Summary
Questo manoscritto descrive un modo coerente per eseguire rapidamente orchiectomie e ovariectomie di sopravvivenza nei roditori.
Abstract
La segnalazione degli ormoni sessuali svolge un ruolo fondamentale in più sistemi di organi e nella progressione di varie malattie, comprese le malattie neurodegenerative. La manipolazione dei livelli di ormoni sessuali nel sistema modello murino consente di studiare il loro impatto su organi/tessuti e all'interno della progressione della malattia. L'orchiectomia - la rimozione chirurgica dei testicoli - e l'ovariectomia - la rimozione chirurgica delle ovaie - forniscono un metodo per esaurire gli ormoni sessuali endogeni in modo che i livelli ormonali precisi possano essere forniti attraverso farmaci o altri metodi di somministrazione. Qui, forniamo metodi rapidi e minimamente invasivi sia per l'orchiectomia che per l'ovariectomia nel sistema modello murino per la riduzione degli ormoni sessuali. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione chirurgica e l'escissione dei testicoli attraverso il sacco scrotale e l'escissione delle ovaie tramite due incisioni nel dorso laterale destro e sinistro.
Introduction
I testicoli e le ovaie sono i principali organi responsabili della produzione di ormoni sessuali. La cascata di comunicazione ormonale che porta alla produzione di testosterone ed estrogeni è un processo ben caratterizzato che inizia nell'ipotalamo con il rilascio dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH)1. Il rilascio di GnRH provoca il rilascio dell'ormone luteinizzante (LH) e dell'ormone follicolo-stimolante (FSH) dalla ghiandola pituitaria. Quando questi ormoni entrano nel flusso sanguigno, influenzano altri tessuti del corpo. Il bersaglio primario dell'LH sono i testicoli (nei maschi) e le ovaie (nelle femmine)2. In risposta all'LH, i testicoli producono e rilasciano testosterone3. Allo stesso modo, le ovaie producono estrogeni4. Mentre gli effetti previsti di questi ormoni sono quelli di preparare le cellule e il corpo per la fecondazione e garantire un sistema riproduttivo funzionante, molti altri sistemi corporei possono essere influenzati.
Gli ormoni sessuali sono stati collegati a diverse funzioni fisiologiche. Ad esempio, gli estrogeni aiutano a mantenere l'omeostasi ossea impedendo il riassorbimento dell'osso da parte degli osteoclasti. Per questo motivo, i modelli murini ovariectomizzati possono essere utilizzati per studiare la fisiologia di malattie ossee come l'osteoporosi 5,6,7. Il testosterone e gli estrogeni sono anche obiettivi di ricerca per molte malattie cardiovascolari e neurodegenerative. Recentemente, l'elevata produzione di testosterone abbinata a una dieta ricca di grassi è stata collegata allo stress ossidativo vascolare8. Nel cervello, i cambiamenti nell'LH dopo l'ovariectomia hanno causato alterazioni nella memoria spaziale9. La riduzione degli estrogeni dopo l'ovariectomia è diventata anche un sistema modello per lo studio della morte cellulare nell'ippocampo, in quanto ciò può indurre apoptosi, con conseguenti deficit di memoria10. Il testosterone ha anche mostrato un ruolo nella crescita dei reni sia nei modelli murini che negli esseri umani dopo il trapianto di rene11.
La creazione di un modello murino privo di ormoni consente lo studio degli ormoni sessuali e delle loro cascate ormonali su varie malattie o tessuti. Ciò può essere ottenuto mediante rimozione chirurgica dei testicoli (orchiectomia) o delle ovaie (ovariectomia). Questa procedura può essere eseguita in topi di qualsiasi ceppo quando sono giovani come l'età dello svezzamento (ventuno giorni) o qualsiasi età adulta. L'ovariectomia viene eseguita nei topi femmine, mentre l'orchiectomia viene eseguita nei topi maschi. Rimuovendo questi organi, i livelli di estrogeni e testosterone e molti dei loro derivati, come il progesterone, possono essere notevolmente ridotti12,13. Il processo di esecuzione di orchiectomie o ovariectomie nei topi può essere rapido e minimamente invasivo con la tecnica appropriata. L'escissione rapida di questi organi in modo sicuro ed efficiente può consentire una rapida elaborazione chirurgica mantenendo il numero di topi al minimo avendo un tasso di sopravvivenza del 100% se eseguita correttamente. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo per l'escissione rapida dei testicoli e delle ovaie e dimostriamo il corretto monitoraggio post-chirurgico per consentire ai ricercatori di eseguire questo intervento chirurgico in modo rapido e sicuro. Includiamo anche esempi visivi degli organi sessuali e dei tessuti circostanti per fornire al chirurgo punti di riferimento anatomici durante l'esecuzione di questa procedura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'UTSW (APN#2019-102840).
1. Orchiectomia murina
- Preparare un campo di lavoro asettico e assicurarsi che gli strumenti chirurgici necessari siano stati sterilizzati e siano prontamente disponibili. Seguire pratiche asettiche per la chirurgia di sopravvivenza dei roditori.
- Registrare il peso del topo maschio e somministrare il metodo di anestesia preferito secondo le linee guida istituzionali. In questo protocollo, l'isoflurano al 2% è stato somministrato tramite un vaporizzatore di precisione per mantenere l'anestesia. Prima della procedura, somministrare antidolorifici secondo le linee guida istituzionali. In questo protocollo, 1,0 mg/kg di Buprenorfina SR e 5 mg/kg di Meloxicam sono stati somministrati per via sottocutanea.
- Una volta che il topo è sotto anestesia, copri gli occhi dell'animale con gel oculare lubrificante per evitare la formazione di lesioni agli occhi, disseccamento corneale o ulcera.
- Prima di procedere, assicurarsi che il piano di anestesia sia corretto eseguendo un test di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
- Preparare l'area chirurgica dell'animale prima di posizionarlo sul campo operatorio asettico e drappeggiato.
- Quindi, radere le aree inguinale e scrotale del topo usando un paio di tosatrici.
NOTA: La rasatura del basso addome superiore al pene consentirà una migliore visualizzazione durante l'intervento. - Utilizzando un applicatore di cotone nastrato, applicare uno strato sottile di crema depilatoria (vedi Tabella dei materiali) sulla pelle dell'animale, coprendo lo scroto e l'area circostante appena rasata. Attendere 30 s e rimuovere la crema con un pezzo di garza pulita.
- Usa spugne di garza imbevute di etanolo al 70% per rimuovere eventuali residui di crema e peli dall'area.
NOTA: Il 70% di etanolo in questa fase aiuta nella rimozione completa della crema depilatoria. La preparazione antisettica del sito chirurgico viene eseguita nella fase 1.8.
- Quindi, radere le aree inguinale e scrotale del topo usando un paio di tosatrici.
- Trasferire il topo nell'area chirurgica e assicurarsi che sia disponibile una fonte di calore per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'operazione. Posizionare l'animale in posizione supina su un telo chirurgico e utilizzare del nastro adesivo morbido per far aderire le zampe del topo al tappetino chirurgico.
- Se i testicoli salgono nell'addome, palpare con cura l'addome per far scendere i testicoli. Usa una mano guantata per applicare una leggera pressione di rotolamento verso il basso sull'addome.
NOTA: È più facile eseguire questo intervento chirurgico con un endoscopio di dissezione o utilizzando un paio di lenti per un maggiore ingrandimento. Se si esegue questa operazione sotto un endoscopio di dissezione, prenditi un momento per posizionare lo scroto del topo sotto il campo visivo dell'endoscopio. È possibile utilizzare un nastro morbido per far aderire le zampe o l'addome del topo al campo operatorio per garantire che rimanga nella posizione corretta. - Strofinare la pelle con lo scrub chirurgico Betadine (o uno scrub antisettico simile per la preparazione della pelle), seguito da uno scrub alcolico al 70% almeno tre volte per garantire una corretta disinfezione della pelle. Per ogni scrub, strofinare con un movimento radiale verso l'esterno, in modo che il centro del sito di incisione venga strofinato per primo e terminando con il bordo esterno dell'area chirurgica rasata che viene strofinato per ultimo.
- A questo punto, indossare guanti chirurgici sterili. Per le fasi successive della procedura, utilizzare tecniche asettiche. Coprire il topo con un telo chirurgico sterile con una piccola incisione (tagliata a circa 0,5-1 pollice quadrato per adattarsi al sito chirurgico) sopra l'animale per coprire il corpo con il materiale del telo.
- Crea un'incisione ventrale sulla linea mediana nello scroto di circa 1 cm -1,5 cm di lunghezza utilizzando una lama per bisturi chirurgico o strumenti simili seguendo le linee guida istituzionali approvate per il benessere degli animali.
- Afferrando il bordo tagliato della pelle, utilizzare uno strumento con punta smussata per separare la pelle dal tessuto sottostante. Prenditi del tempo per farlo sui bordi laterali, superiori e inferiori dell'incisione.
- Isolare un testicolo usando la spatola e la pinza per spostare l'incisione nella pelle da centrare su uno dei testicoli. Se questo è difficile, torna alla 1.11 e separa ulteriormente la pelle dagli strati sottostanti.
- Prendi un paio di pinze curve e posizionale su entrambi i lati del testicolo. Applicare una leggera pressione verso il basso per esteriorizzare il testicolo. Afferra lo strato sottile e trasparente di muscolo che si trova sopra il testicolo usando una pinza. Questo è il muscolo cremastere. La verifica del corretto strato muscolare viene effettuata osservando questo strato e la sua circolazione, muovendosi indipendentemente dal testicolo sottostante.
NOTA: L'identificazione del tessuto corretto è confermata dalla sua trasparenza e dalla capacità di muoversi indipendentemente dai tessuti sottostanti.- Manipolare il tessuto muscolare usando le pinze fino a quando l'apice del muscolo non viene afferrato. Questa dovrebbe essere la porzione più bassa, con i testicoli e la cauda epididimo situati al di sotto.
- Afferrare il muscolo cremastere con una pinza e allontanarsi delicatamente dai testicoli e dall'epididimo. Crea un'incisione di 0,5 cm attraverso il muscolo cremastere del primo testicolo al suo apice usando un piccolo paio di forbici a molla Vannas.
- Posizionare un morsetto di bloccaggio sul bordo posteriore del muscolo cremastere tagliato. Utilizzare un paio di emostatici stretti o un paio di micro portaaghi bloccabili. Una volta che il tessuto è stato bloccato, appoggiare delicatamente lo strumento sul lato laterale del mouse per mantenere il tessuto bloccato durante le seguenti fasi procedurali.
- Utilizzare una pinza per afferrare il bordo superiore dell'incisione eseguita al punto 1.14. Mentre le due estremità del muscolo cremastere vengono retratte, utilizzare un altro paio di pinze per raggiungere l'interno della cavità e afferrare delicatamente il testicolo.
- Tiralo verso l'esterno attraverso il foro nel muscolo. Fare attenzione a verificare la presenza di eventuali segni di vasi sanguigni intaccati e sangue nel campo chirurgico.
- Il testicolo, l'epididimo, il cordone spermatico attaccato e il vaso sanguigno saranno evidenti quando i tessuti sono correttamente esternalizzati.
- Vicino all'estremità caudale-dorsale dell'epididimo e del testicolo, c'è un punto fibroso di attacco del testicolo al muscolo cremastere. Arrotolare lateralmente il tessuto esteriorizzato per individuare questo punto di inserimento. Recidere questo per evitare danni al muscolo e consentire un ulteriore isolamento e visualizzazione dei tessuti. Usa due paia di pinze per eseguire una tecnica di morsetto e strappo.
- Cerca il tessuto adiposo intorno al testicolo dal cuscinetto adiposo inguinale. Usa un paio di pinze per afferrare il cuscinetto adiposo e tira delicatamente per esteriorizzarlo.
- Non afferrare il vaso sanguigno che viaggia lungo il cuscinetto adiposo, poiché tirarlo può portare a emorragie.
- Individua il funicolo spermatico, i vasi sanguigni e il cuscinetto adiposo rimanente che è prossimale ai tessuti esteriori e usa un paio di emostatici per bloccarlo. Mantenendo una leggera tensione sul testicolo distale, cauterizzare il funicolo spermatico e i vasi sanguigni distali alla pinza emostatica.
- Una volta completato, rilasciare lentamente il morsetto prossimale all'estremità cauterizzata e verificare la presenza di segni di sanguinamento. Se presente, ripetere questo passaggio. È utile utilizzare un paio di pinze per mantenere una leggera tensione sull'estremità distale del tessuto da cauterizzare.
- Lasciare che il moncone reciso del funicolo spermatico si ritragga nel corpo. Afferra le due estremità tagliate del muscolo cremastere e uniscile. Valutare la dimensione del taglio nel tessuto e chiudere il tessuto utilizzando punti di sutura riassorbibili 4-0 o 5-0. A seconda delle dimensioni dell'incisione, saranno necessarie 1 o 2 suture. Tagliare le estremità della sutura a 0,5 cm usando le forbici da sutura.
- Ripetere i passaggi 1.13-1.20 sull'altro lato dello scroto per rimuovere il secondo testicolo.
- Preparati a chiudere l'incisione cutanea.
- Garantire una buona emostasi di entrambi i monconi di tessuto. Una scarsa emostasi si tradurrà in sanguinamento residuo nel campo chirurgico. In tal caso, individuare l'emorragia e cauterizzare. Ciò viene evitato con una lenta e attenta manipolazione dei tessuti con strumenti contundenti.
- Se si vede sangue in campo chirurgico, utilizzare un applicatore sterilizzato con punta di cotone per asciugare l'area per una migliore visualizzazione. Utilizzare una siringa per far gocciolare la soluzione salina sull'area per irrigare il sangue o il fluido lontano dal campo operatorio.
- Avvicina i due lati dell'incisione cutanea per prepararla alla chiusura. Assicurarsi che le estremità suturate delle incisioni cremasteri non sporgano nell'incisione cutanea. Se necessario, tagliare ulteriormente le estremità della sutura.
- Chiudi la pelle.
- Se si utilizzano clip per ferite, utilizzare una pinza per estroflacciare la pelle e allontanarla dal tessuto sottostante. Posizionare una clip per ferita centrata sull'incisione. Controlla che la pelle sia ben tagliata. Se l'incisione è leggermente troppo grande per essere chiusa sufficientemente da una clip per ferita, è possibile applicare la colla cutanea chirurgica alle porzioni superiore e inferiore dell'incisione.
- Se si utilizzano punti di sutura, posizionare il numero necessario di punti di sutura attraverso la pelle, senza afferrare il tessuto sottostante. Questo tipo di incisione richiederà 2-3 suture singole interrotte utilizzando materiale di sutura non assorbibile 4-0.
- Pulire delicatamente la pelle intorno al sito chirurgico con soluzione fisiologica e un applicatore sterilizzato con punta di cotone per rimuovere il sangue secco o lo scrub antisettico residuo.
2. Ovariectomia murina
- Preparare un campo di lavoro asettico e assicurarsi che gli strumenti chirurgici necessari siano stati sterilizzati e siano prontamente disponibili. Seguire pratiche asettiche per la chirurgia di sopravvivenza dei roditori.
- Registrare il peso della femmina di topo e somministrare il metodo di anestesia preferito in base alle linee guida istituzionali. In questo protocollo, l'isoflurano al 2% è stato somministrato tramite un vaporizzatore di precisione per mantenere l'anestesia. Prima della procedura, somministrare farmaci antidolorifici secondo le linee guida istituzionali. In questo protocollo, 1,0 mg/kg di Buprenorfina SR e 5 mg/kg di Meloxicam sono stati somministrati per via sottocutanea.
- Somministrare gel lubrificante per gli occhi sugli occhi dell'animale per evitare la formazione di lesioni oculari, disseccamento corneale o ulcera. Assicurarsi che sia disponibile una fonte di calore per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'operazione. Assicurarsi che il piano di anestesia sia corretto controllando la risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
- Preparare l'area chirurgica dell'animale prima di posizionarlo nel campo operatorio.
- Radere delicatamente il pelo sulla regione dorsolaterale del dorso dell'animale usando un paio di tagliacapelli. Rimuovi i peli dalla regione sopra il bordo superiore dei fianchi e sotto il bordo inferiore della gabbia toracica, così come le aree tra questi punti di riferimento.
- Usando un applicatore con punta di cotone, applica uno strato di crema depilatoria sulla pelle dell'animale, coprendo l'area appena rasata. Attendere 30 s e rimuovere la crema con un pezzo di garza, rimuovendo i peli fini che rimangono.
- Utilizzare una spugna di garza imbevuta di etanolo al 70% per rimuovere eventuali residui di crema e capelli dall'area chirurgica.
NOTA: L'etanolo al 70% in questa fase aiuta a rimuovere completamente la crema depilatoria. La preparazione antisettica del sito chirurgico viene eseguita nella fase 2.5.
- Posizionare l'animale in posizione laterale (per l'incisione per rimuovere un'ovaia alla volta) nel campo operatorio e assicurarsi che sia disponibile una fonte di calore. Strofinare l'area operatoria con lo scrub chirurgico Betadine (o uno scrub antisettico simile per la preparazione della pelle), seguito da alcol al 70% almeno tre volte per garantire una corretta disinfezione della pelle. Per ogni scrub, strofinare con un movimento radiale verso l'esterno, in modo che il centro dell'incisione venga strofinato per primo e il bordo esterno dell'area chirurgica rasata venga strofinato per ultimo.
- A questo punto, indossare guanti chirurgici sterili. Per le fasi successive della procedura, utilizzare tecniche asettiche. Posizionare un telo chirurgico con una piccola incisione (tagliare un quadrato di circa 0,5-1 pollice nel telo per adattarlo al sito chirurgico) sull'animale in modo che il corpo sia coperto da un telo.
- Individuare la posizione ideale per l'incisione chirurgica trovando il punto intermedio tra i fianchi e le costole del topo (vedere la Figura 2). Afferrare la pelle con una pinza e praticare un'incisione di 1,0 cm nella pelle in questa posizione.
- Utilizzare uno strumento con punta smussata (sonda, spatola chirurgica o emostatici con punta smussata) per separare la pelle dal tessuto muscolare sottostante. Prenditi del tempo per farlo sui bordi laterali, superiori e inferiori dell'incisione.
- Localizzare la parete muscolare dorsolaterale dell'addome. Se necessario, rimuovere il tessuto adiposo che si trova tra la pelle e gli strati muscolari. Nei topi maturi, questo tessuto adiposo è più prominente. Sposta questo tessuto adiposo verso l'estremità caudale del topo, esponendo la parete muscolare.
- Il tessuto adiposo si differenzia dalla parete addominale per colore: il tessuto adiposo appare bianco pallido e si trova più superficiale, mentre la parete addominale appare rosa e si trova più in profondità del tessuto adiposo.
- Afferrare la parete addominale con una pinza a dente di ratto e praticare un'incisione di 0,5 cm.
- Afferra un bordo di questa incisione con un paio di pinze, usa un secondo paio per raggiungere l'interno della cavità del corpo e trova l'ovaio, il corno uterino e il cuscinetto adiposo. Tirare delicatamente attraverso l'incisione nella parete muscolare per separare il muscolo dal tessuto sottostante ed esteriorizzarlo. Individua la transizione tra il corno uterino e l'ovaio.
- Recidere l'ovaio eseguendo una tecnica di schiacciamento e lacerazione.
- Posizionare una pinza sull'estremità distale del corno uterino e posizionare la seconda pinza appena distale rispetto alla prima. Applicando una pressione decisa con entrambi i morsetti, allontanare quello più distale dal corpo, strappando la connessione tra di loro. Per ridurre al minimo il sanguinamento e il danno tissutale, tenere fermo il morsetto prossimale durante questo processo e fare attenzione a non allontanarlo dal corpo.
- In alternativa, utilizzare un cauterizzazione. Utilizzare un paio di pinze o emostatici per bloccare il corno uterino appena prossimale al punto di cauterizzazione desiderato. Usa uno strumento di cauterizzazione per recidere i tessuti.
- Rilasciare delicatamente e lentamente il morsetto prossimale e verificare la presenza di segni di sanguinamento.
- Lascia che il moncone del tessuto si ritiri nella cavità del corpo. Afferrare la parete addominale e tirare delicatamente verso l'alto. Non forzare il moncone di tessuto verso l'interno, poiché ciò aumenta la probabilità di sanguinamento.
- Individua i bordi dell'incisione nella parete muscolare e uniscili per prepararti a suturarla.
- Posizionare 1-2 punti di sutura singoli interrotti nella parete muscolare addominale utilizzando materiale di sutura riassorbibile 4-0. Tagliare le estremità della sutura a 0,5 cm usando le forbici da sutura.
- Chiudere l'incisione lasciando che la pelle ritorni al suo naturale stato di riposo e poi estrarla verso l'alto, facendo attenzione a non afferrare il tessuto sottostante o le estremità del materiale di sutura. Posiziona 1-2 clip per ferite sulla pelle estroflessa. In base alle linee guida istituzionali, la pelle può anche essere chiusa utilizzando materiale di sutura 4-0 non assorbibile.
- Per rimuovere l'altra ovaia, cambia la posizione del mouse in modo che l'altro lato laterale sia rivolto verso l'alto. Prestare attenzione quando si cambia la posizione del mouse in modo da non esercitare troppa pressione sulla pelle ferita dal passaggio 2.17.
- Su questo lato, ripetere i passaggi da 2.5 a 2.17.
- Pulire delicatamente la pelle intorno al sito chirurgico con soluzione fisiologica e un applicatore sterilizzato con punta di cotone per rimuovere il sangue secco o lo scrub antisettico residuo.
3. Cure post-operatorie
- Secondo le linee guida istituzionali, somministrare farmaci antidolorifici fino a 72 ore dopo l'operazione. Documentare la procedura chirurgica degli animali, annotando la data, l'ora, l'anestetico e l'analgesico utilizzati. In questo caso, la buprenorfina a lento rilascio e il meloxicam vengono somministrati prima dell'intervento.
- Al termine dell'intervento chirurgico, trasferirli in una gabbia pulita foderata con un tovagliolo di carta asciutto. Posiziona questa gabbia per 2/3 su una fonte di calore, lasciando l'altro 1/3 della gabbia fuori dal fuoco. Non mettere i topi insieme in una gabbia fino a quando non si sono ripresi dall'anestesia.
- Lascia che l'animale riacquisti la capacità di camminare liberamente intorno alla gabbia prima di rimetterlo in una gabbia pulita con una normale lettiera per animali. In questo momento, i topi possono essere alloggiati insieme se tutti si sono ripresi dall'anestesia.
- Per i primi giorni dopo l'intervento, assicurarsi che il cibo umido e l'acqua siano facilmente accessibili. Metti del cibo inumidito sul fondo della gabbia. Controllare frequentemente il sito chirurgico del topo e cercare eventuali segni di infezione o sanguinamento.
- Dopo l'intervento chirurgico, assicurarsi che i topi siano alloggiati da soli o con altri animali che hanno subito la stessa procedura contemporaneamente. Un topo che si sta riprendendo da un intervento chirurgico situato nella stessa gabbia di uno senza intervento chirurgico può introdurre un pericolo e dovrebbe essere evitato.
- Per i topi che hanno subito un'ovariectomia e hanno clip per ferite sui lati dorsolaterali della schiena, rimuovere eventuali habitat di igloo di roditori dalla gabbia per ridurre la possibilità che la clip della ferita del topo rimanga impigliata nell'igloo durante la prima settimana di guarigione.
- Continuare a monitorare l'animale per segni di infezione, dolore o complicazioni chirurgiche ogni 12 ore fino alle prime 72 ore del tempo di guarigione.
- Rimuovere le clip della ferita utilizzando uno strumento per la rimozione della clip della ferita 10-14 giorni dopo l'intervento chirurgico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La procedura qui presentata viene eseguita in topi di età compresa tra uno e tre mesi nel background C57BL/6J. I topi maschi pesavano 16-28 g e i topi femmine pesavano 14-24 g al momento della procedura. Questa procedura è stata ottimizzata per essere applicabile a topi di molte età, dallo svezzamento fino all'età adulta.
L'orchiectomia chirurgica comporta una singola incisione cutanea nel sacco scrotale ventrale, come illustrato nella Figura 1A. Entrambi i testicoli vengono rimossi uno alla volta e vengono recisi attraverso i dotti deferenti e i vasi spermatici, con conseguente rimozione del testicolo e dell'epididimo annesso (Figura 1B). Il contenuto rimosso include il testicolo, l'epididimo e il cuscinetto adiposo inguinale, mostrati nella Figura 1C. Il successo della rimozione dei testicoli può essere confermato dall'osservazione visiva dei tessuti rimossi e dalla garanzia di una buona emostasi del moncone di tessuto prima di chiudere la cavità corporea. Il successo dell'orchiectomia può essere misurato dall'osservazione di topi ben recuperati che dimostrano siti di incisione guariti (Figura 1D). I topi che hanno subito orchiectomia dimostreranno anche una riduzione del livello di testosterone misurato nel siero di topo già una settimana dopo la procedura (Figura 1E).
L'ovariectomia chirurgica bilaterale viene eseguita mediante incisioni nel dorso sinistro e destro di topi femmina (Figura 2A). L'approccio dell'incisione laterale può essere utilizzato se si desidera rimuovere una sola ovaia. In questo approccio, viene incisa la parete addominale e si trova il cuscinetto adiposo ovarico. Il cuscinetto adiposo, l'ovaio, il dotto ovarico e il corno uterino distale, come raffigurato nella Figura 2B, vengono esteriorizzati, seguiti dalla recisione del corno uterino distale. Questa tecnica comporta l'asportazione dell'ovaio e dell'ovidotto. L'ovaio e il dotto ovarico possono essere rimossi senza includere il corno uterino distale, ma c'è il rischio che le cellule ovariche rimanenti continuino a mantenere il topo nei cicli estrali. L'inclusione del corno uterino distale assicura che l'ovaia e il dotto completi vengano rimossi, ci sarà un esaurimento degli ormoni sessuali e i topi non funzioneranno più in ciclo. La Figura 2C mostra un esempio degli organi riproduttivi femminili murini sezionati dal corpo. Si può osservare che le ovaie stesse sono molto più piccole dei tessuti circostanti. Un endoscopio di dissezione o lenti di ingrandimento aiuta nell'identificazione di questi tessuti. La Figura 2D mostra l'anatomia ovarica in un endoscopio di dissezione con il tessuto del cuscinetto adiposo uterino rimosso, consentendo una migliore visualizzazione. Il successo di questa procedura può essere misurato dall'osservazione di topi ben recuperati che dimostrano siti di incisione guariti (Figura 2E).
L'intervento chirurgico di ovariectomia è sicuro ed efficiente se eseguito rapidamente e con il minimo disturbo ai tessuti circostanti. Seguire la procedura qui descritta consente di garantire che l'incisione della pelle e della parete addominale sia posizionata correttamente, consentendo una rapida localizzazione dei tessuti uterini. L'identificazione del bordo inferiore della gabbia toracica e del bordo superiore delle ossa della gamba assicura che l'incisione venga eseguita vicino al tessuto di interesse. L'esecuzione di un'incisione che si trova circa a metà strada tra il bordo inferiore delle costole e il bordo superiore delle ossa della gamba e si trova a circa 1,5 cm lateralmente alla colonna vertebrale consente un buon posizionamento del sito chirurgico quando si esegue un approccio di incisione laterale (Figura 2A).
La conferma dell'ovariectomia chirurgica è dimostrata dall'osservazione dell'atrofia uterina. La Figura 2F mostra un corno uterino sezionato da un topo di 6 mesi, mentre la Figura 2G mostra un corno uterino di un topo di 6 mesi sottoposto a ovariectomia chirurgica a tre mesi di età. Il corno uterino ovariectomizzato appare più sottile e manca dell'attacco all'ovaio all'estremità distale. Questo metodo di conferma della tecnica chirurgica mostra effettivamente che l'asportazione dell'ovaio ha provocato l'atrofia del tessuto uterino.
Una volta che i tessuti sono stati identificati e asportati con successo, l'intervento può essere completato con la chiusura delle ferite e un attento monitoraggio post-operatorio. Una corretta tecnica asettica14 è importante per garantire buoni risultati durante l'esecuzione di un intervento chirurgico di sopravvivenza. Quando il topo inizia a guarire dalle incisioni, viene eseguito il monitoraggio per cercare segni di dolore e complicanze chirurgiche. Una possibile complicanza chirurgica è l'emorragia interna dovuta alla puntura o al taglio dei vasi sanguigni durante il tentativo di incidere o manipolare il tessuto. Ciò è denotato da un aspetto rosso persistente e arrossato sotto la pelle intorno al sito chirurgico. Per evitare complicazioni come queste si ottiene localizzando correttamente i siti di incisione e aiutando la visione del chirurgo mediante l'uso di un microscopio operatorio o di occhiali. L'esame visivo è raccomandato ogni 12 ore per i primi tre giorni dopo l'intervento. Il successo dell'intervento chirurgico si tradurrà in ferite pulite e in via di guarigione (Figura 1D, 2E).
Figura 1: Orchiectomia murina maschile . (A) Un topo maschio è mostrato in posizione supina con la posizione di un'incisione chirurgica nel sacco scrotale per la rimozione del testicolo, che è mostrato in rosso. (B) Immagine scattata durante la procedura chirurgica di orchiectomia raffigurante il punto di distacco in verde. (C) Testicoli sezionati, cuscinetti adiposi ed epididimo di un topo maschio. (D) Un topo maschio con una ferita ben guarita sopra l'incisione scrotale dopo l'orchiectomia. (E) Concentrazione sierica del testosterone del topo in ng/mL determinata mediante interpolazione ELISA. Entrambi i gruppi rappresentano topi di 9 settimane. Le orchiectomie chirurgiche sono state eseguite a 8 settimane di età. N = 3 topi per gruppo. I campioni sono stati eseguiti in triplice copia. I campioni di siero sono stati raccolti mediante puntura cardiaca e congelati fino al momento dell'analisi. *, p < 0,05. Barre di errore = SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ovariectomia murina femminile . (A) Una femmina di topo mostrata in posizione laterale con il sito di incisione chirurgica per la rimozione di un singolo ovaio dal lato laterale dorsale, mostrato in rosso. Vengono evidenziati altri importanti punti di riferimento anatomici. (B) Immagine scattata durante l'intervento chirurgico che raffigura l'ovario esteriorizzato, l'ovidotto e il corno uterino distale con il punto di distacco mostrato in verde. (C) Corna, ovaie e cuscinetti di grasso uterini sezionati da un topo femmina. (D) Una vista ravvicinata dell'ovaio sezionato, del dotto ovarico e della porzione distale del corno uterino con il grasso del cuscinetto adiposo rimosso, consentendo una migliore visualizzazione dell'ovaio. (E) Una femmina di topo con una ferita ben guarita sopra l'incisione dopo l'ovariectomia. (F) Corno uterino di topo sezionato. (G) Corno uterino di topo sezionato 3 mesi dopo la procedura di ovariectomia, che mostra atrofia uterina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Abstract grafico per ovariectomia murina e orchiectomia. Una rappresentazione pittorica della procedura di orchiectomia per topi maschi che comporta la rimozione del testicolo e la procedura di ovariectomia che comporta la rimozione delle ovaie, entrambe le quali si traducono in un modello murino impoverito di ormoni sessuali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'asportazione chirurgica dei testicoli e delle ovaie consente di studiare la fisiologia murina in condizioni di deprivazione ormonale controllata. Questa tecnica è importante per molti campi della scienza, tra cui la neurodegenerazione, il metabolismo minerale, la salute cardiovascolare e riproduttiva 15,16,17,18,19,20,21. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo per la rimozione rapida, sicura ed efficace delle ovaie e dei testicoli murini utilizzando la chirurgia di sopravvivenza per esaurire gli ormoni sessuali. Se eseguite da un chirurgo esperto, queste procedure possono richiedere solo 5 minuti, con un tasso di sopravvivenza molto elevato nei topi.
Alcune considerazioni da fare quando si pianifica un intervento chirurgico sul topo includono il miglior sito di incisione e la fisiologia dell'animale. In caso di orchiectomia, il testicolo del topo può anche essere rimosso attraverso l'addome mediante un'incisione ventrale sulla linea mediana13. Questa tecnica non solo apre la cavità peritoneale, ma si basa anche sulla rapida identificazione dei cuscinetti adiposi inguinali. Per i nuovi chirurghi, è difficile eseguire rapidamente questa tecnica. Quando i topi sono molto giovani, anche i cuscinetti adiposi sono meno sviluppati e, quindi, più difficili da localizzare. L'approccio scrotale delineato in questo protocollo è un'opzione adatta per i ricercatori che sono alle prime armi con la chirurgia del topo, che operano su topi piccoli e giovani o che desiderano ridurre al minimo la possibilità di disturbare altri organi nella cavità peritoneale mediante un'incisione addominale.
L'ovariectomia chirurgica comporta l'asportazione di una o entrambe le ovaie. Come per la maggior parte delle procedure chirurgiche, i metodi sicuri e veloci di solito comportano l'esecuzione dell'incisione nella pelle e nella fascia sottostante il più piccola possibile. Ciò consente di ridurre i punti di sutura e le clip della ferita e di accelerare la guarigione. Mentre essere in grado di rendere le incisioni più piccole è un'abilità che viene fornita con la pratica, essere sicuri della posizione dell'incisione è vantaggioso. La Figura 2A mostra un esempio di come individuare i punti di incisione migliori. A causa dell'anatomia del piccolo topo, l'ovaio si trova vicino al fegato e, sul lato sinistro del topo, vicino alla milza. Sondare e tirare accidentalmente questi organi può provocare sanguinamenti indesiderati o danni. Forniamo una guida dettagliata alla corretta posizione dell'incisione e all'identificazione dei punti di riferimento anatomici circostanti per aiutare in questa tecnica e ridurre la probabilità di complicanze avverse.
Qui, forniamo un esempio di come questa procedura può essere utilizzata per abbattere efficacemente i livelli ormonali circolanti nei topi meno di una settimana dopo la procedura chirurgica, nonché di come il tessuto gonadico rimanente si atrofizza nel tempo dopo la procedura. I metodi e le ricerche precedenti descrivono in dettaglio come questi possono essere fatti per generare modelli murini di menopausa o andropausa, ma molti di questi vengono eseguiti in modelli di ratto piuttosto che nei topi12,22. Mentre ratti e topi hanno un'anatomia simile, il sistema murino ha strutture anatomiche più piccole. Qui, forniamo un metodo che funziona in modo affidabile in modelli murini a partire da 3 settimane di età. Nel complesso, questi due protocolli rappresentano un modo coerente per eseguire rapidamente orchiectomie e ovariectomie di sopravvivenza nei roditori, riconoscere l'anatomia del topo e ridurre al minimo le complicanze chirurgiche, creando una base per risultati coerenti ed efficaci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Animal Resource Center dell'Università del Texas Southwestern Medical Center per il loro aiuto nella formazione chirurgica e nella revisione del protocollo. Ringraziamo il team di supporto di Wert Lab per la loro preziosa assistenza. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del National Institute of Health (NIH P30EY030413). Biorender.com è stato utilizzato per la creazione di schemi di cartoni animati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
