Summary
Dette manuskriptet beskriver en konsistent måte å raskt utføre overlevelse gnagere orkiektomier og ovariektomier.
Abstract
Kjønnshormonsignalering spiller en kritisk rolle i flere organsystemer, så vel som i utviklingen av ulike sykdommer, inkludert nevrodegenerativ sykdom. Manipulering av kjønnshormonnivåer i murine modellsystemet gjør det mulig å studere deres innvirkning på organer / vev og innen sykdomsprogresjon. Orkiektomi - kirurgisk fjerning av testiklene - og ovariektomi - kirurgisk fjerning av eggstokkene - gir en metode for å tømme de endogene kjønnshormonene slik at de nøyaktige hormonnivåene kan tilveiebringes gjennom legemiddel eller andre leveringsmetoder. Her tilbyr vi raske og minimalt invasive metoder for både orkiektomi og ovariektomi i murine modellsystemet for reduksjon av kjønnshormoner. Denne protokollen beskriver kirurgisk forberedelse og eksisjon av testiklene gjennom pungsekken, og eksisjon av eggstokkene via to snitt i høyre og venstre lateral dorsum.
Introduction
Testiklene og eggstokkene er de primære organene som er ansvarlige for kjønnshormonproduksjon. Kaskaden av hormonell kommunikasjon som fører til produksjon av testosteron og østrogen er en godt karakterisert prosess som begynner i hypothalamus med frigjøring av gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH)1. Utgivelsen av GnRH forårsaker frigjøring av luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH) fra hypofysen. Når disse hormonene kommer inn i blodet, påvirker de deretter andre vev i kroppen. Det primære målet for LH er testiklene (hos menn) og eggstokkene (hos kvinner)2. Som svar på LH, testiklene produsere og frigjøre testosteron3. På samme måte produserer eggstokkene østrogen4. Mens de tilsiktede effektene av disse hormonene er å forberede cellene og kroppen for befruktning og sikre et fungerende reproduksjonssystem, kan mange andre kroppslige systemer påvirkes.
Kjønnshormoner har vært knyttet til flere fysiologiske funksjoner. For eksempel bidrar østrogen til å opprettholde beinhomeostase ved å forhindre resorpsjon av bein av osteoklaster. Av denne grunn kan ovariektomiserte musemodeller brukes til å studere fysiologien til bein sykdommer som osteoporose 5,6,7. Testosteron og østrogen er også forskningsmål for mange kardiovaskulære og nevrodegenerative sykdommer. Nylig har forhøyet testosteronproduksjon kombinert med fettfattig diett vært knyttet til vaskulær oksidativ stress8. I hjernen har endringer i LH etter ovariektomi forårsaket endringer i romlig minne9. Reduksjon av østrogener etter ovariektomi har også blitt et modellsystem for å studere celledød i hippocampus, da dette kan indusere apoptose, noe som resulterer i hukommelsesunderskudd10. Testosteron har også vist en rolle i veksten av nyrer både i musemodeller og mennesker etter nyretransplantasjon11.
Opprettelsen av en hormonberøvet murinmodell gjør det mulig å studere kjønnshormoner og deres hormonkaskader på ulike sykdommer eller vev. Dette kan oppnås ved kirurgisk fjerning av testiklene (orkiektomi) eller eggstokkene (ovariektomi). Denne prosedyren kan utføres hos mus av hvilken som helst belastning når de er så unge som avvenningsalder (tjueen dager) eller hvilken som helst voksen alder. Ovariektomi utføres hos kvinnelige mus, mens orkiektomi utføres hos hannmus. Ved å fjerne disse organene, kan nivåene av østrogen og testosteron, og mange av deres derivater, som progesteron, reduseres kraftig12,13. Prosessen med å utføre orkiektomier eller ovariektomier hos mus kan være rask og minimalt invasiv med riktig teknikk. Rask eksisjon av disse organene på en sikker og effektiv måte kan muliggjøre rask kirurgisk behandling samtidig som musenumrene holdes minimale ved å ha en 100% overlevelsesrate når de utføres riktig. Her beskriver vi en protokoll for rask eksisjon av testiklene og eggstokkene og demonstrerer riktig postkirurgisk overvåking for å gjøre det mulig for forskere å utføre denne operasjonen raskt og trygt. Vi inkluderer også visuelle eksempler på kjønnsorganene og omkringliggende vev for å gi kirurgen anatomiske landemerker når du utfører denne prosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved UTSW (APN#2019-102840).
1. Murine orkiektomi
- Forbered et aseptisk arbeidsfelt og sørg for at nødvendige kirurgiske instrumenter er sterilisert og lett tilgjengelige. Følg aseptisk praksis for gnagere overlevelse kirurgi.
- Registrer vekten av hannmusen og administrer den foretrukne anestesimetoden i henhold til institusjonelle retningslinjer. I denne protokollen ble 2 % isofluran tilført via en presisjonsfordamper for å opprettholde anestesi. Før prosedyren, administrer smertestillende medisin i henhold til institusjonelle retningslinjer. I denne protokollen ble 1,0 mg/kg SR for buprenorfin og 5 mg/kg meloksikam gitt subkutant.
- Når musen er under anestesi, dekk dyrets øyne med smørende øyegel for å unngå dannelse av øyeskade, uttørking av hornhinnen eller sår.
- Før du fortsetter, sørg for riktig anestesiplan ved å utføre en tåklemmeresponstest.
- Forbered dyrets kirurgiske område før du legger det på det aseptiske, draperte kirurgiske feltet.
- Deretter barberer du musens inguinal og scrotal områder ved hjelp av et par klippere.
MERK: Barbering av underlivet bedre enn penis vil tillate bedre visualisering under operasjonen. - Bruk en bomullstapet applikator, påfør et tynt lag hårfjerningskrem (se materialfortegnelse) på dyrets hud, som dekker pungen og det omkringliggende området som nettopp var barbert. Vent i 30 s og fjern kremet med et stykke rent gasbind.
- Bruk 70% etanol-gjennomvåt gasbind svamper til å tørke av gjenværende krem og hår av området.
MERK: 70% etanol i dette trinnet er å hjelpe til med fullstendig fjerning av hårfjerningskrem. Antiseptisk forberedelse av operasjonsstedet utføres i trinn 1.8.
- Deretter barberer du musens inguinal og scrotal områder ved hjelp av et par klippere.
- Overfør musen til operasjonsområdet og sørg for at en varmekilde er tilgjengelig for å opprettholde dyrets kroppstemperatur under operasjonen. Plasser dyret i en liggende stilling på en kirurgisk drapering og bruk myk tape for å feste musens føtter til operasjonsmatten.
- Hvis testiklene stiger opp i magen, forsiktig palpere magen for å få testiklene ned. Bruk en hansket hånd til å påføre forsiktig rulletrykk nedover på magen.
MERK: Det er lettere å utføre denne operasjonen under et disseksjonsomfang eller ved hjelp av et par luper for forbedret forstørrelse. Hvis du utfører dette under et disseksjonsomfang, ta deg tid til å plassere musens skrot under synsfeltet i omfanget. En myk tape kan brukes til å feste musens ben eller mage til det kirurgiske feltet for å sikre at den holder seg i riktig plassering. - Skrubb huden med Betadine kirurgisk skrubb (eller en lignende antiseptisk hudpreparasjonsskrubb), etterfulgt av 70% alkoholskrubb minst tre ganger for å sikre riktig desinfeksjon av huden. For hver skrubb, skrubb i en radiell bevegelse utover, slik at midten av snittstedet skrubbes først og slutter med at den ytre grensen til det barberte kirurgiske området blir skrubbet sist.
- På denne tiden, sett på sterile kirurgiske hansker. For de neste trinnene i prosedyren, bruk aseptiske teknikker. Dekk musen med en steril kirurgisk drapering med et lite snitt (kuttet til omtrent 0,5-1 tomme firkant for å passe over operasjonsstedet) over dyret for å dekke kroppen i draperingsmaterialet.
- Lag et ventralt midtlinjesnitt i pungen ca. 1 cm -1,5 cm i lengde ved hjelp av et kirurgisk skalpellblad eller lignende instrumenter i henhold til dine godkjente institusjonelle retningslinjer for dyrevelferd.
- Ta tak i kuttgrensen til huden, bruk et stumpt tipped instrument for å skille huden fra undervevet. Ta deg tid til å gjøre dette på snittets laterale, overordnede og nedre grenser.
- Isoler en testikkel ved å bruke slikkepott og tang for å flytte snittet i huden som skal sentreres på toppen av en av testiklene. Hvis dette er vanskelig, gå tilbake til 1,11 og skill huden ytterligere fra lagene under.
- Ta et par buede tang og legg dem på hver side av testikkelen. Påfør et mildt trykk nedover for å eksteriorisere testikkelen. Ta tak i det tynne, gjennomsiktige laget av muskel som er på toppen av testikkelen ved hjelp av tang. Dette er cremastermuskelen. Verifikasjon av riktig muskellag gjøres ved å observere dette laget og dets sirkulasjon, som beveger seg uavhengig av testikkelen under den.
MERK: Identifikasjon av riktig vev bekreftes av dets gjennomsiktighet og evne til å bevege seg uavhengig av det underliggende vevet.- Manipuler muskelvevet ved hjelp av tang til toppen av muskelen er grepet. Dette bør være den laveste delen, med testiklene og cauda epididymis plassert under.
- Ta tak i cremastermuskelen med tang og beveg deg forsiktig bort fra testiklene og bitestikkelen. Lag et 0,5 cm snitt gjennom cremastermuskelen til den første testikkelen ved toppunktet ved hjelp av en liten Vannas-fjærsaks.
- Plasser en låseklemme på den bakre kanten av den kuttede cremastermuskelen. Bruk et smalt par hemostater eller et par låsende mikronåleholdere. Når vevet er klemmet, legg forsiktig instrumentet på siden av musen for å holde vevet klemmet ned under følgende prosedyretrinn.
- Bruk tang for å ta tak i den øvre grensen til snittet som ble gjort i trinn 1.14. Mens de to endene av cremastermuskelen trekkes tilbake, bruk et annet par tang for å nå inn i hulrommet og ta forsiktig tak i testikkelen.
- Trekk den utover gjennom hullet i muskelen. Vær forsiktig med å se etter tegn på nicked blodkar og blod i det kirurgiske feltet.
- Testikkelen, epididymis, festet spermatisk ledning og blodkar vil være tydelig når vevet er riktig eksternalisert.
- Nær den caudal-dorsale enden av epididymis og testikkel, er det et fibrøst festepunkt for testikkel til cremastermuskelen. Rull det utvendige vevet sideveis for å finne dette innsettingspunktet. Kutt dette for å unngå skade på muskelen og tillate ytterligere isolering og visualisering av vev. Bruk to par tang for å utføre en klemme- og riveteknikk.
- Se etter fettvev rundt testikkelen fra inguinal fettpute. Bruk en tang til å ta tak i fettputen og dra forsiktig for å utvendige den.
- Ikke ta tak i blodkaret som beveger seg langs fettputen, da det å trekke på dette kan føre til blødning.
- Finn spermatisk ledning, blodkar og gjenværende fettpute som er proksimal for det ytre vevet, og bruk et par hemostater for å klemme den. Mens du holder liten spenning på den distale testikkelen, cauterize spermatisk ledning og blodkar distalt for hemostatklemmen.
- Når du er ferdig, slipp sakte klemmen proksimalt til den cauterized enden og se etter tegn på blødning. Hvis det finnes, gjentar du dette trinnet. Det er nyttig å bruke et par tang for å holde mild spenning på den distale enden av vevet som blir cauterized.
- La den avskårne stubben av spermatisk ledning trekke seg tilbake i kroppen. Ta tak i de to kuttede endene av cremastermuskelen og før dem sammen. Vurder størrelsen på kuttet i vevet, og lukk vevet ved hjelp av 4-0 eller 5-0 absorberbare suturer. Avhengig av snittstørrelsen, vil det være behov for 1 eller 2 suturer. Trim suturendene til 0,5 cm ved hjelp av sutursaks.
- Gjenta trinn 1,13-1,20 på den andre siden av pungen for å fjerne den andre testikkelen.
- Forbered deg på å lukke hudsnittet.
- Sørg for god hemostase av begge vevsstubber. Dårlig hemostase vil resultere i gjenværende blødning i det kirurgiske feltet. Hvis dette skjer, finn blødningen og cauterize. Dette unngås ved langsom og forsiktig manipulering av vevet med stumpe instrumenter.
- Hvis blod er sett i det kirurgiske feltet, bruk en sterilisert bomull-tipped applikator for å tørke området for bedre visualisering. Bruk en sprøyte til å dryppe saltvann på området for å irrigere blod eller væske vekk fra det kirurgiske feltet.
- Trekk de to sidene av huden snittet sammen for å forberede den for nedleggelse. Forsikre deg om at de suturerte endene av cremaster-snittene ikke stikker ut i hudsnittet. Trim om nødvendig endene av suturen ytterligere.
- Lukk huden.
- Hvis du bruker sårklemmer, bruk tang for å fukte huden og trekke den bort fra det underliggende vevet. Plasser en sårklemme sentrert over snittet. Sjekk at huden er godt klippet. Hvis snittet er litt for stort til at en sårklemme kan lukke det tilstrekkelig, kan kirurgisk hudlim påføres de øvre og nedre delene av snittet.
- Hvis du bruker suturer, plasser det nødvendige antall suturer gjennom huden, uten å ta tak i det underliggende vevet. Denne typen snitt vil kreve 2-3 enkelt avbrutte suturer ved bruk av 4-0 ikke-absorberbart suturmateriale.
- Rengjør huden forsiktig rundt operasjonsstedet med saltvann og en sterilisert bomullstippet applikator for å fjerne tørket blod eller gjenværende antiseptisk skrubb.
2. Murine ovariektomi
- Forbered et aseptisk arbeidsfelt og sørg for at nødvendige kirurgiske instrumenter er sterilisert og lett tilgjengelige. Følg aseptisk praksis for gnagere overlevelse kirurgi.
- Registrer vekten av den kvinnelige musen og administrer den foretrukne anestesimetoden i henhold til dine institusjonelle retningslinjer. I denne protokollen ble 2 % isofluran tilført via en presisjonsfordamper for å opprettholde anestesi. Før prosedyren, administrer smertestillende medisin i henhold til institusjonens retningslinjer. I denne protokollen ble 1,0 mg/kg SR for buprenorfin og 5 mg/kg meloksikam gitt subkutant.
- Administrer smørende øyegel på dyrets øyne for å unngå dannelse av øyeskade, hornhindeuttørking eller sår. Sørg for at en varmekilde er tilgjengelig for å opprettholde dyrets kroppstemperatur under operasjonen. Sørg for riktig anestesiplan ved å se etter en tåklemmerespons.
- Forbered dyrets kirurgiske område før du plasserer det i det kirurgiske feltet.
- Barber håret forsiktig på den dorsolaterale regionen av dyrets rygg ved hjelp av et par klippere. Fjern hår fra regionen over den øvre grensen til hoftene og under den nedre grensen til ribbeholderen, samt områdene mellom disse landemerkene.
- Bruk en bomullstippet applikator, påfør et lag med hårfjerningskrem på dyrets hud, som dekker området som nettopp ble barbert. Vent i 30 s og fjern kremet med et stykke gasbind, fjern de fine hårene som er igjen.
- Bruk en 70% etanol-gjennomvåt gasbind svamp for å tørke gjenværende krem og hår fra operasjonsområdet.
MERK: 70% etanol i dette trinnet er å hjelpe til med å fjerne hårfjerningskrem helt. Antiseptisk forberedelse av operasjonsstedet utføres i trinn 2.5.
- Plasser dyret i sideleie (for snitt for å fjerne en eggstokk om gangen) i kirurgisk felt og sørg for at en varmekilde er tilgjengelig. Skrubb operasjonsområdet med Betadine kirurgisk skrubb (eller en lignende antiseptisk hudpreparasjonsskrubb), etterfulgt av 70% alkohol minst tre ganger for å sikre riktig desinfeksjon av huden. For hver skrubb, skrubb i en radiell bevegelse utover, slik at midten av snittet skrubbes først og den ytre grensen til det barberte kirurgiske området skrubbes sist.
- På denne tiden, sett på sterile kirurgiske hansker. For de neste trinnene i prosedyren, bruk aseptiske teknikker. Plasser en kirurgisk drapering med et lite snitt i den (kutt en omtrent 0,5-1 tommers firkant i drapet for å passe til operasjonsstedet) over dyret slik at kroppen er dekket av drapmateriale.
- Finn det ideelle stedet for det kirurgiske snittet ved å finne halvveispunktet mellom hoftene og ribbeina på musen (se figur 2). Ta tak i huden med tang og gjør et snitt på 1,0 cm inn i huden på dette stedet.
- Bruk en stump tipped instrument (sonde, kirurgisk slikkepott, eller stump tipped hemostater) for å skille huden fra undersiden muskelvev. Ta deg tid til å gjøre dette på snittets laterale, overordnede og nedre grenser.
- Finn den dorsolaterale muskelveggen i magen. Hvis nødvendig, fjern fettvev som ligger mellom huden og muskellagene. Hos modne mus er dette fettvevet mer fremtredende. Flytt dette fettvevet mot den kaudale enden av musen, og utsett muskelveggen.
- Fettvev er differensiert fra bukveggen etter farge: fettvev virker blekhvitt og ligger mer overfladisk, mens bukveggen virker rosa og ligger dypere enn fettvevet.
- Ta tak i bukveggen med rottetanntang og gjør et 0,5 cm snitt i den.
- Ta tak i en kant av dette snittet med ett par tang, bruk et annet par for å nå inn i kroppshulen, og finn eggstokken, livmorhornet og fettputen. Trekk dette forsiktig gjennom snittet i muskelveggen for å skille muskelen fra det underliggende vevet og eksteriorisere det. Finn overgangen mellom livmorhornet og eggstokken.
- Kutt eggstokken ved å utføre en knuse og rive teknikk.
- Plasser en klemme på den distale enden av livmorhornet og plasser den andre klemmen bare distalt for den første. Mens du bruker fast trykk med begge klemmer, flytt den mer distale bort fra kroppen, og riv forbindelsen mellom dem. For å minimere blødning og vevskader, hold den proksimale klemmen stasjonær under denne prosessen, og vær forsiktig så du ikke også trekker den bort fra kroppen.
- Alternativt kan du bruke en cautery. Bruk et par tang eller hemostatiker for å klemme livmorhornet bare proksimalt til ønsket cautery punkt. Bruk et cautery verktøy for å kutte vevet.
- Slipp forsiktig og sakte den proksimale klemmen og se etter tegn på blødning.
- La vevsstubben trekke seg tilbake i kroppshulen. Ta tak i bukveggen og trekk forsiktig oppover. Ikke tving vevsstubben innover, da dette øker sannsynligheten for blødning.
- Finn kantene av snittet i muskelveggen og ta dem sammen for å forberede seg på å suturere den.
- Plasser 1-2 enkelt avbrutte suturer i bukmuskelveggen ved hjelp av 4-0 absorberbart suturmateriale. Trim suturendene til 0,5 cm ved hjelp av sutursaks.
- Lukk snittet ved å la huden gå tilbake til sin naturlige hviletilstand og deretter vandre den oppover, vær forsiktig så du ikke tar tak i underliggende vev eller endene av suturmaterialet. Plasser 1-2 sårklemmer på den avbrutte huden. Basert på dine institusjonelle retningslinjer, kan huden også lukkes ved hjelp av 4-0 ikke-absorberbart suturmateriale.
- For å fjerne den andre eggstokken, bytt musens posisjon slik at den andre sidesiden vender opp. Vær forsiktig når du bytter musens posisjon for ikke å legge for mye press på den sårklippede huden fra trinn 2.17.
- Gjenta trinn 2,5 - 2,17 på denne siden.
- Rengjør huden forsiktig rundt operasjonsstedet med saltvann og en sterilisert bomullstippet applikator for å fjerne tørket blod eller gjenværende antiseptisk skrubb.
3. Postoperativ behandling
- I henhold til institusjonens retningslinjer, administrer smertestillende medisin i opptil 72 timer etter operasjonen. Dokumenter dyrenes kirurgiske prosedyre, og noter dato, klokkeslett, bedøvelse og smertestillende bruk. Her gis buprenorfin med langsom frisetting og meloksikam preoperativt.
- Etter ferdigstillelse av dyrenes kirurgi, overfør dem til et rent bur foret med et tørt papirhåndkle. Plasser dette buret 2/3 på en varmekilde, og la den andre 1/3 av buret være av varme. Ikke plasser mus sammen i et bur før de har kommet seg etter anestesi.
- La dyret gjenvinne evnen til å gå fritt rundt buret før du legger dem tilbake i et rent bur med vanlig dyresengetøy. På dette tidspunktet kan mus bli plassert sammen hvis alle har gjenopprettet fra anestesi.
- De første dagene etter operasjonen må du sørge for at fuktig mat og vann er lett tilgjengelig. Legg litt fuktet mat på bunnen av buret. Sjekk ofte på musens operasjonssted og se etter tegn på infeksjon eller blødning.
- Etter operasjonen, sørg for at mus enten er plassert alene eller sammen med andre dyr som har gjennomgått samme prosedyre samtidig. En mus som gjenoppretter fra kirurgi som ligger i samme bur som en uten kirurgi, kan introdusere en fare og bør unngås.
- For mus som har gjennomgått ovariektomi og har sårklemmer på de dorsolaterale sidene av ryggen, fjern eventuelle gnageriglohabitater fra buret for å redusere sjansen for at musens sårklipp blir fanget på igloen i løpet av den første uken av helbredelse.
- Fortsett å overvåke dyret for tegn på infeksjon, smerte eller kirurgiske komplikasjoner hver 12. time gjennom de første 72 timene av helbredelsestiden.
- Fjern sårklemmer ved hjelp av et sårklipsverktøy 10-14 dager etter operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prosedyren som presenteres her utføres i en til tre måneder gammel mus i C57BL/6J-bakgrunnen. Hannmus veide 16-28 g, og kvinnelige mus veide 14-24 g på tidspunktet for prosedyren. Denne prosedyren er optimalisert for å kunne brukes for mus i mange aldre, fra avvenning til voksen alder.
Kirurgisk orkiektomi innebærer et enkelt hudsnitt i ventral pungsekk, som vist i figur 1A. Begge testiklene fjernes en om gangen og kuttes gjennom vas deferens og spermatiske blodkar, noe som resulterer i fjerning av testis og festet epididymis (figur 1B). Det fjernede innholdet inkluderer testis, epididymis, og inguinal fett pad, vist i figur 1C. Vellykket fjerning av testiklene kan bekreftes ved visuell observasjon av fjernet vev og sikre god hemostase av vevsstubben før lukking av kroppshulen. Suksessen til orkiektomi kan måles ved observasjon av godt gjenopprettede mus som demonstrerer helbredede snittsteder (figur 1D). Mus som har gjennomgått orkiektomi vil også vise en reduksjon i testosteronnivået målt i museserum så tidlig som en uke etter inngrepet (figur 1E).
Kirurgisk bilateral ovariektomi gjøres ved snitt i venstre og høyre dorsum hos hunnmus (figur 2A). Den laterale snitttilnærmingen kan brukes hvis bare en eggstokk skal fjernes. I denne tilnærmingen er bukveggen innskåret, og eggstokkfettputen er plassert. Fettputen, eggstokken, eggstokkkanalen og det distale livmorhornet, som vist i figur 2B, er eksteriorisert, etterfulgt av å kutte det distale livmorhornet. Denne teknikken resulterer i fjerning av eggstokken og ovidukten. Eggstokken og eggstokkkanalen kan fjernes uten å inkludere det distale livmorhornet, men det er fare for at eventuelle gjenværende eggstokkceller vil fortsette å holde musen i brunstsykluser. Inkludert det distale livmorhornet sikrer at hele eggstokken og kanalen fjernes, det vil bli en uttømming av kjønnshormonene, og musene vil ikke lenger sykle. Figur 2C viser et eksempel på murine kvinnelige reproduktive organer dissekert ut av kroppen. Det kan observeres at eggstokkene selv er mye mindre enn det omkringliggende vevet. En disseksjon omfang eller loupes hjelpemidler i identifiseringen av disse vev. Figur 2D viser ovarieanatomien under et dissekeringsomfang med vev fra livmorfettputen fjernet, noe som muliggjør bedre visualisering. Suksessen til denne prosedyren kan måles ved observasjon av godt gjenopprettede mus som demonstrerer helbredede snittsteder (figur 2E).
Ovariektomi kirurgi er trygt og effektivt når det utføres raskt og med minimal forstyrrelse av omgivende vev. Etter prosedyren som er skissert her, oppnår dette ved å sikre at huden og bukveggsnittet er plassert riktig, noe som muliggjør rask lokalisering av livmorvevet. Identifisering av den nedre grensen til ribbeholderen og den øvre grensen til benbenene sikrer at snittet blir gjort nær vevet av interesse. Å lage et snitt som er omtrent halvveis mellom den nedre grensen til ribbeina og øvre kant av leggbenene og ligger ca. 1,5 cm lateralt til ryggraden, gir god posisjonering av operasjonsstedet når man utfører en lateral snitttilnærming (figur 2A).
Bekreftelse av kirurgisk ovariektomi er vist ved observasjon av livmoratrofi. Figur 2F viser et livmorhorn dissekert fra en 6 måneder gammel mus, mens figur 2G viser et livmorhorn fra en 6 måneder gammel mus som gjennomgikk kirurgisk ovariektomi ved tre måneders alder. Det ovariektomiserte livmorhornet virker tynnere og mangler vedlegget til eggstokken på den distale enden. Denne metoden for bekreftelse av kirurgisk teknikk viser effektivt at fjerning av eggstokken resulterte i atrofi av livmorvevet.
Når vev har blitt identifisert og skåret ut, kan operasjonen fullføres ved lukking av sårene og nøye postoperativ overvåking. Riktig aseptisk teknikk14 er viktig for å sikre gode resultater ved overlevelseskirurgi. Når musen begynner å helbrede fra snittene, utføres overvåking for å se etter tegn på smerte og kirurgiske komplikasjoner. En mulig kirurgisk komplikasjon er indre blødninger på grunn av poking eller nicking blodkar mens du prøver å snitte eller manipulere vevet. Dette betegnes av et vedvarende rødt, rødt utseende under huden rundt operasjonsstedet. Unngå komplikasjoner som disse oppnås ved riktig lokalisering av snittsteder og hjelpe kirurgens syn ved bruk av et kirurgisk mikroskop eller luper. Visuell undersøkelse anbefales hver 12. time de tre første dagene etter operasjonen. Vellykket kirurgi vil resultere i rene, helbredende sår (figur 1D, 2E).
Figur 1 Mannlig murine orkiektomi. (A) En hannmus vises i liggende stilling med plasseringen av et kirurgisk snitt i pungsekken for fjerning av testis, som er vist i rødt. (B) Bilde tatt under orkiektomi kirurgisk prosedyre som viser løsrivelsespunktet i grønt. (C) Dissekert testis, fettputer og bitestikkelen fra en hannmus. (D) En hannmus med en godt helbredet sårklemme over pungsnittet etter orkiektomi. (E) Serumtestosteronkonsentrasjon hos mus i ng / ml som bestemt ved ELISA-interpolering. Begge gruppene representerer 9 uker gamle mus. Kirurgiske orkiektomier ble utført ved 8 ukers alder. N = 3 mus per gruppe. Prøvene ble kjørt i tre eksemplarer. Serumprøver ble tatt ved hjertepunksjon og fryst ned til analysetidspunktet. *, p < 0,05. Feilfelt = SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Kvinnelig murine ovariektomi. (A) En hunnmus vist i sideleie med det kirurgiske snittstedet for fjerning av en enkelt eggstokk fra dorsalsiden, vist i rødt. Andre viktige anatomiske landemerker er uthevet. (B) Bilde tatt under operasjonen som viser den eksterioriserte eggstokken, ovidukten og distale livmorhornet med løsrivelsespunktet vist i grønt. (C) Dissekerte livmorhorn, eggstokker og fettputer fra en kvinnelig mus. (D) Et nærbilde av dissekert eggstokk, eggstokkkanal og distale del av livmorhornet med fett fra fettputen fjernet, noe som muliggjør bedre visualisering av eggstokken. (E) En kvinnelig mus med en godt helbredet sårklemme over snittet etter ovariektomi. (F) Dissekert mus livmorhorn. (G) Dissekert mus livmorhorn 3 måneder etter ovariektomi prosedyre, som viser livmoratrofi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Grafisk abstrakt for murine ovariektomi og orkiektomi. En billedlig fremstilling av orkiektomiprosedyren for hannmus som involverer fjerning av testis og ovariektomi-prosedyren som involverer fjerning av eggstokkene, som begge resulterer i en kjønnshormonutarmet musemodell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kirurgisk fjerning av testikler og eggstokker gjør det mulig å studere murinfysiologi under kontrollert hormonmangel. Denne teknikken er viktig for mange fagområder, inkludert nevrodegenerasjon, mineralmetabolisme, kardiovaskulær og reproduktiv helse 15,16,17,18,19,20,21. Her beskriver vi en protokoll for rask, sikker og effektiv fjerning av murine eggstokkene og testiklene ved hjelp av overlevelseskirurgi for å tømme kjønnshormonene. Når de utføres av en erfaren kirurg, kan disse prosedyrene ta så lite som 5 minutter, noe som resulterer i en svært høy overlevelse hos mus.
Noen hensyn når du planlegger en museoperasjon inkluderer det beste snittstedet og dyrets fysiologi. I tilfelle av orkiektomi, kan musen testis også fjernes gjennom magen ved en midtlinje ventral snitt13. Denne teknikken åpner ikke bare bukhulen, men er også avhengig av rask identifisering av inguinal fettputer. For nye kirurger er det vanskelig å utføre denne teknikken raskt. Når musene er veldig unge, er fettputene også mindre utviklede og derfor vanskeligere å finne. Den scrotal tilnærming skissert i denne protokollen er et egnet alternativ for forskere som er nye til mus kirurgi, opererer på små, unge mus, eller som ønsker å minimere sjansen for å forstyrre andre organer i bukhulen ved en abdominal snitt.
Kirurgisk ovariektomi innebærer fjerning av en eller begge eggstokkene. Som for de fleste kirurgiske prosedyrer, sikre og raske metoder vanligvis innebære å gjøre snittet i huden og underliggende fascia så liten som mulig. Dette muliggjør reduserte suturer og sårklemmer og raskere helbredelse. Selv om det å kunne gjøre snittene mindre er en ferdighet som kommer med praksis, er det gunstig å være trygg på plasseringen av snittet. Figur 2A viser et eksempel på hvordan man finner de beste snittpunktene. På grunn av den lille musens anatomi vil eggstokken ligge nær leveren, og på venstre side av musen, nær milten. Utilsiktet sondering og trekke på disse organene kan føre til uønsket blødning eller skade. Vi gir en detaljert veiledning til riktig snittplassering og identifisering av de omkringliggende anatomiske landemerkene for å hjelpe til med denne teknikken og redusere sannsynligheten for uønskede komplikasjoner.
Her gir vi et eksempel på hvordan denne prosedyren kan brukes til effektivt å slå ned de sirkulerende hormonnivåene hos mus mindre enn en uke etter den kirurgiske prosedyren, samt hvordan det gjenværende gonadale vevet atrofierer over tid etter prosedyren. Tidligere metoder og forskning beskriver hvordan disse kan gjøres for å generere overgangsalder eller andropause musemodeller, men mange av disse utføres i rottemodeller i stedet for mus12,22. Mens rotter og mus har lignende anatomi, har murinsystemet mindre anatomiske strukturer. Her tilbyr vi en metode som pålitelig fungerer i musemodeller så unge som 3 ukers alder. Samlet sett representerer disse to protokollene en konsistent måte å raskt utføre overlevelse gnager orkiektomier og ovariektomier, gjenkjenne musens anatomi og minimere kirurgiske komplikasjoner, noe som skaper grunnlag for konsistente og effektive resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker University of Texas Southwestern Medical Center Animal Resource Center for deres hjelp i kirurgisk trening og protokollgjennomgang. Vi takker Wert Labs supportteam for deres uvurderlige hjelp. Dette arbeidet har blitt støttet av midler fra National Institute of Health (NIH P30EY030413). Biorender.com ble brukt til å lage tegneserieskjemaer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
