Summary
Dette manuskript beskriver en konsekvent måde at hurtigt udføre overlevelse gnaver orchiektomier og ovariektomier.
Abstract
Kønshormonsignalering spiller en kritisk rolle i flere organsystemer såvel som i udviklingen af forskellige sygdomme, herunder neurodegenerativ sygdom. Manipulation af kønshormonniveauer i murine modelsystemet gør det muligt at studere deres indvirkning på organer / væv og inden for sygdomsprogression. Orchiektomi - kirurgisk fjernelse af testiklerne - og ovariektomi - kirurgisk fjernelse af æggestokkene - giver en metode til at nedbryde de endogene kønshormoner, så de præcise hormonniveauer kan tilvejebringes gennem medicin eller andre leveringsmetoder. Her leverer vi hurtige og minimalt invasive metoder til både orkiektomi og ovariektomi i murinmodelsystemet til reduktion af kønshormoner. Denne protokol beskriver kirurgisk forberedelse og udskæring af testiklerne gennem pungsækken og udskæring af æggestokkene via to snit i højre og venstre laterale dorsum.
Introduction
Testiklerne og æggestokkene er de primære organer, der er ansvarlige for kønshormonproduktion. Kaskaden af hormonel kommunikation, der fører til produktion af testosteron og østrogen, er en velkarakteriseret proces, der begynder i hypothalamus med frigivelsen af gonadotropinfrigivende hormon (GnRH)1. Frigivelsen af GnRH forårsager frigivelse af luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH) fra hypofysen. Da disse hormoner kommer ind i blodbanen, påvirker de derefter andre væv i kroppen. Det primære mål for LH er testiklerne (hos mænd) og æggestokkene (hos kvinder)2. Som reaktion på LH producerer og frigiver testiklerne testosteron3. På samme måde producerer æggestokkene østrogen4. Mens de tilsigtede virkninger af disse hormoner er at forberede cellerne og kroppen til befrugtning og sikre et fungerende reproduktionssystem, kan mange andre kropslige systemer blive påvirket.
Kønshormoner har været forbundet med flere fysiologiske funktioner. For eksempel hjælper østrogen med at opretholde knoglehomeostase ved at forhindre resorption af knogle ved osteoklaster. Af denne grund kan ovariectomized musemodeller bruges til at studere fysiologien af knoglesygdomme som osteoporose 5,6,7. Testosteron og østrogen er også forskningsmål for mange kardiovaskulære og neurodegenerative sygdomme. For nylig har forhøjet testosteronproduktion kombineret med fedtfattig kost været forbundet med vaskulær oxidativ stress8. I hjernen har ændringer i LH efter ovariektomi forårsaget ændringer i rumlig hukommelse9. Reduktion af østrogener efter ovariektomi er også blevet et modelsystem til undersøgelse af celledød i hippocampus, da dette kan fremkalde apoptose, hvilket resulterer i hukommelsesunderskud10. Testosteron har også vist en rolle i væksten af nyrer både i musemodeller og mennesker efter nyretransplantation11.
Oprettelsen af en hormonberøvet murinmodel giver mulighed for undersøgelse af kønshormoner og deres hormonkaskader på forskellige sygdomme eller væv. Dette kan opnås ved kirurgisk fjernelse af testiklerne (orkiektomi) eller æggestokke (ovariektomi). Denne procedure kan udføres hos mus af enhver stamme, når de er så unge som fravænningsalder (enogtyve dage) eller enhver voksen alder. Ovariektomi udføres hos hunmus, mens orkiektomi udføres hos hanmus. Ved at fjerne disse organer kan niveauerne af østrogen og testosteron og mange af deres derivater, såsom progesteron, reduceres kraftigt12,13. Processen med at udføre orkiektomier eller ovariektomier hos mus kan være hurtig og minimalt invasiv med den rette teknik. Hurtig udskæring af disse organer på en sikker og effektiv måde kan give mulighed for hurtig kirurgisk behandling, samtidig med at museantallet holdes minimalt ved at have en 100% overlevelsesrate, når den udføres korrekt. Her beskriver vi en protokol for hurtig udskæring af testikler og æggestokke og demonstrerer den korrekte postkirurgiske overvågning, så forskere kan udføre denne operation hurtigt og sikkert. Vi inkluderer også visuelle eksempler på kønsorganerne og omgivende væv for at give kirurgen anatomiske landemærker, når han udfører denne procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved UTSW (APN # 2019-102840).
1. Urin orkiektomi
- Forbered et aseptisk arbejdsområde og sørg for, at nødvendige kirurgiske instrumenter er blevet steriliseret og er let tilgængelige. Følg aseptisk praksis for gnaveroverlevelseskirurgi.
- Registrer vægten af hanmusen og administrer den foretrukne anæstesimetode i henhold til de institutionelle retningslinjer. I denne protokol blev 2% isofluran leveret via en præcisionsfordamper for at opretholde anæstesi. Før proceduren skal du administrere smertestillende medicin i henhold til de institutionelle retningslinjer. I denne protokol blev 1,0 mg/kg Buprenorphin SR og 5 mg/kg Meloxicam indgivet subkutant.
- Når musen er under bedøvelse, skal du dække dyrets øjne med smørende øjengel for at undgå dannelse af øjenskade, hornhindeudtørring eller sår.
- Før du fortsætter, skal du sikre dig det korrekte anæstesiplan ved at udføre en tåklemmeresponstest.
- Forbered dyrets kirurgiske område, inden det placeres på det aseptiske, draperede kirurgiske felt.
- Barber derefter musens inguinale og scrotale områder ved hjælp af et par klippere.
BEMÆRK: Barbering af underlivet bedre end penis vil give mulighed for bedre visualisering under operationen. - Brug en bomuldstapet applikator til at påføre et tyndt lag hårfjerningscreme (se materialetabel) på dyrets hud, der dækker pungen og det omkringliggende område, der lige er barberet. Vent i 30 s og fjern cremen med et stykke rent gasbind.
- Brug 70% ethanol-gennemblødt gaze svampe til at tørre eventuelle resterende creme og hår af området.
BEMÆRK: 70% ethanol i dette trin er at hjælpe med fuldstændig fjernelse af hårfjerningscreme. Antiseptisk forberedelse af det kirurgiske sted udføres i trin 1.8.
- Barber derefter musens inguinale og scrotale områder ved hjælp af et par klippere.
- Overfør musen til det kirurgiske område, og sørg for, at der er en varmekilde til rådighed for at opretholde dyrets kropstemperatur under operationen. Placer dyret i liggende stilling på et kirurgisk gardin og brug blødt tape til at klæbe musens fødder til den kirurgiske måtte.
- Hvis testiklerne stiger op i maven, skal du forsigtigt palpere maven for at få testiklerne ned. Brug en handskehånd til at lægge et blidt rulletryk nedad på maven.
BEMÆRK: Det er lettere at udføre denne operation under et dissektionsomfang eller ved hjælp af et par loupes til forbedret forstørrelse. Hvis du udfører dette under et dissektionsomfang, skal du bruge et øjeblik på at placere musens pung under synsfeltet i kikkerten. Et blødt tape kan bruges til at klæbe musens ben eller mave til det kirurgiske felt for at sikre, at det forbliver i den rigtige placering. - Skrub huden med Betadine kirurgisk scrub (eller en lignende antiseptisk hudpræparatscrub), efterfulgt af 70% alkoholscrub mindst tre gange for at sikre korrekt desinfektion af huden. For hver skrubbe skrubbes i en radial bevægelse udad, så midten af snitstedet skrubbes først og slutter med, at den ydre kant af det barberede kirurgiske område skrubbes sidst.
- På dette tidspunkt skal du tage sterile kirurgiske handsker på. For de næste trin i proceduren skal du bruge aseptiske teknikker. Dæk musen med en steril kirurgisk drapering med et lille snit (skåret til ca. 0,5-1 tomme firkant for at passe over det kirurgiske sted) over dyret for at dække kroppen i drapermaterialet.
- Opret et ventralt midterlinjesnit i pungen ca. 1 cm -1,5 cm i længden ved hjælp af et kirurgisk skalpelblad eller lignende instrumenter i henhold til dine godkendte institutionelle retningslinjer for dyrevelfærd.
- Tag fat i den afskårne kant af huden, brug et stump tippet instrument til at adskille huden fra undervævet. Tag dig tid til at gøre dette på snittets laterale, overlegne og ringere grænser.
- Isoler en testikel ved hjælp af spatel og tang til at flytte snittet i huden, der skal centreres oven på en af testiklerne. Hvis dette er svært, skal du gå tilbage til 1.11 og adskille huden yderligere fra underlagene.
- Tag et par buede tang og læg dem på hver side af testiklen. Påfør et blidt nedadgående tryk for at udvendiggøre testiklen. Grib det tynde, gennemsigtige lag af muskler, der er oven på testiklen ved hjælp af tang. Dette er cremaster-musklen. Verifikation af det korrekte muskellag foretages ved at observere dette lag og dets cirkulation, der bevæger sig uafhængigt af testiklen under det.
BEMÆRK: Identifikation af korrekt væv bekræftes af dets gennemsigtighed og evne til at bevæge sig uafhængigt af det underliggende væv.- Manipuler muskelvævet ved hjælp af tang, indtil toppen af musklen er grebet. Dette bør være den laveste del, med testiklerne og cauda epididymis placeret nedenunder.
- Tag fat i cremastermusklen med tang og bevæg dig forsigtigt væk fra testiklerne og epididymis. Opret et 0,5 cm snit gennem cremastermusklen i den første testikel ved dens spids ved hjælp af en lille Vannas fjedersaks.
- Placer en låseklemme på den bageste kant af den skårne cremastermuskel. Brug et smalt par hæmostater eller et par låsende mikronåleholdere. Når vævet er fastspændt, skal du forsigtigt lægge instrumentet på den laterale side af musen for at holde vævet fastspændt under følgende proceduretrin.
- Brug pincet til at få fat i den overlegne kant af snittet i trin 1.14. Mens de to ender af cremastermusklen trækkes tilbage, skal du bruge et andet par tang til at nå ind i hulrummet og forsigtigt gribe fat i testiklen.
- Træk det udad gennem hullet i musklen. Vær omhyggelig med at holde øje med tegn på nicked blodkar og blod i det kirurgiske felt.
- Testiklen, epididymis, vedhæftet sædstreng og blodkar vil være tydelige, når vævene er korrekt eksternaliseret.
- I nærheden af den kaudale dorsale ende af epididymis og testikel er der et fibrøst fastgørelsespunkt for testiklen til cremastermusklen. Rul det udvendige væv sideværts for at finde dette indsættelsespunkt. Afbryd dette for at undgå skade på musklen og muliggøre yderligere isolering og visualisering af væv. Brug to par tang til at udføre en klemme og rive teknik.
- Se efter fedtvæv omkring testiklen fra lyskefedtpuden. Brug et par tang til at gribe fat i fedtpuden og træk forsigtigt for at udvendiggøre den.
- Tag ikke fat i blodkarret, der bevæger sig langs fedtpuden, da træk i dette kan føre til blødning.
- Find sædstrengen, blodkarrene og den resterende fedtpude, der er proksimal til det udvendige væv, og brug et par hæmostater til at klemme det. Mens du holder let spænding på den distale testikel, cauterize spermatic ledning og blodkar distal til hemostat klemme.
- Når du er færdig, skal du langsomt frigøre klemmen proksimal til den cauteriserede ende og kontrollere for tegn på blødning. Gentag dette trin, hvis det findes. Det er nyttigt at bruge et par tang til at holde blid spænding på den distale ende af vævet, der kauteriseres.
- Lad den afskårne stub af sædstrengen trække sig tilbage i kroppen. Tag fat i de to afskårne ender af cremastermusklen og bring dem sammen. Vurder størrelsen af snittet i vævet, og luk vævet ved hjælp af 4-0 eller 5-0 absorberbare suturer. Afhængigt af snitstørrelsen er der brug for 1 eller 2 suturer. Trim suturenderne til 0,5 cm ved hjælp af sutur saks.
- Gentag trin 1.13-1.20 på den anden side af pungen for at fjerne den anden testikel.
- Forbered dig på at lukke hudsnittet.
- Sørg for god hæmostase af begge vævsstubbe. Dårlig hæmostase vil resultere i resterende blødning i det kirurgiske felt. Hvis dette sker, skal du lokalisere blødningen og cauterize. Dette undgås ved langsom og omhyggelig manipulation af vævene med stumpe instrumenter.
- Hvis der ses blod i det kirurgiske felt, skal du bruge en steriliseret applikator med bomuldsspids til at tørre området for bedre visualisering. Brug en sprøjte til at dryppe saltvand på området for at skylle blod eller væske væk fra det kirurgiske felt.
- Træk de to sider af hudsnittet sammen for at forberede det til lukning. Sørg for, at de suturerede ender af cremastersnittene ikke stikker ud i hudsnittet. Hvis det er nødvendigt, skal du trimme enderne af suturen yderligere.
- Luk huden.
- Hvis du bruger sårklemmer, skal du bruge tang til at evert huden og trække den væk fra det underliggende væv. Placer en sårklemme centreret over snittet. Kontroller, at huden er godt klippet. Hvis snittet er lidt for stort til, at et sårklip kan lukke det tilstrækkeligt, kan kirurgisk hudlim påføres de overlegne og ringere dele af snittet.
- Hvis du bruger suturer, skal du placere det nødvendige antal suturer gennem huden uden at gribe det underliggende væv. Denne type snit kræver 2-3 enkelt afbrudte suturer ved hjælp af 4-0 ikke-absorberbart suturmateriale.
- Rens huden omkring det kirurgiske sted forsigtigt med saltvand og en steriliseret applikator med bomuldsspids for at fjerne eventuelt tørret blod eller resterende antiseptisk skrubbe.
2. Urin ovariektomi
- Forbered et aseptisk arbejdsområde og sørg for, at nødvendige kirurgiske instrumenter er blevet steriliseret og er let tilgængelige. Følg aseptisk praksis for gnaveroverlevelseskirurgi.
- Registrer vægten af hunmusen og administrer den foretrukne anæstesimetode i henhold til dine institutionelle retningslinjer. I denne protokol blev 2% isofluran leveret via en præcisionsfordamper for at opretholde anæstesi. Før proceduren skal du administrere smertestillende medicin i henhold til dine institutionelle retningslinjer. I denne protokol blev 1,0 mg/kg Buprenorphin SR og 5 mg/kg Meloxicam indgivet subkutant.
- Administrer smørende øjengel på dyrets øjne for at undgå dannelse af øjenskade, hornhindeudtørring eller sår. Sørg for, at der er en varmekilde til rådighed for at opretholde dyrets kropstemperatur under operationen. Sørg for det korrekte anæstesiplan ved at kontrollere, om der er et tåklemmerespons.
- Forbered dyrets kirurgiske område, inden det placeres i det kirurgiske felt.
- Barber forsigtigt håret på den dorsolaterale region af dyrets ryg ved hjælp af et par klippere. Fjern hår fra regionen over hofternes overlegne grænse og under ribbenburets nedre grænse samt områderne mellem disse vartegn.
- Brug en applikator med bomuldsspids til at påføre et lag hårfjerningscreme på dyrets hud, der dækker det område, der lige var barberet. Vent i 30 s og fjern cremen med et stykke gasbind, fjern de fine hår, der er tilbage.
- Brug en 70% ethanol-gennemblødt gaze svamp til at tørre eventuelle resterende creme og hår fra det kirurgiske område.
BEMÆRK: 70% ethanol i dette trin er at hjælpe med helt at fjerne hårfjerningscreme. Antiseptisk forberedelse af det kirurgiske sted udføres i trin 2.5.
- Placer dyret i lateral position (til snit for at fjerne en æggestok ad gangen) i det kirurgiske felt og sørg for, at en varmekilde er tilgængelig. Skrub det operative område med Betadine kirurgisk skrubbe (eller en lignende antiseptisk hudpræparatskrubbe) efterfulgt af 70% alkohol mindst tre gange for at sikre korrekt desinfektion af huden. For hver skrubbe skrubbes i en radial bevægelse udad, så midten af snittet skrubbes først, og den ydre kant af det barberede kirurgiske område skrubbes sidst.
- På dette tidspunkt skal du tage sterile kirurgiske handsker på. For de næste trin i proceduren skal du bruge aseptiske teknikker. Placer et kirurgisk drapering med et lille snit i det (skær en ca. 0,5-1 tommer firkant i draperingen for at passe til det kirurgiske sted) over dyret, så kroppen er dækket af drapermateriale.
- Find det ideelle sted for det kirurgiske snit ved at finde halvvejs mellem musens hofter og ribben (se figur 2). Tag fat i huden med pincet og lav et snit på 1,0 cm i huden på dette sted.
- Brug et stump tippet instrument (sonde, kirurgisk spatel eller stump tippet hæmostat) for at adskille huden fra undersiden muskelvæv. Tag dig tid til at gøre dette på snittets laterale, overlegne og ringere grænser.
- Find den dorsolaterale muskelvæg i maven. Fjern om nødvendigt fedtvæv, der ligger mellem huden og muskellagene. Hos modne mus er dette fedtvæv mere fremtrædende. Flyt dette fedtvæv mod den kaudale ende af musen og udsæt muskelvæggen.
- Fedtvæv er differentieret fra abdominalvæggen efter farve: fedtvæv fremstår bleg hvidt og ligger mere overfladisk, mens abdominalvæggen ser lyserød ud og ligger dybere end fedtvævet.
- Tag fat i abdominalvæggen med rottetandtang og lav et 0,5 cm snit i det.
- Tag fat i en kant af dette snit med et par tang, brug et andet par til at nå ind i kropshulrummet, og find æggestokken, livmoderhornet og fedtpuden. Træk forsigtigt dette gennem snittet i muskelvæggen for at adskille musklen fra det underliggende væv og eksteriørisere det. Find overgangen mellem livmoderhornet og æggestokken.
- Afbryd æggestokken ved at udføre en knusnings- og tåreteknik.
- Placer en klemme på den distale ende af livmoderhornet, og placer den anden klemme lige distal til den første. Mens du lægger et fast tryk med begge klemmer, skal du flytte den mere distale væk fra kroppen og rive forbindelsen mellem dem. For at minimere blødning og vævsskade skal du holde den proksimale klemme stille under denne proces og pas på ikke også at trække den væk fra kroppen.
- Alternativt kan du bruge et cautery. Brug et par tang eller hæmostater til at klemme livmoderhornet lige proksimalt til det ønskede cautery punkt. Brug et cautery værktøj til at adskille vævene.
- Slip forsigtigt og langsomt den proksimale klemme og kontroller for tegn på blødning.
- Lad vævsstubben trække sig tilbage i kropshulen. Tag fat i abdominalvæggen og træk forsigtigt opad. Tving ikke vævsstubben indad, da dette øger sandsynligheden for blødning.
- Find snittets grænser ind i muskelvæggen og bring dem sammen for at forberede sig på at suturere det.
- Placer 1-2 enkelt afbrudte suturer i mavemuskelvæggen ved hjælp af 4-0 absorberbart suturmateriale. Trim suturenderne til 0,5 cm ved hjælp af sutur saks.
- Luk snittet ved at lade huden vende tilbage til sin naturlige hviletilstand og derefter evert det opad, og pas på ikke at få fat i underliggende væv eller enderne af suturmaterialet. Placer 1-2 sårklip på den everted hud. Baseret på dine institutionelle retningslinjer kan huden også lukkes ved hjælp af 4-0 ikke-absorberbart suturmateriale.
- For at fjerne den anden æggestok skal du skifte musens position for at have den anden laterale side opad. Vær forsigtig, når du skifter musens position for ikke at lægge for meget pres på den sårklippede hud fra trin 2.17.
- Gentag trin 2.5 - 2.17 på denne side.
- Rens huden omkring det kirurgiske sted forsigtigt med saltvand og en steriliseret applikator med bomuldsspids for at fjerne eventuelt tørret blod eller resterende antiseptisk skrubbe.
3. Postoperativ pleje
- I henhold til dine institutionelle retningslinjer skal du administrere smertestillende medicin i op til 72 timer efter operationen. Dokumenter dyrenes kirurgiske procedure med angivelse af dato, klokkeslæt, bedøvelsesmiddel og smertestillende middel. Her administreres Buprenorphin med langsom frigivelse og meloxicam præoperativt.
- Efter afslutningen af dyrenes operation overføres de til et rent bur foret med et tørt papirhåndklæde. Placer dette bur 2/3 på en varmekilde, og lad den anden 1/3 af buret være ude af varme. Placer ikke mus sammen i et bur, før de er kommet sig efter anæstesi.
- Lad dyret genvinde evnen til frit at gå rundt i buret, før det placeres tilbage i et rent bur med normalt dyrestrøelse. På dette tidspunkt kan mus huses sammen, hvis alle er kommet sig efter anæstesi.
- I de første mange dage efter operationen skal du sørge for, at fugtig mad og vand er let tilgængeligt. Placer lidt fugtet mad på bunden af buret. Kontroller ofte musens kirurgiske sted og se efter tegn på infektion eller blødning.
- Efter operationen skal du sørge for, at mus enten er anbragt alene eller sammen med andre dyr, der har gennemgået den samme procedure samtidigt. En mus, der kommer sig efter operation, der er placeret i samme bur som en uden kirurgi, kan medføre en fare og bør undgås.
- For mus, der har gennemgået ovariektomi og har sårklip på de dorsolaterale sider af ryggen, skal du fjerne eventuelle gnaver-iglohabitater fra buret for at reducere risikoen for, at musens sårklip bliver fanget på igloen i løbet af den første uge af helingen.
- Hold øje med dyret for tegn på infektion, smerte eller kirurgiske komplikationer hver 12. time gennem de første 72 timer af helingstiden.
- Fjern sårklemmer ved hjælp af et sårklipfjernerværktøj 10-14 dage efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den procedure, der præsenteres her, udføres på en til tre måneder gamle mus i C57BL/6J-baggrunden. Hanmus vejede 16-28 g, og hunmus vejede 14-24 g på tidspunktet for proceduren. Denne procedure er optimeret til at være anvendelig for mus i mange aldre, fra fravænning gennem voksenalderen.
Kirurgisk orkiektomi involverer et enkelt hudsnit i den ventrale scrotalsæk, som afbildet i figur 1A. Begge testikler fjernes en ad gangen og adskilles gennem sædlederens og spermatiske blodkar, hvilket resulterer i fjernelse af testiklerne og vedhæftet epididymis (figur 1B). Det fjernede indhold omfatter testikler, epididymis og lyskefedtpude, vist i figur 1C. Vellykket fjernelse af testiklerne kan bekræftes ved visuel observation af fjernet væv og sikre god hæmostase af vævsstubben inden lukning af kropshulen. Succesen med orkiektomi kan måles ved observation af godt restituerede mus, der demonstrerer helede snitsteder (figur 1D). Mus, der har gennemgået orkiektomi, vil også vise en reduktion i niveauet af testosteron målt i museserum så tidligt som en uge efter proceduren (figur 1E).
Kirurgisk bilateral ovariektomi udføres ved snit i venstre og højre dorsum af hunmus (figur 2A). Den laterale snitmetode kan anvendes, hvis kun en æggestok skal fjernes. I denne tilgang skæres abdominalvæggen, og æggestokkens fedtpude er placeret. Fedtpuden, æggestokken, æggestokkene og det distale livmoderhorn, som afbildet i figur 2B, er eksteriøriseret, efterfulgt af afskæring af det distale livmoderhorn. Denne teknik resulterer i fjernelse af æggestokken og ovidukten. Æggestokken og æggestokkene kan fjernes uden at inkludere det distale livmoderhorn, men der er risiko for, at eventuelle resterende ovarieceller fortsat vil holde musen i østruscyklusser. Inkludering af det distale livmoderhorn sikrer, at den fulde æggestok og kanal fjernes, der vil være en udtømning af kønshormonerne, og musene vil ikke længere cykle. Figur 2C viser et eksempel på de murin kvindelige reproduktive organer, der er dissekeret ud af kroppen. Det kan observeres, at æggestokkene selv er meget mindre end de omgivende væv. En dissektion omfang eller loupes hjælpemidler i identifikationen af disse væv. Figur 2D demonstrerer æggestokkens anatomi under et dissekerende omfang med væv fra livmoderfedtpuden fjernet, hvilket giver mulighed for bedre visualisering. Succesen med denne procedure kan måles ved observation af godt genvundne mus, der demonstrerer helede snitsteder (figur 2E).
Ovariektomikirurgi er sikker og effektiv, når den udføres hurtigt og med minimal forstyrrelse af omgivende væv. Ved at følge den procedure, der er skitseret her, opnås dette ved at sikre, at hud- og abdominalvægssnittet er placeret korrekt, hvilket giver mulighed for hurtig placering af livmodervævet. Identifikation af ribbenburets nedre grænse og benbenets overlegne kant sikrer, at snittet foretages nær vævet af interesse. At lave et snit, der er ca. halvvejs mellem ribbenenes nedre grænse og den overlegne kant af benbenene og er placeret ca. 1,5 cm lateralt til rygsøjlen, giver mulighed for god positionering af det kirurgiske sted, når der udføres en lateral snittilgang (figur 2A).
Bekræftelse af kirurgisk ovariektomi er vist ved observation af livmoderatrofi. Figur 2F viser et livmoderhorn dissekeret fra en 6 måneder gammel mus, mens figur 2G viser et livmoderhorn fra en 6 måneder gammel mus, der gennemgik kirurgisk ovariektomi ved tre måneders alder. Det ovariektomiserede livmoderhorn ser tyndere ud og mangler vedhæftning til æggestokken i den distale ende. Denne metode til bekræftelse af den kirurgiske teknik viser effektivt, at fjernelsen af æggestokken resulterede i atrofi af livmodervævet.
Når væv er blevet identificeret og udskåret, kan operationen afsluttes ved lukning af sårene og omhyggelig postoperativ overvågning. Korrekt aseptisk teknik14 er vigtig for at sikre gode resultater, når der udføres overlevelseskirurgi. Når musen begynder at helbrede fra snittene, udføres overvågning for at lede efter tegn på smerte og kirurgiske komplikationer. En mulig kirurgisk komplikation er indre blødninger på grund af at stikke eller nicking blodkar, mens du forsøger at skære eller manipulere vævet. Dette betegnes ved et vedvarende rødt, blussende udseende under huden omkring det kirurgiske sted. Undgå komplikationer som disse opnås ved korrekt lokalisering af snitsteder og hjælper kirurgens syn ved hjælp af et kirurgisk mikroskop eller lup. Visuel undersøgelse anbefales hver 12. time i de første tre dage efter operationen. Vellykket operation vil resultere i rene, helbredende sår (figur 1D, 2E).
Figur 1: Mandlig murin orkiektomi . (A) En hanmus vises i liggende stilling med placeringen af et kirurgisk snit i pungsækken til fjernelse af testiklerne, som er vist med rødt. (B) Billede taget under orkiektomi kirurgisk procedure, der viser løsrivelsespunktet i grønt. (C) Dissekerede testikler, fedtpuder og bitestik fra en hanmus. (D) En hanmus med en velhelet sårklemme over pungsnittet efter orkiektomi. E) Serumtestosteronkoncentration hos mus i ng/ml bestemt ved ELISA-interpolation. Begge grupper repræsenterer 9 uger gamle mus. Kirurgiske orkiektomier blev udført ved 8 ugers alderen. N = 3 mus pr. Gruppe. Prøverne blev kørt i tre eksemplarer. Serumprøver blev indsamlet ved hjertepunktur og frosset indtil analysetidspunktet. *, p < 0,05. Fejlbjælker = SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ovariektomi hos hunner . (A) En hunmus vist i lateral position med det kirurgiske snitsted til fjernelse af en enkelt æggestok fra den dorsale laterale side, vist med rødt. Andre vigtige anatomiske vartegn fremhæves. (B) Billede taget under operationen, der viser den udvendige æggestok, ovidukt og distale livmoderhorn med løsrivelsespunktet vist med grønt. (C) Dissekerede livmoderhorn, æggestokke og fedtpuder fra en hunmus. (D) Et nærbillede af den dissekerede æggestok, ovariekanal og distale del af livmoderhornet med fedt fra fedtpuden fjernet, hvilket giver mulighed for bedre visualisering af æggestokken. (E) En hunmus med en velhelet sårklemme over snittet efter ovariektomi. (F) Dissekeret muselivmoderhorn. (G) Dissekeret muselivmoderhorn 3 måneder efter ovariektomiprocedure, der viser livmoderatrofi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Grafisk abstrakt for murin ovariektomi og orkiektomi. En billedlig gengivelse af orkiektomiproceduren for hanmus, der involverer fjernelse af testikler og ovariektomiprocedure, der involverer fjernelse af æggestokkene, som begge resulterer i en kønshormonforarmet musemodel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kirurgisk fjernelse af testikler og æggestokke giver mulighed for at studere murinfysiologi under kontrolleret hormonmangel. Denne teknik er vigtig for mange videnskabelige områder, herunder neurodegeneration, mineralmetabolisme, kardiovaskulær og reproduktiv sundhed 15,16,17,18,19,20,21. Her beskriver vi en protokol til hurtig, sikker og effektiv fjernelse af murin æggestokke og testikler ved hjælp af overlevelseskirurgi for at nedbryde kønshormonerne. Når de udføres af en erfaren kirurg, kan disse procedurer tage så lidt som 5 minutter, hvilket resulterer i en meget høj overlevelsesrate hos mus.
Nogle overvejelser, når du planlægger en museoperation, omfatter det bedste snitsted og dyrets fysiologi. I tilfælde af orkiektomi kan musetestiklerne også fjernes gennem maven ved et ventralt snit i midterlinjen13. Denne teknik åbner ikke kun bughulen, men er også afhængig af hurtig identifikation af de inguinale fedtpuder. For nye kirurger er det svært hurtigt at udføre denne teknik. Når mus er meget unge, er fedtpuderne også mindre udviklede og derfor sværere at finde. Den scrotale tilgang, der er skitseret i denne protokol, er en passende mulighed for forskere, der er nye inden for musekirurgi, opererer på små, unge mus, eller som ønsker at minimere risikoen for at forstyrre andre organer i bughulen ved et abdominal snit.
Kirurgisk ovariektomi indebærer fjernelse af en eller begge æggestokke. Som for de fleste kirurgiske procedurer involverer sikre og hurtige metoder normalt at gøre snittet i huden og underliggende fascia så lille som muligt. Dette giver mulighed for reducerede suturer og sårklip og hurtigere heling. Mens det at være i stand til at gøre snittene mindre er en færdighed, der følger med praksis, er det gavnligt at være sikker på placeringen af snittet. Figur 2A viser et eksempel på, hvordan man finder de bedste snitpunkter. På grund af den lille museanatomi vil æggestokken ligge nær leveren og på venstre side af musen tæt på milten. Utilsigtet sondering og træk på disse organer kan resultere i uønsket blødning eller skade. Vi giver en detaljeret vejledning til den korrekte snitplacering og identifikation af de omgivende anatomiske landemærker for at hjælpe med denne teknik og reducere sandsynligheden for uønskede komplikationer.
Her giver vi et eksempel på, hvordan denne procedure kan bruges til effektivt at slå ned de cirkulerende hormonniveauer hos mus mindre end en uge efter den kirurgiske procedure, samt hvordan det resterende gonadale væv atrofierer over tid efter proceduren. Tidligere metoder og forskning beskriver, hvordan disse kan gøres for at generere overgangsalderen eller andropause musemodeller, men mange af disse udføres i rottemodeller snarere end mus12,22. Mens rotter og mus har lignende anatomi, har murinsystemet mindre anatomiske strukturer. Her leverer vi en metode, der pålideligt fungerer i musemodeller helt ned til 3 uger. Samlet set repræsenterer disse to protokoller en konsekvent måde at hurtigt udføre overlevelse gnaver orkiektomier og ovariektomier, genkende musens anatomi og minimere kirurgiske komplikationer, hvilket skaber grundlag for ensartede og effektive resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker University of Texas Southwestern Medical Center Animal Resource Center for deres hjælp med kirurgisk træning og protokolgennemgang. Vi takker Wert Labs supportteam for deres uvurderlige hjælp. Dette arbejde er blevet støttet af midler fra National Institute of Health (NIH P30EY030413). Biorender.com blev brugt til oprettelse af tegneserieskemaer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
