Bioengineering

इन विट्रो लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के लिए इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स का चयन

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64403

Alessandro Migliara¹, Martino Alfredo Cappelluti¹, Francesca Giannese², Sara Valsoni¹, Alberto Coglot¹, Ivan Merelli^1,3, Davide Cittaro², Angelo Lombardo^1,4

¹San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, ²Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, ³Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, ⁴Vita-Salute San Raffaele University

Summary

यहां, हम उच्च, दीर्घकालिक, स्थिर, ऑन-टारगेट साइलेंसिंग दक्षता और कम जीनोम-वाइड, ऑफ-टारगेट गतिविधि के साथ इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स (ईटीआर) के इन विट्रो चयन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह वर्कफ़्लो उम्मीदवार ईटीआर के प्रारंभिक, जटिल प्रदर्शनों को एक छोटी सूची में कम करने की अनुमति देता है, जो चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सेटिंग्स में आगे के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।

Abstract

जीन निष्क्रियता जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है और रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के उपचार के लिए एक आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व करती है। पारंपरिक प्रौद्योगिकियों में, आरएनए हस्तक्षेप आंशिक लक्ष्य निरस्तीकरण और जीवन भर के उपचार की आवश्यकता से ग्रस्त है। इसके विपरीत, कृत्रिम न्यूक्लियस डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) के प्रेरण के माध्यम से स्थिर जीन निष्क्रियता लागू कर सकते हैं, लेकिन हाल के अध्ययन इस दृष्टिकोण की सुरक्षा पर सवाल उठा रहे हैं। इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स (ईटीआर) के माध्यम से लक्षित एपिजेनेटिक संपादन एक समाधान का प्रतिनिधित्व कर सकता है, क्योंकि विशिष्ट ईटीआर संयोजनों के एकल प्रशासन से डीएनए ब्रेक को प्रेरित किए बिना टिकाऊ साइलेंसिंग हो सकती है।

ईटीआर प्रोटीन होते हैं जिनमें एक प्रोग्राम करने योग्य डीएनए-बाइंडिंग डोमेन (डीबीडी) होता है और स्वाभाविक रूप से होने वाले ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स से प्रभावकारक होते हैं। विशेष रूप से, मानव ZNF10 के KRAB डोमेन से लैस तीन ETR का एक संयोजन, मानव DNMT3A और मानव DNMT3L का उत्प्रेरक डोमेन, ETR-लक्ष्य जीन पर आनुवंशिक दमनकारी एपिजेनेटिक राज्यों को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था। इस मंच की हिट-एंड-रन प्रकृति, लक्ष्य के डीएनए अनुक्रम पर प्रभाव की कमी, और मांग पर डीएनए डिमिथाइलेशन द्वारा दमनकारी स्थिति में लौटने की संभावना, एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को एक गेम-चेंजिंग टूल बनाती है। एक महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य जीन पर उचित ईटीआर की स्थिति की पहचान करना है ताकि लक्ष्य को अधिकतम किया जा सके और ऑफ-टारगेट साइलेंसिंग को कम किया जा सके। अंतिम पूर्व विवो या विवो प्रीक्लिनिकल सेटिंग में इस चरण को करना बोझिल हो सकता है।

सीआरआईएसपीआर/कैटेलिटिक रूप से मृत कैस9 प्रणाली को ईटीआर के लिए आदर्श डीबीडी के रूप में लेते हुए, यह पेपर एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसमें गाइड आरएनए (जीआरएनए) की इन विट्रो स्क्रीन शामिल है, जो कुशल ऑन-टारगेट साइलेंसिंग के लिए ट्रिपल-ईटीआर संयोजन के साथ युग्मित है, इसके बाद शीर्ष हिट ्स के जीनोम-वाइड विशिष्टता प्रोफाइल का मूल्यांकन किया जाता है। यह उम्मीदवार जीआरएनए के प्रारंभिक प्रदर्शनों को होनहार लोगों की एक छोटी सूची में कम करने की अनुमति देता है, जिनकी जटिलता चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक रुचि सेटिंग में उनके अंतिम मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।

Introduction

जीन निष्क्रियता ने पारंपरिक रूप से सेलुलर और पशु मॉडल दोनों में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इसके अलावा, पिछले दो दशकों में, जीन थेरेपी के उदय के साथ, इसे गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन¹, संक्रामक रोग², या विकृति के कारण होने वाली बीमारियों के इलाज के लिए संभावित गेम-चेंजिंग दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है, जिसमें एक जीन को चुप कराने से^{दूसरे में विरासत} में मिले दोष की भरपाई हो सकती है। अंत में, कैंसर इम्यूनोथेरेपी⁴ और पुनर्योजी चिकित्सा⁵ के लिए सेल उत्पादों की दक्षता बढ़ाने के लिए सेल फिटनेस और कार्यात्मक नियंत्रण के प्रमुख नियामकों की आनुवंशिक निष्क्रियता का प्रस्ताव किया गया है।

जीन निष्क्रियता को पूरा करने के लिए विभिन्न तकनीकों में से, सबसे आशाजनक में से एक लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग ^6,7 है। इस तकनीक के मूल में तथाकथित इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स (ईटीआर), चिमेरिक प्रोटीन हैं जिनमें एक प्रोग्राम करने योग्य डीएनए-बाइंडिंग डोमेन (डीबीडी) और एपिजेनेटिक दमनकारी फ़ंक्शन के साथ एक प्रभावक डोमेन (ईडी) शामिल है। जिंक फिंगर प्रोटीन (जेडएफपी) ⁸, ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-जैसे प्रभावक (टीएएलई) 9, या सीआरआईएसपीआर / डीसीएएस ⁹ ^{10-आधारित} डीबीडी को चुनिंदा रूप से ईडी को लक्षित जीन के प्रमोटर / एन्हांसर अनुक्रम से जोड़ने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। एक बार वहां, ईटीआर का ईडी हेटेरोक्रोमैटिन-उत्प्रेरण दमनकारी एपिजेनेटिक निशान जैसे हिस्टोन संशोधनों (एच 3 के 9 11,12 या एच 3 के 27¹³ मिथाइलेशन^, एच 3 या एच 4 डीएसिटिलीकरण¹⁴) और सीपीजी डीएनए मिथाइलेशन ¹⁵ को लागू करके अपनी साइलेंसिंग गतिविधि करता है।

विशेष रूप से, पूर्व-आरोपण भ्रूण¹⁶ में होने वाले अंतर्जात रेट्रोवायरस के स्थायी ट्रांसक्रिप्शनल दमन की आणविक प्रक्रियाओं से प्रेरित, निम्नलिखित ईडी का फायदा उठाने के लिए तीन ईटीआर का एक संयोजन उत्पन्न किया गया है: i) मानव ZNF10 के क्रुपेल-संबद्ध बॉक्स (KRAB) डोमेन; मानव डी नोवो डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 3 ए (डीएनएमटी 3 ए) का उत्प्रेरक डोमेन; और iii) पूर्ण लंबाई वाले मानव डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 3-जैसे (डीएनएमटी 3 एल)। केआरएबी एक संरक्षित दमनकारी डोमेन है जिसे उच्च कशेरुकी^17,18 में कई जेडएफपी द्वारा साझा किया जाता है, जिनकी साइलेंसिंग गतिविधि मुख्य रूप से केएपी 1^19-एक पाड़ प्रोटीन को भर्ती करने की क्षमता पर आधारित होती है जो तब कई अन्य हेटेरोक्रोमैटिन इंड्यूसर ्स²⁰ के साथ बातचीत करती है- जिसमें न्यूक्लियोसोम रीमॉडेलिंग और डिएसिटिलीकरण (एनयूआरडी) कॉम्प्लेक्स 21, एच 3 के 9 हिस्टोन मिथाइलट्रांसफेरेज़ एसईटीडीबी 1 22^, और एच 3 के 9 मिथाइलेशन रीडर एचपी 1 ²³ शामिल हैं^।²⁴, दूसरों के बीच।

DNMT3A सक्रिय रूप से CPG अनुक्रम²⁵ पर डीएनए पर मिथाइल समूहों को स्थानांतरित करता है। DNMT3A की उत्प्रेरक गतिविधि DNMT3L के साथ इसके भौतिक संबंध से बढ़ी है, DNMT3A का एक भ्रूण- और जर्म सेल-प्रतिबंधित पैरालॉग जिसमें मिथाइल समूह हस्तांतरण^26,27 के लिए जिम्मेदार उत्प्रेरक डोमेन की कमी है। सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों में डीएनए मिथाइलेशन - जिसे सीपीजी द्वीप (सीजीआई) के रूप में संदर्भित किया जाता है - स्तनधारी जीन के प्रमोटर / एन्हांसर तत्वों में एम्बेडेड आमतौर पर प्रतिलेखन साइलेंसिंग²⁸ से जुड़ा होता है। महत्वपूर्ण रूप से, एक बार जमा होने के बाद, सीपीजी मिथाइलेशन को यूएचआरएफ 1-डीएनएमटी 1-आधारित आणविक परिसर²⁹ द्वारा माइटोसिस के दौरान स्थिर रूप से विरासत में मिला जा सकता है।

लक्ष्य सेल में ईटीआर का स्थिर ओवरएक्प्रेशन समस्याग्रस्त हो सकता है, संभवतः ऑफ-टारगेट गतिविधि के बढ़ते जोखिम ों और समय के साथ उनके शारीरिक लक्ष्य साइटों से अंतर्जात इंटरएक्टर्स के झुकाव के कारण। हालांकि, एकल-ईटीआर मोइटीज की क्षणिक अभिव्यक्ति उच्च दक्षता³⁰ के साथ दीर्घकालिक साइलेंसिंग को प्रेरित करने में विफल हो सकती है, जिससे उनके चिकित्सीय अनुप्रयोग में बाधा उत्पन्न हो सकती है। इसलिए, क्षेत्र में एक मौलिक सफलता यह सबूत थी कि तीन KRAB-, DNMT3A-, और DNMT3L-आधारित ETR का संयोजन तालमेल कर सकता है और, भले ही केवल क्षणिक रूप से सह-वितरित हो, लक्ष्य जीन H3K9 और CPG मिथाइलेशन के प्रमोटर अनुक्रम पर लागू हो। फिर इन्हें माइटोसिस के दौरान कोशिका द्वारा पढ़ा और प्रचारित किया जाता है, जिससे कई मानव और मुराइन सेल लाइनों में आनुवंशिक साइलेंसिंग होती है, साथ ही साथ पूर्व विवो सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाएं³⁰ होती हैं।

ध्यान दें, ईटीआर द्वारा लगाए गए एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को लक्षित (जैसे, सीआरआईएसपीआर / डीसीएएस 9-आधारित टीईटी 1 डीएनए डीमिथाइलेज की भर्ती साइलेंट लोकस पर) या फार्माकोलॉजिकल (डीएनए मिथाइलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर 5-एज़ा का प्रशासन) डीएनए डिमिथाइलेशन³⁰, ईटीआर से संबंधित प्रतिकूल घटनाओं के मामले में एक संभावित एंटीडोट द्वारा मांग पर वापस लाया जा सकता है। तीन KRAB-, DNMT3A-और DNMT3L-आधारित EDs वाले ऑल-इन-वन ETR का भी वर्णन किया गया था, जो प्रोटीन-कोडिंग जीन के बड़े बहुमत के खिलाफ सेल लाइनों^31,32 में महत्वपूर्ण साइलेंसिंग क्षमता दिखाते हैं। इसके अलावा, ईटीआर को नियोजित करने वाले कई अध्ययनों ने एक उच्च सुरक्षा प्रोफ़ाइल की सूचना दी, जिसमें नए सीपीजी मिथाइलेशन या क्रोमैटिन पहुंच^30,31,32 के परिवर्तन के संदर्भ में कोई बड़ी ऑफ-टारगेट गतिविधि नहीं थी। हालांकि, नैदानिक अनुप्रयोगों से पहले एक नए डिज़ाइन किए गए डीबीडी से लैस ईटीआर की विशिष्टता प्रोफ़ाइल का एक समर्पित विश्लेषण अनुशंसित है।

नैदानिक दृष्टिकोण से, लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) -आधारित वध³³ और कृत्रिम न्यूक्लियस-आधारित जीन व्यवधान⁸ दोनों के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकता है। आरएनएआई के विपरीत, लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग प्रति सेल अपने लक्ष्य के पूर्ण निरस्तीकरण को प्रेरित कर सकती है और दीर्घकालिक चुप्पी सुनिश्चित करने के लिए आवधिक उपचार की आवश्यकता नहीं होती है; जीन व्यवधान के विपरीत, यह डीएनए अनुक्रम को अपरिवर्तित छोड़ देता है, डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) की पीढ़ी से बचता है। डीएसबी तब एपोप्टोसिस और सेल चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित कर सकते हैं, संभावित रूप से एक कार्यात्मक पी 53 मार्ग 34,35 के साथ कोशिकाओं के खिलाफ चयन कर सकते हैं और विशेष रूप से मल्टीप्लेक्स जीन संपादन सेटिंग्स में^, क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था³⁵। इसके अलावा, गैर-समरूप-अंत-जुड़ने-मध्यस्थता वाले डीएनए डीएसबी मरम्मत³⁶ के अपरिवर्तनीय मोज़ेक परिणाम को रिले करके, जीन व्यवधान अंतिम परिणामों में से एक के रूप में कार्यात्मक कोडिंग अनुक्रमों में लक्ष्य की इन-फ्रेम मरम्मत से बच नहीं सकता है और, एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के विपरीत, मांग पर मिटाया नहीं जा सकता है।

अंत में, एपिजेनेटिक साइलेंसिंग में लक्षित आनुवंशिक तत्वों की सीमा को आरएनएआई और जीन व्यवधान के लिए पूरी तरह से या कम से कम आंशिक रूप से दुर्दम्य, जैसे गैर-स्थानांतरित नियामक तत्व और गैर-कोडिंग आरएनए^30,32 तक विस्तारित करने की क्षमता है। किसी भी लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग एप्लिकेशन के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य जीन के विभिन्न नियामक अनुक्रमों को कवर करने वाले ईटीआर के एक पैनल को डिजाइन करना और सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वालों की पहचान करना है। परीक्षण किए जाने वाले ईटीआर की संख्या महत्वपूर्ण हो सकती है, जीनोम के बढ़ते हिस्से को देखते हुए जिसे^{लगातार विकास के} तहत प्रोग्राम करने योग्य डीएनए बाइंडिंग प्रौद्योगिकियों द्वारा लक्षित किया जा सकता है। ईटीआर की स्क्रीन को सीधे सेल प्रकार पर निष्पादित करना जिसमें चिकित्सीय रूप से लक्ष्य जीन को शांत करना सबसे प्रासंगिक विकल्प का प्रतिनिधित्व करेगा। हालांकि, संस्कृति में उनके सीमित अस्तित्व और उनकी अक्सर उप-मानक इंजीनियरिंग क्षमता के कारण प्राथमिक कोशिकाओं में उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन तकनीकी रूप से बोझिल हो सकती है। विवो में बड़े पैमाने पर स्क्रीन और भी असंभव हो सकती है।

एक अधिक व्यावहारिक विकल्प में पहले आसानी से इंजीनियर सेल लाइनों में ईटीआर के एक बड़े पैनल की प्रारंभिक स्क्रीनिंग करना शामिल है, और फिर केवल चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सेल प्रकार में सबसे आशाजनक लोगों को मान्य करना है। एक समानांतर मुद्दा ईटीआर की साइलेंसिंग दक्षता को मापने के लिए एक उपयुक्त रीडआउट का चयन है। आरटी-क्यूपीसीआर, वेस्टर्न ब्लॉट, या एलिसा द्वारा लक्ष्य जीन के प्रतिलेख या प्रोटीन स्तर का सीधे आकलन करना महंगा और समय लेने वाला हो सकता है और इसमें पर्याप्त संवेदनशीलता की कमी हो सकती है, इस प्रकार उच्च-थ्रूपुट स्केल पर उनके आवेदन को सीमित किया जा सकता है। तदर्थ इंजीनियर रिपोर्टर सेल लाइनों की पीढ़ी जिसमें एक फ्लोरोफोरे को लक्ष्य जीन के नियामक अनुक्रमों के ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण के तहत रखा जाता है, एकल-कोशिका स्तर पर और उच्च-थ्रूपुट गति से एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को पढ़ने के लिए फ्लो साइटोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण के शोषण की अनुमति देता है।

इन सामान्य विचारों के बाद, यह पेपर एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसमें ऑन-टारगेट साइलेंसिंग दक्षता के लिए ईटीआर की इन विट्रो सरणी स्क्रीन शामिल है, इसके बाद शीर्ष हिट ्स की जीनोम-वाइड ऑफ-टारगेट गतिविधि का मूल्यांकन किया जाता है। यह वर्कफ़्लो उम्मीदवार ईटीआर के प्रारंभिक प्रदर्शनों को आशाजनक लोगों की एक छोटी सूची में कम करने की अनुमति देता है, जिनकी जटिलता चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सेल प्रकार की रुचि में उनके अंतिम मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।

ईटीआर उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जा सकने वाले विभिन्न प्रोग्राम करने योग्य डीबीडी के बीच, यह प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर / डीसीएएस 9-आधारित तकनीक पर ध्यान केंद्रित करेगा, क्योंकि उच्च-थ्रूपुट पैमाने पर लक्ष्य जीन प्रमोटर को फैलाने वाले जीआरएनए को डिजाइन करने में आसानी होती है। हालांकि, नीचे वर्णित एक ही वैचारिक वर्कफ़्लो को अन्य डीबीडी से लैस ईटीआर की दक्षता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए अपनाया जा सकता है।

Protocol

1. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा लक्ष्य जीन की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि की निगरानी के लिए एक प्रतिदीप्ति-आधारित रिपोर्टर सेल लाइन इंजीनियरिंग।

चुप किए जाने वाले लक्ष्य जीन को व्यक्त करने वाली सेल लाइनों की पहचान करें। मानव प्रोटीन एटलस³⁸ में चुप होने के लिए लक्ष्य जीन ब्राउज़ करें और रुचि के दैहिक ऊतक के प्रतिनिधि उन लाइनों की पहचान करने के लिए इसके "सेल लाइन" अनुभाग के माध्यम से नेविगेट करें (उदाहरण के लिए, एक हेपेटिक सेल लाइन यदि अंतिम लक्ष्य यकृत हेपेटोसाइट्स हैं)। वैकल्पिक रूप से, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) डेटाबेस (जैसे, एनसीबीआई जीईओ) से पूछताछ करें।
उम्मीदवारों के बीच, सेल लाइनों को प्राथमिकता दें जिसके लिए कुशल क्षणिक जीन वितरण प्रोटोकॉल - ईटीआर वितरण के लिए सहायक - उपलब्ध हैं।
नोट: विभिन्न तौर-तरीकों के बीच, न्यूक्लियोफेक्शन सबसे अच्छे विकल्पों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि यह उच्च अभिकर्मक क्षमता सुनिश्चित करता है। यहां, मानव एरिथ्रोल्यूकेमिया के -562 कोशिकाओं को बीटा -2-माइक्रोग्लोबुलिन (बी 2 एम) जीन की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि की रिपोर्ट करने वाली सेल लाइन उत्पन्न करने के लिए चुना गया है (इसके बाद बी 2 एम ^{टीडीटोमेटो} के -562 कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है)।
इसके अलावा सेल लाइनों से बचने के लिए उम्मीदवारों को प्राथमिकता दें जिसमें सेल व्यवहार्यता के लिए लक्ष्य जीन आवश्यक है, क्योंकि यह संस्कृति में लक्ष्य जीन के स्थिर साइलेंसिंग के साथ कोशिकाओं के रखरखाव को बाधित करता है। यदि पहले रिपोर्ट नहीं की गई है, तो सेल प्रकार की पसंद में लक्ष्य जीन की अनिवार्यता की भावना रखने के लिए, कैस 9 न्यूक्लियस के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करके आनुवंशिक व्यवधान नियंत्रण उत्पन्न करें और जीन के पहले कोडिंग एक्सॉन में से एक को लक्षित करने वाले जीआरएनए को लक्षित करें।
नोट: आनुवंशिक व्यवधान परिभाषा के अनुसार एक स्थिर घटना है; समय के साथ बाधित कोशिकाओं का प्रतिचयन इंगित करता है कि चयनित सेल के शरीर विज्ञान के लिए लक्ष्य जीन आवश्यक है।
1. चयनित सेल लाइन में अधिमान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले लक्ष्य स्प्लिसिंग आइसोफॉर्म की पहचान करें ( बी 2 एम जीन का आइसोफॉर्म NM_004048.4 इस प्रोटोकॉल में लक्षित है)।
2. एक जीआरएनए की पहचान करें जो लक्ष्य आइसोफॉर्म के पहले कोडिंग एक्सॉन में प्रभावी ढंग से और विशेष रूप से कटौती कर सकता है (उदाहरण के लिए, चोपचोप (http://chopchop.cbu.uib.no/)³⁹, जो एक वैध और उपयोगकर्ता के अनुकूल ऑनलाइन जीआरएनए चयन उपकरण है)।
3. K-562 कोशिकाओं के लिए, न्यूक्लियोफेक्शन (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) के माध्यम से प्रति 5 × 10⁵ कोशिकाओं में एसपीकैस 9-एन्कोडिंग प्लास्मिड (एचसीएएस 9; सामग्री की तालिका देखें) के 1 μg और जीआरएनए-एन्कोडिंग प्लास्मिड (phU6-gRNA; सामग्री की तालिका देखें) के 250 ng को स्थानांतरित करें।
4. कोशिकाओं (आरपीएमआई -1640 में 5% सीओ₂ के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर के -562 कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], एल-ग्लूटामाइन, और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन [100 यू / एमएल] के साथ पूरक किया जाता है) और उत्परिवर्तन का पता लगाने वाली किट का फायदा उठाकर समय के साथ जीन व्यवधान के स्तर की निगरानी करते हैं (निर्माता के निर्देशों का पालन करें)।
रुचि के लक्ष्य जीन के ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के समरूप पुनर्संयोजन-मध्यस्थता एकीकरण के लिए एक दाता टेम्पलेट क्लोन करें (चित्रा 1)।
1. फ्लोरोफोरे अभिव्यक्ति कैसेट को एकीकृत करने के लिए लक्ष्य जीन के क्षेत्र की पहचान करें।
  नोट: ट्रांसक्रिप्शनल रूप से प्रासंगिक तत्वों को लक्षित करने से बचें, जैसे कि सीपीजी द्वीप और एच 3 के 27 एसिटिलीकरण (सक्रिय प्रमोटरों और एन्हांसर ्स का मार्कर) के लिए समृद्ध क्षेत्र। इन नियामक तत्वों को बदलना (एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को निर्देश देने के लिए ईटीआर द्वारा लक्षित किया जाना संभावित रूप से महत्वपूर्ण) रिपोर्टर सेल लाइन को लक्ष्य जीन के शारीरिक विनियमन का कम पूर्वानुमान बनाता है।
  1. यदि लक्ष्य जीन एक स्रावित प्रोटीन के लिए एन्कोड नहीं करता है, तो लक्ष्य जीन की कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए 2 ए सेल्फ-क्लीविंग पेप्टाइड के माध्यम से रिपोर्टर को लक्ष्य जीन के अंतिम कोडन में फ्यूज करें।
  2. यदि लक्ष्य जीन एक स्रावित प्रोटीन के लिए एन्कोड करता है, तो रिपोर्टर के संभावित स्राव से बचने के लिए, रिपोर्टर को लक्ष्य जीन के इनट्रोनिक क्षेत्र में रखें। स्प्लिस स्वीकर्ता साइट (एसए) के माध्यम से स्प्लिस्ड ट्रांसक्रिप्ट में रिपोर्टर का बल एकीकरण और बाद में आंतरिक राइबोसोम एंट्री सीक्वेंस (आईआरईएस) के माध्यम से अनुवाद लक्ष्य जीन की कार्यक्षमता को बाधित करता है।
2. लक्ष्य क्षेत्र में जीआरएनए काटने का चयन करने के लिए चोपचोप का उपयोग करें (यहां, बी 2 एम जीन के पहले इंट्रोन के अनुक्रम 5'-एजीजीसीटीएसीटीएजीसीसीसीसीसीएजीएजीएजी -3' को लक्षित करने के लिए एक जीआरएनए का चयन किया जाता है)।
3. जीआरएनए कट साइट के लिए एक दाता टेम्पलेट डिजाइन करें जिसमें शामिल हैं: i) एक बाएं होमोलॉजी आर्म (एन बेस जोड़े [बीपी] जीआरएनए कट साइट के ठीक ऊपर के क्षेत्र से मेल खाते हैं); ii) एक प्रमोटर-मुक्त ट्रांसजेन अभिव्यक्ति कैसेट (यहां दिखाए गए मामले में, एक एसए -3 एक्स स्टॉप कोडन-आईआरईएस-टीडी टमाटर-बीजीएच पॉली (ए) बी 2 एम जीन के पहले इंट्रोन के साथ स्प्लिसिंग का पक्ष लेता है); और iii) एक सही होमोलॉजी आर्म (जीआरएनए कट साइट के डाउनस्ट्रीम क्षेत्र से मेल खाने वाला एन बीपी)।
  नोट: होमोलोगस पुनर्संयोजन को प्रभावी ढंग से प्रेरित करने के लिए आवश्यक होमोलॉजी हथियारों की लंबाई विभिन्न सेल प्रकारों के बीच भिन्न हो सकती है (100-500 बीपी के -562 कोशिकाओं के लिए एक उचित सीमा है)।
CRISPR / Cas9 न्यूक्लियस सिस्टम और दाता टेम्पलेट को लक्ष्य सेल लाइन के अंदर वितरित करें। K-562 कोशिकाओं के लिए, spCas9-एन्कोडिंग प्लास्मिड (hCas9; सामग्री की तालिका देखें), 250 ng gRNA-एन्कोडिंग प्लास्मिड (phU6-gRNA; सामग्री की तालिका देखें), और 1 μg दाता टेम्पलेट-एन्कोडिंग प्लास्मिड प्रति 5 × 10⁵ कोशिकाओं को न्यूक्लियोफेक्शन के माध्यम से (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) के माध्यम से स्थानांतरित करें।
कोशिकाओं को कम से कम 14 दिनों के लिए कल्चर करें (के -562 कोशिकाओं के लिए) और फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके समय के साथ फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के अभिव्यक्ति स्तर की निगरानी करें (टीडीटोमेटो रिपोर्टर की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए फाइकोएरिथ्रिन (पीई) चैनल को सक्रिय करें और फ्लो साइटोमेट्री करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें)।
नोट: दाता टेम्पलेट-विशेष रूप से यदि प्लास्मिड-आधारित-में क्रिप्टिक प्रमोटर अनुक्रम हो सकते हैं, जिससे गैर-एकीकृत दाता प्रतियों से फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति हो सकती है। कोशिकाओं का संवर्धन कोशिका विभाजन द्वारा इन गैर-एकीकृत प्रतियों को कमजोर करने की अनुमति देता है और अंत में केवल लक्ष्य जीनोम में एकीकृत दाता प्रतियों से रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को बनाए रखता है।
एकल-कोशिका स्तर पर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के माध्यम से रिपोर्टर-पॉजिटिव कोशिकाओं को क्लोन करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, टीडीटोमेटो रिपोर्टर की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए पीई चैनल को सक्रिय करें और 96-वेल प्लेट के प्रति अच्छी तरह से एकल टीडीटमाटर-पॉजिटिव के -562 कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
संस्कृति में सेल विस्तार (आमतौर पर के -562 कोशिकाओं के लिए 20-30 दिन) पर, पीसीआर द्वारा रिपोर्टर-पॉजिटिव क्लोन स्क्रीन करने के लिए लक्षित स्थान के अंदर रिपोर्टर कैसेट के द्वि-एलील एकीकरण वाले एक का चयन किया जाता है।
नोट: यह रिपोर्टर अभिव्यक्ति को अधिकतम करता है और ईटीआर उपचार पर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा रिपोर्टर-व्यक्त और रिपोर्टर-मौन कोशिकाओं के बीच आगे के समाधान की सुविधा प्रदान करता है।
1. डीएनए निष्कर्षण किट (निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए) का उपयोग करके प्रति रिपोर्टर-पॉजिटिव क्लोन 1 ×^{10 5} कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालें।
2. पीसीआर प्रवर्धन किट के निर्देशों का पालन करते हुए बी2एम लक्ष्य क्षेत्र को आगे (5'-जीटीएटीटीजीसीटीजीजीटीएजीटीएजीटीएजीटी-3') प्राइमरों के साथ बढ़ाएं। प्राइमरों की इस जोड़ी के लिए एनीलिंग तापमान 47.7 डिग्री सेल्सियस है जिसमें टैक-आधारित डीएनए पोलीमरेज़ और 0.5 μM प्राइमर सांद्रता है।
3. 1% एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए) का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण करें। क्लोन के लिए स्क्रीन जो बी 2 एम लक्ष्य लोकस (3,413 बीपी) में टीडीटमाटर के एकीकरण से संबंधित बैंड को दिखाती है, जंगली प्रकार के लक्ष्य लोकस (1,027 बीपी) से संबंधित बैंड के बिना।

2. सीआरआईएसपीआर/डीसीएएस 9-आधारित लक्ष्य जीन के एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के लिए जीआरएनए डिजाइन करना।

यूसीएससी जीनोम ब्राउज़र⁴⁰ में लक्ष्य जीन ब्राउज़ करें और संभावित रूप से इसकी ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को विनियमित करने वाले क्षेत्रों के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को निकालें, जैसे कि सीपीजी द्वीप और एच 3 के 27 एसिटिलीकरण (सक्रिय प्रमोटरों और एन्हांसर का मार्कर) के लिए समृद्ध साइटें।
नोट: हाल के एक अध्ययन के अनुसार, सबसे अच्छा लक्ष्यीकरण क्षेत्र लक्ष्य जीन³² के प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल पर केंद्रित 1 किलोबेस (केबी) विंडो है।
चयनित अनुक्रमों को चोपचोप ऑनलाइन टूल में पेस्ट करें और पुनः प्राप्त किए जाने वाले जीआरएनए के उद्देश्य के रूप में दमन का चयन करें। रुचि के आनुवंशिक अनुक्रम पर मैप किए गए जीआरएनए की एक सूची प्रदान करने के लिए चोपचोप की प्रतीक्षा करें और ऑफ-टारगेट मैचों की संख्या और अनुमानित ऑन-टारगेट दक्षता दोनों पर विचार करते हुए स्कोर के अनुसार सूचीबद्ध करें (चित्रा 2)।
प्रति लक्ष्य अनुक्रम में कम से कम 10 जीआरएनए का चयन करें। यदि संभव हो, तो पूरे क्षेत्र में फैले जीआरएनए का चयन करने का प्रयास करें, जिसमें पूरे जीनोम में अन्य इंट्राजेनिक अनुक्रमों के साथ कोई पूर्ण मेल नहीं है।

3. रिपोर्टर सेल लाइन में CRISPR / dCAS 9-आधारित ETR की सरणी क्षणिक डिलीवरी।

लक्ष्य सेल लाइन के लिए पहले रिपोर्ट किए गए ट्रांसजीन डिलीवरी सिस्टम में से, केवल क्षणिक ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की अनुमति देने वालों को चुनें, वितरण दक्षता को अधिकतम करें, और सेल हेरफेर से संबंधित विषाक्तता को कम करें। के -562 कोशिकाओं के मामले में, प्लास्मिड और एमआरएनए न्यूक्लियोफेक्शन दोनों की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, जिसमें प्लास्मिड उत्पादन तकनीकी रूप से आसान और सस्ता विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।
अनुभाग 2 में चयनित जीआरएनए और सीआरआईएसपीआर/डीसीएएस9-आधारित ईटीआर दोनों को पसंद की ट्रांसजेन वितरण प्रणाली में क्लोन करें। प्लास्मिड डीएनए में ईटीआर क्लोनिंग के लिए प्रोटोकॉल के लिए निम्नलिखित चरण देखें।
नोट: dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, और dCas9: DNMT3L³⁰ के लिए प्लास्मिड अलग से एन्कोडिंग Addgene पर उपलब्ध नहीं हैं। उन्हें प्लास्मिड पीएसी 154-डुअल-डीसीएएस 9वीपी160-एसजीएक्सप्रेशन⁴¹ ( सामग्री की तालिका देखें) से वीपी 160 ट्रांस-एक्टिवेटर को या तो केआरएबी, डीएनएमटी 3 ए या डीएनएमटी 3 एल डोमेन-कोडिंग अनुक्रम³⁰ के साथ बदलकर क्लोन किया गया था। ऑल-इन-वन ईटीआर के लिए एक प्लास्मिड एन्कोडिंग, जिसे CRISPRoff-v2.1³² कहा जाता है, उपलब्ध है ( सामग्री की तालिका देखें)।
1. रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं (निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए) में ईटीआर के लिए प्लास्मिड एन्कोडिंग को बदलें। प्रतिबंध एंजाइम पाचन और सेंगर अनुक्रमण द्वारा ईटीआर-असर प्लास्मिड की उपस्थिति के लिए कॉलोनियों को स्क्रीन करें, और अंत में प्लास्मिड डीएनए मिडिप्रेप उत्पादन (निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए) के लिए सकारात्मक कॉलोनियों में से एक चुनें।
2. पीएचयू 6-जीआरएनए रीढ़ के अंदर जीआरएनए का क्लोन करें (चित्रा 3)।
  1. आणविक जीव विज्ञान डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, सिलिको में 25 एनटी-लंबे ऑलिगो उत्पन्न करने के लिए प्रोटोस्पेसर (चयनित जीआरएनए के पहले चर 20 न्यूक्लियोटाइड [एनटी]) के अपस्ट्रीम 5'-सीएसीसीजी -3' अनुक्रम को जोड़ें, जिसे एसजीएफडब्ल्यू कहा जाता है।
  2. इसी तरह, चयनित जीआरएनए के प्रोटोस्पेसर के रिवर्स पूरक के ऊपर 5'-एएएसी -3' अनुक्रम और इसके डाउनस्ट्रीम में 5'-सी-3' अनुक्रम जोड़ें ताकि 25 एनटी-लंबा ऑलिगो उत्पन्न हो सके जिसे एसजीआरवी कहा जाता है।
  3. SGFW और SGrv दोनों अनुक्रमों को नमक-मुक्त एकल-फंसे हुए डीएनए ऑलिगोस के रूप में ऑर्डर करें, 100 μM पर पानी में फिर से निलंबित कर दें।
  4. प्रत्येक ऑलिगो के 1 μL को 2 μL एनीलिंग बफर (10 mM Tris [pH 7.5-8.0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) और 16 μL पानी में जोड़ें।
  5. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर शुरू करने के लिए प्रोग्राम किए गए थर्मोसाइकलर में समाधान रखकर ऑलिगो एनीलिंग करें। फिर, धीरे-धीरे 45 मिनट में 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  6. 99 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ एनाल्ड ऑलिगोस के 1 μL को पतला करें, और फिर इस कमजोर पड़ने के 1 μL को 50 ng phU6-gRNA प्लास्मिड के साथ मिलाएं जो पहले बीएसएआई प्रतिबंध एंजाइम के साथ पच गया था (पाचन और बंधाव प्रक्रिया के लिए बीएसएआई और लिगेज किट विक्रेताओं के निर्देशों का पालन करें)।
  7. रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं के 20 μL को 2 μL बंधाव उत्पाद के साथ बदलें (परिवर्तन प्रक्रिया के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें)।
  8. प्लास्मिड डीएनए मिनिप्रेप उत्पादन के लिए कई कॉलोनियों को चुनें (विक्रेता के निर्देशों का पालन करें) और यू 6 प्रमोटर 5'-जीएजीजीजीसीसीटीटीसीसीएटीसीएटीटीटी -3' से मेल खाने वाले निम्नलिखित प्राइमर के साथ सेंगर अनुक्रमण द्वारा प्रोटोस्पेसर की सफल क्लोनिंग को नियंत्रित करें।
  9. प्लास्मिड डीएनए मिडिप्रेप उत्पादन के लिए सकारात्मक कॉलोनियों में से एक चुनें (निर्माता के निर्देशों का पालन करें)।
चयनित जीआरएनए और CRISPR / dCas9-आधारित ETR को रिपोर्टर सेल लाइन में सरणी में वितरित करें (प्रति शर्त एक विशिष्ट gRNA) (चित्रा 3)।
नोट: एक प्रतिनिधि मामले के रूप में, dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, dCas9: DNMT3L, और B2M^TdTomato K-562 कोशिकाओं में B2M CPG द्वीप को लक्षित करने वाले gRNA के लिए प्लास्मिड एन्कोडिंग के न्यूक्लियोफेक्शन के लिए वर्कफ़्लो निम्नलिखित चरणों में दिखाया गया है।
1. प्रत्येक dCas9: KRAB-, dCas9: DNMT3A-, और dCas9: DNMT3L-एन्कोडिंग प्लास्मिड के 500 ng वाले अलग-अलग ट्यूब तैयार करें, लेकिन जीआरएनए के परीक्षण के लिए भिन्न (प्रति ट्यूब जीआरएनए-एन्कोडिंग प्लास्मिड का 125 एनजी)। मॉक-उपचारित नमूने के रूप में एक जीआरएनए- और ईटीआर-मुक्त न्यूक्लियोअभिकर्मक स्थिति शामिल करें। प्रति नमूना कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृति के साथ स्क्रीन निष्पादित करें।
2. पेलेट 5 × 10⁵ बी 2 एम^{टीडीटोमेटो} के -562 कोशिकाएं प्रति ट्यूब और उन्हें प्लास्मिड मिश्रण (निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए) के साथ न्यूक्लियोफेक्ट करें।
3. पहले से गर्म आरपीएमआई -1640 स्तनधारी सेल कल्चर मीडिया के 200 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें इनक्यूबेटर में वापस रखें।

4. समय के साथ लक्ष्य जीन की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि का विश्लेषण करना

ईटीआर के वितरण के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर मौन कोशिकाओं के प्रतिशत को मापने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करें (चित्रा 4)। रिपोर्टर-नकारात्मक कोशिकाओं की सीमा निर्धारित करने के लिए जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) कोशिकाओं का उपयोग करें- फ्लोरोफोर-कोडिंग अनुक्रम को सहन नहीं करते हैं। रिपोर्टर-पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए गेट सेट करने के लिए मॉक-ट्रीटेड नमूने का उपयोग करें।
नोट: जैसा कि चरण 1.3 में सुझाया गया है, प्रयोग में आनुवंशिक व्यवधान नियंत्रण शामिल करें। यह सीआरआईएसपीआर वितरण दक्षता और लक्ष्य जीन से वंचित कोशिकाओं की फिटनेस दोनों की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है; समय के साथ ट्रांसक्रिप्शनल साइलेंसिंग और आनुवंशिक व्यवधान दोनों के नुकसान को सेल प्रकार की पसंद में लक्ष्य जीन की अनिवार्यता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। साइलेंसिंग की तीव्र और दीर्घकालिक दक्षता दोनों का संकेत प्राप्त करने के लिए अल्पकालिक (दिन 3, दिन 7, दिन 10) और दीर्घकालिक (दिन 21, दिन 35) समय बिंदुओं को शामिल करें।
दीर्घकालिक साइलेंसिंग दक्षता के मामले में शीर्ष तीन जीआरएनए की पहचान करें। उन नमूनों में स्थिर रूप से बनाए गए रिपोर्टर-नकारात्मक उप-जनसंख्या का चयन करने के लिए एफएसीएस का उपयोग करें। इसके अलावा, बाद के विश्लेषणों में उचित तुलना की अनुमति देने के लिए उन्हें परीक्षण नमूनों के समान उपचार के तहत रखने के लिए थोक मॉक-उपचारित नमूनों का एफएसीएस करें।

5. आरएनए-सेक और मिथाइलेटेड डीएनए इम्यूनोप्रेसिपेशन (एमईडीआईपी)-सेक द्वारा ईटीआर उपचार की विशिष्टता का मूल्यांकन करना।

ईटीआर डिलीवरी पर किसी भी अंतिम जीनोम-वाइड ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का मूल्यांकन करने के लिए आरएनए-सेक का उपयोग करें।
1. तीन शीर्ष प्रदर्शन करने वाले जीआरएनए और मॉक-उपचारित कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए नमूनों की रिपोर्टर-मौन उप-आबादी दोनों के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके आरएनए निकालें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके आरएनए की गुणवत्ता और एकाग्रता का आकलन करें।
2. आरएनए-सेक पुस्तकालयों (निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए) की तैयारी के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके आरएनए विखंडन, रेट्रोट्रांसक्रिप्शन और लाइब्रेरी की तैयारी करें।
3. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और डिजिटल वैद्युतकणसंचलन के साथ संगत गुणवत्ता नियंत्रण उपकरणों का उपयोग करके पुस्तकालय परिमाणीकरण और गुणवत्ता नियंत्रण करें।
4. निर्माता के निर्देश का पालन करते हुए अगली पीढ़ी के अनुक्रमक पर अनुक्रम पुस्तकालय, 100 बीपी युग्मित-अंत प्रोटोकॉल के साथ और औसतन 45 एम रीड / सैंपल पर लक्ष्य रखें।
5. रीड टैग को उपयुक्त संदर्भ जीनोम में संरेखित करें और प्रतिलेख अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें। टीडीटमाटर अनुक्रम पर संरेखण करें और इसे अलग से निर्धारित करें।
  नोट: यहाँ, स्टार संरेखक (v 2.3.0)⁴³, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर के साथ, Rsubread पैकेज⁴⁴ के साथ युग्मित किया जाता है।
6. प्रकाशित^{सर्वोत्तम प्रथाओं के} अनुसार आरएनए-सेक डेटा का विश्लेषण करें।
  बायोकंडक्टर पैकेज एजआर⁴⁶ का उपयोग यहां किया जाता है, जो कम-व्यक्त जीन को त्यागने के लिए कम से कम तीन नमूनों में कम से कम एक गिनती प्रति मिलियन (सीपीएम) का फ़िल्टर लागू करता है। वैकल्पिक रूप से, एजआर में फ़िल्टरबायएक्सप्रेस फ़ंक्शन का उपयोग किया जा सकता है।
7. एक नकारात्मक द्विपद सामान्यीकृत लॉग-रैखिक मॉडल का उपयोग करके अंतर जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करें एजआर (फ़ंक्शन जीएलएमफिट)⁴⁷। अलग-अलग विनियमित जीन को बनाए रखने के लिए समायोजित पी मानों (बेंजामिनी-होचबर्ग [बीएच] सुधार) पर 0.01 की सीमा निर्धारित करें।
एमईडीआईपी-सेक द्वारा ईटीआर की किसी भी अंतिम ऑफ-टारगेट सीपीजी मिथाइलेशन गतिविधि का मूल्यांकन करें।
1. शीर्ष तीन जीआरएनए और मॉक-उपचारित कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए नमूनों की रिपोर्टर-मौन उप-आबादी दोनों के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए) का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निकालें।
2. एक अल्ट्रासोनिकेटर और निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए के 500 एनजी को सोनिकेट करें: ड्यूटी: 20%; पीआईपी: 175; प्रति विस्फोट चक्र: 200; समय: 40 सेकंड।
3. MeDIP-seq के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार करें (निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए)।
4. एडाप्टर लिगेशन चरण के बाद, फ्लोरोमेट्रिक परख द्वारा पुस्तकालयों की मात्रा निर्धारित करें और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय परिमाणीकरण किट (निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए) का उपयोग करके क्यूपीसीआर द्वारा बंधाव दक्षता की जांच करें।
5. तकनीकी पूर्वाग्रहों को कम करने के लिए यादृच्छिक रूप से चयनित पुस्तकालयों को मिलाकर लाइब्रेरी पूल प्राप्त करें। पूल को संतुलित करने के लिए प्रत्येक पुस्तकालय के लिए एक समान पुस्तकालय राशि (एनजी) का उपयोग करें। प्रत्येक पूल में, किट में प्रदान किए गए मिथाइलेटेड और अनमेथिलेटेड स्पाइक-इन कंट्रोल डीएनए जोड़ें। नियंत्रण उद्देश्यों के लिए, पुस्तकालय की 10% मात्रा रखें, जिसे "इनपुट" के रूप में लेबल किया गया है और इम्यूनोप्रेसिपिटेट नहीं किया गया है। एमईडीआईपी-सेक किट में प्रदान किए गए 5-मिथाइलसाइटोसिन के खिलाफ निर्देशित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके पुस्तकालय के शेष 90% पर इम्यूनोप्रेसिपेशन करें।
6. निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए 5-मिथाइलसाइटोसिन इम्यूनोप्रेसिपेशन उत्पाद के शुद्धिकरण के लिए किट का उपयोग करके समृद्ध और इनपुट पुस्तकालयों को शुद्ध करें।
7. किट के साथ प्रदान किए गए प्राइमरों का उपयोग करके नियंत्रण में आंतरिक स्पाइक पर मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर करके संवर्धन दक्षता का मूल्यांकन करें। प्रत्येक इम्यूनोप्रेसिपेशन (आईपी) के लिए, एमईडीआईपी के चक्र थ्रेशोल्ड (सीटी) मूल्यों और क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया से प्राप्त इनपुट अंशों का उपयोग करके मिथाइलेटेड और अनमेथिलेटेड डीएनए की वसूली से संवर्धन विशिष्टता की गणना करें (समीकरण 1 और 2 देखें):
  (1)
  (2)
  नोट: यदि विशिष्टता मान ≥0.95 हैं तो आईपी लाइब्रेरी को सफल मानें।
8. निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए, MeDIP-seq लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करके पुस्तकालयों को बढ़ाएं, और उत्पाद का परिमाणीकरण और पुस्तकालय आकार वितरण विश्लेषण करें।
9. अगली पीढ़ी के अनुक्रमकों पर लाइब्रेरी अनुक्रमण करें। 100 बीपी की पढ़ने की लंबाई के साथ युग्मित-अंत अनुक्रमण का उपयोग करें, जिसका लक्ष्य औसतन 30 एम रीड / नमूना है।
10. अनुक्रमण रीड टैग को बीडब्ल्यूए (वी 0.7.5 या उच्चतर) 48 का उपयोग करके उपयुक्त संदर्भ जीनोम (जैसे, एचजी ³⁸) में संरेखित करें और फिर एमएसीएस (वी 2.0.10 या उच्चतर) ⁴⁹ का उपयोग करके चोटियों की पहचान करें, जिससे व्यापक चोटियों (-स्लोकल = 0,-लोकल = 500000) की पहचान हो सके।
11. BEDTools के मल्टीइंटरसेक्शन टूल⁵⁰ का उपयोग करके विभिन्न नमूनों से क्षेत्रों का एक सामान्य सेट बनाएं, जिससे क्लस्टरिंग विकल्प सक्षम हो सके।
12. BEDTools के मल्टीकोव का उपयोग करके अंतिम क्षेत्र सूची पर प्रति-नमूना कवरेज की गणना करें, डुप्लिकेट रीड को छोड़ दें।
13. एजआर का उपयोग करके मैट्रिक्स गिनती का विश्लेषण करें। कम समृद्ध क्षेत्रों को त्यागने के लिए कम से कम तीन नमूनों में कम से कम एक गिनती प्रति मिलियन (सीपीएम) का फ़िल्टर लागू करें।
  नोट: वैकल्पिक रूप से, एजआर में फ़िल्टरबायएक्सप्रेस फ़ंक्शन का उपयोग किया जा सकता है।
14. एजआर (फ़ंक्शन जीएलएमफिट) में लागू सामान्यीकृत लॉग-रैखिक मॉडल को अपनाकर अंतर मिथाइलेशन की पहचान करें और क्षेत्र-वार जीसी-सामग्री को सही करने के लिए सशर्त मात्रा सामान्यीकरण⁵¹ का उपयोग करके सामान्यीकरण करें। बीएच समायोजित पी मानों पर 0.01 की सीमा लागू करके विभेदक मिथाइलेटेड क्षेत्रों का चयन करें। दोहराए गए अनुक्रमों का विश्लेषण निम्नानुसार करें।
  नोट: विकल्पों और मापदंडों (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html) की पूरी सूची के लिए edgeR उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका देखें।
  1. मामूली पी मान <0.01 के लिए MeDIP-seq परिणामों को फ़िल्टर करें और क्षेत्रों के दो सेट बनाएं: पहले सेट में logFC >1 वाले क्षेत्रों का चयन करें और दूसरे सेट में logFC <-1 वाले क्षेत्रों का चयन करें।
  2. चुने हुए जीनोम के लिए रिपीटमास्कर एनोटेशन को बेड फ़ाइल के रूप में पुनर्प्राप्त करें और प्रत्येक सेट में तत्वों की संख्या की गणना करें। गणना को प्रत्येक डेटासेट के लिए क्षेत्रों की संख्या पर अनुपात के रूप में परिवर्तित करें।
  3. मिथाइलोम का अनुपात निकालें जो दोहराव के प्रत्येक वर्ग को ओवरलैप करता है और किसी भी महत्वपूर्ण संवर्धन का पता लगाने के लिए ची-स्क्वायर परीक्षण करता है।
मूल्यांकन करें कि क्या ईटीआर- और मॉक-उपचारित नमूनों के बीच अलग-अलग रूप से स्थानांतरित या अलग-अलग मिथाइलेटेड क्षेत्रों को सिलिको-अनुमानित ऑफ-टारगेट जीआरएनए बाइंडिंग में मैप किया गया है।
1. CRISPR डिज़ाइन सूट⁵² को ऑफ-टारगेट जीआरएनए बाइंडिंग पूर्वानुमान उपकरण के रूप में उपयोग करें।
2. प्रत्येक कथित ऑफ-टारगेट क्षेत्र के लिए, निकटतम प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल (टीएसएस) और निकटतम मिथाइलेटेड क्षेत्र को देखें। एक सच्चे ऑफ-टारगेट प्रभाव के रूप में एक क्षेत्र जो या तो एफडीआर <0.01 के साथ विनियमित जीन से जुड़ा हुआ है और टीएसएस की दूरी 10 केबी से कम है, या एफडीआर <0.01 के साथ विनियमित मिथाइलेटेड क्षेत्र और 1 केबी से कम दूरी है।
3. जीआरएनए के बीच सबसे विशिष्ट की पहचान करने के लिए मॉक-ट्रीटेड नमूनों (चित्रा 5) की तुलना में तीन शीर्ष प्रदर्शन करने वाले जीआरएनए में से प्रत्येक के साथ इलाज किए गए नमूनों में ट्रांसक्रिप्शनल रूप से परिवर्तित या ओवरमेथिलेटेड क्षेत्रों की संख्या और विशेषताओं की पहचान करें। लक्ष्य कोशिकाओं के शरीर विज्ञान पर एक ऑफ-टारगेट साइट के संभावित प्रभाव को निम्नलिखित क्रम में रैंक करें (सबसे अधिक प्रभाव से कम प्रभाव तक):
  i) इंट्राजेनिक, नियामक क्षेत्र-शारीरिक रूप से व्यक्त जीन
  ii) इंट्राजेनिक, एक्सोनिक क्षेत्र-शारीरिक रूप से व्यक्त जीन।
  iii) इंट्राजेनिक, इनट्रोनिक क्षेत्र-शारीरिक रूप से व्यक्त जीन।
  iv) इंट्राजेनिक, नियामक क्षेत्र-व्यक्त जीन नहीं।
  v) इंट्राजेनिक, एक्सोनिक क्षेत्र-व्यक्त जीन
  vi) इंट्राजेनिक, इनट्रोनिक क्षेत्र-व्यक्त जीन नहीं।
  vii) इंटरजेनिक क्षेत्र

Representative Results

सीआरआईएसपीआर/कैस 9 प्रणाली (उदाहरण के लिए, के -562 कोशिकाओं के मामले में प्लास्मिड न्यूक्लियोफेक्शन द्वारा) के साथ युग्मित लक्ष्य लोकस में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के समरूप पुनर्संयोजन-मध्यस्थता एकीकरण के लिए एक दाता टेम्पलेट के वितरण पर, रिपोर्टर-पॉजिटिव कोशिकाएं उपचारित नमूने में दिखाई देती हैं (चित्रा 1, नीचे)। यदि ऐसा नहीं होता है, तो दाता टेम्पलेट और CRISPR / Cas9 अभिकर्मकों दोनों के डिजाइन और क्लोनिंग की सटीकता को फिर से जांचें। यदि पुष्टि की जाती है, तो अभिकर्मकों की खुराक और वितरण प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने का प्रयास करें।

एक बार रिपोर्टर सेल लाइन प्राप्त हो जाने के बाद, लक्ष्य जीन के प्रमोटर / एन्हांसर अनुक्रमों का चयन करें और मिलान जीआरएनए का एक पैनल डिजाइन करें। जीआरएनए अनुक्रमों की पहचान करने और अनुमानित दक्षता और विशिष्टता के संदर्भ में उन्हें रैंक करने के लिए चोपचोप जैसे सिलिको भविष्यवाणी उपकरणों में उपयोग करें (चित्रा 2)। यदि कोई जीआरएनए पुनर्प्राप्त नहीं किया जाता है, तो लक्ष्य अनुक्रम में कैननिकल कैस 9 प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) (5'-एनजीजी -3') की उपस्थिति को नियंत्रित करें। यदि कोई पीएएम अनुक्रम मौजूद नहीं हैं, तो वैकल्पिक पीएएम-स्वतंत्र सीएएस 9 वेरिएंट (अभी तक इन वेरिएंट के साथ प्रकाशित कोई ईटीआर नहीं) के आधार पर ईटीआर पर शिफ्ट करने या वैकल्पिक डीएनए बाइंडिंग डोमेन प्लेटफॉर्म पर स्विच करने पर विचार करें, जैसे कि जेडएफपी⁵³ या टीएएलई³⁰। हालांकि, यदि केवल कम अनुमानित प्रभावकारिता / विशिष्टता वाले जीआरएनए को पुनर्प्राप्त किया जाता है, तो 1) इन कम गुणवत्ता वाले जीआरएनए का परीक्षण करने या 2) बेहतर जीआरएनए की तलाश में लक्ष्य डीएनए अनुक्रम का विस्तार करने पर विचार करें। जीआरएनए के साथ ट्रिपल ईटीआर संयोजन (या सीआरआईएसप्रोफ; वी 2.1) के क्षणिक वितरण पर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के लिए अनुदैर्ध्य प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण करें, अक्सर तीव्र विश्लेषण में रिपोर्टर दमन में एक शिखर का अवलोकन करें, जो तब समय के साथ ईटीआर-एन्कोडिंग प्लास्मिड के माइटोटिक कमजोर पड़ने के कारण कम से कम आंशिक रूप से पुन: अवशोषित हो जाता है (चित्रा 4 सी; चित्र 4 सी)). यदि ईटीआर / जीआरएनए संयोजन प्रभावी रूप से लक्षित स्थान पर सीपीजी मिथाइलेशन जमा करता है, तो रिपोर्टर का स्थायी दमन उपचारित कोशिकाओं के एक बड़े हिस्से में होगा (चित्रा 4 सी)। विभिन्न जीआरएनए परिवर्तनीय दीर्घकालिक साइलेंसिंग दक्षता दिखा सकते हैं (चित्रा 4 बी, सी)।

जीनोम-व्यापक विशिष्टता आकलन के लिए, कोशिकाओं के बीच विभेदक मिथाइलेटेड क्षेत्रों की पहचान करने के लिए MeDIP-seq का उपयोग करें जिसमें लक्ष्य लंबे समय तक चुप और अनुपचारित कोशिकाओं रहा है। आदर्श रूप से, एक अत्यधिक विशिष्ट जीआरएनए केवल लक्ष्य स्थल पर डी नोवो सीपीजी मिथाइलेशन के शिखर को प्रेरित करेगा (चित्रा 5)। यदि नहीं, तो कोई भी ऑन-टारगेट दक्षता सूची में कम स्थान पर रखे गए जीआरएनए की ऑफ-टारगेट गतिविधि को चिह्नित करने पर विचार कर सकता है।

चित्रा 1: होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत द्वारा मानव बी 2 एम जीन के नियामक तत्वों के तहत एक टीडीटोमैटो रिपोर्टर का एकीकरण। शीर्ष: CRISPR / Cas9-प्रेरित होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत द्वारा मानव B2M जीन के पहले इंट्रोन में एक tdTomato फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को एकीकृत करने की रणनीति के योजनाबद्ध। नीचे: बी 2 एम जीन के पहले इंट्रोन में टीडीटोमेटो रिपोर्टर के पूर्व और बाद के एकीकरण के -562 कोशिकाओं के प्रतिनिधि डॉट प्लॉट। संक्षेप: एचए = होमोलॉजी आर्म; एचडीआर = होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत; आईआरईएस = आंतरिक राइबोसोम प्रवेश स्थल; पीए = बीजीएच पॉली (ए); एसए = स्प्लिस स्वीकर्ता साइट; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; 3XSTOP = तीन इन-टेंडम स्टॉप कोडन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2: बी 2 एम जीन के सीपीजी द्वीप को लक्षित करने वाले जीआरएनए की सिलिको पहचान में, अनुमानित दक्षता और विशिष्टता के लिए रैंक किया गया। चोपचोप का आउटपुट इंटरफ़ेस बी 2 एम जीन के प्रमोटर अनुक्रम में एम्बेडेड सीपीजी द्वीप को लक्षित करने वाले जीआरएनए को दर्शाता है, जो 0 (एमएम 0), 1 (एमएम 1), 2 (एमएम 2), या 3 (एमएम 3) बेमेल के साथ ऑफ-टारगेट अनुक्रमों की संख्या और अनुमानित ऑन-टारगेट दक्षता दोनों के लिए रैंक किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3: डीसीएएस 9 ईटीआर-मध्यस्थता एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के लिए जीआरएनए की क्लोनिंग और सरणी न्यूक्लियोफेक्शन। शीर्ष: मानव यू 6-जीआरएनए में प्लास्मिड व्यक्त करने वाले ऑलिगो-मध्यस्थता प्रोटोस्पेसर क्लोनिंग। नीचे: K-562^B²^{M/tdटमाटर} कोशिकाओं में प्लास्मिड न्यूक्लियोफेक्शन द्वारा CRISPR/dCas9-आधारित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के लिए B2M-लक्ष्यीकरण gRNA की सरणी स्क्रीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4: जीआरएनए के लिए स्क्रीन प्रभावी रूप से बी 2 एम जीन के दीर्घकालिक साइलेंसिंग को प्रेरित करती है। (ए) शीर्ष: बढ़े हुए क्षेत्र में दर्शाए गए बी 2 एम ^{टीडीटमाटर} जीन के योजनाबद्ध, जीआरएनए के साथ जटिल डीसीएएस 9-आधारित ईटीआर के बंधन का सापेक्ष क्रम और अभिविन्यास। नीचे: बी 2 एम^{टीडीटोमेटो} के -562 कोशिकाओं के प्रतिनिधि डॉट प्लॉट या तो पहले (बाएं) या बाद में (दाएं) ईटीआर साइलेंसिंग। जीआरएनए के लिए प्लास्मिड एन्कोडिंग और ट्रिपल डीसीएएस 9: केआरएबी + डीसीएएस 9: डी 3 ए + डीसीएएस 9: डी 3 एल संयोजन के साथ 30 दिनों के पोस्ट-अभिकर्मक पर विश्लेषण। (बी) के-562 बी2एम^{टीडीटोमैटो} कोशिकाओं में बी2एम के सीपीजी द्वीप (शीर्ष योजनाबद्ध में लाल तीर जीआरएनए के अभिविन्यास को इंगित करते हैं) को लक्षित करने वाले संकेतित जीआरएनए (या तो पूल में या व्यक्तिगत जीआरएनए के रूप में) की साइलेंसिंग गतिविधि। डेटा टीडीटमाटर-नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है (एसईएम ± औसत; एन = प्रत्येक उपचार स्थिति के लिए चार स्वतंत्र अभिकर्मक)। (सी) ट्रिपल ईटीआर संयोजन और संकेतित बी 2 एम सीपीजी द्वीप-लक्ष्यीकरण जीआरएनए या मॉक (जीआरएनए- और ईटीआर-मुक्त अभिकर्मक) को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ अभिकर्मक पर बी 2 एम ^{टीडी टमाटर} के -562 कोशिकाओं का समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण। डेटा टीडीटमाटर-नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है (एसईएम ± औसत; एन = प्रत्येक उपचार स्थिति के लिए तीन स्वतंत्र अभिकर्मक)। अप्रकाशित डेटा. पैनल ए और बी अमाबिल एट अल ^.30 से अनुकूलित। संक्षेप: सीजीआई = सीपीजी द्वीप; आईआरईएस = आंतरिक राइबोसोम प्रवेश स्थल; पीए = बीजीएच पॉली (ए); एसए = स्प्लिस स्वीकर्ता साइट; एसडी = स्प्लिस डोनर साइट; टीएसएस = प्रतिलेखन प्रारंभ साइट; यूटी = असंक्रमित; 3XSTOP = 3 इन-टेंडम स्टॉप कोडन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 5: आरएनए-सेक और एमईडीआईपी-सेक द्वारा ईटीआर विशिष्टता का जीनोम-व्यापी विश्लेषण। बाएं: नकली उपचारित B2M^tdTomata K-562 कोशिकाओं और कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना ट्रिपल dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, dCas9: DNMT3L ETR संयोजन और B2M जीन के CPG द्वीप को लक्षित करने वाले जीआरएनए के साथ इलाज किया जाता है। मान मैप किए गए रीड के प्रति किलोबेस प्रति मिलियन (आरपीकेएम) रीड के लॉग 2 में व्यक्त किए जाते हैं। काले बिंदु सभी स्थितियों में तुलनीय स्तरों पर व्यक्त जीन का प्रतिनिधित्व करते हैं; पीले घेरे एफडीआर <0.01 के तहत अलग-अलग विनियमित जीन का प्रतिनिधित्व करते हैं; लाल सर्कल B2M-IRES-tdTomato प्रतिलेख का प्रतिनिधित्व करता है। ऊपर दाईं ओर: सर्कोस प्लॉट में मॉक-ट्रीटेड बी 2 एम^{टीडीटोमेटो} के -562 कोशिकाओं (नीले) या ट्रिपल डीसीएएस 9: केआरएबी, डीसीएएस 9: डीएनएमटी 3 ए, डीसीएएस 9: डीएनएमटी 3 एल ईटीआर संयोजन और बी 2 एम जीन (हरे) के सीपीजी द्वीप (सीजीआई) को लक्षित करने वाले जीआरएनए के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के पूरे जीनोम एमईडीआईपी-सेक प्रोफाइल दिखाए गए हैं। नीचे दाएं: संकेतित नमूनों में बी 2 एम^{टीडीटोमेटो} लोकस की मिथाइलेशन स्थिति दिखाई गई है। प्रत्येक ढेर में तीन प्रतिकृतियों का प्रतिनिधित्व किया जाता है; गॉसियन विंडो का उपयोग करके संरेखित रीड के ढेर को चिकना किया गया था। यह आंकड़ा अमाबिल एट अल ^.30 से अनुकूलित किया गया था। संक्षिप्त नाम: टीएसएस = प्रतिलेखन प्रारंभ साइट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग उन विकारों के इलाज के लिए एक आशाजनक समाधान का प्रतिनिधित्व कर सकती है जो स्थायी जीन निष्क्रियता से लाभान्वित हो सकते हैं, जिसमें गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन¹, संक्रामक रोग², और विकृति के कारण होने वाली बीमारियां शामिल हैं जिनमें एक जीन को चुप कराने से या तो दूसरे जीन में विरासत में मिले दोष की भरपाई हो सकती है³ या दत्तक सेल थेरेपी की पूरी क्षमता को उजागर किया जा सकता है^।⁵. क्रोमैटिन स्तर पर कार्य करके और कोशिका 7,30,32 द्वारा स्वतः प्रचारित होने से, एपिजेनेटिक साइलेंसिंग लक्ष्य जीन के डीएनए अनुक्रम के विषाक्त परिवर्तनों (जैसे, क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था) और लक्ष्य के आंशिक, क्षणिक साइलेंसिंग से बच सकती है, जो क्रमशः कृत्रिम न्यूक्लियस-आधारित जीन विघटन 8,34,35 और आरएनएआई-आधारित वध ³³ की सीमाएं हैं।

किसी भी एपिजेनेटिक साइलेंसिंग प्रोटोकॉल में प्रमुख प्रारंभिक चरणों में से एक ईटीआर को निर्देशित करने के लिए लक्ष्य जीन पर उचित स्थिति की पहचान करना है जो लक्ष्य की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को बंद करने के लिए आवश्यक दमनकारी एपिजेनेटिक निशान जमा करेगा। विभिन्न ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट-समीपस्थ और -डिस्टल नियामक तत्व किसी दिए गए मानव जीन⁵⁴ के ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट का समर्थन करने के लिए सहमत हो सकते हैं। इसके अलावा, प्रोग्राम करने योग्य डीएनए^{बाइंडिंग प्रौद्योगिकियों की} बढ़ती संख्या के लिए प्रति विशिष्ट नियामक तत्व के विभिन्न लक्ष्य साइटों की पहचान की जा सकती है। इसलिए, प्रोटोकॉल, जैसे कि इंजीनियर सेल लाइनों में यहां वर्णित है, का उपयोग व्यक्तिगत लक्ष्य साइटों और / या जीनोमिक क्षेत्रों को नामांकित करने के लिए किया जा सकता है, जो ईटीआर-मध्यस्थता एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के लिए उत्तरदायी हैं, अंतिम चिकित्सीय सेटिंग में सर्वश्रेष्ठ उम्मीदवारों के बोझिल और समय लेने वाले मूल्यांकन प्रयासों को शुरू करने से पहले। प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं को नीचे वर्णित किया गया है।

अंतिम चिकित्सीय लक्ष्य के एक रिपोर्टर सेल लाइन पूर्वानुमान की इंजीनियरिंग।
सेल इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल के निरंतर अनुकूलन के बावजूद- लक्ष्य जीन में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए कैसेट कोडिंग डालने और ईटीआर वितरित करने के लिए यहां आवश्यक है- यह नहीं माना जा सकता है कि वे सेल लाइन के लिए पहले से ही उपलब्ध हो सकते हैं जो अंतिम चिकित्सीय लक्ष्य से सबसे अधिक मिलता जुलता है। इस मामले में, विभिन्न शमन रणनीतियों को लागू किया जा सकता है: ए) लक्ष्य सेल लाइन के लिए अभिकर्मक प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए विक्रेताओं द्वारा प्रदान किए गए अनुकूलन किट का लाभ उठाना; बी) अन्य सेल लाइनों पर स्विच करना अभी भी उस लक्ष्य जीन को व्यक्त करता है लेकिन अंतिम चिकित्सीय लक्ष्य के अलावा अन्य ऊतकों से संबंधित है- जिसके लिए इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल को बड़े पैमाने पर अनुकूलित किया गया है। यदि ये विकल्प उपलब्ध नहीं हैं, तो कोई अंतिम लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करने वाले प्राथमिक सेल प्रकारों या ऑर्गेनोइड्स पर स्विच करने पर विचार कर सकता है। ईटीआर-आधारित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों और चिकित्सीय अनुप्रयोगों दोनों के लिए एक सामान्य विचार के रूप में, ऐसे परिदृश्य जिनमें लक्ष्य सेल प्रकार के लिए लक्ष्य जीन आवश्यक है, को त्याग दिया जाना चाहिए। ईटीआर द्वारा लगाए गए एक आवश्यक जीन के पूर्ण, दीर्घकालिक साइलेंसिंग से समय के साथ लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिचयन होगा (और, संभावित रूप से, उपचार की विषाक्तता)। इन मामलों में आंशिक लक्ष्य निरस्तीकरण प्रदान करने वाली वैकल्पिक प्रौद्योगिकियां, जैसे आरएनएआई³³, को प्राथमिकता दी जाती है।

ईटीआर की ऑन-टारगेट साइलेंसिंग गतिविधि का मूल्यांकन
KRAB, DNMT3A और DNMT3L प्रभावक डोमेन के संयोजन पर आधारित ETR प्रोटीन-कोडिंग जीन के बड़े बहुमत के खिलाफ प्रभावी साबित हुए हैं, जिसमें ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट³² पर केंद्रित लगभग 1 किलोबेस लंबी-अनुमेय लक्ष्यीकरण विंडो है। यह समझने के लिए कि एक अच्छी तरह से प्रदर्शन किया गया एपिजेनेटिक साइलेंसिंग प्रयोग कैसा दिखता है, के -562 कोशिकाओं में बी 2 एम जीन को चुप कराने के तकनीकी विवरण और परिणाम यहां प्रदान किए गए हैं। इसे न केवल के -562 कोशिकाओं के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं द्वारा बल्कि पहली बार ईटीआर-आधारित तकनीक के करीब आने वालों द्वारा शामिल किया जाने वाला एक महत्वपूर्ण सकारात्मक नियंत्रण माना जा सकता है। जैसा कि प्रोटोकॉल में कहा गया है, कृत्रिम न्यूक्लियस (जैसे, CRISPR / Cas9) -आधारित जीन व्यवधान को सेल प्रकार की रुचि में जीन वितरण की दक्षता और लक्ष्य जीन से वंचित कोशिकाओं के फेनोटाइप दोनों के अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में अनुशंसित किया जाता है। CRISPR/dCas9-आधारित ETR के साथ युग्मित होने के लिए GRNA की प्रारंभिक स्क्रीन के बाद, यदि परीक्षण किए गए जीआरएनए में से कोई भी लक्ष्य जीन को स्थायी रूप से चुप करने में सक्षम नहीं है, तो किसी को निम्नलिखित क्रम में विचार करना चाहिए: 1) वितरित किए गए जीआरएनए और ईटीआर की मात्रा में वृद्धि; 2) उनके बीच सहक्रियात्मक प्रभाव ों की तलाश में शीर्ष जीआरएनए के परीक्षण पूल। यदि दीर्घकालिक साइलेंसिंग अभी भी हासिल नहीं की गई है, तो किसी को विचार करना चाहिए: 3) अतिरिक्त जीआरएनए का परीक्षण, जो एपिजेनेटिक साइलेंसिंग को निर्देश देने के लिए अधिक प्रासंगिक साइटों को लक्षित कर सकता है; 4) जेडएफपी⁸- या टीएएलई^{9-आधारित} डीबीडी प्लेटफार्मों पर स्विच करना, जिसमें लक्ष्य क्रोमैटिन के लिए बेहतर बाध्यकारी क्षमता हो सकती है; 5) क्षणिक से स्थिर में स्विच करना- उदाहरण के लिए, ईटीआर की वायरल वेक्टर-आधारित-अभिव्यक्ति को एकीकृत करना (या तो जीआरएनए या डीसीएएस 9 संलयन निर्माण या सीआरआईएसपीआर / डीसीएएस 9 तकनीक को अपनाते समय दोनों)। चूंकि हमारे समूह ने विकसित किया है, और तीन अलग-अलग ईटीआर³⁰ के सह-वितरण के साथ मजबूत अनुभव है, इसलिए यहां दिखाए गए प्रोटोकॉल और परिणाम इस दृष्टिकोण पर आधारित हैं। हालांकि, एक समान वैचारिक वर्कफ़्लो संभवतः ऑल-इन-वन CRISPR-आधारित सिस्टम³² के लिए लागू किया जा सकता है।

ईटीआर की ऑफ-टारगेट गतिविधि का मूल्यांकन
कई अध्ययनों ने केआरएबी, डीएनएमटी 3 ए और डीएनएमटी 3 एल प्रभावक डोमेन^30,31,32 के संयोजन के आधार पर ईटीआर की विशिष्टता के प्रारंभिक इन विट्रो संकेत दिखाए हैं। हालांकि, यदि परीक्षण किए गए जीआरएनए में से, उनमें से कोई भी ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन और / या डी नोवो डीएनए मिथाइलेशन के संदर्भ में संतोषजनक विशिष्टता प्रोफ़ाइल नहीं दिखाता है, तो कोई दो गैर-पारस्परिक रूप से अनन्य रणनीतियों का पीछा कर सकता है: ए) ईटीआर की खुराक को कम करके या वैकल्पिक वितरण प्रणालियों का परीक्षण करके सेल के अंदर ईटीआर के निवास समय को कम करना (और परिणामस्वरूप उनकी संभावित ऑफ-टारगेट गतिविधि)। उदाहरण के लिए, प्लास्मिड की तुलना में, एमआरएनए और प्रोटीन डिलीवरी दोनों से ईटीआर के सेल-एक्सपोज़र समय को कम करने की उम्मीद है और परिणामस्वरूप, ऑफ-टारगेट गतिविधि की संभावना⁵⁵; बी) हाल ही में सीएएस 9 वेरिएंट पर स्विच करना, प्लेटफॉर्म⁵⁶ के ऑफ-टारगेट बाइंडिंग को कम करने के लिए अनुकूलित, या वैकल्पिक जेडएफपी⁸- या टीएएलई^{9-आधारित} डीएनए बाइंडिंग प्रौद्योगिकियों के लिए। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि, नकली-उपचारित नमूनों की तुलना में, जीन साइलेंसिंग की ऑन-टारगेट और ऑफ-टारगेट गतिविधि न केवल डीबीडी के उनके लक्ष्य अनुक्रम से जुड़ने से प्रभावित होती है, बल्कि एपिजेनेटिक प्रभावक डोमेन की संभावित क्षमता से भी प्रभावित होती है जिसे उनके प्राकृतिक, अंतर्जात कोफ़ैक्टर्स द्वारा अन्य लोकी में भर्ती किया जाता है। इसलिए, लक्ष्य सेल में ईटीआर के निवास समय को कम करने से न केवल ऑफ-टारगेट साइटों पर डीबीडी के बंधन की संभावना कम हो सकती है, बल्कि ईटीआर की अंतर्जात कोफ़ैक्टर्स के साथ बातचीत करने की संभावना भी कम हो सकती है, जिसमें ऑन-टारगेट गतिविधि के संदर्भ में विशिष्टता और नुकसान के संदर्भ में संभावित लाभ होते हैं। अंत में, नकली-उपचारित नमूनों की तुलना में, मौन कोशिकाओं में मापा गया कुछ ट्रांसक्रिप्शनल और-कम संभावना-सीपीजी मिथाइलेशन परिवर्तन केवल लक्ष्य जीन के अभाव से प्राप्त किया जा सकता है। इन्हें साइलेंसिंग तकनीक का ऑफ-टारगेट नहीं माना जाता है। उनकी पहचान करने के लिए, प्रयोगात्मक पैनल ^8,9,10 में कृत्रिम न्यूक्लियस द्वारा जीन व्यवधान को भी शामिल करना चाहिए। लक्ष्य जीन के कार्यात्मक नुकसान के कारण जैविक परिवर्तन एपिजेनेटिक साइलेंसिंग और इस वैकल्पिक तकनीक के बीच साझा किए जाएंगे।

Disclosures

एएल क्रोमा मेडिसिन, इंक के सह-संस्थापक, कोटा धारक और सलाहकार हैं।

Acknowledgments

लेखक एंजेलो अमाबिल, पाओला कैपासो, इलारिया कैसर्टा, तानिया बाकेगा, ऐलिस रेशिग्ना, वालेरिया मोलिका और डेबोरा सिप्रिया को पूरे वर्षों में एपिजेनेटिक साइलेंसिंग तकनीक विकसित करने के सहयोगी प्रयास के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं; प्रोटोकॉल में वर्णित आरएनए-सेक और एमईडीआईपी-सेक विश्लेषणों की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डेजन लाजारेविक और फ्रांसेस्का गियानीज़। इस काम को टेलीथॉन फाउंडेशन (टीआईजीईटी अनुदान संख्या एफ 1) और यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 कार्यक्रम (अपग्रेड) से एएल को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। BioRender.com के साथ चित्र बनाए गए हैं।

लेखक का योगदान
एएम, एमएसी, एफजी और एसी ने प्रोटोकॉल के डिजाइन और पांडुलिपि लिखने में योगदान दिया; एस.वी., आई.एम. और डी.सी. ने प्रोटोकॉल के जैव सूचना विज्ञान अनुभागों को डिजाइन किया और पांडुलिपि को संशोधित किया; एएम और ए.एल. ने प्रोटोकॉल डिजाइन किया, कल्पना की और सभी लेखकों के इनपुट के साथ पांडुलिपि लिखी।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit	Lonza Bioscience	AAF-1003X	Nucleofection
B2M silencing gRNA #1	Lombardo's lab	GCAATCAGGACAAGGCCCGC	Gene silencing
B2M silencing gRNA #2	Lombardo's lab	GGGGTAGGAGAGACTCACGC	Gene silencing
B2M silencing gRNA #3	Lombardo's lab	GAGTCCAGGGCTGGATCTCG	Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion	Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools	Bedtools	http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/	Processing of genomic intervals
bwa	Ih3	https://github.com/lh3/bwa	Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop	Valen's lab	http://chopchop.cbu.uib.no/	gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine	Corning	10-040-CV	Cell culture
cqn	Bioconductor	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html	Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite	Zhang's lab	https://zlab.bio/resources-2	off-target gRNA binding prediction
CRISPRoff-v2.1 plasmid	Addgene	167981	Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer	Beckman Coulter	C01161	Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene	Lombardo's lab	ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc agtaactggttgagcccaaattcaaacccagc ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct caaacagagagttccaggcaggatgaatctgt gctctgatccctgaggcatttaatatgttcttatta ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagct tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttct cttcctcccacagggataactagatgactcgag ggatccgaattcctgcaggcctcgacgagggc cggcgcgccgcggccgctacgtaaattccgc cccccccccccctctccctcccccccccctaac gttactggccgaagccgcttggaataaggccg gtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgc cgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct ggccctgtcttcttgacgagcattcctagggg tctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc gaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaac cccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaac aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc attgtatgggatctgatctggggcctcggtgcaca tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacg tctaggccccccgaaccacggggacgtggtttt cctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa ccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaa agagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg ctccatgaacggccacgagttcgagatcgaggg cgagggcgagggccgcccctacgagggcac ccagaccgccaagctgaaggtgaccaaggg cggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag aagctgtccttccccgagggcttcaagtgggag cgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtg accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg agcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaa gggcgagatccaccaggccctgaagctgaa ggacggcggccactacctggtggagttcaag accatctacatggccaagaagcccgtgcaac tgcccggctactactacgtggacaccaagctg gacatcacctcccacaacgaggactacacca tcgtggaacagtacgagcgctccgagggccg ccaccacctgttcctggggcatggcaccggca gcaccggcagcggcagctccggcaccgcctc ctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaa gagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg ctccatgaacggccacgagttcgagatcga gggcgagggcgagggccgcccctacgag ggcacccagaccgccaagctgaaggtgac caagggcggccccctgcccttcgcctgggac atcctgtccccccagttcatgtacggctccaa ggcgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc gattacaagaagctgtccttccccgagggcttc aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac ggcggtctggtgaccgtgacccaggactcct ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga cggccccgtaatgcagaagaagaccatggg ctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccc cgcgacggcgtgctgaagggcgagatccac caggccctgaagctgaaggacggcggcca ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc caagaagcccgtgcaactgcccggctactact acgtggacaccaagctggacatcacctccca caacgaggactacaccatcgtggaacagtac gagcgctccgagggccgccaccacctgttcct gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg ccgcgtcgacctgtgccttctagttgccagccatc tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataa aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg tgtcattctattctggggggtggggtggggcag gacagcaagggggaggattgggaagacaat agcaggcatgctggggatgcggtgggctctat ggcttaagtgatggggctagtagcctttccttaa tgatagggtgtttctagagagatatatctggtca aggtggcctggtactcctccttctccccacagc ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaaaag aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt cccaacctggctagtttacagcaactgca	Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500239	DNA sonication
edgeR	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html	Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit	NEB	E3321	Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	Cell culture
Flowjo	BD Biosciences	https://www.flowjo.com/solutions/flowjo	Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x)	NEB	B7024S	DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase	Promega	M7401	PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene	Lombardo's lab	AGGCTACTAGCCCCATCAAG	Genetic engineering
hCas9 plasmid	Addgene	41815	Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent	5067-5585	DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584	DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579	RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder	Agilent	5067-5581	RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer	Agilent	5067-5580	RNA quantification
IPure kit	Diagenode	C03010011	Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells	ATCC	CCL-243	Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit	Roche	KK4824	MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2	Taoliu	https://github.com/macs3-project/MACS	Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit	Diagenode	C02010020	5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1	Bioo Scientific	5118-01	MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000	Illumina	SY-415-1002 / 20012850	Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA	Macherey-nagel	740410.50	Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent cells	ThermoFisher	C404010	Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid	Addgene	48240	Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid	Lombardo's lab	available on request (lombardo.angelo@hsr.it)	Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid	Lombardo's lab	available on request (lombardo.angelo@hsr.it)	Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid	Lombardo's lab	available on request (lombardo.angelo@hsr.it)	Gene silencing
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	Cell culture
phU6.sgRNA plasmid	Addgene	53188	Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply	Biorad	1645050	Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene	Lombardo's lab	GTATTTGCTGGTTATGTTAG	Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene	Lombardo's lab	AATGGTTGAGTTGGAC	Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	DNA extraction
Qubit	Thermo Fisher	Q33238	DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851	DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit	Thermo Fisher	Q32852	RNA quantification
Restriction enzymes	NEB		DNA digestion
RNeasy Mini kit	Qiagen	74106	RNA extraction
Rsubread	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html	Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT)	Lonza Bioscience	V4XC-2032	Nucleofection
SnapGene	Dotmatics	https://www.snapgene.com/	Molecular biology design software
STAR	Alexander Dobin	https://github.com/alexdobin/STAR	Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler	Biorad	1861096	PCR amplification
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	DNA ligation
TAE Buffer	Fisher scientific	BP1332500	Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit	Illumina	20020597	RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose	ThermoFisher	16500500	Agarose gel

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References

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Bioengineering

इन विट्रो लक्षित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग के लिए इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर्स का चयन

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

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Acknowledgments

Materials

References

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