Summary
כתב יד זה מתאר דרך עקבית לבצע במהירות כריתת מכרסמים הישרדותית וכריתת שחלות.
Abstract
איתות הורמוני מין ממלא תפקיד קריטי במערכות איברים מרובות, כמו גם בהתקדמות של מחלות שונות, כולל מחלות נוירודגנרטיביות. המניפולציה של רמות הורמוני המין במערכת מודל מורין מאפשרת לחקור את השפעתם על איברים/רקמות ובתוך התקדמות המחלה. אורכיאקטומיה - הסרה כירורגית של האשכים - וכריתת שחלות - הסרה כירורגית של השחלות - מספקות שיטה לדלדול הורמוני המין האנדוגניים, כך שניתן יהיה לספק את רמות ההורמונים המדויקות באמצעות תרופות או שיטות מסירה אחרות. כאן, אנו מספקים שיטות מהירות וזעיר פולשניות הן לכריתת שחלות והן לכריתת שחלות במערכת מודל מורין להפחתת הורמוני מין. פרוטוקול זה מפרט את ההכנה הכירורגית והכריתה של האשכים דרך שק האשכים, וכריתה של השחלות דרך שני חתכים בגב הלטרלי הימני והשמאלי.
Introduction
האשכים והשחלות הם האיברים העיקריים האחראים על ייצור הורמוני המין. מפל התקשורת ההורמונלית המוביל לייצור טסטוסטרון ואסטרוגן הוא תהליך מאופיין היטב שמתחיל בהיפותלמוס עם שחרורו של הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH)1. שחרור GnRH גורם לשחרור הורמון luteinizing (LH) והורמון מגרה זקיק (FSH) מבלוטת יותרת המוח. כאשר הורמונים אלה נכנסים לזרם הדם, הם משפיעים על רקמות אחרות בגוף. המטרה העיקרית של LH היא האשכים (אצל זכרים) והשחלות (אצל נקבות)2. בתגובה ל- LH, האשכים מייצרים ומשחררים טסטוסטרון3. באופן דומה, השחלות מייצרות אסטרוגן4. בעוד ההשפעות המיועדות של הורמונים אלה הן להכין את התאים ואת הגוף להפריה ולהבטיח מערכת רבייה מתפקדת, מערכות גוף רבות אחרות יכולות להיות מושפעות.
הורמוני מין נקשרו למספר תפקודים פיזיולוגיים. לדוגמה, אסטרוגן מסייע לשמור על הומאוסטזיס העצם על ידי מניעת ספיגת עצם על ידי אוסטאוקלסטים. מסיבה זו, מודלים עכבר השחלה ניתן להשתמש כדי ללמוד את הפיזיולוגיה של מחלות עצם כגון אוסטאופורוזיס 5,6,7. טסטוסטרון ואסטרוגן הם גם מטרות מחקר עבור מחלות לב וכלי דם רבות ומחלות נוירודגנרטיביות. לאחרונה, ייצור טסטוסטרון מוגבר יחד עם תזונה עתירת שומן נקשרו לעקה חמצונית וסקולרית8. במוח, שינויים ב- LH לאחר כריתת שחלות גרמו לשינויים בזיכרון המרחבי9. הפחתת אסטרוגנים לאחר כריתת שחלות הפכה גם למערכת מודל לחקר מוות תאי בהיפוקמפוס, שכן זה יכול לגרום אפופטוזיס, וכתוצאה מכך ליקויים בזיכרון10. טסטוסטרון הראה גם תפקיד בצמיחת הכליות הן במודלים של עכברים והן בבני אדם לאחר השתלת כליה11.
יצירת מודל מורין נטול הורמונים מאפשרת לחקור את הורמוני המין ואת מפל ההורמונים שלהם על מחלות או רקמות שונות. זה יכול להיות מושגת על ידי הסרה כירורגית של האשכים (orchiectomy) או השחלות (ovariectomy). הליך זה יכול להתבצע בעכברים מכל זן כאשר הם צעירים כמו גיל הגמילה (עשרים ואחד ימים) או כל גיל בוגר. כריתת שחלות מבוצעת בעכברים נקבות, ואילו כריתת שחלות מבוצעת בעכברים זכרים. על ידי הסרת איברים אלה, רמות האסטרוגן והטסטוסטרון, ורבים מהנגזרות שלהם, כגון פרוגסטרון, ניתן להפחית באופן משמעותי12,13. תהליך ביצוע כריתת שחלות או כריתת שחלות בעכברים יכול להיות מהיר וזעיר פולשני עם הטכניקה הנכונה. כריתה מהירה של איברים אלה בצורה בטוחה ויעילה יכולה לאפשר עיבוד כירורגי מהיר תוך שמירה על מספרי עכברים מינימליים על ידי שיעור הישרדות של 100% כאשר מבוצע כראוי. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול לכריתה מהירה של האשכים והשחלות ומדגימים את הניטור הנכון לאחר הניתוח כדי לאפשר לחוקרים לבצע ניתוח זה במהירות ובבטחה. אנו כוללים גם דוגמאות חזותיות של איברי המין והרקמות הסובבות כדי לספק למנתח ציוני דרך אנטומיים בעת ביצוע הליך זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ב- UTSW (APN#2019-102840).
1. כריתת מורין
- הכינו שדה עבודה אספטי וודאו שכלי הניתוח הדרושים עוקרו וזמינים. בצע שיטות אספטיות עבור ניתוח הישרדות מכרסמים.
- רשום את משקל העכבר הזכר ונהל את שיטת ההרדמה המועדפת על פי ההנחיות המוסדיות. בפרוטוקול זה, 2% איזופלורן הועבר באמצעות וופורייזר מדויק לשמירה על הרדמה. לפני ההליך, יש לתת תרופות כאב בהתאם להנחיות המוסדיות. בפרוטוקול זה, 1.0 מ"ג / ק"ג Buprenorphine SR ו 5 מ"ג / ק"ג Meloxicam הועברו תת עורית.
- ברגע שהעכבר נמצא תחת הרדמה, כסו את עיני החיה בג'ל עיניים משמן כדי למנוע היווצרות של פגיעה בעיניים, התייבשות הקרנית או כיב.
- לפני שתמשיך, ודא את מישור ההרדמה הנכון על ידי ביצוע בדיקת תגובה צביטת בוהן.
- הכינו את האזור הכירורגי של בעל החיים לפני הנחתו על השדה הכירורגי האספטי.
- לאחר מכן, לגלח את אזורי המפשעה ושק האשכים של העכבר באמצעות זוג קוצצים.
הערה: גילוח הבטן התחתונה העדיפה על הפין יאפשר הדמיה טובה יותר במהלך הניתוח. - בעזרת אפליקטור מודבק כותנה, מרחו שכבה דקה של קרם דפילטורי (ראו טבלת חומרים) על עור החיה, וכיסו את שק האשכים ואת האזור שמסביב שזה עתה גולח. המתן 30 שניות והסר את הקרם עם חתיכת גזה נקייה.
- השתמשו בספוגי גזה ספוגי אתנול 70% כדי לנגב את שאריות הקרם והשיער מהאזור.
הערה: 70% אתנול בשלב זה הוא לסייע בהסרה מלאה של קרם depilatory. הכנה חיטוי של האתר הכירורגי מתבצעת בשלב 1.8.
- לאחר מכן, לגלח את אזורי המפשעה ושק האשכים של העכבר באמצעות זוג קוצצים.
- העבירו את העכבר לאזור הניתוח וודאו שיש מקור חום זמין לשמירה על חום הגוף של בעל החיים במהלך הניתוח. הניחו את בעל החיים במצב שכיבה על וילון כירורגי והשתמשו בסרט הדבקה רך כדי להצמיד את רגלי העכבר למזרן הניתוח.
- אם האשכים עולים לתוך הבטן, בזהירות למשש את הבטן כדי לקבל את האשכים לרדת. השתמש ביד כפפה כדי להפעיל לחץ גלגול עדין כלפי מטה על הבטן.
הערה: קל יותר לבצע ניתוח זה תחת היקף דיסקציה או באמצעות זוג זכוכית מגדלת להגדלה משופרת. אם אתה מבצע זאת תחת טווח דיסקציה, הקדש רגע כדי למקם את שק האשכים של העכבר מתחת לשדה הראייה של הטווח. ניתן להשתמש בסרט רך כדי להצמיד את רגלי העכבר או בטנו לשדה הניתוח כדי להבטיח שהוא נשאר במיקום הנכון. - יש לשפשף את העור עם פילינג כירורגי בטאדין (או פילינג דומה להכנת עור מחטא), ולאחר מכן לשפשף 70% אלכוהול לפחות שלוש פעמים כדי להבטיח חיטוי נאות של העור. עבור כל קרצוף, יש לשפשף בתנועה רדיאלית כלפי חוץ, כך שאת אמצע אתר החתך מקרצפים תחילה וכלה בקרצוף האחרון של הגבול החיצוני של אזור הניתוח המגולח.
- בשלב זה, ללבוש כפפות כירורגיות סטריליות. עבור השלבים הבאים של ההליך, להשתמש בטכניקות אספטיות. כסו את העכבר עם וילון כירורגי סטרילי עם חתך קטן (חתוך לכ 0.5-1 אינץ 'מרובע כדי להתאים מעל אתר הניתוח) מעל החיה כדי לכסות את הגוף בחומר הווילון.
- צור חתך בקו האמצע הגחוני בשק האשכים באורך של כ-1 ס"מ עד 1.5 ס"מ באמצעות להב אזמל כירורגי או מכשירים דומים בהתאם להנחיות המוסדיות המאושרות שלך לרווחת בעלי חיים.
- באחיזת הגבול החתוך של העור, השתמש במכשיר קהה כדי להפריד את העור מהרקמה שמתחת לרקמה. קח זמן לעשות זאת על הגבולות הרוחביים, העליונים והנחותים של החתך.
- בודד אשך באמצעות מרית ומלקחיים כדי להזיז את החתך בעור כדי להיות ממורכז על אחד האשכים. אם זה קשה, לחזור ל 1.11 ולהפריד עוד יותר את העור מהשכבות שמתחת.
- קח זוג מלקחיים מעוקלים והנח אותם משני צדי האשך. הפעל לחץ עדין כלפי מטה כדי לחוץ את האשך. תפוס את שכבת השריר הדקה והשקופה שנמצאת על גבי האשך באמצעות מלקחיים. זהו שריר הקרמסטר. אימות שכבת השריר הנכונה נעשה על ידי התבוננות בשכבה זו ובמחזור הדם שלה, הנע באופן עצמאי מהאשך שמתחתיה.
הערה: זיהוי הרקמה הנכונה מאושר על ידי שקיפותה ויכולתה לנוע באופן עצמאי מהרקמות הבסיסיות.- לתפעל את רקמת השריר באמצעות מלקחיים עד לתפיסת קודקוד השריר. זה צריך להיות החלק הנמוך ביותר, עם האשכים ואת cauda epididymis ממוקם מתחת.
- אחזו בשריר הקרמסטר במלקחיים והתרחקו בעדינות מהאשכים ומהאפידידימיס. צור חתך של 0.5 ס"מ דרך שריר הקרמסטר של האשך הראשון בשיאו באמצעות זוג מספריים קפיציים קטנים של Vannas.
- מניחים מהדק נעילה על הקצה האחורי של שריר הקרמאסטר החתוך. השתמש זוג צר של hemostats או זוג מחזיקי מחט מיקרו נעילה. לאחר הידוק הרקמה, הנח בעדינות את המכשיר בצד הצדדי של העכבר כדי לשמור על הרקמה מהודקת במהלך השלבים הפרוצדורליים הבאים.
- השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הגבול העליון של החתך שנעשה בשלב 1.14. בזמן ששני הקצוות של שריר הקרמסטר נסוגים, השתמשו בזוג מלקחיים נוסף כדי להגיע אל תוך החלל ותפסו בעדינות את האשך.
- משוך אותו החוצה דרך החור בשריר. היזהר לשים לב לכל סימן של כלי דם ניקובים ודם בשדה הניתוח.
- האשך, אפידידימיס, חוט הזרע המחובר וכלי הדם יהיו גלויים כאשר הרקמות מוחצנות כראוי.
- ליד הקצה הקאודלי-גבי של האפידידימיס והאשך, יש נקודת חיבור סיבית של האשך לשריר הקרמסטר. גלגלו את הרקמה החיצונית לרוחב כדי לאתר נקודת הכנסה זו. לנתק את זה כדי למנוע נזק לשריר ולאפשר בידוד נוסף הדמיה של רקמות. השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי לבצע טכניקת מהדק וקרע.
- חפשו רקמת שומן סביב האשך מכרית השומן המפשעה. השתמשו בזוג מלקחיים כדי לתפוס את כרית השומן ומשכו אותה בעדינות כדי להוציא אותה החוצה.
- אין לתפוס את כלי הדם שנע לאורך כרית השומן, כמו משיכה על זה יכול להוביל לדימום.
- אתרו את חוט הזרע, כלי הדם וכרית השומן הנותרת הקרובה לרקמות החיצוניות והשתמשו בזוג המוסטטים כדי להדק אותה. תוך כדי החזקת מתח קל באשך הדיסטלי, צרוב את חוט הזרע וכלי הדם דיסטליים למהדק המוסט.
- לאחר השלמתו, שחררו לאט את המהדק פרוקסימלי לקצה הצרוב ובדקו סימני דימום. אם קיים, חזור על שלב זה. כדאי להשתמש בזוג מלקחיים כדי להחזיק מתח עדין בקצה הדיסטלי של הרקמה הצובה.
- אפשרו לגדם הקטוע של חוט הזרע לסגת חזרה לגוף. תפוס את שני הקצוות החתוכים של שריר הקרמאסטר וקרב אותם יחד. להעריך את גודל החתך ברקמה, ולסגור את הרקמה באמצעות 4-0 או 5-0 תפרים נספגים. בהתאם לגודל החתך, יהיה צורך בתפרים 1 או 2. חותכים את קצות התפר עד 0.5 ס"מ באמצעות מספריים לתפר.
- חזור על שלבים 1.13-1.20 בצד השני של שק האשכים כדי להסיר את האשך השני.
- יש להתכונן לסגירת החתך בעור.
- להבטיח hemostasis טוב של שני גדמי הרקמות. המוסטזיס ירוד יגרום לדימום שיורי בתחום הניתוחי. אם זה קורה, לאתר את הדימום ולצרוב. זה נמנע על ידי מניפולציה איטית וזהירה של הרקמות עם מכשירים קהים.
- אם רואים דם בשדה הניתוח, השתמש במוליך כותנה מעוקר כדי לייבש את האזור להדמיה טובה יותר. השתמש מזרק כדי לטפטף מלוחים על האזור כדי להשקות כל דם או נוזל הרחק משדה הניתוח.
- משכו את שני צידי החתך בעור יחד כדי להכין אותו לסגירה. יש לוודא שהקצוות התפורים של חתכי הקרמסטר אינם בולטים לתוך חתך העור. במידת הצורך, יש לקצץ עוד יותר את קצות התפר.
- סגרו את העור.
- אם אתם משתמשים באטבי פצעים, השתמשו במלקחיים כדי לנתק את העור ולמשוך אותו הרחק מהרקמה שמתחתיו. מניחים אטב פצע אחד במרכז החתך. בדוק כי העור הוא גזוז היטב. אם החתך מעט גדול מדי עבור קליפ פצע אחד כדי לסגור אותו מספיק, ניתן למרוח דבק עור כירורגי על החלקים העליונים והנחותים של החתך.
- אם אתם משתמשים בתפרים, הניחו את מספר התפרים הדרוש דרך העור, מבלי לתפוס את הרקמה שמתחתיו. חתך מסוג זה ידרוש 2-3 תפרים קטועים בודדים באמצעות 4-0 חומר תפר שאינו נספג.
- יש לנקות את העור סביב אתר הניתוח בעדינות עם מי מלח ומוליך כותנה מעוקר כדי להסיר דם מיובש או שאריות של פילינג אנטיספטי.
2. כריתת שחלות מורין
- הכינו שדה עבודה אספטי וודאו שכלי הניתוח הדרושים עוקרו וזמינים. בצע שיטות אספטיות עבור ניתוח הישרדות מכרסמים.
- רשום את משקל העכבר הנשי ונהל את שיטת ההרדמה המועדפת בהתאם להנחיות המוסדיות שלך. בפרוטוקול זה, 2% איזופלורן הועבר באמצעות וופורייזר מדויק לשמירה על הרדמה. לפני ההליך, יש לתת תרופות נגד כאבים בהתאם להנחיות המוסדיות. בפרוטוקול זה, 1.0 מ"ג / ק"ג Buprenorphine SR ו 5 מ"ג / ק"ג Meloxicam הועברו תת עורית.
- יש למרוח ג'ל עיניים משמן על עיני בעל החיים כדי למנוע היווצרות פגיעה בעיניים, התייבשות הקרנית או כיב. ודא מקור חום זמין כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים במהלך הניתוח. ודא את מישור ההרדמה הנכון על ידי בדיקת תגובת צביטת הבוהן.
- הכינו את האזור הכירורגי של בעל החיים לפני הכנסתו לשדה הניתוח.
- יש לגלח בעדינות את השיער על האזור הגבי של גב החיה באמצעות זוג קוצצים. הסר שיער מהאזור שמעל הגבול העליון של הירכיים ומתחת לגבול התחתון של כלוב הצלעות, כמו גם את האזורים שבין ציוני דרך אלה.
- בעזרת מוליך צמר גפן, מרחו שכבה של קרם מסיר שיער על עור החיה, וכיסו את האזור שזה עתה גולח. מחכים 30 שניות ומסירים את הקרם עם חתיכת גזה, מסירים את השערות העדינות שנותרו.
- השתמשו בספוג גזה ספוג אתנול 70% כדי לנגב את שאריות הקרם והשיער מאזור הניתוח.
הערה: 70% אתנול בשלב זה הוא לסייע בהסרה מוחלטת של קרם depilatory. הכנה אנטיספטית של אתר הניתוח מתבצעת בשלב 2.5.
- הניחו את בעל החיים במצב רוחבי (לחתך להסרת שחלה אחת בכל פעם) בשדה הניתוחי וודאו כי קיים מקור חום זמין. יש לקרצף את האזור הניתוחי עם פילינג כירורגי Betadine (או פילינג דומה להכנת עור מחטא), ולאחר מכן 70% אלכוהול לפחות שלוש פעמים כדי להבטיח חיטוי עור תקין. עבור כל קרצוף, יש לשפשף בתנועה רדיאלית כלפי חוץ, כך שאת אמצע החתך מקרצפים תחילה ואת הגבול החיצוני של אזור הניתוח המגולח אחרון.
- בשלב זה, ללבוש כפפות כירורגיות סטריליות. עבור השלבים הבאים של ההליך, להשתמש בטכניקות אספטיות. מניחים וילון כירורגי עם חתך קטן בתוכו (חותכים ריבוע של כ 0.5-1 אינץ 'בווילון כדי להתאים לאתר הניתוח) מעל בעל החיים כך שהגוף מכוסה בחומר וילון.
- אתר את המיקום האידיאלי עבור החתך הניתוחי על-ידי מציאת נקודת אמצע הדרך בין הירכיים והצלעות של העכבר (ראה איור 2). אחזו את העור במלקחיים ובצעו חתך של 1.0 ס"מ לתוך העור במיקום זה.
- השתמש במכשיר קהה (בדיקה, מרית כירורגית, או hemostats קהה) כדי להפריד את העור מרקמת השריר שמתחת לרקמת השריר. קח זמן לעשות זאת על הגבולות הרוחביים, העליונים והנחותים של החתך.
- אתר את דופן השריר הדורסולטרלי של הבטן. במידת הצורך, הסירו רקמת שומן שנמצאת בין שכבת העור לשכבת השריר. בעכברים בוגרים, רקמת שומן זו בולטת יותר. הזיזו את רקמת השומן לכיוון הקצה הקאודלי של העכבר, וחשפו את דופן השריר.
- רקמת השומן נבדלת מדופן הבטן בצבע: רקמת השומן נראית לבנה בהירה ושטחית יותר, ואילו דופן הבטן נראית ורודה ועמוקה יותר מרקמת השומן.
- אחזו בדופן הבטן בעזרת מלקחיים של שיני חולדה ובצעו לתוכו חתך של 0.5 ס"מ.
- תפסו גבול אחד של חתך זה עם זוג מלקחיים אחד, השתמשו בזוג שני כדי להגיע לתוך חלל הגוף, ומצאו את השחלה, קרן הרחם וכרית השומן. משכו אותו בעדינות דרך החתך בדופן השריר כדי להפריד את השריר מהרקמה שמתחתיו ולצאת ממנו. אתר את המעבר בין קרן הרחם לשחלה.
- לחתוך את השחלה על ידי ביצוע טכניקת ריסוק וקרע.
- מניחים מהדק אחד בקצה הדיסטלי של קרן הרחם ומניחים את המהדק השני רק דיסטלי לראשון. תוך הפעלת לחץ חזק עם שני מלחציים, להרחיק את הדיסטלי יותר מהגוף, לקרוע את הקשר ביניהם. כדי למזער דימום ונזק לרקמות, שמור על מהדק פרוקסימלי נייח במהלך תהליך זה והיזהר לא למשוך אותו גם מהגוף.
- לחלופין, השתמש בצריבה. השתמש זוג מלקחיים או hemostats כדי להדק את קרן הרחם רק פרוקסימלי לנקודת הצריבה הרצויה. השתמש בכלי צריבה כדי לנתק את הרקמות.
- שחררו בעדינות ובאיטיות את המהדק הפרוקסימלי ובדקו סימני דימום.
- אפשרו לגדם הרקמה לסגת לתוך חלל הגוף. תפסו את דופן הבטן ומשכו בעדינות כלפי מעלה. אין לדחוף את גדם הרקמה פנימה, כמו זה מגדיל את הסבירות לדימום.
- אתרו את גבולות החתך בדופן השריר וחברו אותם יחד כדי להתכונן לתפירתו.
- יש להכניס 1-2 תפרים קטועים בודדים לדופן שריר הבטן באמצעות חומר תפר נספג 4-0. חותכים את קצות התפר עד 0.5 ס"מ באמצעות מספריים לתפר.
- סגרו את החתך בכך שתאפשרו לעור לחזור למצב המנוחה הטבעי שלו ואז לסובב אותו כלפי מעלה, תוך זהירות שלא לתפוס את הרקמה שמתחתיו או את קצות חומר התפרים. יש להניח 1-2 אטבי פצעים על העור הקטוע. בהתאם להנחיות המוסדיות שלך, ניתן לסגור את העור גם באמצעות חומר תפר 4-0 שאינו נספג.
- כדי להסיר את השחלה השנייה, החלף את מיקום העכבר כך שהצד השני הצדדי פונה כלפי מעלה. היו עדינים בעת החלפת תנוחת העכבר כדי לא להפעיל לחץ רב מדי על העור החתוך של הפצע משלב 2.17.
- בצד זה, חזור על שלבים 2.5 - 2.17.
- יש לנקות את העור סביב אתר הניתוח בעדינות עם מי מלח ומוליך כותנה מעוקר כדי להסיר דם מיובש או שאריות של פילינג אנטיספטי.
3. טיפול לאחר הניתוח
- בהתאם להנחיות המוסדיות שלך, יש לתת תרופות נגד כאבים עד 72 שעות לאחר הניתוח. תעד את ההליך הכירורגי של בעלי החיים, תוך ציון התאריך, השעה, חומר ההרדמה ומשכך הכאבים שבהם נעשה שימוש. כאן, שחרור איטי Buprenorphine ו meloxicam מנוהל לפני הניתוח.
- לאחר סיום הניתוח של בעלי החיים, העבירו אותם לכלוב נקי מרופד במגבת נייר יבשה. מניחים את הכלוב 2/3 על מקור חום, ומשאירים את 1/3 הכלוב האחרים מחום. אין להניח עכברים יחד בכלוב עד שהם התאוששו מההרדמה.
- אפשרו לבעל החיים להחזיר לעצמו את היכולת להסתובב בחופשיות בכלוב לפני החזרתו לכלוב נקי עם מצעים רגילים של בעלי חיים. בשלב זה, עכברים יכולים להיות מאוחסנים יחד אם כולם התאוששו מהרדמה.
- בימים הראשונים לאחר הניתוח, יש לוודא שמזון לח ומים נגישים בקלות. הניחו מעט אוכל לח בתחתית הכלוב. לעתים קרובות לבדוק על אתר כירורגי העכבר ולחפש כל סימנים של זיהום או דימום.
- לאחר הניתוח, יש לוודא שהעכברים שוכנים לבדם או עם בעלי חיים אחרים שעברו את אותו הליך בו זמנית. עכבר המתאושש מניתוח הממוקם באותו כלוב כמו עכבר ללא ניתוח עלול להוות סכנה ויש להימנע ממנו.
- עבור עכברות שעברו כריתת שחלות ויש להן קליפסים לפצעים בצידי הגב הגב, הסר את כל בתי הגידול של איגלו מכרסם מהכלוב כדי להפחית את הסיכוי שקליפ הפצע של העכבר ייתפס באיגלו במהלך השבוע הראשון לריפוי.
- המשך לעקוב אחר בעל החיים לאיתור סימני זיהום, כאב או סיבוכים כירורגיים כל 12 שעות במהלך 72 השעות הראשונות של זמן הריפוי.
- הסר אטבי פצעים באמצעות כלי מסיר קליפסים לפצע 10-14 יום לאחר הניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההליך המוצג כאן מבוצע בעכברים בני חודש עד שלושה חודשים על רקע C57BL/6J. עכברים זכרים שקלו 16-28 גרם, ועכברות נקבות שקלו 14-24 גרם בזמן ההליך. הליך זה הותאם כך שיהיה ישים עבור עכברים בגילאים רבים, החל מהגמילה ועד לבגרות.
כריתה כירורגית כוללת חתך עור יחיד בשק האשכים הגחוני, כפי שמתואר באיור 1A. שני האשכים מוסרים בזה אחר זה ונחתכים דרך כלי הדם וכלי הדם הזרעיים, מה שמוביל להסרת האשכים והאפידידימיס המצורף (איור 1B). התכולה שהוסרה כוללת את האשכים, האפידידימיס וכרית השומן המפשעה, כפי שניתן לראות באיור 1C. הסרה מוצלחת של האשכים יכולה להיות מאושרת על ידי תצפית חזותית של רקמות שהוסרו והבטחת hemostasis טוב של גדם הרקמה לפני סגירת חלל הגוף. ההצלחה של כריתת אורכיאקטומיה יכולה להימדד על-ידי התבוננות בעכברים שהתאוששו היטב ומדגימים אתרי חתך שנרפאו (איור 1D). עכברים שעברו כריתת אורכיאקטומיה גם ידגימו ירידה ברמת הטסטוסטרון שנמדדה בסרום עכברים כבר שבוע לאחר ההליך (איור 1E).
כריתת שחלות דו-צדדית כירורגית נעשית על-ידי חתכים לתוך הגב השמאלי והימני של נקבות עכברים (איור 2A). ניתן להשתמש בגישת החתך הצידי אם יש להסיר שחלה אחת בלבד. בגישה זו חותכים את דופן הבטן, וכרית השומן השחלתי ממוקמת. כרית השומן, השחלה, צינור השחלות וקרן הרחם הדיסטלית, כפי שמתואר באיור 2B, הם חיצוניים, ולאחר מכן נקטעת קרן הרחם הדיסטלית. טכניקה זו גורמת להסרת השחלה והאובידוקט. ניתן להסיר את השחלה ואת צינור השחלה מבלי לכלול את קרן הרחם הדיסטלית, אך קיים סיכון שכל תאי השחלה הנותרים ימשיכו לשמור על העכבר במחזורי הייחום. הכללת קרן הרחם הדיסטלית מבטיחה הסרת השחלה והצינור המלאים, יהיה דלדול של הורמוני המין והעכברים לא יחזרו עוד במחזור. איור 2C מתאר דוגמה של איברי הרבייה הנקביים של מורין שנותחו מחוץ לגוף. ניתן לראות כי השחלות עצמן קטנות בהרבה מהרקמות הסובבות. היקף דיסקציה או זכוכית מגדלת מסייע בזיהוי רקמות אלה. איור 2D מדגים את האנטומיה של השחלות תחת טווח חיתוך עם הסרת רקמה מכרית השומן ברחם, מה שמאפשר הדמיה טובה יותר. ההצלחה של ההליך הזה יכולה להימדד על-ידי תצפית על עכברים שהתאוששו היטב והדגימו אתרי חתך שנרפאו (איור 2E).
ניתוח לכריתת שחלות הוא בטוח ויעיל כאשר הוא מבוצע במהירות ועם הפרעה מינימלית לרקמות הסובבות. ביצוע ההליך המתואר כאן משיג זאת על ידי הקפדה על מיקום נכון של העור והחתך בדופן הבטן, המאפשר מיקום מהיר של רקמות הרחם. זיהוי הגבול התחתון של כלוב הצלעות והגבול העליון של עצמות הרגליים מבטיח שהחתך יבוצע בסמוך לרקמה המעניינת. ביצוע חתך שנמצא בערך באמצע הדרך בין הגבול התחתון של הצלעות לגבול העליון של עצמות הרגליים וממוקם כ-1.5 ס"מ לרוחב עמוד השדרה מאפשר מיקום טוב של אתר הניתוח בעת ביצוע גישת חתך רוחבי (איור 2A).
אישור של כריתת שחלות כירורגית מוצג על ידי תצפית של ניוון הרחם. איור 2F מראה קרן רחם שנותחה מעכבר בן 6 חודשים, ואילו איור 2G מראה קרן רחם של עכבר בן 6 חודשים שעבר כריתת שחלות כירורגית בגיל שלושה חודשים. קרן הרחם השחלתית נראית דקה יותר וחסרה את החיבור לשחלה בקצה הדיסטלי. שיטה זו של אישור של הטכניקה הכירורגית מראה ביעילות כי הסרת השחלה הביאה ניוון של רקמת הרחם.
לאחר שהרקמות זוהו בהצלחה ונכרתו, ניתן להשלים את הניתוח על ידי סגירת הפצעים ומעקב קפדני לאחר הניתוח. טכניקה אספטית נכונה14 חשובה להבטחת תוצאות טובות בעת ביצוע ניתוח הישרדות. כאשר העכבר מתחיל להחלים מהחתכים, מתבצע ניטור כדי לחפש סימנים של כאב וסיבוכים כירורגיים. סיבוך ניתוחי אפשרי הוא דימום פנימי בגלל חיטוט או ניקוב כלי דם בזמן ניסיון לחתוך או לתפעל את הרקמה. זה מסומן על ידי מראה אדום מתמשך, סמוק מתחת לעור סביב אתר הניתוח. הימנעות מסיבוכים כגון אלה מושגת על ידי לוקליזציה נכונה של אתרי חתך וסיוע לחזון המנתח באמצעות מיקרוסקופ כירורגי או זכוכית מגדלת. בדיקה חזותית מומלצת כל 12 שעות בשלושת הימים הראשונים לאחר הניתוח. ניתוח מוצלח יביא לפצעים נקיים ומחלימים (איור 1D, 2E).
איור 1: כריתת מורין זכרית . (A) עכבר זכר מוצג במצב שכיבה עם מיקום של חתך כירורגי לתוך שק האשכים להסרת האשכים, אשר מוצג באדום. (B) תמונה שצולמה במהלך ההליך הכירורגי של כריתת אורכיקטומיה המתארת את נקודת הניתוק בירוק. (C) אשכים מנותחים, רפידות שומן ואפידידימיס מעכבר זכר. (D) עכבר זכר עם קליפס פצע שנרפא היטב מעל חתך שק האשכים לאחר כריתת אורכיאקטומיה. (E) ריכוז טסטוסטרון בסרום עכבר ב-ng/mL כפי שנקבע על ידי אינטרפולציה של ELISA. שתי הקבוצות מייצגות עכברים בני 9 שבועות. כריתת אורכיאקטומיה כירורגית בוצעה בגיל 8 שבועות. N = 3 עכברים לקבוצה. הדגימות הופעלו בשלשה. דגימות סרום נאספו על ידי ניקוב לב והוקפאו עד למועד הניתוח. *, עמ' < 0.05. קווי שגיאה = SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כריתת שחלות מורין נשיות . (A) עכברה ממין נקבה המוצגת במצב רוחבי עם אתר החתך הניתוחי להסרת שחלה בודדת מהצד הגבי הצידי, מסומנת באדום. ציוני דרך אנטומיים חשובים אחרים מודגשים. (B) תמונה שצולמה במהלך ניתוח המתארת את השחלה החיצונית, האובידוקט וקרן הרחם הדיסטלית עם נקודת הניתוק המוצגת בירוק. (C) קרני רחם, שחלות וכריות שומן מנותחות מנקבת עכבר. (D) מבט מקרוב על השחלה המנותחת, צינור השחלה והחלק הדיסטלי של קרן הרחם עם שומן מכרית השומן שהוסר, מה שמאפשר הדמיה טובה יותר של השחלה. (E) עכברה נקבה עם קליפס פצע שנרפא היטב מעל החתך לאחר כריתת השחלות. (F) קרן רחם עכבר מנותחת. (G) קרן רחם עכבר שנחתה 3 חודשים לאחר הליך כריתת השחלות, המראה ניוון רחם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תקציר גרפי עבור כריתת שחלות מורין וכריתת אורכיאקטומיה. ייצוג ציורי של הליך כריתת אורכיקטומיה לעכברים זכרים הכולל את הסרת האשכים והליך כריתת שחלות הכולל את הסרת השחלות, שניהם מביאים למודל עכבר מדולדל הורמון מין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסרה כירורגית של אשכים ושחלות מאפשרת ללמוד פיזיולוגיה של מורין תחת חסך הורמונלי מבוקר. טכניקה זו חשובה עבור תחומים רבים של מדע, כולל ניוון עצבי, מטבוליזם מינרלי, לב וכלי דם, ובריאות הרבייה 15,16,17,18,19,20,21. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול להסרה מהירה, בטוחה ויעילה של שחלות מורין ואשכים באמצעות ניתוח הישרדות כדי לרוקן את הורמוני המין. כאשר הם מבוצעים על ידי מנתח מנוסה, הליכים אלה יכולים להימשך רק 5 דקות, וכתוצאה מכך שיעור הישרדות גבוה מאוד בעכברים.
כמה שיקולים בעת תכנון ניתוח עכבר כוללים את אתר החתך הטוב ביותר ואת הפיזיולוגיה של החיה. במקרה של כריתת אורכיאקטומיה, ניתן להסיר את אשך העכבר גם דרך הבטן על ידי חתך גחוני בקו האמצע13. טכניקה זו לא רק פותחת את חלל הצפק, אלא גם מסתמכת על זיהוי מהיר של כריות שומן המפשעה. עבור מנתחים חדשים, קשה לבצע במהירות טכניקה זו. כאשר עכברים צעירים מאוד, כריות השומן גם פחות מפותחות, ולכן קשה יותר לאתר. גישת שק האשכים המתוארת בפרוטוקול זה מתאימה לחוקרים חדשים בניתוחי עכברים, המנתחים עכברים קטנים וצעירים, או המעוניינים למזער את הסיכוי להפריע לאיברים אחרים בחלל הצפק על ידי חתך בבטן.
כריתת שחלות כירורגית כרוכה בהסרת שחלות אחת או שתיהן. באשר לרוב ההליכים הכירורגיים, שיטות בטוחות ומהירות כוללות בדרך כלל ביצוע החתך בעור ובפאשיה שמתחתיו קטן ככל האפשר. זה מאפשר צמצום התפרים וקליפסי הפצעים וריפוי מהיר יותר. בעוד היכולת להקטין את החתכים היא מיומנות שמגיעה עם תרגול, להיות בטוח לגבי המיקום של החתך מועיל. איור 2A מדגים דוגמה לאיתור נקודות החתך הטובות ביותר. בשל האנטומיה של העכבר הקטן, השחלה תשכב ליד הכבד, ובצד שמאל של העכבר, ליד הטחול. חיטוט ומשיכה בטעות של איברים אלה עלולים לגרום לדימום או נזק לא רצויים. אנו מספקים מדריך מפורט למיקום החתך הנכון וזיהוי ציוני הדרך האנטומיים שמסביב כדי לסייע בטכניקה זו ולהפחית את הסבירות לסיבוכים שליליים.
כאן, אנו מספקים דוגמה כיצד ניתן להשתמש בהליך זה כדי להפיל ביעילות את רמות ההורמונים במחזור הדם בעכברים פחות משבוע לאחר ההליך הכירורגי, כמו גם כיצד רקמת הגונדל הנותרת מתנוונת עם הזמן לאחר ההליך. שיטות ומחקרים קודמים מפרטים כיצד ניתן לעשות זאת כדי ליצור מודלים של עכברי גיל המעבר או אנדרופוס, אך רבים מהם מבוצעים במודלים של חולדות ולא בעכברים12,22. בעוד שלחולדות ולעכברים יש אנטומיה דומה, למערכת המורין יש מבנים אנטומיים קטנים יותר. כאן, אנו מספקים שיטה שעובדת באופן אמין בדגמי עכברים החל מגיל 3 שבועות. בסך הכל, שני פרוטוקולים אלה מייצגים דרך עקבית לבצע במהירות כריתת מכרסמים הישרדותיים וכריתת שחלות, לזהות את האנטומיה של העכבר ולמזער סיבוכים כירורגיים, תוך יצירת בסיס לתוצאות עקביות ויעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים למרכז משאבי בעלי החיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן על עזרתם בהכשרה כירורגית ובסקירת פרוטוקולים. אנו מודים לצוות התמיכה של Wert Lab על עזרתם שלא תסולא בפז. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהמכון הלאומי לבריאות (NIH P30EY030413). Biorender.com שימש ליצירת סכמות מצוירות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
