פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית למחצה לבדיקות סמים אורגנואידיות בתפוקה בינונית עד גבוהה ותוכנת ניתוח תמונה אוטומטית אגנוסטית למיקרוסקופ לכימות ולהמחשה של תגובות תרופתיות רב-פרמטריות בעלות אורגנואיד יחיד ללכידת הטרוגניות תוך-גופית.
אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה (PDTOs) טומנים בחובם הבטחה גדולה למחקר פרה-קליני ותרגום ולחיזוי תגובת הטיפול בחולה מהקרנות של תרופות ex vivo . עם זאת, מבחני בדיקת התרופות הנוכחיים המבוססים על אדנוזין טריפוספט (ATP) אינם לוכדים את המורכבות של תגובת תרופה (ציטוטסטטית או ציטוטוקסית) והטרוגניות תוך-סרטנית שהוכחה ככזו שנשמרת ב-PDTOs עקב קריאה בתפזורת. הדמיית תאים חיים היא כלי רב עוצמה להתגבר על בעיה זו ולדמיין תגובות לתרופות בצורה מעמיקה יותר. עם זאת, תוכנת ניתוח תמונה לרוב אינה מותאמת לתלת-ממדיות של PDTOs, דורשת צבעי כדאיות פלואורסצנטיים, או שאינה תואמת לפורמט microplate של 384 בארות. מאמר זה מתאר מתודולוגיה חצי אוטומטית לזרע, טיפול ותמונה של PDTOs בפורמט בעל תפוקה גבוהה של 384 בארות תוך שימוש במערכות הדמיה קונבנציונליות, רחבות שדה ותאים חיים. בנוסף, פיתחנו תוכנה לניתוח תמונות ללא סמני כדאיות כדי לכמת מדדי תגובה לתרופות המבוססים על קצב גדילה המשפרים את יכולת ההתרבות ומתקנים שינויים בקצב הצמיחה בין קווי PDTO שונים. באמצעות מדד התגובה לתרופות מנורמלות, אשר מדרג את תגובת התרופה בהתבסס על קצב הגדילה המנורמל למצב בקרה חיובי ושלילי, וניתן להבחין בקלות בין צבע מוות של תאים פלואורסצנטיים, תגובות ציטוטוקסיות ותרופות ציטוטסטטיות, מה שמשפר באופן עמוק את הסיווג של מגיבים ושאינם מגיבים. בנוסף, הטרוגניות של תגובת תרופה יכולה לכמת מניתוח תגובה של תרופה חד-אורגנואידית כדי לזהות שיבוטים פוטנציאליים ועמידים. בסופו של דבר, שיטה זו נועדה לשפר את הניבוי של תגובת הטיפול הקליני על ידי לכידת חתימת תגובה רב-פרמטרית לתרופה, הכוללת מעצר גדילה קינטי וכימות מוות של תאים.
בשנים האחרונות, גילוי תרופות לסרטן במבחנה , בדיקת תרופות ומחקרים בסיסיים עברו משימוש במודלים מסורתיים של סרטן דו-ממדי (2D) עם קווי תאים אימורטליים למודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של סרטן תלת-ממדי (3D). זה דרבן את האימוץ של ספרואידים סרטניים עם קווי תאים סרטניים מבוססים, אשר משחזרים אינטראקציות מורכבות יותר בין תאים ומבנים הקיימים בגידולים מוצקים. כיום, אורגנואידים של גידולים שמקורם בחולה (PDTOs) הם מודל הסרטן התלת-ממדי המתקדם והרלוונטי ביותר מבחינה פיזיולוגית הזמין לחקר סרטן במבחנה , שכן הם מספקים יתרונות נוספים על פני ספרואידים סרטניים, כלומר ההטרוגניות שנמצאת בחולי סרטן1. PDTOs נוצרים מרקמת גידול שמקורה בחולי סרטן, ולכן שומרים הן על פנוטיפ הגידול והן על הגנוטיפ. ככאלה, PDTOs הופכים להיות יקרי ערך עבור מחקר סרטן בסיסי ותרגום ויש להם את הפוטנציאל לשפר מאוד אונקולוגיה מדויקת2.
למרות הפוטנציאל המבטיח שלהם, מודלים מתוחכמים אלה של סרטן תלת-ממד במבחנה אינם מנוצלים לעתים קרובות בשל היעדר שיטות ניתוח מתקדמות. הבדיקה הנפוצה ביותר קובעת את מספר התאים בני קיימא ב- PDTO באמצעות כימות של ATP3 תוך תאי. מבחנים אלה הם בדרך כלל ניתוחים חד-פעמיים בתפזורת, ובכך מתעלמים מתגובות תלויות זמן קריטיות ומזניחים תגובות קלונליות. באופן ספציפי, היכולת לעקוב אחר הצמיחה של PDTOs (קצב גדילה) ותגובתם לטיפולים ספציפיים היא בעלת עניין רב 4,5. תגובת התרופה המנורמלת (NDR), אשר מדרגת את תגובת התרופה בהתבסס על קצב הצמיחה המנורמל למצב חיובי (ctrl+) ובקרה שלילית (ctrl-), דווחה לאחרונה גם היא כמדד מכריע להערכת רגישות לתרופות לסרטן באמצעות הקרנה מבוססת תאים, אם כי הדבר נעשה בעיקר עבור קווי תאים דו-ממדיים6. לכן, יש צורך בשיטות ניתוח מתוחכמות יותר כדי לנצל באופן מלא את המודלים התלת-ממדיים המייצגים והמורכבים יותר מבחינה קלינית של סרטן. מיקרוסקופיה נחשבת לגישה רבת עוצמה לחקר המורכבות של מודלים אורגנואידים אלה7.
מאמר זה מתאר שיטה לניטור תגובות של תרופות קינטיות במודלים תלת-ממדיים של סרטן, תוך שימוש במיקרוסקופים קונבנציונליים רחבים ובמערכות הדמיה של תאים חיים. נעשו התאמות לפרוטוקול שתואר על ידי Driehuis et al.4 כדי להיות תואם לאוטומציה באמצעות רובוט פיפטינג, מתקן תרופות דיגיטלי ומערכת הדמיה של תאים חיים כדי להגביר את יכולת ההתרבות ולהפחית את מספר שעות העבודה ‘המעשיות’. שיטה זו מאפשרת הקרנה של תרופות בתפוקה בינונית עד גבוהה של שני הספרואידים של הגידול עם קווי תאים סרטניים מבוססים (ראו טבלה משלימה S1 עבור קווי התאים שנבדקו), כמו גם של PDTOs, בפורמט של 384 מיקרו-פלטות ומולטי-אורגנואידים. על ידי שימוש בתהליך למידת מכונה קונבולוציוני ברשת, זיהוי ומעקב אוטומטיים של כדורואידים סרטניים בודדים או PDTOs יכולים להתבצע אך ורק מהדמיית שדה בהיר וללא שימוש בצבעי תיוג פלואורסצנטיים של תאים חיים8. יש לכך יתרון רב, שכן רוב הזיהוי עם הדמיית שדה בהיר דורש ביאור ידני (שהוא מייגע וגוזל זמן) או דורש תוספת של צבעים פלואורסצנטיים, שיכולים לבלבל תגובות תרופתיות הקשורות לעקה חמצונית הנגרמת על ידי פוטוקסיטי9.
תוכנת ניתוח התמונה המתקבלת שפותחה בתוך החברה מרחיבה את הפונקציונליות של מערכות הדמיה קונבנציונליות של תאים חיים, מכיוון שמודולי ניתוח תמונה תלת-ממדיים אינם זמינים, מוגבלים בפלטפורמה או אינם תואמים למיקרו-לוחות של 384 בארות והדמיה של באר שלמה. בנוסף, מודולים אלה הם לעתים קרובות במחיר גבוה ומציעים קריאות אורגנואידים בתפזורת מוגבלת. לכן, שיטה זו רלוונטית מאוד למדענים שיש להם גישה למערכות הדמיה של תאים חיים הזמינות באופן נרחב ומטרתם לחלץ מידע רב יותר על תגובה לתרופה בהשוואה לבדיקה מבוססת ATP בתקן זהב אך בסיסית. עם תוספת של אינדיקטורים ספציפיים למוות תאי, ניתן להבחין בין תגובות תרופות ציטוטסטטיות לבין תגובות ציטוטוקסיות, ובכך לספק תובנה נוספת לגבי פעולות תרופה מכניסטיות שאינן ניתנות להשגה כיום מניתוח נקודת זמן אחת. לבסוף, הדמיית תאים חיים מאפשרת מעקב אחר אורגנואידים בודדים כדי לקבל מדדי תגובה של תרופה אורגנואידית יחידה כדי ללכוד הטרוגניות של תגובה ולזהות תת-מולקולות עמידות פוטנציאליות.
המטרה של שיטה זו והתוכנה הנלווית לניתוח תמונות היא ליישם אוטומציה בעלות נמוכה בסינון תרופות אורגנואידיות כדי להגביל את התערבות המשתמש ולהפחית את השונות בטיפול, ניתוח תמונות וניתוח נתונים. כדי להפוך תוכנה זו לזמינה לחוקרים, היא אגנוסטית למיקרוסקופ ולפלטפורמה, ואפליקציה מבוססת ענן זמינה. לפיכך, על ידי תמיכה במערכות הדמיה קונבנציונליות של תאים חיים, אנו שואפים גם לשפר את הפונקציונליות שלהן עבור יישומים וניתוח תלת-ממדיים.
בדיקת תרופות PDTO בתפוקה בינונית עד גבוהה מסתמכת לעתים קרובות על קריאות המחלימות רק שבריר מהמידע שהאורגנואידים עשויים לספק. יותר ויותר ברור שכדי שהטכנולוגיה האורגנואידית המתפתחת במהירות תממש פוטנציאל מדעי וקליני גדול יותר, נדרשים באופן קריטי מבחנים, קריאות ושיטות ניתוח תלת-ממדיות מתקדמות יותר. כאן מתואר צינור סינון מתקדם, אשר לא רק מגדיל את יכולת השחזור, אלא גם משפר במידה ניכרת את יכולת התרגום הקלינית על ידי שילוב קריאת הדמיה של תאים חיים המונעת על ידי בינה מלאכותית. בנוסף לתוכנת ניתוח שפותחה בתוך החברה, מיושם השימוש במדד התגובה התרופתית המנורמלת (NDR), המדגים בבירור את יכולתו להגדיר הבדלים ספציפיים למטופל בתגובה לטיפול6.
הכללתו של מדד נורמליזציה זה תהיה ללא ספק בעלת ערך עצום, ומזכירה כי מחקרים רבים שואפים להגדיר את תגובות הטיפול בהתבסס על הבדלים קלים באזור שמתחת לעקומה (AUC) או בריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50) (שכן רוב עקומות המינון-תגובה חופפות/ממוקמות קרוב זו לזו)11,12 . מדדי קצב הצמיחה כבר יושמו בפרוטוקולי סינון תרופות אורגנואידיות באמצעות הבדיקה מבוססת ATP, אך מסתמכים על הנורמליזציה של בארות ייחוס בנקודת זמן 04. לעומת זאת, שיטה זו מאפשרת נורמליזציה של קצב גידול תוך-ביתי, אשר לא רק לוקחת בחשבון הבדלים בין-אשפוזיים בקצב הצמיחה של PDTO, אלא גם הבדלים בין-חיים הנובעים משינויים בצפיפות הזריעה והשפעות תלויות מיקום צלחת כדי להגדיל את יכולת השחזור. יתר על כן, התאמנו את ה- NDR כדי להגדיל עוד יותר את ההפרדה של תגובת PDTO בין-אשפוזית על ידי הכללת בקרה חיובית לנורמליזציה 6,8.
יתר על כן, הניתוח, התואם לפורמטים של תפוקה גבוהה ואוטומציה, יכול לזהות במדויק תגובות אורגנואידיות בודדות, מה שמאפשר לכמת את ההתנגדות התת-שבטית – הכוח המניע העיקרי של הישנות הגידול והתקדמותו13. לדוגמה, למרות ש-PDAC052 ו-PDAC060 הראו תגובה טובה לטיפול במבחנה (בהתבסס על ה-NDR), הניתוח הנוסף של אורגנואיד יחיד הצליח לזהות אוכלוסייה קטנה (גדולה יותר עם PDAC060) של תת-קבוצות שאינן מגיבות לטיפול. מעניין, זה התכתב מאוד עם התצפית הקלינית, בהתחשב בכך PDAC052 ו PDAC060 היה תגובה עמידה (לא זוהתה פעילות הגידול) אבל בסופו של דבר שניהם אובחנו עם התקדמות הגידול המקומי (בשל נוכחות של שיבוטים עמידים). בהשוואה לקריאות התלת-ממד הקונבנציונליות (בדיקה מבוססת ATP וגודל/מספרים), צינור סינון מתקדם זה צפוי לשפר את ביצועי הניבוי על ידי חילוץ מידע רלוונטי יותר מבחינה קלינית מתוך ‘מטופלים במעבדה’ אלה. השערה זו נבדקת כעת על ידי סינון דגימות PDTO קליניות במעבדה של המחברים בשיטה זו כדי לתאם ex vivo עם תגובה in vivo ותוצאה קלינית.
כדי לקבל תובנות נוספות על המנגנונים של תגובה לתרופה, ריאגנטים קונבנציונליים להדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים, בנוסף לצבעי ציטוטוקסיות, תואמים לשיטה זו כדי לחקור מנגנונים של מוות תאי. הראינו בעבר את התאימות של שיטה זו עם הריאגנט הירוק Sartorius Caspase 3/7 לחקר אינדוקציה תלוית קספאז של אפופטוזיס לאחר טיפול בסיספלטין8. התאימות עם צבעים אחרים לחקר עקה חמצונית (ריאגנטים של CellROX) או היפוקסיה (ריאגנטים של Image-iT Hypoxia) עדיין נבדקת. עם זאת, ריאגנטים אלה כבר שימשו בהצלחה מודלים 3D in vitro 14,15.
תוכנת ניתוח התמונה תואמת גם לפורמטים אחרים של צלחות או לשיטות culturing (למשל, לוחות microcavity, כיפות ECM) אם ניתן ללכוד תמונות ברורות וממוקדות של האורגנואידים. לעתים קרובות זה מאתגר עבור אורגנואידים שגודלו בכיפות מכיוון שהם גדלים במישורי z שונים, מה שדורש פונקציונליות z-stacking של המיקרוסקופ שלא תמיד זמינה. לכן, אנו ממליצים להשתמש במיקרו-לוחות ULA 384-well בעלי תחתית שטוחה כדי להבטיח תמונות באיכות מספקת.
בנוסף, הניתוח תואם למערכות הדמיה אחרות של תאים חיים, כפי שהוצג בעבר עבור תמונות ניגודיות פאזה שצולמו עם מערכת זום IncuCyte8. מגבלה של מערכת ההדמיה של תאים חיים של Spark Cyto ששימשה בכתב יד זה היא הקיבולת של צלחת אחת למדידות קינטיות. עם זאת, הרחבת Spark Motion מגדילה את הקיבולת שלה לעד 40 מיקרו-לוחות שניתן למסך בכמויות גדולות. התאימות של התוכנה שפותחה בתוך החברה תורחב למערכות אלה ואחרות כדי להציע פתרון אגנוסטי לפלטפורמה, במטרה לתקנן ולהפוך צינורות ניתוח תמונה ונתונים לאוטומטיים. היישום מבוסס האינטרנט יכלול גם כלי גרפים אינטראקטיביים וחישובים אוטומטיים של מדדי תרופות, כפי שמוצג במאמר זה, כדי לקצר את זמן הניתוח הידני.
אלגוריתם הסגמנטציה PDTO נטול התוויות אומן ונבדק על מודלים שונים של ספרואידים ו-PDTO שגודלו בבית עם הבדלים מורפולוגיים מובהקים (מוצק, מוצק למחצה, ציסטי), וכתוצאה מכך יכול לזהות אותם בדיוק גבוה8. מגבלה של המודל היא שהכללת PDTOs ציסטיים הגבירה את הגילוי הלא רצוי של בועות הקיימות בבאר שלאחר הזריעה. עם זאת, דגירה במהלך הלילה הספיקה כדי להסיר את רוב הבועות הללו, מה שאפשר סריקה איכותית של נקודת זמן 0. הדיוק של פילוח התמונה האורגנואידית והשיטה צריכים להיות מאומתים על ידי משתמשים אחרים, ועל סמך המשוב שלהם, ניתן לאמן את התוכנה עוד יותר כדי להשיג אלגוריתם ניתוח תמונה חזק ואוטומטי. בנוסף, אנו שואפים להשיג נתונים קליניים נוספים כדי לתאם את תגובת התרופה ex vivo המכמתת בשיטה זו לתגובה הקלינית בחולה כדי לזהות את הפרמטרים הטובים ביותר לניבוי תגובת הטיפול ולהמשיך לפתח שיטה זו לרפואת סרטן מדויקת תפקודית16.
The authors have nothing to disclose.
חלק ממחקר זה מומן על ידי תרומות מתורמים שונים, כולל Dedert Schilde vzw ומר וילי פלורן. עבודה זו ממומנת בחלקה על ידי קרן המחקר הפלמית, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G.), 1S27021N (M.L), ועל ידי קרן המחקר התעשייתי של אוניברסיטת אנטוורפן, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). איור 1 נוצר עם BioRender.com.
6-well plate | Greiner | 657160 | |
8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
300 µL Tips | Opentrons | ||
384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
T8 plus cassette | Tecan | ||
TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |