsolaterala muskelväggen i buken. Ta vid behov bort fettvävnad som ligger mellan huden och muskellagren. Hos mogna möss är denna fettvävnad mer framträdande. Flytta denna fettvävnad mot den kaudala änden av musen och exponera muskelväggen.
- Fettvävnad skiljer sig från bukväggen genom färg: fettvävnad ser blekvit ut och ligger mer ytligt, medan bukväggen ser rosa ut och ligger djupare än fettvävnaden.
- Ta tag i bukväggen med en råtttandstång och gör ett 0,5 cm snitt i den.
- Ta tag i en kant av detta snitt med en pincett, använd ett andra par för att nå in i kroppshålan och hitta äggstocken, livmoderhornet och fettkudden. Dra försiktigt detta genom snittet i muskelväggen för att separera muskeln från den underliggande vävnaden och exteriorisera den. Lokalisera övergången mellan livmoderhornet och äggstocken.
- Skär av äggstocken genom att utföra en kross- och rivteknik.
- Placera en clamp på den distala änden av livmoderhornet och placera den andra clamp precis distalt om den första. Medan du applicerar ett fast tryck med båda clamps, flytta den mer distala bort från kroppen och riv anslutningen mellan dem. För att minimera blödning och vävnadsskador, håll den proximala klämman stilla under denna process och var försiktig så att du inte också drar bort den från kroppen.
- Alternativt kan du använda en brännare. Använd en pincett eller hemostater för att klämma fast livmoderhornet precis proximalt till önskad brännpunkt. Använd ett brännverktyg för att skära av vävnaderna.
- Släpp försiktigt och långsamt den proximala klämman och kontrollera om det finns tecken på blödning.
- Låt vävnadsstumpen dra sig tillbaka in i kroppshålan. Ta tag i bukväggen och dra försiktigt uppåt. Tvinga inte vävnadsstumpen inåt, eftersom det ökar risken för blödning.
- Lokalisera snittets gränser i muskelväggen och för dem samman för att förbereda sig för att sy den.
- Placera 1-2 enstaka avbrutna suturer i bukmuskelväggen med 4-0 absorberbart suturmaterial. Klipp av suturändarna till 0,5 cm med en sutursax.
- Stäng snittet genom att låta huden återgå till sitt naturliga viloläge och sedan vända det uppåt, var noga med att inte ta tag i underliggande vävnad eller ändarna på suturmaterialet. Placera 1-2 sårklämmor på den everted huden. Baserat på dina institutionella riktlinjer kan huden också stängas med 4-0 icke-absorberbart suturmaterial.
- För att ta bort den andra äggstocken, byt musens position så att den andra sidan är vänd uppåt. Var försiktig när du byter musens position för att inte lägga för mycket tryck på den sårklippta huden från steg 2.17.
- Upprepa steg 2.5 - 2.17 på den här sidan.
- Rengör huden runt operationsområdet försiktigt med koksaltlösning och en steriliserad applikator med bomullsspets för att ta bort eventuellt torkat blod eller kvarvarande antiseptisk skrubb.
3. Postoperativ vård
- Enligt dina institutionella riktlinjer, administrera smärtstillande medicin i upp till 72 timmar efter operationen. Dokumentera djurens kirurgiska ingrepp och notera datum, tid, bedövningsmedel och smärtstillande medel som använts. Här administreras buprenorfin med långsam frisättning och meloxikam preoperativt.
- När djuren har opererats ska de överföras till en ren bur med en torr pappershandduk. Placera denna bur 2/3 på en värmekälla och lämna den andra 1/3 av buren avstängd värme. Placera inte möss tillsammans i en bur förrän de har återhämtat sig från narkosen.
- Låt djuret återfå förmågan att gå fritt runt buren innan du placerar tillbaka det i en ren bur med normalt strö. Vid denna tidpunkt kan möss hållas tillsammans om alla har återhämtat sig från narkosen.
- Under de första dagarna efter operationen, se till att fuktig mat och vatten är lättillgängligt. Lägg lite fuktad mat på botten av buren. Kontrollera ofta musens operationsställe och leta efter tecken på infektion eller blödning.
- Efter operationen, se till att möss antingen hålls ensamma eller tillsammans med andra djur som har genomgått samma procedur samtidigt. En mus som återhämtar sig från en operation och befinner sig i samma bur som en mus utan operation kan medföra en fara och bör undvikas.
- För möss som har genomgått ovariektomi och har sårklämmor på de dorsolaterala sidorna av ryggen, ta bort alla gnagarigloohabitat från buren för att minska risken för att musens sårklämma fastnar på igloon under den första läkningsveckan.
- Fortsätt att övervaka djuret för tecken på infektion, smärta eller kirurgiska komplikationer var 12:e timme under de första 72 timmarna av läkningstiden.
- Ta bort sårklämmor med ett sårklämmaborttagningsverktyg 10-14 dagar efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proceduren som presenteras här utförs på en till tre månader gamla möss i C57BL/6J-bakgrunden. Hanmöss vägde 16-28 g och honmöss vägde 14-24 g vid tidpunkten för ingreppet. Denna procedur har optimerats för att vara tillämplig på möss i många åldrar, från avvänjning till vuxen ålder.
Kirurgisk orkidektomi innebär ett enda hudsnitt i den ventrala pungsäcken, som avbildas i figur 1A. Båda testiklarna avlägsnas en i taget och skärs av genom sädesledaren och sädesblodkärlen, vilket resulterar i att testiklarna och bitestiklarna avlägsnas (Figur 1B). Det borttagna innehållet inkluderar testiklarna, bitestiklarna och fettkudden i ljumsk, som visas i figur 1C. Framgångsrikt avlägsnande av testiklarna kan bekräftas genom visuell observation av avlägsnade vävnader och säkerställande av god hemostas av vävnadsstumpen innan kroppshålan stängs. Framgången för orkidektomi kan mätas genom observation av väl återhämtade möss som uppvisar läkta snittställen (Figur 1D). Möss som har genomgått orkidektomi kommer också att uppvisa en minskning av testosteronnivån uppmätt i musserum så tidigt som en vecka efter ingreppet (Figur 1E).
Kirurgisk bilateral ovariektomi görs genom snitt i vänster och höger rygg på honmöss (Figur 2A). Metoden med laterala snitt kan användas om endast en äggstock ska tas bort. I detta tillvägagångssätt snittas bukväggen och äggstockarnas fettkudde lokaliseras. Fettkudden, äggstocken, äggstockskanalen och det distala livmoderhornet, som avbildas i figur 2B, exterioriseras, följt av att det distala livmoderhornet skärs av. Denna teknik resulterar i avlägsnande av äggstocken och äggledaren. Äggstocken och äggstockskanalen kan tas bort utan att inkludera det distala livmoderhornet, men det finns en risk att eventuella kvarvarande äggstocksceller fortsätter att hålla musen i brunstcykler. Att inkludera det distala livmoderhornet säkerställer att hela äggstocken och kanalen tas bort, det kommer att ske en utarmning av könshormonerna och mössen kommer inte längre att cykla. Figur 2C visar ett exempel på de murina kvinnliga reproduktionsorganen som dissekerats ut ur kroppen. Det kan observeras att äggstockarna i sig är mycket mindre än de omgivande vävnaderna. Ett dissektionsskop eller luppar hjälper till att identifiera dessa vävnader. Figur 2D visar äggstockarnas anatomi under ett dissekerande kikarsikte med vävnad från livmoderns fettkudde borttagen, vilket möjliggör bättre visualisering. Framgången för denna procedur kan mätas genom observation av väl återhämtade möss som uppvisar läkta snittställen (Figur 2E).
Ovariektomikirurgi är säker och effektiv när den utförs snabbt och med minimal störning av omgivande vävnader. Genom att följa proceduren som beskrivs här åstadkoms detta genom att se till att huden och bukväggens snitt är korrekt placerade, vilket möjliggör snabb lokalisering av livmodervävnaderna. Att identifiera den nedre gränsen för bröstkorgen och den övre gränsen för benbenen säkerställer att snittet görs nära vävnaden av intresse. Att göra ett snitt som är ungefär halvvägs mellan revbenens nedre gräns och benbenens övre gräns och som ligger cirka 1,5 cm lateralt om ryggraden möjliggör god positionering av operationsstället när man utför ett lateralt snitt (Figur 2A).
Bekräftelse av kirurgisk ovariektomi visas genom observation av livmoderatrofi. Figur 2F visar ett livmoderhorn dissekerat från en 6 månader gammal mus, medan figur 2G visar ett livmoderhorn från en 6 månader gammal mus som genomgick kirurgisk ovariektomi vid tre månaders ålder. Det ovariektomerade livmoderhornet verkar tunnare och saknar fästet vid äggstocken i den distala änden. Denna metod för att bekräfta den kirurgiska tekniken visar effektivt att avlägsnandet av äggstocken resulterade i atrofi av livmodervävnaden.
När vävnaderna har identifierats och skurits ut kan operationen slutföras genom att såren försluts och noggrann postoperativ övervakning. Korrekt aseptisk teknik14 är viktig för att säkerställa goda resultat vid överlevnadskirurgi. När musen börjar läka från snitten utförs övervakning för att leta efter tecken på smärta och kirurgiska komplikationer. En möjlig kirurgisk komplikation är inre blödningar på grund av att man petar eller hackar i blodkärlen när man försöker skära eller manipulera vävnaden. Detta betecknas av ett ihållande rött, rodnande utseende under huden runt operationsområdet. Att undvika komplikationer som dessa uppnås genom korrekt lokalisering av snittställen och hjälpa kirurgens syn med hjälp av ett kirurgiskt mikroskop eller luppar. Visuell undersökning rekommenderas var 12:e timme under de första tre dagarna efter operationen. En lyckad operation kommer att resultera i rena, läkande sår (Figur 1D, 2E).
Figur 1: Manlig murin orkiektomi . (A) En hanmus visas i ryggläge med ett kirurgiskt snitt i pungsäcken för avlägsnande av testiklarna, vilket visas i rött. (B) Bild tagen under det kirurgiska ingreppet för orkidektomi som visar den punkt där den lossnar i grönt. (C) Dissekerade testiklar, fettkuddar och bitestiklar från en hanmus. (D) En hanmus med en väl läkt sårklämma över pungsnittet efter orkidektomi. E) Koncentration av serumtestosteron hos möss uttryckt i ng/ml, bestämt genom ELISA-interpolering. Båda grupperna representerar 9 veckor gamla möss. Kirurgisk orkidektomi utfördes vid 8 veckors ålder. N = 3 möss per grupp. Proverna kördes i tre exemplar. Serumprover samlades in genom hjärtpunktion och frystes fram till analystillfället. *, p < 0,05. Felstaplar = SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kvinnlig murin ovariektomi . A) En mushona som visas i sidoläge med det kirurgiska snittstället för avlägsnande av en enda äggstock från den dorsala laterala sidan, som visas i rött. Andra viktiga anatomiska landmärken lyfts fram. (B) Bild tagen under operation som visar den exterioriserade äggstocken, äggledaren och det distala livmoderhornet med avlossningspunkten markerad i grönt. (C) Dissekerade livmoderhorn, äggstockar och fettkuddar från en honmus. (D) En närbild av den dissekerade äggstocken, äggstockskanalen och den distala delen av livmoderhornet med fett från fettkudden borttagen, vilket möjliggör bättre visualisering av äggstocken. E) En mushona med en väl läkt sårklämma över snittet efter ovariektomi. (F) Dissekerat livmoderhorn från möss. (G) Dissekerat livmoderhorn hos möss 3 månader efter ovariektomi, som visar livmoderatrofi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Grafiskt abstrakt för murin ovariektomi och orkidektomi. En bildframställning av orkidektomiproceduren för hanmöss som involverar avlägsnande av testiklarna och ovariektomiprocedur som involverar avlägsnande av äggstockarna, som båda resulterar i en könshormonutarmad musmodell. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kirurgiskt avlägsnande av testiklar och äggstockar gör det möjligt att studera murina fysiologi under kontrollerad hormonbrist. Denna teknik är viktig för många vetenskapsområden, inklusive neurodegeneration, mineralmetabolism, kardiovaskulär och reproduktiv hälsa 15,16,17,18,19,20,21. Här beskriver vi ett protokoll för snabb, säker och effektiv borttagning av murina äggstockar och testiklar med hjälp av överlevnadskirurgi för att tömma könshormonerna. När de utförs av en erfaren kirurg kan dessa ingrepp ta så lite som 5 minuter, vilket resulterar i en mycket hög överlevnadsgrad hos möss.
Några saker att tänka på när man planerar för en musoperation är det bästa snittstället och djurets fysiologi. Vid orkidektomi kan mustestiklarna också avlägsnas genom buken genom ett ventralt snitt i mittlinjen13. Denna teknik öppnar inte bara bukhålan, utan förlitar sig också på snabb identifiering av de inguinala fettkuddarna. För nya kirurger är det svårt att snabbt utföra denna teknik. När mössen är mycket unga är fettkuddarna också mindre utvecklade och därför svårare att lokalisera. Den pungmetod som beskrivs i detta protokoll är ett lämpligt alternativ för forskare som är nya inom muskirurgi, som opererar små, unga möss eller som vill minimera risken för att störa andra organ i bukhålan genom ett buksnitt.
Kirurgisk ovariektomi innebär att en eller båda äggstockarna tas bort. Som för de flesta kirurgiska ingrepp innebär säkra och snabba metoder vanligtvis att snittet i huden och underliggande fascia görs så litet som möjligt. Detta möjliggör minskade suturer och sårklämmor och snabbare läkning. Även om det är en färdighet att kunna göra snitten mindre är en färdighet som kommer med övning, är det fördelaktigt att vara säker på snittets placering. Figur 2A visar ett exempel på hur man hittar de bästa snittpunkterna. På grund av den lilla musens anatomi kommer äggstocken att ligga nära levern och på vänster sida av musen, nära mjälten. Att oavsiktligt undersöka och dra i dessa organ kan resultera i oönskad blödning eller skada. Vi tillhandahåller en detaljerad guide till korrekt snittplats och identifiering av de omgivande anatomiska landmärkena för att hjälpa till med denna teknik och minska sannolikheten för negativa komplikationer.
Här ger vi ett exempel på hur denna procedur kan användas för att effektivt slå ner de cirkulerande hormonnivåerna hos möss mindre än en vecka efter det kirurgiska ingreppet, samt hur den återstående gonadvävnaden förtvinar över tid efter ingreppet. Tidigare metoder och forskning beskriver hur dessa kan göras för att generera modeller av klimakteriet eller andropausmöss, men många av dessa utförs i råttmodeller snarare än möss12,22. Medan råttor och möss har liknande anatomi, har det murina systemet mindre anatomiska strukturer. Här tillhandahåller vi en metod som på ett tillförlitligt sätt fungerar i musmodeller så unga som 3 veckors ålder. Sammantaget representerar dessa två protokoll ett konsekvent sätt att snabbt utföra överlevnadsorkiektomier och ovariektomier för gnagare, känna igen musens anatomi och minimera kirurgiska komplikationer, vilket skapar en grund för konsekventa och effektiva resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar University of Texas Southwestern Medical Center Animal Resource Center för deras hjälp med kirurgisk utbildning och protokollgranskning. Vi tackar Wert Labs supportteam för deras ovärderliga hjälp. Detta arbete har stötts av medel från National Institute of Health (NIH P30EY030413). Biorender.com användes för att skapa tecknade scheman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
