Summary
Bu el yazması, hayatta kalma kemirgen orkiektomilerini ve yumurtalıklarını hızlı bir şekilde gerçekleştirmenin tutarlı bir yolunu açıklamaktadır.
Abstract
Seks hormonu sinyali, çoklu organ sistemlerinde ve nörodejeneratif hastalık da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesinde kritik bir rol oynar. Fare model sisteminde cinsiyet hormonu seviyelerinin manipülasyonu, organlar / dokular üzerindeki etkilerinin ve hastalığın ilerlemesinin incelenmesine izin verir. Orşiektomi - testislerin cerrahi olarak çıkarılması - ve yumurtalıkların cerrahi olarak çıkarılması - endojen seks hormonlarını tüketmek için bir yöntem sağlar, böylece kesin hormon seviyeleri ilaç veya diğer dağıtım yöntemleriyle sağlanabilir. Burada, cinsiyet hormonlarının azaltılması için murin model sisteminde hem orşiektomi hem de ovariektomi için hızlı ve minimal invaziv yöntemler sunuyoruz. Bu protokol, testislerin skrotal keseden cerrahi hazırlığını ve eksizyonu ile yumurtalıkların sağ ve sol lateral dorsumdan iki kesiden çıkarılmasını detaylandırır.
Introduction
Testisler ve yumurtalıklar, seks hormonu üretiminden sorumlu birincil organlardır. Testosteron ve östrojen üretimine yol açan hormonal iletişim kademesi, hipotalamusta gonadotropin salgılatıcı hormonun (GnRH) salınmasıyla başlayan iyi karakterize edilmiş bir süreçtir1. GnRH salınımı, hipofiz bezinden luteinize edici hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) salınımına neden olur. Bu hormonlar kan dolaşımına girdiğinde, vücuttaki diğer dokuları etkiler. LH'nin birincil hedefi testisler (erkeklerde) ve yumurtalıklardır (kadınlarda)2. LH'ye yanıt olarak, testisler testosteron3 üretir ve serbest bırakır. Benzer şekilde, yumurtalıklar östrojen4 üretir. Bu hormonların amaçlanan etkileri, hücreleri ve vücudu döllenmeye hazırlamak ve işleyen bir üreme sistemi sağlamak olsa da, diğer birçok vücut sistemi etkilenebilir.
Cinsiyet hormonları çeşitli fizyolojik işlevlerle ilişkilendirilmiştir. Örneğin östrojen, kemiğin osteoklastlar tarafından emilmesini önleyerek kemik homeostazının korunmasına yardımcı olur. Bu nedenle, osteoporoz 5,6,7 gibi kemik hastalıklarının fizyolojisini incelemek için yumurtalıklı fare modelleri kullanılabilir. Testosteron ve östrojen ayrıca birçok kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalık için araştırma hedefleridir. Son zamanlarda, yüksek yağlı diyetle birlikte yüksek testosteron üretimi, vasküler oksidatif stres ile ilişkilendirilmiştir8. Beyinde, ovariektomi sonrası LH'deki değişiklikler uzamsal bellekte değişikliklere neden olmuştur9. Yumurtalıkektomiyi takiben östrojenlerin azaltılması, hipokampusta hücre ölümünü incelemek için bir model sistem haline gelmiştir, çünkü bu, apoptozu indükleyebilir ve hafıza eksikliklerine neden olabilir10. Testosteron ayrıca böbrek naklini takiben hem fare modellerinde hem de insanlarda böbreklerin büyümesinde rol oynamıştır11.
Hormondan yoksun bir fare modelinin oluşturulması, cinsiyet hormonlarının ve bunların hormonlarının çeşitli hastalıklar veya dokular üzerindeki kademeli olarak incelenmesine izin verir. Bu, testislerin (orşiektomi) veya yumurtalıkların (ovariektomi) cerrahi olarak çıkarılmasıyla gerçekleştirilebilir. Bu prosedür, sütten kesme yaşı (yirmi bir gün) veya herhangi bir yetişkin yaşı kadar küçükken herhangi bir suştaki farelerde gerçekleştirilebilir. Dişi farelerde ovariektomi, erkek farelerde ise orşiektomi yapılır. Bu organları çıkararak, östrojen ve testosteron seviyeleri ve progesteron gibi türevlerinin çoğu büyük ölçüde azaltılabilir12,13. Farelerde orkiektomi veya yumurtalık yapma süreci, uygun teknikle hızlı ve minimal invaziv olabilir. Bu organların güvenli ve verimli bir şekilde hızlı bir şekilde çıkarılması, doğru yapıldığında %100 hayatta kalma oranına sahip olarak fare sayılarını minimumda tutarken hızlı cerrahi işlemlere izin verebilir. Burada, testislerin ve yumurtalıkların hızlı eksizyonu için bir protokolü detaylandırıyoruz ve araştırmacıların bu ameliyatı hızlı ve güvenli bir şekilde gerçekleştirmelerini sağlamak için uygun ameliyat sonrası izlemeyi gösteriyoruz. Cerraha bu prosedürü gerçekleştirirken anatomik işaretler sağlamak için cinsiyet organlarının ve çevresindeki dokuların görsel örneklerini de dahil ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, UTSW'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (APN # 2019-102840).
1. Murin orşiektomi
- Aseptik bir çalışma alanı hazırlayın ve gerekli cerrahi aletlerin sterilize edildiğinden ve kolayca bulunabildiğinden emin olun. Kemirgen sağkalım cerrahisi için aseptik uygulamaları takip edin.
- Erkek farenin ağırlığını kaydedin ve tercih edilen anestezi yöntemini kurumsal yönergelere göre uygulayın. Bu protokolde, anesteziyi korumak için hassas bir buharlaştırıcı ile %2 izofluran verildi. İşlemden önce, ağrı kesici ilaçları kurumsal yönergelere göre uygulayın. Bu protokolde 1.0 mg/kg Buprenorfin SR ve 5 mg/kg Meloksikam subkutan yolla verildi.
- Fare anestezi altına alındıktan sonra, göz yaralanması, kornea kuruması veya ülser oluşumunu önlemek için hayvanın gözlerini kayganlaştırıcı göz jeli ile kapatın.
- Devam etmeden önce, ayak parmağı sıkışma tepki testi yaparak uygun anestezi düzlemini sağlayın.
- Aseptik, örtülü cerrahi alana yerleştirmeden önce hayvanın cerrahi alanını hazırlayın.
- Ardından, bir çift makas kullanarak farenin kasık ve skrotal bölgelerini tıraş edin.
NOT: Alt karın bölgesinin penisten daha üst kısmının tıraş edilmesi, ameliyat sırasında daha iyi görselleştirme sağlayacaktır. - Pamuklu bantlı bir aplikatör kullanarak, hayvanın derisine ince bir tabaka tüy dökücü krem uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız), skrotum ve yeni traş edilmiş olan çevresini kaplayın. 30 saniye bekleyin ve kremi bir parça temiz gazlı bezle çıkarın.
- Bölgede kalan krem ve saçları silmek için %70 etanole batırılmış gazlı bez süngerleri kullanın.
NOT: Bu adımda% 70 etanol, tüy dökücü kremin tamamen çıkarılmasına yardımcı olmak içindir. Cerrahi bölgenin antiseptik hazırlığı adım 1.8'de gerçekleştirilir.
- Ardından, bir çift makas kullanarak farenin kasık ve skrotal bölgelerini tıraş edin.
- Fareyi cerrahi alana aktarın ve operasyon sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için bir ısı kaynağının mevcut olduğundan emin olun. Hayvanı cerrahi bir örtü üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve farenin ayaklarını cerrahi paspasa yapıştırmak için yumuşak yapışkan bant kullanın.
- Testisler karın içine yükselirse, testislerin inmesi için karnı dikkatlice palpe edin. Eldivenli bir el kullanarak karnına aşağı doğru hafif bir yuvarlanma basıncı uygulayın.
NOT: Bu ameliyatı bir diseksiyon kapsamı altında veya gelişmiş büyütme için bir çift büyüteç kullanarak yapmak daha kolaydır. Bunu bir diseksiyon dürbünü altında yapıyorsanız, farenin skrotumunu skopun görüş alanının altına yerleştirmek için bir dakikanızı ayırın. Doğru yerde kalmasını sağlamak için farenin bacaklarını veya karnını cerrahi alana yapıştırmak için yumuşak bir bant kullanılabilir. - Cildi Betadine cerrahi fırçalama (veya benzer bir antiseptik cilt hazırlama fırçası) ile ovalayın, ardından uygun cilt dezenfeksiyonunu sağlamak için en az üç kez% 70 alkol fırçalayın. Her fırçalama için, dışa doğru radyal bir hareketle fırçalayın, böylece önce kesi bölgesinin ortası fırçalanır ve traş edilen cerrahi alanın dış sınırının en son fırçalanmasıyla sona erer.
- Şu anda, steril cerrahi eldiven giyin. Prosedürün sonraki adımları için aseptik teknikler kullanın. Fareyi, vücudu örtü malzemesiyle örtmek için hayvanın üzerinde küçük bir kesi (cerrahi bölgeye sığacak şekilde yaklaşık 0,5-1 inç kareye kesilmiş) ile steril bir cerrahi örtü ile örtün.
- Onaylanmış kurumsal hayvan refahı yönergelerinizi izleyerek cerrahi bir neşter bıçağı veya benzeri aletler kullanarak skrotumda yaklaşık 1 cm -1,5 cm uzunluğunda bir ventral orta hat kesisi oluşturun.
- Derinin kesik sınırını kavrayarak, cildi alt dokudan ayırmak için künt uçlu bir alet kullanın. Bunu insizyonun lateral, üst ve alt sınırlarında yapmak için zaman ayırın.
- Derideki kesiği testislerden birinin üzerinde ortalanacak şekilde hareket ettirmek için spatula ve forseps kullanarak bir testisi izole edin. Bu zorsa, 1.11'e geri dönün ve cildi alt katmanlardan ayırın.
- Bir çift kavisli forseps alın ve testisin her iki tarafına yerleştirin. Testisin dışını dışa doğru hafif bir aşağı doğru basınç uygulayın. Forseps kullanarak testisin üstündeki ince, şeffaf kas tabakasını tutun. Bu kremaster kasıdır. Doğru kas tabakasının doğrulanması, altındaki testisten bağımsız olarak hareket eden bu tabaka ve dolaşımı gözlemlenerek yapılır.
NOT: Doğru dokunun tanımlanması, şeffaflığı ve alttaki dokulardan bağımsız hareket etme yeteneği ile doğrulanır.- Kasın tepesi kavrayana kadar forseps kullanarak kas dokusunu manipüle edin. Bu, testisler ve kauda epididiminin altında yer alan en alt kısım olmalıdır.
- Cremaster kasını forseps ile kavrayın ve testislerden ve epididimden yavaşça uzaklaşın. Küçük bir çift Vannas yaylı makas kullanarak ilk testisin tepesindeki kremaster kası boyunca 0,5 cm'lik bir kesi oluşturun.
- Kesilen kremaster kasının arka kenarına bir kilitleme kelepçesi yerleştirin. Dar bir çift kanama durdurucu veya bir çift kilitli mikro iğne tutucu kullanın. Doku kenetlendikten sonra, aşağıdaki prosedür adımları sırasında dokuyu kenetlenmiş halde tutmak için aleti farenin yan tarafına nazikçe yerleştirin.
- Adım 1.14'te yapılan insizyonun üst sınırını tutmak için forseps kullanın. Krepistan kasının iki ucu geri çekilirken, boşluğun içine ulaşmak için başka bir forseps kullanın ve testisi nazikçe kavrayın.
- Kastaki delikten dışarı doğru çekin. Cerrahi alanda herhangi bir çentikli kan damarı ve kan belirtisi olup olmadığına dikkat edin.
- Testis, epididim, bağlı spermatik kord ve kan damarı, dokular uygun şekilde dışlandığında belirgin olacaktır.
- Epididim ve testisin kaudal-dorsal ucunun yakınında, testisin kremaster kasına fibröz bir bağlanma noktası vardır. Bu yerleştirme noktasını bulmak için dış dokuyu yanal olarak yuvarlayın. Kasın zarar görmesini önlemek ve dokuların daha fazla izolasyonuna ve görselleştirilmesine izin vermek için bunu kesin. Bir kelepçe ve yırtma tekniği uygulamak için iki çift forseps kullanın.
- Kasık yağ yastığından testis çevresindeki yağ dokusunu arayın. Yağ yastığını tutmak için bir çift forseps kullanın ve dışını çıkarmak için hafifçe çekin.
- Yağ yastığı boyunca hareket eden kan damarını tutmayın, çünkü bunu çekmek kanamaya neden olabilir.
- Spermatik kordi, kan damarlarını ve dış dokulara yakın olan kalan yağ yastığını bulun ve klemplemek için bir çift kanama durdurucu kullanın. Distal testis üzerinde hafif bir gerginlik tutarken, hemostat klempinin distalindeki spermatik kordon ve kan damarlarını koterize edin.
- Tamamlandığında, kelepçeyi koterize uca proksimal yavaşça serbest bırakın ve kanama belirtileri olup olmadığını kontrol edin. Varsa, bu adımı tekrarlayın. Koterize edilen dokunun distal ucunda hafif bir gerginlik sağlamak için bir çift forseps kullanmak yararlıdır.
- Spermatik kordun kopmuş kütüğünün vücuda geri çekilmesine izin verin. Cremaster kasının iki kesik ucunu tutun ve bir araya getirin. Dokudaki kesiğin boyutunu değerlendirin ve 4-0 veya 5-0 emilebilir dikişler kullanarak dokuyu kapatın. Kesi boyutuna bağlı olarak 1 veya 2 dikişe ihtiyaç duyulacaktır. Dikiş makası kullanarak dikiş uçlarını 0,5 cm'ye kadar kesin.
- İkinci testisi çıkarmak için skrotumun diğer tarafındaki 1.13-1.20 adımlarını tekrarlayın.
- Cilt kesisini kapatmaya hazırlanın.
- Her iki doku kütüğünün iyi hemostaz olmasını sağlayın. Kötü hemostaz, cerrahi alanda rezidüel kanamaya neden olur. Bu meydana gelirse, kanamayı bulun ve koterize edin. Bu, dokuların künt aletlerle yavaş ve dikkatli bir şekilde manipüle edilmesiyle önlenir.
- Cerrahi alanda kan görülürse, daha iyi görselleştirme için bölgeyi kurutmak için sterilize edilmiş pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Cerrahi alandan herhangi bir kan veya sıvıyı sulamak için bölgeye salin damlatmak için bir şırınga kullanın.
- Kapanmaya hazırlamak için cilt kesisinin iki tarafını birlikte çekin. Kremaster kesilerinin dikişli uçlarının cilt kesisine doğru çıkıntı yapmadığından emin olun. Gerekirse, dikişin uçlarını daha da kesin.
- Cildi kapatın.
- Yara klipsleri kullanıyorsanız, cildi temizlemek ve alttaki dokudan uzaklaştırmak için forseps kullanın. Bir yara klipsini insizyonun üzerine ortalayın. Cildin iyi kırpılıp kırpılmadığını kontrol edin. Kesi, bir yara klipsinin yeterince kapatması için biraz fazla büyükse, insizyonun üst ve alt kısımlarına cerrahi cilt yapıştırıcısı uygulanabilir.
- Dikiş kullanıyorsanız, alttaki dokuyu tutmadan gerekli sayıda süşeyi deriye yerleştirin. Bu tip bir kesi, 4-0 emilmeyen dikiş materyali kullanılarak 2-3 tek kesintili dikiş gerektirecektir.
- Kurumuş kanı veya kalan antiseptik fırçalamayı çıkarmak için ameliyat bölgesinin etrafındaki cildi salin ve sterilize edilmiş pamuk uçlu bir aplikatör ile nazikçe temizleyin.
2. Murin yumurtalık,
- Aseptik bir çalışma alanı hazırlayın ve gerekli cerrahi aletlerin sterilize edildiğinden ve kolayca bulunabildiğinden emin olun. Kemirgen sağkalım cerrahisi için aseptik uygulamaları takip edin.
- Dişi farenin ağırlığını kaydedin ve tercih ettiğiniz anestezi yöntemini kurumsal yönergelerinize göre uygulayın. Bu protokolde, anesteziyi korumak için hassas bir buharlaştırıcı ile %2 izofluran verildi. İşlemden önce, ağrı kesici ilaçları kurumsal yönergelerinize göre uygulayın. Bu protokolde 1.0 mg/kg Buprenorfin SR ve 5 mg/kg Meloksikam subkutan yolla verildi.
- Göz yaralanması, kornea kuruması veya ülser oluşumunu önlemek için hayvanın gözlerine kayganlaştırıcı göz jeli uygulayın. Çalışma sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için bir ısı kaynağının mevcut olduğundan emin olun. Ayak parmağı sıkışması tepkisini kontrol ederek uygun anestezi düzlemini sağlayın.
- Cerrahi alana yerleştirmeden önce hayvanın cerrahi bölgesini hazırlayın.
- Bir çift makas kullanarak hayvanın sırtının dorsolateral bölgesindeki kılları nazikçe tıraş edin. Kalçaların üst sınırının üstündeki ve göğüs kafesinin alt sınırının altındaki bölgeden ve bu yer işaretleri arasındaki alanlardan kılları alın.
- Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, hayvanın derisine yeni traş edilmiş alanı kaplayan bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın. 30 saniye bekleyin ve kremi bir parça gazlı bezle çıkarın, kalan ince tüyleri alın.
- Ameliyat bölgesinde kalan krem ve saçları silmek için %70 etanole batırılmış gazlı bez kullanın.
NOT: Bu adımda% 70 etanol, tüy dökücü kremin tamamen çıkarılmasına yardımcı olmak içindir. Ameliyat bölgesinin antiseptik hazırlığı adım 2.5'te gerçekleştirilir.
- Hayvanı cerrahi alanda yanal pozisyona (her seferinde bir yumurtalık çıkarmak için kesi için) yerleştirin ve bir ısı kaynağının mevcut olduğundan emin olun. Ameliyat bölgesini Betadine cerrahi fırçalama (veya benzeri bir antiseptik cilt hazırlama fırçası) ile ovalayın, ardından uygun cilt dezenfeksiyonunu sağlamak için en az üç kez% 70 alkol uygulayın. Her fırçalama için, dışa doğru radyal hareketlerle fırçalayın, böylece önce kesiğin ortası fırçalanır ve traş edilen cerrahi alanın dış sınırı en son fırçalanır.
- Şu anda, steril cerrahi eldiven giyin. Prosedürün sonraki adımları için aseptik teknikler kullanın. Vücudun örtü malzemesiyle kaplanması için hayvanın üzerine küçük bir kesi bulunan bir cerrahi örtü yerleştirin (cerrahi bölgeye uyacak şekilde örtüde yaklaşık 0,5-1 inçlik bir kare kesin).
- Farenin kalçaları ve kaburgaları arasındaki yarı noktayı bularak cerrahi insizyon için ideal yeri bulun (bkz. Şekil 2). Forseps ile cildi kavrayın ve bu bölgede cilde 1.0 cm'lik bir kesi yapın.
- Cildi kas dokusunun altından ayırmak için künt uçlu bir alet (prob, cerrahi spatula veya künt uçlu hemostatlar) kullanın. Bunu insizyonun lateral, üst ve alt sınırlarında yapmak için zaman ayırın.
- Karnın dorsolateral kas duvarını bulun. Gerekirse, cilt ve kas katmanları arasında kalan yağ dokusunu çıkarın. Olgun farelerde bu yağ dokusu daha belirgindir. Bu yağ dokusunu farenin kuyruk ucuna doğru hareket ettirin ve kas duvarını açığa çıkarın.
- Yağ dokusu karın duvarından renge göre ayrılır: yağ dokusu soluk beyaz görünür ve daha yüzeyseldir, karın duvarı ise pembe görünür ve yağ dokusundan daha derinde bulunur.
- Karın duvarını sıçan dişi forseps ile kavrayın ve içine 0,5 cm'lik bir kesi yapın.
- Bu kesiğin bir sınırını bir çift forseps ile tutun, vücut boşluğuna ulaşmak için ikinci bir çift kullanın ve yumurtalık, rahim boynuzu ve yağ yastığını bulun. Kası alttaki dokudan ayırmak ve dışsallaştırmak için bunu kas duvarındaki kesiden yavaşça çekin. Rahim boynuzu ve yumurtalık arasındaki geçişi bulun.
- Ezme ve yırtma tekniği uygulayarak yumurtalığı kesin.
- Uterus boynuzunun distal ucuna bir kelepçe yerleştirin ve ikinci kelepçeyi birincinin hemen dışına yerleştirin. Her iki kelepçe ile sıkı bir baskı uygularken, daha uzak olanı vücuttan uzaklaştırın ve aralarındaki bağlantıyı yırtın. Kanamayı ve doku hasarını en aza indirmek için, bu işlem sırasında proksimal kelepçeyi sabit tutun ve vücuttan da çekmemeye dikkat edin.
- Alternatif olarak, bir koter kullanın. Uterus boynuzunu istenen koter noktasına hemen yakın klemplemek için bir çift forseps veya hemostat kullanın. Dokuları kesmek için bir koter aleti kullanın.
- Proksimal kelepçeyi nazikçe ve yavaşça serbest bırakın ve kanama belirtileri olup olmadığını kontrol edin.
- Doku kütüğünün vücut boşluğuna çekilmesine izin verin. Karın duvarını tutun ve yavaşça yukarı doğru çekin. Doku kütüğünü içe doğru zorlamayın, çünkü bu kanama olasılığını artırır.
- Kesiğin sınırlarını kas duvarına yerleştirin ve dikmeye hazırlanmak için bir araya getirin.
- 4-0 emilebilir dikiş materyali kullanarak karın kas duvarına 1-2 adet tekli kesintili dikiş atın. Dikiş makası kullanarak dikiş uçlarını 0,5 cm'ye kadar kesin.
- Cildin doğal dinlenme durumuna dönmesine izin vererek kesiyi kapatın ve ardından alttaki dokuyu veya dikiş malzemesinin uçlarını tutmamaya dikkat ederek yukarı doğru kaldırın. Everted cilde 1-2 yara klipsi yerleştirin. Kurumsal yönergelerinize bağlı olarak, cilt 4-0 emilmeyen sütür materyali kullanılarak da kapatılabilir.
- Diğer yumurtalığı çıkarmak için, farenin konumunu diğer yan taraf yukarı bakacak şekilde değiştirin. Adım 2.17'den itibaren yaralı kırpılmış cilde çok fazla baskı uygulamamak için farenin konumunu değiştirirken nazik olun.
- Bu tarafta, 2.5 - 2.17 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Kurumuş kanı veya kalan antiseptik fırçalamayı çıkarmak için ameliyat bölgesinin etrafındaki cildi salin ve sterilize edilmiş pamuk uçlu bir aplikatör ile nazikçe temizleyin.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Kurumsal yönergelerinize göre, ameliyattan sonra 72 saate kadar ağrı kesici ilaç verin. Kullanılan tarih, saat, anestezi ve analjezik belirtilerek hayvanların cerrahi prosedürünü belgeleyin. Burada yavaş salınan Buprenorfin ve meloksikam ameliyat öncesi uygulanır.
- Hayvanların ameliyatının tamamlanmasından sonra, onları kuru bir kağıt havluyla kaplı temiz bir kafese aktarın. Bu kafesin 2/3'ünü bir ısı kaynağına yerleştirin ve kafesin diğer 1/3'ünü ısıdan uzak tutun. Anesteziden kurtulana kadar fareleri bir kafese koymayın.
- Hayvanı normal hayvan yataklarıyla temiz bir kafese yerleştirmeden önce kafesin etrafında serbestçe dolaşma yeteneğini yeniden kazanmasına izin verin. Şu anda, hepsi anesteziden kurtulmuşsa, fareler bir araya getirilebilir.
- Ameliyattan sonraki ilk birkaç gün nemli yiyecek ve suya kolayca erişilebildiğinden emin olun. Kafesin dibine biraz nemli yiyecek koyun. Farenin cerrahi bölgesini sık sık kontrol edin ve herhangi bir enfeksiyon veya kanama belirtisi olup olmadığına bakın.
- Ameliyattan sonra, farelerin ya tek başlarına ya da aynı prosedürden aynı anda geçen diğer hayvanlarla birlikte barındırıldığından emin olun. Ameliyatsız bir fare ile aynı kafeste bulunan ameliyattan iyileşen bir fare tehlike oluşturabilir ve bundan kaçınılmalıdır.
- Ovariektomi geçirmiş ve sırtın dorsolateral taraflarında yara klipsleri olan fareler için, iyileşmenin ilk haftasında farenin yara klipsinin igloya takılma olasılığını azaltmak için kemirgen iglo habitatlarını kafesten çıkarın.
- İyileşme süresinin ilk 72 saatine kadar her 12 saatte bir enfeksiyon, ağrı veya cerrahi komplikasyon belirtileri açısından hayvanı izlemeye devam edin.
- Ameliyattan 10-14 gün sonra bir yara klipsi sökücü alet kullanarak yara klipslerini çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan prosedür, C57BL / 6J arka planında bir ila üç aylık farelerde gerçekleştirilir. İşlem sırasında erkek fareler 16-28 g ağırlığındaydı ve dişi fareler 14-24 g ağırlığındaydı. Bu prosedür, sütten kesmeden yetişkinliğe kadar birçok yaştaki fareler için geçerli olacak şekilde optimize edilmiştir.
Cerrahi orşiektomi, Şekil 1A'da gösterildiği gibi ventral skrotal kesede tek bir cilt insizyonu içerir. Her iki testis teker teker çıkarılır ve vas deferens ve spermatik kan damarlarından kesilerek testisin ve bağlı epididimin çıkarılmasına neden olur (Şekil 1B). Çıkarılan içerik, Şekil 1C'de gösterilen testis, epididim ve kasık yağ yastığını içerir. Testislerin başarılı bir şekilde çıkarılması, çıkarılan dokuların görsel olarak gözlemlenmesi ve vücut boşluğunu kapatmadan önce doku güdüğünün iyi hemostazının sağlanmasıyla doğrulanabilir. Orşiektominin başarısı, iyileşmiş insizyon bölgelerini gösteren iyi iyileşmiş farelerin gözlemlenmesiyle ölçülebilir (Şekil 1D). Orşiektomi geçiren fareler, işlemden bir hafta sonra fare serumunda ölçülen testosteron seviyesinde bir azalma gösterecektir (Şekil 1E).
Cerrahi bilateral overektomi, dişi farelerin sol ve sağ dorsumuna yapılan insizyonlarla yapılır (Şekil 2A). Lateral insizyon yaklaşımı, sadece bir yumurtalık çıkarılacaksa kullanılabilir. Bu yaklaşımda karın duvarı kesilir ve yumurtalık yağ yastığı yerleştirilir. Şekil 2B'de gösterildiği gibi yağ yastıkçığı, yumurtalık, yumurtalık kanalı ve distal uterin boynuz dıştan çıkarılır ve ardından distal uterin horn kesilir. Bu teknik, yumurtalık ve yumurta kanalının çıkarılmasıyla sonuçlanır. Yumurtalık ve yumurtalık kanalı, distal uterus boynuzu dahil edilmeden çıkarılabilir, ancak kalan yumurtalık hücrelerinin fareyi kızgınlık döngülerinde tutmaya devam etme riski vardır. Distal uterin boynuzun dahil edilmesi, tüm yumurtalık ve kanalın çıkarılmasını sağlar, seks hormonlarının tükenmesi olur ve fareler artık döngü yapmaz. Şekil 2C , vücuttan diseke edilen murin dişi üreme organlarının bir örneğini göstermektedir. Yumurtalıkların kendilerinin çevre dokulardan çok daha küçük olduğu gözlemlenebilir. Bir diseksiyon kapsamı veya luplar bu dokuların tanımlanmasına yardımcı olur. Şekil 2D , uterus yağ yastığından alınan doku ile bir diseksiyon kapsamı altında yumurtalık anatomisini göstermektedir ve daha iyi görselleştirmeye izin vermektedir. Bu prosedürün başarısı, iyileşmiş insizyon bölgelerini gösteren iyi iyileşmiş farelerin gözlemlenmesiyle ölçülebilir (Şekil 2E).
Ovariektomi ameliyatı, hızlı bir şekilde ve çevre dokulara en az rahatsızlık verecek şekilde yapıldığında güvenli ve etkilidir. Burada özetlenen prosedürün ardından, cilt ve karın duvarı kesisinin doğru şekilde konumlandırılmasını sağlayarak rahim dokularının hızlı bir şekilde bulunmasını sağlayarak bunu başarır. Göğüs kafesinin alt sınırının ve bacak kemiklerinin üst sınırının belirlenmesi, kesinin ilgilenilen dokuya yakın yapılmasını sağlar. Kaburgaların alt sınırı ile bacak kemiklerinin üst sınırı arasında yaklaşık yarıya kadar olan ve omurganın yaklaşık 1,5 cm lateralinde yer alan bir kesi yapılması, lateral insizyon yaklaşımı yapılırken cerrahi bölgenin iyi konumlandırılmasını sağlar (Şekil 2A).
Cerrahi ovariektominin doğrulanması uterus atrofisinin gözlenmesi ile gösterilir. Şekil 2F , 6 aylık bir fareden kesilen bir uterus boynuzunu gösterirken, Şekil 2G , üç aylıkken cerrahi ovariektomi geçiren 6 aylık bir fareden alınan uterus boynuzunu göstermektedir. Yumurtalıklı uterus boynuzu daha ince görünür ve distal uçta yumurtalığa bağlanmaz. Cerrahi tekniğin bu doğrulanma yöntemi, yumurtalığın çıkarılmasının uterus dokusunun atrofisine neden olduğunu etkili bir şekilde göstermektedir.
Dokular başarılı bir şekilde tanımlandıktan ve eksize edildikten sonra, yaraların kapatılması ve ameliyat sonrası dikkatli bir şekilde izlenmesi ile ameliyat tamamlanabilir. Uygun aseptik teknik14 , sağkalım cerrahisi yapılırken iyi sonuçların sağlanmasında önemlidir. Fare kesilerden iyileşmeye başladığında, ağrı belirtileri ve cerrahi komplikasyonlar aramak için izleme yapılır. Olası bir cerrahi komplikasyon, dokuyu kesmeye veya manipüle etmeye çalışırken kan damarlarının dürtülmesi veya çentiklenmesi nedeniyle iç kanamadır. Bu, cerrahi bölgenin etrafındaki derinin altında kalıcı kırmızı, kızarık bir görünüm ile gösterilir. Bu gibi komplikasyonlardan kaçınmak, insizyon bölgelerinin uygun şekilde lokalizasyonu ve cerrahi mikroskop veya büyüteçler kullanılarak cerrahın görüşüne yardımcı olunmasıyla sağlanır. Ameliyattan sonraki ilk üç gün boyunca her 12 saatte bir görsel muayene önerilir. Başarılı bir ameliyat temiz ve iyileşen yaralarla sonuçlanacaktır (Şekil 1D, 2E).
Şekil 1: Erkek murin orşiektomi . (A) Bir erkek fare, kırmızı ile gösterilen testisin çıkarılması için skrotal kese içine cerrahi bir insizyonun yeri ile sırtüstü pozisyonda gösterilmiştir. (B) Orşiektomi cerrahi prosedürü sırasında çekilen ve dekolman noktasını yeşil renkle gösteren resim. (C) Bir erkek fareden disseke edilmiş testis, yağ yastıkçıkları ve epididim. (D) Orşiektomi sonrası skrotal insizyon üzerinde iyi iyileşmiş bir yara klipsi olan bir erkek fare. (E) ELISA enterpolasyonu ile belirlenen ng / mL cinsinden fare serum testosteron konsantrasyonu. Her iki grup da 9 haftalık fareleri temsil ediyor. Cerrahi orkiektomiler 8 haftalıkken yapıldı. N = grup başına 3 fare. Örnekler üç kopya halinde çalıştırıldı. Serum örnekleri kardiyak ponksiyon ile toplandı ve analiz zamanına kadar donduruldu. *, p < 0.05. Hata çubukları = SEM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kadın murin ovariektomisi . (A) Dorsal lateral taraftan tek bir yumurtalığın çıkarılması için cerrahi insizyon bölgesi ile lateral pozisyonda gösterilen bir dişi fare, kırmızı ile gösterilmiştir. Diğer önemli anatomik işaretler vurgulanmıştır. (B) Ameliyat sırasında çekilen ve dıştan yumurtalık, yumurta kanalı ve distal uterin boynuzu, ayrılma noktası yeşil renkle gösterilen resim. (C) Dişi bir fareden çıkarılmış uterus boynuzları, yumurtalıklar ve yağ yastıkçıkları. (D) Kesilen yumurtalık, yumurtalık kanalı ve uterus boynuzunun distal kısmının, yağ yastığından alınan yağın çıkarıldığı ve yumurtalığın daha iyi görüntülenmesini sağlayan yakından görünümü. (E) Ovariektomiyi takiben insizyon üzerinde iyi iyileşmiş bir yara klipsi olan bir dişi fare. (F) Disseke fare uterus boynuzu. (G) Yumurtalık ameliyatından 3 ay sonra uterus atrofisi gösteren disseke fare uterus boynuzu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Murin ovariektomi ve orşiektomi için grafik özet. Her ikisi de seks hormonu tükenmiş bir fare modeliyle sonuçlanan, testisin çıkarılmasını içeren erkek fareler için orşiektomi prosedürünün ve yumurtalıkların çıkarılmasını içeren yumurtalık ameliyatının resimli bir temsili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Testislerin ve yumurtalıkların cerrahi olarak çıkarılması, kontrollü hormon yoksunluğu altında murin fizyolojisinin incelenmesine izin verir. Bu teknik, nörodejenerasyon, mineral metabolizması, kardiyovasküler ve üreme sağlığıdahil olmak üzere birçok bilim alanı için önemlidir 15,16,17,18,19,20,21. Burada, seks hormonlarını tüketmek için hayatta kalma cerrahisi kullanarak murin yumurtalıklarının ve testislerin hızlı, güvenli ve etkili bir şekilde çıkarılması için bir protokolü detaylandırıyoruz. Deneyimli bir cerrah tarafından yapıldığında, bu prosedürler 5 dakika kadar kısa sürebilir ve bu da farelerde çok yüksek bir hayatta kalma oranı ile sonuçlanır.
Bir fare ameliyatı planlarken göz önünde bulundurulması gereken bazı hususlar arasında en iyi kesi yeri ve hayvanın fizyolojisi yer alır. Orşiektomi durumunda, fare testisi orta hat ventral insizyonu ile karın içinden de çıkarılabilir13. Bu teknik sadece periton boşluğunu açmakla kalmaz, aynı zamanda kasık yağ yastıkçıklarının hızlı bir şekilde tanımlanmasına da dayanır. Yeni cerrahlar için bu tekniği hızlı bir şekilde uygulamak zordur. Fareler çok gençken, yağ yastıkçıkları da daha az gelişmiştir ve bu nedenle bulunması daha zordur. Bu protokolde özetlenen skrotal yaklaşım, fare cerrahisinde yeni olan, küçük, genç fareler üzerinde çalışan veya karın kesisi ile periton boşluğundaki diğer organları rahatsız etme şansını en aza indirmek isteyen araştırmacılar için uygun bir seçenektir.
Cerrahi yumurtalık, bir veya her iki yumurtalığın çıkarılmasını içerir. Çoğu cerrahi prosedürde olduğu gibi, güvenli ve hızlı yöntemler genellikle insizyonun cilde ve alttaki fasyaya mümkün olduğunca küçük yapılmasını içerir. Bu, dikişlerin ve yara klipslerinin azalmasına ve daha hızlı iyileşmeye izin verir. Kesileri küçültebilmek pratikle gelen bir beceri olsa da, kesinin yeri konusunda emin olmak faydalıdır. Şekil 2A , en iyi kesi noktalarının nasıl bulunacağına dair bir örnek göstermektedir. Küçük fare anatomisi nedeniyle, yumurtalık karaciğerin yanında ve farenin sol tarafında, dalağın yakınında yer alacaktır. Bu organların yanlışlıkla yoklanması ve çekilmesi istenmeyen kanamalara veya hasara neden olabilir. Bu tekniğe yardımcı olmak ve advers komplikasyon olasılığını azaltmak için doğru insizyon yeri ve çevredeki anatomik işaretlerin tanımlanması için ayrıntılı bir rehber sunuyoruz.
Burada, bu prosedürün, cerrahi işlemden bir haftadan daha kısa bir süre sonra farelerde dolaşımdaki hormon seviyelerini etkili bir şekilde düşürmek için nasıl kullanılabileceğine ve işlemden sonra kalan gonadal dokunun zamanla nasıl köreldiğine dair bir örnek sunuyoruz. Önceki yöntemler ve araştırmalar, bunların menopoz veya andropoz fare modelleri oluşturmak için nasıl yapılabileceğini detaylandırıyor, ancak bunların çoğu farelerden ziyade sıçan modellerinde gerçekleştiriliyor12,22. Sıçanlar ve fareler benzer anatomiye sahipken, murin sistemi daha küçük anatomik yapılara sahiptir. Burada, 3 haftalıktan küçük fare modellerinde güvenilir bir şekilde çalışan bir yöntem sunuyoruz. Genel olarak, bu iki protokol, hayatta kalma kemirgen orkiektomilerini ve yumurtalıklarını hızlı bir şekilde gerçekleştirmenin, fare anatomisini tanımanın ve cerrahi komplikasyonları en aza indirmenin tutarlı ve etkili sonuçlar için bir temel oluşturmasının tutarlı bir yolunu temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Hayvan Kaynak Merkezi'ne cerrahi eğitim ve protokol incelemesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Wert Lab destek ekibine paha biçilmez yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (NIH P30EY030413) fonlarıyla desteklenmiştir. Biorender.com, çizgi film şemalarının oluşturulmasında kullanıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
- Kaprara, A., Huhtaniemi, I. T. The hypothalamus-pituitary-gonad axis: Tales of mice and men. Metabolism. 86, 3-17 (2018).
- Stamatiades, G. A., Kaiser, U. B. Gonadotropin regulation by pulsatile GnRH: Signaling and gene expression. Molecular and Cellular Endocrinology. 463, 131-141 (2018).
- Plant, T. M., Marshall, G. R. The functional significance of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates. Endocrine Reviews. 22 (6), 764-786 (2001).
- Fuentes, N., Silveyra, P.
- Guo, X., Yu, X., Yao, Q., Qin, J. Early effects of ovariectomy on bone microstructure, bone turnover markers and mechanical properties in rats. BMC Musculoskeletal Disorder. 23 (1), 316 (2022).
- Yu, H., et al. High-mobility group box chromosomal protein-1 deletion alleviates osteoporosis in OVX rat model via suppressing the osteoclastogenesis and inflammation. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 232 (2022).
- Sun, J., et al. Quercetin attenuates osteoporosis in orchiectomy mice by regulating glucose and lipid metabolism. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 13, 849544 (2022).
- Costa, R. M., et al. Testosterone contributes to vascular dysfunction in young mice fed a high fat diet by promoting nuclear factor E2-related factor 2 downregulation and oxidative stress. Frontiers in Physiology. 13, 837603 (2022).
- Bohm-Levine, N., Goldberg, A. R., Mariani, M., Frankfurt, M., Thornton, J. Reducing luteinizing hormone levels after ovariectomy improves spatial memory: Possible role of brain-derived neurotrophic factor. Hormones and Behavior. 118, 104590 (2020).
- Pandey, R., et al. Estrogen deficiency induces memory loss via altered hippocampal HB-EGF and autophagy. Journal of Endocrinology. 244 (1), 53-70 (2020).
- Laouari, D., et al. The sexual dimorphism of kidney growth in mice and humans. Kidney International. 102 (1), 78-95 (2022).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. Journal of Visualized Experiments. (64), e4013 (2012).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine prostate micro-dissection and surgical castration. Journal of Visualized Experiments. (111), e53984 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
- Haider, A., et al. Role of sex hormones in modulating myocardial perfusion and coronary flow reserve. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (7), 2209-2218 (2022).
- Joll, J. E., Bersi, M. R., Nyman, J. S., Merryman, W. D. Evaluation of early bilateral ovariectomy in mice as a model of left heart disease. American Journal of Physiology Heart-Circulartory Physiology. 322 (6), H1080-H1085 (2022).
- Lu, H., Ma, K., Jin, L., Zhu, H., Cao, R. 17β-estradiol rescues damages following traumatic brain injury from molecule to behavior in mice. Journal of Cell Physiology. 233 (2), 1712-1722 (2018).
- Meydan, S., et al. Effects of testosterone on orchiectomy-induced oxidative damage in the rat hippocampus. Journal of Chemical Neuroanatomy. 40 (4), 281-285 (2010).
- Ohlson, N., Bergh, A., Persson, M. L., Wikström, P. Castration rapidly decreases local insulin-like growth factor-1 levels and inhibits its effects in the ventral prostate in mice. Prostate. 66 (16), 1687-1697 (2006).
- Tehranipour, M., Moghimi, A. Neuroprotective effects of testosterone on regenerating spinal cord motoneurons in rats. Journal of Motor Behavior. 42 (3), 151-155 (2010).
- Yamada, K., et al. The impact of ovariectomy on olfactory neuron regeneration in mice. Chemical Senses. 45 (3), 203-209 (2020).
- Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).
