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Cancer Research

थोक और एकल-ऑर्गेनॉइड विश्लेषण के लिए वाइडफील्ड लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग करके मल्टीपैरामीट्रिक ट्यूमर ऑर्गेनॉइड ड्रग स्क्रीनिंग

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64434
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,3, 2, 1,4, 1,4, 1,5, 1
1Center for Oncological Research (CORE), Integrated Personalized & Precision Oncology Network (IPPON), University of Antwerp, 2Industrial Vision Lab, University of Antwerp, 3Department of Hepatobiliary Transplantation and Endocrine Surgery, University Hospital Antwerp (UZA), 4Department of Oncology, University Hospital Antwerp (UZA), 5Plasma Lab for Applications in Sustainability and Medicine ANTwerp (PLASMANT), University of Antwerp

Summary

यह प्रोटोकॉल इंट्राट्यूमर विषमता को पकड़ने के लिए मल्टीपैरामीट्रिक, सिंगल-ऑर्गेनॉइड दवा प्रतिक्रियाओं को मापने और कल्पना करने के लिए मध्यम से उच्च-थ्रूपुट ऑर्गेनोइड ड्रग स्क्रीनिंग और माइक्रोस्कोप-अज्ञेयवादी, स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए एक अर्ध-स्वचालित विधि का वर्णन करता है।

Abstract

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स (पीडीटीओ) प्रीक्लिनिकल और ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए बहुत वादा करते हैं और पूर्व विवो ड्रग स्क्रीनिंग से रोगी चिकित्सा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करते हैं। हालांकि, वर्तमान एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) आधारित दवा स्क्रीनिंग परख एक दवा प्रतिक्रिया (साइटोस्टैटिक या साइटोटोक्सिक) और इंट्राट्यूमर विषमता की जटिलता को कैप्चर नहीं करती है जिसे थोक रीडआउट के कारण पीडीटीओ में बनाए रखा गया है। लाइव-सेल इमेजिंग इस मुद्दे को दूर करने और दवा प्रतिक्रियाओं को अधिक गहराई से कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर अक्सर पीडीटीओ के त्रि-आयामीता के लिए अनुकूलित नहीं होता है, फ्लोरोसेंट व्यवहार्यता रंजक की आवश्यकता होती है, या 384-वेल माइक्रोप्लेट प्रारूप के साथ संगत नहीं होता है। यह पेपर पारंपरिक, वाइडफील्ड, लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट, 384-वेल प्रारूप में पीडीटीओ को बीज, उपचार और छवि बनाने के लिए एक अर्ध-स्वचालित पद्धति का वर्णन करता है। इसके अलावा, हमने विकास दर-आधारित दवा प्रतिक्रिया मैट्रिक्स को निर्धारित करने के लिए व्यवहार्यता मार्कर-मुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर विकसित किया है जो विभिन्न पीडीटीओ लाइनों के बीच प्रजनन क्षमता और सही विकास दर भिन्नताओं में सुधार करता है। सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया मीट्रिक का उपयोग करके, जो सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण स्थिति में सामान्यीकृत विकास दर के आधार पर दवा प्रतिक्रिया को स्कोर करता है, और एक फ्लोरोसेंट सेल डेथ डाई, साइटोटोक्सिक और साइटोस्टैटिक दवा प्रतिक्रियाओं को आसानी से अलग किया जा सकता है, उत्तरदाताओं और गैर-उत्तरदाताओं के वर्गीकरण में गहराई से सुधार होता है। इसके अलावा, संभावित, प्रतिरोधी क्लोन की पहचान करने के लिए एकल-ऑर्गेनॉइड दवा प्रतिक्रिया विश्लेषण से दवा-प्रतिक्रिया विषमता की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। अंततः, इस पद्धति का उद्देश्य एक बहुपैरामीट्रिक दवा प्रतिक्रिया हस्ताक्षर को कैप्चर करके नैदानिक चिकित्सा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी में सुधार करना है, जिसमें गतिज विकास गिरफ्तारी और कोशिका मृत्यु परिमाणीकरण शामिल है।

Introduction

हाल के वर्षों में, इन विट्रो कैंसर दवा की खोज, दवा स्क्रीनिंग और मौलिक अनुसंधान अमर सेल लाइनों के साथ पारंपरिक दो-आयामी (2 डी) कैंसर मॉडल के उपयोग से अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक त्रि-आयामी (3 डी) कैंसर मॉडल में संक्रमण कर रहे हैं। इसने स्थापित कैंसर सेल लाइनों के साथ ट्यूमर स्फेरॉइड को अपनाने के लिए प्रेरित किया है, जो ठोस ट्यूमर में मौजूद अधिक जटिल सेल-टू-सेल इंटरैक्शन और संरचनाओं को फिर से बनाते हैं। वर्तमान में, रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स (पीडीटीओ) इन विट्रो कैंसर अनुसंधान के लिए उपलब्ध सबसे उन्नत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी कैंसर मॉडल हैं, क्योंकि वे ट्यूमर स्फेरॉइड पर अतिरिक्त लाभ प्रदान करते हैं, अर्थात् कैंसर रोगियों में पाई जाने वाली विषमता1। पीडीटीओ कैंसर रोगियों से उत्पन्न ट्यूमर ऊतक से स्थापित होते हैं, और इसलिए ट्यूमर फेनोटाइप और जीनोटाइप दोनों को बनाए रखते हैं। जैसे, पीडीटीओ मौलिक और ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान के लिए अमूल्य बन रहे हैं और सटीक ऑन्कोलॉजी2 में काफी सुधार करने की क्षमता रखते हैं।

उनकी आशाजनक क्षमता के बावजूद, इन परिष्कृत 3 डी इन विट्रो कैंसर मॉडल अक्सर उन्नत विश्लेषण विधियों की कमी के कारण कम उपयोग किए जाते हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली परख इंट्रासेल्युलर एटीपी 3 की मात्रा का ठहराव के माध्यम से पीडीटीओ में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करतीहै। ये परख आम तौर पर एकल-समय बिंदु, थोक विश्लेषण होते हैं, इस प्रकार महत्वपूर्ण समय-निर्भर प्रतिक्रियाओं की अनदेखी करते हैं और क्लोनल प्रतिक्रियाओं की उपेक्षा करते हैं। विशेष रूप से, पीडीटीओ (विकास दर) के विकास की निगरानी करने की क्षमता और विशिष्ट उपचारों के लिए उनकी प्रतिक्रिया उच्च रुचि 4,5 है। सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया (एनडीआर), जो सकारात्मक (ctrl+) और नकारात्मक नियंत्रण (ctrl-) स्थिति में सामान्यीकृत वृद्धि दर के आधार पर दवा प्रतिक्रिया को स्कोर करती है, को हाल ही में सेल-आधारित स्क्रीनिंग के साथ कैंसर की दवा संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मीट्रिक बताया गया है, हालांकि यह मुख्य रूप से 2 डी सेललाइनों 6 के लिए किया गया था। इसलिए, इन अधिक चिकित्सकीय प्रतिनिधि और जटिल 3 डी कैंसर मॉडल का पूरी तरह से लाभ उठाने के लिए अधिक परिष्कृत विश्लेषण विधियों की आवश्यकता है। माइक्रोस्कोपी को इन ऑर्गेनोइड मॉडल 7 की जटिलता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण माना जाताहै।

यह पेपर पारंपरिक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप और लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके 3 डी कैंसर मॉडल में गतिज दवा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक विधि का वर्णन करता है। प्रजनन क्षमता बढ़ाने और श्रम के 'हैंड-ऑन' घंटों की संख्या को कम करने के लिए एक पिपेटिंग रोबोट, डिजिटल ड्रग डिस्पेंसर और लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके स्वचालन के साथ संगत होने के लिए ड्रिहुइस एट अल.4 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलन किए गए थे। यह विधि स्थापित कैंसर सेल लाइनों के साथ दोनों ट्यूमर स्फेरॉइड की मध्यम से उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग की अनुमति देती है (परीक्षण किए गए सेल लाइनों के लिए पूरक तालिका एस 1 देखें), साथ ही पीडीटीओ, 384-वेल माइक्रोप्लेट और मल्टी-ऑर्गेनॉइड प्रारूप में। एक संक्रामक नेटवर्क मशीन सीखने की प्रक्रिया का उपयोग करके, व्यक्तिगत ट्यूमर स्फेरॉइड या पीडीटीओ की स्वचालित पहचान और ट्रैकिंग पूरी तरह से ब्राइटफील्ड इमेजिंग से और फ्लोरोसेंट लाइव-सेल लेबलिंग रंजक8 के उपयोग के बिना की जा सकती है। यह अत्यधिक फायदेमंद है, क्योंकि ब्राइटफील्ड इमेजिंग के साथ अधिकांश पहचान के लिए मैनुअल एनोटेशन की आवश्यकता होती है (जो श्रमसाध्य और समय लेने वाली होती है) या फ्लोरोसेंट रंगों को जोड़ने की आवश्यकता होती है, जो फोटोक्सिसिटी-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव से संबंधित दवा प्रतिक्रियाओं को भ्रमित कर सकतेहैं।

परिणामस्वरूप इन-हाउस विकसित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पारंपरिक लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम की कार्यक्षमता का विस्तार करता है, क्योंकि 3 डी छवि विश्लेषण मॉड्यूल या तो उपलब्ध नहीं हैं, प्लेटफ़ॉर्म-प्रतिबंधित हैं, या 384-वेल माइक्रोप्लेट और होल-वेल इमेजिंग के साथ संगत नहीं हैं। इसके अलावा, ये मॉड्यूल अक्सर अत्यधिक कीमत वाले होते हैं और सीमित थोक ऑर्गेनॉइड रीडआउट प्रदान करते हैं। इसलिए, यह विधि उन वैज्ञानिकों के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है जिनके पास व्यापक रूप से उपलब्ध लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम तक पहुंच है और स्वर्ण-मानक लेकिन अल्पविकसित एटीपी-आधारित परख की तुलना में दवा प्रतिक्रिया के बारे में अधिक जानकारी निकालने का लक्ष्य रखते हैं। विशिष्ट कोशिका मृत्यु संकेतकों के अलावा, साइटोस्टैटिक दवा प्रतिक्रियाओं को साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाओं से अलग किया जा सकता है, इस प्रकार यांत्रिक दवा कार्यों में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो वर्तमान में एकल-टाइमपॉइंट विश्लेषण से अप्राप्य है। अंत में, लाइव-सेल इमेजिंग प्रतिक्रिया विषमता को पकड़ने और संभावित प्रतिरोधी उपक्लोनों की पहचान करने के लिए एकल ऑर्गनॉइड दवा प्रतिक्रिया मैट्रिक्स प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत ऑर्गनॉइड ट्रैकिंग की अनुमति देता है।

इस पद्धति और संबंधित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का लक्ष्य उपयोगकर्ता हस्तक्षेप को सीमित करने और हैंडलिंग, छवि विश्लेषण और डेटा विश्लेषण में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए ऑर्गेनॉइड ड्रग स्क्रीनिंग में कम लागत वाले स्वचालन को लागू करना है। इस सॉफ्टवेयर को शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध कराने के लिए, यह माइक्रोस्कोप- और प्लेटफ़ॉर्म-अज्ञेयवादी है, और एक क्लाउड-आधारित एप्लिकेशन उपलब्ध कराया गया है। इस प्रकार, पारंपरिक लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का समर्थन करके, हम 3 डी संवर्धन अनुप्रयोगों और विश्लेषण के लिए उनकी कार्यक्षमता में सुधार करने का भी लक्ष्य रखते हैं।

Protocol

मानव अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उपयोग किया गया था। एंटवर्प यूनिवर्सिटी अस्पताल में उपचारात्मक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से ऊतक शोधन टुकड़े प्राप्त किए गए थे। सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी, और अध्ययन को यूजेडए एथिकल कमेटी (रेफरी 14/47/480) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों, उपकरणों और सॉफ्टवेयर से संबंधित विवरण सामग्री की तालिका में प्रदान किए गए हैं। वर्कफ़्लो का अवलोकन चित्रा 1 में प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल को पुन: पेश करने के लिए पूरक सामग्री में उदाहरण डेटा प्रदान किया जाता है।

1. दिन 0: 2- या 3 दिन पुराने ऑर्गेनोइड्स की तैयारी

  1. माइक्रोप्लेट्स को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) को पिघलाएं।
  2. पूर्ण पीडीएसी ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम तैयार करें: पूरक एडीएफ +++ (उन्नत डीएमईएम / एफ 12, 1% ग्लूटामाइन पूरक, 1% एचईपीईएस, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) 0.5 एनएम डब्ल्यूएनटी सरोगेट-एफसी-फ्यूजन प्रोटीन के साथ, 4% नोगिन-एफसी फ्यूजन प्रोटीन वातानुकूलित माध्यम, 4% आरपीएसओ 3-एफसी फ्यूजन प्रोटीन वातानुकूलित माध्यम, 1 एक्स बी 27, 1 एमएम एन-एसिटाइल सिस्टीन (एनएसी), 5 एमएम निकोटिनामाइड, 5 एमएम निकोटिनामाइड, 5 एमएम निकोटिनमाइड, 5 एमएम
  3. पसंद की विधि के अनुसार पीडीटीओ स्थापित करें।
    नोट: ड्रिहुइस एट अल द्वारा एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जो ईसीएम गुंबदों में पीडीटीओ को स्थापित करने, संस्कृति और पारित करने के लिए पारंपरिक विधि का वर्णन करता है।
  4. एंजाइमेटिक रूप से ईसीएम गुंबदों में ऑर्गेनोइड्स को अलग करते हैं।
    1. मध्यम को एस्पिरेट करें और फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 1 एक्स धोएं। ऑर्गेनोइड्स और ईसीएम गुंबदों को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए पृथक्करण एंजाइम (उदाहरण के लिए, 6-वेल माइक्रोप्लेट में 2 एमएल) और पिपेट को 10 गुना ऊपर और नीचे 1 एमएल पिपेट के साथ जोड़ें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, ऊपर और नीचे, और जांचें कि क्या ऑर्गेनोइड एकल कोशिकाओं से अलग हैं। यदि आवश्यक हो तो इस चरण को दोहराएं।
    3. 15 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन एकत्र करें, 10 एमएल की मात्रा में एडीएफ +++ जोड़ें, कमरे के तापमान पर 450 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और पाश्चर पिपेट और सक्शन पंप के साथ सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
    4. गोली के आकार के आधार पर पूर्ण माध्यम के 100-200 μL में गोली को पुन: निलंबित करें और पसंद की विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। उदाहरण के लिए: सेल सस्पेंशन के 10 μL + ट्रिपैन ब्लू के 10 μL मिलाएं और एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिनती करें।
  5. ईसीएम गुंबदों में एकल कोशिकाओं को प्लेट करें।
    1. सेल निलंबन को पतला करें और तालिका 1 के अनुसार 2/3 ईसीएम जोड़ें। पहले से गर्म 6-वेल प्लेट में प्रति कुएं दस 20 μL बूंदों तक पिपेट करें। प्लेट को पलटें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. पूर्ण माध्यम के साथ ओवरले को 10 μM Y-27632 के साथ पूरक किया जाता है और एक इनक्यूबेटर में 2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया जाता है।
      नोट: 75,000 कोशिकाओं वाले दस गुंबद आमतौर पर किनारे पर कुओं को छोड़कर, 200 ऑर्गेनोइड / वेल की एकाग्रता पर एक 384-वेल माइक्रोप्लेट को भरने के लिए पर्याप्त होते हैं।

2. दिन 2 - 3: फसल और बीज 2- या 3 दिन पुराने ऑर्गेनोइड्स

  1. ईसीएम गुंबदों से बरकरार ऑर्गेनोइड्स एकत्र करें।
    नोट: ऑर्गेनोइड प्लास्टिक की सतहों (जैसे, ट्यूब, पिपेट टिप्स) से चिपके रहते हैं। इससे बचने के लिए, प्लास्टिकवेयर को 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)/पीबीएस समाधान के साथ प्रीरिन किया जा सकता है।
    1. मध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ 1x धो लें। ईसीएम गुंबदों की संख्या के आधार पर 6-वेल प्लेट में 1-2 एमएल ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) ऑर्गेनॉइड कटाई समाधान जोड़ें और 10 मिनट के लिए एक हिलने वाले मंच पर बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    2. ईसीएम गुंबदों को अलग करने के लिए 1 एमएल पिपेट के साथ पिपेट ऊपर और नीचे, बर्फ पर अतिरिक्त 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और माइक्रोस्कोप के तहत नेत्रहीन जांच करें कि क्या ईसीएम अलग है।
    3. वैकल्पिक: यदि अधिक समान आकार वितरण पसंद किया जाता है, तो सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करें।
    4. पीबीएस के साथ प्रीकोट किए गए 15 एमएल ट्यूब में ऑर्गेनोइड्स एकत्र करें, 10 एमएल तक एडीएफ +++ जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और >6,000 ऑर्गेनोइड्स / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए गोली के आकार के आधार पर पूर्ण पीडीएसी ऑर्गेनॉइड माध्यम के 1,000 μL तक गोली को पुन: निलंबित करें।
    5. पसंद की किसी भी गिनती विधि का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स की गणना करें, अधिमानतः एक छवि-आधारित।
  2. ऑर्गेनोइड्स को बीज दें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले दो अलग-अलग प्रकार के 384-वेल माइक्रोप्लेट के लिए न्यूनतम मात्रा / अच्छी तरह से सामग्री की तालिका देखें।
    1. ईसीएम के जमने से बचने के लिए उपयोग करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर कम से कम 20 मिनट के लिए सभी प्लास्टिकवेयर प्रीकूल करें।
    2. 1 एमएल ऑर्गेनॉइड स्टॉक समाधान (चरण 2.1.6) से बीज का समाधान तैयार करें, जिसमें 50 μL में प्रति अच्छी तरह से बीज ~ 200 ऑर्गेनोइड्स का उपयोग किया जाता है, जो एक कुएं को भरने के लिए उपयोग की जाने वाली न्यूनतम मात्रा है। ऑर्गेनॉइड सीडिंग समाधान की मात्रा की गणना करने के लिए पूरक फ़ाइल 1 का उपयोग करें। 25 एमएल जलाशय और मल्टीचैनल पिपेट या पिपेटिंग रोबोट का उपयोग करते समय 1,500 μL की अवशिष्ट मात्रा जोड़ें।
    3. एक पिपेटिंग रोबोट का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स को बीज दें।
      नोट: ईसीएम के जमने से बचने के लिए पिपेटिंग के दौरान बीज घोल और माइक्रोप्लेट दोनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, एक 25 एमएल जलाशय और माइक्रोप्लेट धारक को पाइपिंग रोबोट के साथ संयोजन में उपयोग करने के लिए 3 डी मुद्रित किया गया था जो सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध शीतलन तत्वों को पकड़ सकता है। कस्टम लैबवेयर (पूरक फ़ाइल 2 और पूरक फ़ाइल 3) और पाइपिंग रोबोट (पूरक फ़ाइल 4 और पूरक फ़ाइल 5) के लिए कस्टम लैबवेयर जेएसओएन फाइलें 3 डी प्रिंटिंग के लिए एसटीएल फाइलें प्रदान की जाती हैं।
      1. ऑनलाइन प्रोटोकॉल डिज़ाइनर टूल का उपयोग करके वितरण प्रोटोकॉल डिज़ाइन करें। एक उदाहरण JSON फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 6) प्रदान की जाती है, जिसमें कस्टम लैबवेयर पहले से ही लोड किया गया है और संबंधित पिपेट युक्तियों के साथ एक आठ-चैनल p300 (Gen2) पिपेट का उपयोग किया जाता है।
      2. पाइपिंग रोबोट नियंत्रण ऐप खोलें, प्रोटोकॉल का चयन करें, आयात पर क्लिक करें, और निर्दिष्ट फ़ील्ड में पूरक फ़ाइल 6 को खींचें और छोड़ दें।
      3. आयातित प्रोटोकॉल का चयन करें और डेक सेटअप फ़ील्ड में दिखाए गए लेआउट के अनुसार डेक में शीतलन तत्वों और प्लास्टिकवेयर सहित सभी लैबवेयर रखें। पूरक फ़ाइल 7 में दिखाए गए अनुसार 25 एमएल जलाशय और शीतलन तत्व के लिए बाएं स्लॉट का उपयोग करें।
      4. रन प्रोटोकॉल पर क्लिक करें और सेटअप के लिए आगे बढ़ें। लैबवेयर सेटअप टैब खोलें, रन लैबवेयर स्थिति जांच पर क्लिक करें, और पाइपिंग रोबोट को नए हार्डवेयर में कैलिब्रेट करने के निर्देशों का पालन करें।
        नोट: लैबवेयर ऑफसेट डेटा को बाद में संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक रन से पहले लैबवेयर स्थिति जांच चलाने की सिफारिश की जाती है।
      5. कूल्ड ऑर्गेनॉइड सीडिंग समाधान के साथ 25 एमएल जलाशय (शीतलन तत्व के शीर्ष पर रखा गया) भरें और स्टार्ट रन पर क्लिक करें।
        नोट: आठ-चैनल पिपेट के उपयोग के कारण शीर्ष और निचले कुएं भी ऑर्गेनॉइड निलंबन समाधान से भर जाते हैं।
      6. माइक्रोप्लेट को 1 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      7. कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      8. वाष्पीकरण से बचने के लिए बाहरी रिक्त कुओं को कम से कम 50 μLH2Oसे भरें।
      9. कुएं में किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जो छवि विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकता है।

3. दिन 4: डिजिटल ड्रग डिस्पेंसर के साथ दवा उपचार और अभिकर्मक वितरण

  1. डिजिटल ड्रग डिस्पेंसर कंट्रोल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दवा वितरण प्रोटोकॉल बनाएं।
    1. प्लेट लेआउट के ऊपर प्लेट 1 पर होवर, प्लेट विशेषताओं को संपादित करें का चयन करें, और प्लेट प्रकार भरें: 384 अच्छी तरह से, अतिरिक्त मात्रा (μL): 50, और DMSO सीमा (%): 1.
    2. तरल पदार्थ के बगल में + बटन पर क्लिक करके तरल पदार्थ जोड़ें। नए बनाए गए तरल पदार्थ पर डबल-क्लिक करें और इसे नाम दें; वर्ग (डीएमएसओ-आधारित या जलीय + ट्वीन 20) और एकाग्रता का चयन करें।
      नोट: सभी दवाओं और अभिकर्मकों को 100% डीएमएसओ या 0.3% ट्वीन -20 में भंग किया जाना चाहिए। <1% की अधिकतम डीएमएसओ एकाग्रता को ध्यान में रखते हुए, 1-10 एमएम स्टॉक समाधान का उपयोग किया जा सकता है। तालिका 2 सामान्य फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों और उपचारों के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने के उदाहरण प्रदान करती है।
    3. प्लेट लेआउट
      1. दवा अनुमापन के लिए, कुओं का चयन करें और अनुमापन पर क्लिक करें। तरल पदार्थ के लिए, रुचि की दवा का चयन करें, उच्चतम एकाग्रता (जैसे, 2,000 एनएम), और सबसे कम एकाग्रता (जैसे, 10 एनएम) चुनें; प्रतिकृति के लिए, न्यूनतम 2 चुनें, और वांछित अनुमापन पैटर्न चुनें।
        नोट: अनुमापन पैटर्न कई कारकों पर निर्भर करेगा, जिसमें एक प्लेट में कितना यौगिक फिट होना है, क्या कुओं को यादृच्छिक किया जाना है, और प्रतिकृति और नियंत्रण की संख्या।
      2. सकारात्मक नियंत्रण के लिए, तीन कुओं का चयन करें, सेट वैल्यू पर क्लिक करें, और डीएमएसओ में 10 एमएम स्टॉक से 2 μM staurosporine भरें, जो अधिकतम कोशिका मृत्यु को प्रेरित करेगा।
      3. साइटोटॉक्स ग्रीन के लिए, सभी उपयोग किए गए कुओं का चयन करें, सेट मान पर क्लिक करें, और 60 एनएम /
        नोट: साइटोटॉक्स ग्रीन फ्लोरोसेंट धुंधला उन कोशिकाओं को इंगित करता है जो मर गए हैं, और इसलिए दवा प्रतिक्रिया निगरानी में हस्तक्षेप नहीं करेंगे। यहां, जीवित कोशिकाओं के लिए कोई फ्लोरोसेंट मार्कर की आवश्यकता नहीं है।
      4. नकारात्मक नियंत्रण और डीएमएसओ सामान्यीकरण के लिए, वाहन नियंत्रण के लिए अतिरिक्त चार कुओं के साथ सभी कुओं का चयन करें, राइट-क्लिक करें, सामान्यीकरण का चयन करें, द्रव वर्ग को सामान्य करें: डीएमएसओ-आधारित, और प्रत्येक कुएं में समान डीएमएसओ एकाग्रता प्राप्त करने के लिए उच्चतम वर्ग की मात्रा को सामान्य करें।
        नोट: डीएमएसओ सांद्रता <1% होनी चाहिए। एक उदाहरण टीडीडी दवा अनुमापन फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 8) प्रदान की जाती है।
      5. शीर्ष बाएं कोने में रन के तहत तीर पर क्लिक करें, हमेशा अनुकरण का चयन करें, और किसी भी त्रुटि की पहचान करने और तैयार की जाने वाली प्रत्येक दवा के वॉल्यूम प्राप्त करने के लिए अनुकरण पर क्लिक करें।
        नोट: एक चेतावनी को दूर करने के लिए जब प्रारंभिक वितरण मात्रा बहुत कम होती है, "प्रत्येक प्लेट पर प्रत्येक तरल पदार्थ के लिए 30 nL या उससे अधिक की चेतावनी वेल की सिफारिश की जाती है," किनारे पर दो कुओं का चयन करें जो पानी से भरे हुए हैं, सेट मान का चयन करें, और दवा के 10 μM दर्ज करें जिसके लिए चेतावनी होती है। यह दवा कारतूस को 30 एनएल से अधिक मात्रा के साथ प्राइम करता है। इन कुओं का उपयोग डीएमएसओ कारतूस को कुल मात्रा मूल्य (जैसे, 0.5%) के % पर सामान्यीकृत सेट करके प्राइम करने के लिए किया जा सकता है।
  2. अनचेक हमेशा रन बटन के तहत अनुकरण करें; दवा वितरण प्रोटोकॉल शुरू करने और निर्देशों का पालन करने के लिए रन पर क्लिक करें।
  3. वाष्पीकरण को रोकने के लिए माइक्रोप्लेट पर सीलिंग झिल्ली लागू करें।
  4. इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर साइटोटॉक्स ग्रीन डाई 1-2 घंटे को इनक्यूबेट करें और चरण 4 पर आगे बढ़ें।

4. लाइव-सेल इमेजर के साथ छवियां प्राप्त करें

नोट: विकास दर और एनडीआर के लिए, साइटोटॉक्स ग्रीन जोड़ने के 1-2 घंटे बाद टाइमपॉइंट 0 (टी 0 = स्टार्ट ट्रीटमेंट) पर एक स्कैन प्राप्त किया जाना चाहिए।

  1. लाइव-सेल इमेजर नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें, विधि संपादक नया चुनें, आयात > फ़ाइल पर जाएँ, और उदाहरण विधि XML फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 9) का चयन करें। वैकल्पिक रूप से, एक नई फ़ाइल बनाएं और प्लेट का चयन करें : (CORE384fb_OpticalImaging) - कॉर्निंग 384 फ्लैट ब्लैक (कॉर्निंग # 4588), कोई ढक्कन और कोई आर्द्रता कैसेट नहीं; आवेदन: छवियां-केवल; उद्देश्य: 4x; पैटर्न: केंद्रीय; चेक चैनल ब्राइटफील्ड और ग्रीन (एलईडी तीव्रता (%) = 40; एक्सपोजर समय (एमएस) = 200)।
    नोट: ग्रीन चैनल सेटिंग्स 60 एनएम साइटोटॉक्स ग्रीन की एकाग्रता के लिए अच्छी तरह से काम करती हैं। लाइव व्यूअर विकल्प का उपयोग वास्तविक समय में फोकस ऑफसेट और / या एलईडी सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए किया जा सकता है।
  2. T0 पर स्कैनिंग शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।
  3. एक ही विधि का उपयोग करके 5 दिनों तक हर 24 घंटे के लिए स्कैन दोहराएं। वैकल्पिक रूप से, टाइमलैप्स माप को स्वचालित रूप से चलाने के लिए, लाइव-सेल इमेजर कंट्रोल सॉफ्टवेयर में विधि को विधि क्षेत्र में काइनेटिक लूप टैब पर क्लिक करके और खींचकर गतिज प्रयोग में समायोजित करें। इसी तरह, प्रयोग के दौरान लाइव-सेल इमेजर के भीतर सही स्थिति सुनिश्चित करने के लिए सिस्टम को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेट करने के लिए तापमान और गैस टैब को विधि क्षेत्र में खींचा जाना चाहिए।

5. छवि और डेटा विश्लेषण

  1. डेटा को मर्ज करना और संपीड़ित करना
    1. लाइव-सेल इमेजर कंट्रोल सॉफ्टवेयर प्रत्येक टाइमपॉइंट पर प्रत्येक स्कैन के लिए एक फ़ोल्डर उत्पन्न करता है। एक नया फ़ोल्डर बनाएँ, इस नए पेरेंट फ़ोल्डर में अलग-अलग प्रयोग फ़ोल्डरों की प्रतिलिपि बनाएँ, और संबंधित प्रयोग फ़ोल्डर नामों में _0h, _24h, _48h, _72h, _96h और _120h जोड़ें.
    2. दवा वितरण प्रोटोकॉल से प्लेट मैप लेआउट पर राइट-क्लिक करके डिजिटल ड्रग डिस्पेंसर कंट्रोल सॉफ्टवेयर से एक्सएलएसएक्स प्लेट मैप तैयार करें और सभी कुओं की प्रतिलिपि बनाएं; डेटा को XLSX फ़ाइल में चिपकाएँ। साइटोटॉक्स ग्रीन और स्टौरोस्पोरिन डेटा को हटा दें और सेल लाइन और प्रतिकृति के लिए एक मैट्रिक्स जोड़ें। ctrl- और ctrl+ दर्ज करें। उदाहरण प्लेट मानचित्र के लिए अनुपूरक फ़ाइल 10 देखें.
    3. डेटा संपीड़न उपकरण खोलें, ब्राउज़ पर क्लिक करें, मूल फ़ोल्डर का चयन करें, और छवि डेटा संपीड़न प्रारंभ करने के लिए चलाएँ पर क्लिक करें. विभिन्न टाइमपॉइंट के लिए सभी टीआईएफएफ छवि फ़ाइलों को पैतृक फ़ोल्डर के भीतर एक नए डेटासेट फ़ोल्डर में प्रत्येक कुएं के लिए एकल एचडीएफ 5 में संपीड़ित किया जाता है।
  2. छवि विश्लेषण
    1. छवि विश्लेषण वेबऐप प्लेटफ़ॉर्म पर जाएं, लॉग इन करें, और होम टैब में नया प्रोजेक्ट जोड़ें पर क्लिक करें। प्रोजेक्ट का नाम दर्ज करें, जारी रखें, नया प्रयोग जोड़ें का चयन करें, और HDF5 फ़ाइलों वाले डेटासेट फ़ोल्डर अपलोड करें।
    2. अपलोड करने के बाद, प्रोजेक्ट और प्रयोग फ़ोल्डर में जाएं और अतिरिक्त कार्यक्षमताओं के लिए अपलोड प्लेटमैप पर क्लिक करें। रन विश्लेषण पर क्लिक करें, मल्टी-ऑर्गनॉइड विश्लेषण, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का चयन करें, और छवि विश्लेषण शुरू करने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें।
    3. कच्चे डेटा तालिकाओं को डाउनलोड करने के लिए डाउनलोड परिणामों पर क्लिक करें जिसमें प्रत्येक कुएं (जैसे, कुल उज्ज्वल क्षेत्र, कुल फ्लोरेसेंस ग्रीन एरिया, आदि) के लिए माप होते हैं और विश्लेषण की सटीकता और आगे डेटा प्रोसेसिंग की पुष्टि करने के लिए खंडित छवियां / वीडियो होते हैं।
  3. विकास दर-आधारित दवा प्रतिक्रिया मैट्रिक्स और सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया
    1. परिणाम फ़ोल्डर (प्लेट मैप आवश्यक) (पूरक फ़ाइल 11) से Raw_NDR.xlsx फ़ाइल का चयन करें और इसे Official_NDR_7point R-स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 12) में लोड करें ताकि स्वचालित रूप से GR (ctrl-के लिए सामान्यीकृत) और NDR (ctrl- और ctrl+) मान तालिकाओं (पूरक फ़ाइल 13, पूरक फ़ाइल 14, पूरक फ़ाइल 15, और पूरक फ़ाइल 16) उत्पन्न हो सके। ). जीआर और एनडीआर मानों की गणना आर-स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 12) का उपयोग करके समीकरण (1) में दिखाए गए पैरामीटर से की जाती है।
      कुल उत्तरजीविता क्षेत्र = कुल ब्राइटफील्ड क्षेत्र - कुल हरा क्षेत्र (1)
      जहां 0 < एनडीआर <1 = साइटोस्टैटिक प्रभाव (विकास गिरफ्तारी), और एनडीआर < 0 = साइटोटोक्सिक प्रतिक्रिया (कोशिका मृत्यु)।
      नोट: आर-स्क्रिप्ट को गुप्ता एट अल.6 से अनुकूलित किया गया था।
    2. clonal_data.xlsx तालिका से, एकल-ऑर्गेनॉइड प्रतिक्रिया डेटा पुनर्प्राप्त करें और उन्हें बुलबुला प्लॉट के रूप में प्लॉट करें।
    3. रन की दवा स्क्रीन गुणवत्ता का आकलन करने के लिए जेड-फैक्टर10 का उपयोग करें (समीकरण (2))। 0.5 < जेड-फैक्टर के साथ एक प्रयोग को छोड़ दें।
      Equation 1(2)

Representative Results

स्वचालित पाइपिंग प्रोटोकॉल 384-वेल माइक्रोप्लेट (चित्रा 2 ए) के सभी स्तंभों में पीडीटीओ के PDAC_060 का समान वितरण सुनिश्चित करता है। जैसा कि अपेक्षित था, कुओं के बीच पीडीटीओ की संख्या और औसत क्षेत्र में भिन्नता देखी गई (चित्रा 2 ए, बी)। कुल उत्तरजीविता क्षेत्र (कुल उज्ज्वल क्षेत्र - कुल हरा क्षेत्र) प्रतिदीप्ति-आधारित कोशिका मृत्यु संकेत के साथ लेबल-मुक्त ऑर्गेनॉइड विभाजन को जोड़ता है और हमारे अनुभव में, समय के साथ दवा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे मजबूत पैरामीटर है (चित्रा 2 सी)8। सेल सीडिंग और ऑर्गेनॉइड आकार में भिन्नताओं के लिए, प्रतिकृति के बीच भिन्नताओं को कम करने के लिए विकास दर-आधारित मैट्रिक्स का उपयोग किया जाना चाहिए, जैसा कि चित्रा 2 डी बनाम चित्रा 2 सी में कम त्रुटि सलाखों द्वारा दिखाया गया है, और एक उच्च जेड-कारक जो दृढ़ता से बेहतर दवा स्क्रीन गुणवत्ता (चित्रा 2 ई) का संकेत देता है।

एनडीआर खुराक-प्रतिक्रिया वक्र (चित्रा 2 जी), सीटीआरएल- और सीटीआरएल + में सामान्यीकृत, स्पष्ट रूप से जीआर खुराक-प्रतिक्रिया वक्र (चित्रा 2 एफ) से बेहतर है, जिसे सीटीआरएल में सामान्यीकृत किया गया है, क्योंकि यह दवा प्रतिक्रिया वक्रों के पृथक्करण को बढ़ाता है और अधिक सटीक रूप से साइटोटोक्सिक दवा प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करता है। ctrl-, ctrl+, और 400 nM gemcitabine/80 nM पैक्लिटैक्सेल-उपचारित PDTO के लिए संबंधित छवियों का एक उदाहरण चित्र 3 में दिखाया गया है। एक दिलचस्प अवलोकन यह है कि जेमसिटाबाइन का साइटोटोक्सिक प्रभाव संयोजन चिकित्सा में प्रमुख था क्योंकि पैक्लिटैक्सेल का कोई अतिरिक्त मूल्य नहीं देखा गया था।

इसके बाद, दो अतिरिक्त पीडीटीओ लाइनों, PDAC_052 और PDAC_087 का उपयोग किया गया था। इन लाइनों के बीच विकास दर में एक स्पष्ट अंतर देखा गया (चित्रा 4 ए), जो जीआर मैट्रिक्स के उपयोग का समर्थन करता है। फिर, एनडीआर खुराक-प्रतिक्रिया वक्र (चित्रा 4 सी) के परिणामस्वरूप जीआर कर्व्स (चित्रा 4 बी) की तुलना में तीन अलग-अलग रोगियों के बीच एक बढ़ी हुई गतिशील सीमा और अलगाव हुआ। इसके अलावा, प्रोटोकॉल समय के साथ एनडीआर के निर्धारण की अनुमति देता है और दिखाता है कि PDAC_052 और PDAC_060 में जेम-पैक (चित्रा 4 डी) की कम खुराक के लिए बहुत समान साइटोस्टैटिक दवा प्रतिक्रिया थी, जबकि जेम-पैक के मध्य (चित्रा 4 ई) और उच्च खुराक (चित्रा 4 एफ) के लिए एक स्पष्ट अंतर साइटोस्टैटिक बनाम साइटोटोक्सिक प्रतिक्रिया देखी जा सकती है। ये दवा प्रतिक्रियाएं रोगियों में देखी गई नैदानिक प्रतिक्रियाओं के अनुरूप थीं (चित्रा 4 जी)।

अंत में, दृष्टिकोण और सॉफ्टवेयर का एक बड़ा लाभ यह है कि प्रतिक्रिया विषमता का अध्ययन करने और संभावित प्रतिरोधी उपक्लोनों की पहचान करने के लिए एकल-ऑर्गेनॉइड दवा प्रतिक्रियाओं को परिमाणित किया जा सकता है। चित्रा 5 विभिन्न रोगियों की क्लोनल गतिशीलता का एक स्पष्ट अवलोकन प्रदान करता है और दिखाता है कि पीडीएसी -087 में उपचार के बाद सबसे प्रतिरोधी उपक्लोन थे, जो रोगी में देखी गई आक्रामक और अत्यधिक प्रतिरोधी बीमारी के अनुरूप है। दिलचस्प बात यह है कि यह रोगी सीटीआरएल + स्टौरोस्पोरिन के प्रति कम से कम संवेदनशील था।

Figure 1
चित्र 1: वर्कफ़्लो अवलोकन. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सीडिंग सटीकता और दवा प्रतिक्रिया मैट्रिक्स। (ए) पिपेटिंग रोबोट का उपयोग करके 384-वेल माइक्रोप्लेट में बीजित PDAC_060 पीडीटीओ के ऑर्गेनोइड गिनती / प्रत्येक बिंदु एक ही कुएं में गिनती का प्रतिनिधित्व करता है और भूखंडों को 384-वेल माइक्रोप्लेट कॉलम द्वारा अलग किया जाता है। (बी) औसत पीडीटीओ क्षेत्र / (ग) जेमसिटाबाइन/पैक्लिटैक्सेल के 5:1 अनुपात के साथ उपचारित PDAC_060 पीडीटीओ की कुल उत्तरजीविता क्षेत्र (कुल उज्ज्वल क्षेत्र - कुल हरित क्षेत्र) और (डी) वृद्धि दर (टी0 = 1 तक सामान्यीकृत कुल जीवित रहने का क्षेत्र)। (ई) परख गुणवत्ता के लिए एक मीट्रिक के रूप में जेड-फैक्टर। (एफ) विकास दर-खुराक प्रतिक्रिया वक्र सीटीआरएल- और (जी) सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया वक्र को सीटीआरएल- और सीटीआरएल + में सामान्यीकृत किया गया। त्रुटि पट्टियाँ दो कुओं के माध्य ± एसडी को इंगित करती हैं। संक्षेप: पीडीएसी = अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा; पीडीटीओ = रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड; जीआर = विकास दर; एनडीआर = सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: उदाहरण छवियाँ. PDAC_060 पीडीटीओ की प्रतिनिधि छवियों को वाहन (ctrl-), 400 nM gemcitabine / 80 nM पैक्लिटैक्सेल, और 2 μM staurosporin (ctrl+) के साथ इलाज किया जाता है। बाएं कॉलम ब्राइटफील्ड छवियों को दिखाता है, मध्य कॉलम साइटोटॉक्स ग्रीन फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाता है, और दायां कॉलम ऑर्गेनॉइड विश्लेषण मॉड्यूल का उपयोग करके लेबल-मुक्त एनोटेट ब्राइटफील्ड छवियों को दिखाता है। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: पीडीएसी = अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा; पीडीटीओ = रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड; GemPac = gemcitabine/ पैक्लिटैक्सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
(ए) पीडीटीओ लाइनों के PDAC_052, PDAC_060 और PDAC_087 की वृद्धि दर (कुल जीवित रहने के क्षेत्र के आधार पर) की तुलना। (बी) विकास दर-खुराक प्रतिक्रिया वक्र सीटीआरएल- और (सी) सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया वक्र को सीटीआरएल- और सीटीआरएल + में सामान्यीकृत किया गया। पैक्लिटैक्सेल की उच्च खुराक (5: 1 अनुपात) और (डी) कम, (ई) मध्य, और (एफ) उच्च खुराक का काइनेटिक एनडीआर। (जी) पीडीएसी रोगियों की नैदानिक विशेषताएं। त्रुटि पट्टियाँ दो कुओं के माध्य ± एसडी को इंगित करती हैं। संक्षेप: पीडीएसी = अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा; पीडीटीओ = रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड; जीआर = विकास दर; एनडीआर = सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया; एफएफएक्स = फोलफिरिनोक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एकल ऑर्गेनॉइड मैट्रिक्स। सेल मृत्यु (ग्रीन एरिया/ब्राइटफील्ड एरिया) और PDAC_052 PDAC_060 के क्षेत्र (ब्राइटफील्ड) और PDAC_087 पीडीटीओ के क्षेत्र (ब्राइटफील्ड) के आधार पर एकल ऑर्गेनॉइड खुराक प्रतिक्रिया वाहन (सीटीआरएल-), 400 एनएम जेमसिटाबाइन/80 एनएम पैक्लिटैक्सेल और 2 μM staurosporine (ctrl+) के साथ इलाज किया जाता है। हरे क्षेत्र व्यवहार्य ऑर्गेनोइड्स का संकेत देते हैं; नीले क्षेत्र जेमपैक और ctrl + भूखंडों की x-as रेंज को इंगित करते हैं। संक्षेप: पीडीएसी = अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा; पीडीटीओ = रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड; GemPac = gemcitabine/ पैक्लिटैक्सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल निलंबन स्टॉक कोशिकाएं/ड्रॉप # बूंदें (20 μL) स्टॉक (1/3) ईसीएम (2/3)
1.13 × 107 कोशिकाएं / 75,000 10 75 uL 150 μL
1.13 × 107 कोशिकाएं / 75,000 5 40 uL 80 μL

तालिका 1: ईसीएम गुंबदों में चढ़ाना के लिए कमजोर पड़ना। संक्षिप्त नाम: ईसीएम = बाह्य मैट्रिक्स।

यौगिक स्टॉक एकाग्रता तनूकरण काम करने की एकाग्रता विलायक अच्छी एकाग्रता टिप्पणियाँ
साइटोटॉक्स ग्रीन 1 mM (DMSO) 1/10 10 μM DMSO 60 nM कोशिका मृत्यु मार्कर
साइटोटॉक्स लाल 1 mM (DMSO) 1/10 10 μM DMSO 250 nM कोशिका मृत्यु मार्कर
कैसपेज़ 3/7 ग्रीन 5 mM (DMSO) 1/2 2.5 mM DMSO 2.5 μM एपोप्टोटिक मार्कर
Hoechst 20 mM (H2O) 1/200 100 μM 0.33% ट्वीन / 50 nM परमाणु मार्कर
स्टौरोस्पोरिन 10 mM (DMSO) / 1 - 10 mM / 2 – 5 μM सकारात्मक नियंत्रण
जेमसिटाबाईन 10 mM (DMSO) / 1 - 10 mM / अनुमापन कीमोथेरपी
पैक्लिटैक्सेल 10 mM (DMSO) / 1 - 10 mM / अनुमापन कीमोथेरपी
सिस्प्लैटिन 5 mM (0.9% NaCl) 1/2 2.5 mM 0.6% ट्वीन / अनुमापन कीमोथेरपी

तालिका 2: अक्सर इस्तेमाल की जाने वाली दवाओं और फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों के उदाहरण कमजोर पड़ने। प्रत्येक यौगिक को 100% डीएमएसओ या 0.3% ट्वीन / पीबीएस में भंग करने की आवश्यकता होती है।

पूरक तालिका एस 1: संगत कैंसर सेल लाइनों का अवलोकन। स्थैतिक: स्फेरॉइड प्रवासी नहीं हैं। मर्ज: स्फेरॉइड एक-दूसरे की ओर पलायन करते हैं और एक साथ विलय होते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: ऑर्गेनोइड सीडिंग समाधान गणना उपकरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: 3 डी प्रिंटिंग कस्टम लैबवेयर 'माइक्रोप्लेट होल्डर' के लिए एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: 3 डी प्रिंटिंग कस्टम लैबवेयर '2 x 25 एमएल जलाशय धारक' के लिए एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: कस्टम लैबवेयर पाइपिंग रोबोट 'माइक्रोप्लेट होल्डर' के लिए जेएसओएन फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 5: कस्टम लैबवेयर पाइपिंग रोबोट '2 x 25 एमएल जलाशय Holder_WithCooler' के लिए जेएसओएन फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फाइल 6: जेएसओएन रोबोट प्रोटोकॉल 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23' के लिए फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 7: पाइपिंग रोबोट डेस्क सेटअप का अवलोकन। (ए) शीतलन तत्व और (बी) जलाशय और माइक्रोप्लेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 8: डिजिटल ड्रग डिस्पेंसर के प्रोटोकॉल के लिए टीडीडी फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 9: ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए लाइव-सेल इमेजर के प्रोटोकॉल के लिए एक्सएमएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 10: उदाहरण प्लेट मानचित्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 11: NDR R स्क्रिप्ट के लिए उदाहरण इनपुट फ़ाइल। संक्षिप्त नाम: एनडीआर = सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 12: सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया एनडीआर आर स्क्रिप्ट। संक्षिप्त नाम: एनडीआर = सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 13: एनडीआर आर स्क्रिप्ट जीआर मानों की उदाहरण आउटपुट फ़ाइल। संक्षेप: जीआर = विकास दर; एनडीआर = सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 14: जीआर मानों के साथ एनडीआर आर स्क्रिप्ट की उदाहरण आउटपुट फ़ाइल। संक्षेप: जीआर = विकास दर; एनडीआर = सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एसअपप्लेमेंट्री फ़ाइल 15: एनडीआर आर स्क्रिप्ट एनडीआर मानों की उदाहरण आउटपुट फ़ाइल। संक्षिप्त नाम: एनडीआर = सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 16: एनडीआर मानों के साथ एनडीआर आर स्क्रिप्ट की उदाहरण आउटपुट फ़ाइल। संक्षिप्त नाम: एनडीआर = सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

मध्यम से उच्च-थ्रूपुट पीडीटीओ दवा स्क्रीनिंग अक्सर रीडआउट पर निर्भर करती है जो केवल जानकारी का एक अंश निकालती है जो ऑर्गेनोइड संभावित रूप से प्रदान कर सकती है। यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि, तेजी से विकसित ऑर्गेनॉइड तकनीक के लिए अधिक वैज्ञानिक और नैदानिक क्षमता का एहसास करने के लिए, अधिक उन्नत 3 डी परख, रीडआउट और विश्लेषण विधियों की गंभीर रूप से आवश्यकता है। यहां, एक उन्नत स्क्रीनिंग पाइपलाइन का वर्णन किया गया है, जो न केवल प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है, बल्कि एआई-संचालित, लाइव-सेल इमेजिंग रीडआउट को शामिल करके नैदानिक ट्रांसलेबिलिटी को भी काफी बढ़ाता है। इन-हाउस विकसित विश्लेषण सॉफ्टवेयर के अलावा, सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया मीट्रिक (एनडीआर) का उपयोग लागू किया जाता है, जो स्पष्ट रूप से उपचार प्रतिक्रिया 6 में रोगी-विशिष्ट अंतर को परिभाषित करने की अपनी क्षमता को प्रदर्शित करताहै।

इस सामान्यीकरण मीट्रिक को शामिल करना निस्संदेह जबरदस्त मूल्य का होगा, यह याद करते हुए कि कई अध्ययनों का उद्देश्य वक्र (एयूसी) या अर्ध-अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50) के तहत क्षेत्र में मामूली अंतर के आधार पर उपचार प्रतिक्रियाओं को चित्रित करना है (क्योंकि अधिकांश खुराक-प्रतिक्रिया वक्र ओवरलैप होते हैं / एक दूसरे के करीब स्थित होते हैं) 11,12 . एटीपी-आधारित परख का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड ड्रग स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में वृद्धि दर मैट्रिक्स पहले से ही लागू किए गए हैं, लेकिन समय बिंदु 04 पर संदर्भ कुओं के सामान्यीकरण पर भरोसा करते हैं। इसके विपरीत, यह विधि इंट्रावेल विकास-दर सामान्यीकरण की अनुमति देती है, जो न केवल पीडीटीओ विकास दर में अंतर-रोगी अंतर के लिए जिम्मेदार है, बल्कि प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए सीडिंग घनत्व और प्लेट स्थान-निर्भर प्रभावों में भिन्नता के परिणामस्वरूप अंतर-कल्याण अंतर भी है। इसके अलावा, हमने सामान्यीकरण 6,8 के लिए सकारात्मक नियंत्रण को शामिल करके इंटरपेशेंट पीडीटीओ प्रतिक्रिया के पृथक्करण को और बढ़ाने के लिए एनडीआर को अनुकूलित किया।

इसके अलावा, विश्लेषण, जो उच्च-थ्रूपुट और स्वचालन प्रारूपों के साथ संगत है, व्यक्तिगत ऑर्गेनोइड प्रतिक्रियाओं का सटीक रूप से पता लगा सकता है, जिससे सबक्लोनल प्रतिरोध की मात्रा का ठहराव संभव हो सकता है- ट्यूमर रिलैप्स और प्रगति13 की प्रमुख ड्राइविंग शक्ति। उदाहरण के लिए, हालांकि पीडीएसी 052 और पीडीएसी 060 ने विट्रो (एनडीआर के आधार पर) में उपचार के लिए अच्छी प्रतिक्रिया दिखाई, अतिरिक्त एकल-ऑर्गेनॉइड विश्लेषण उपक्लोनों की एक छोटी (बड़ी आबादी पीडीएसी 060 के साथ बड़ी आबादी) का पता लगाने में सक्षम था जो उपचार का जवाब नहीं देते हैं। दिलचस्प बात यह है कि यह नैदानिक अवलोकन के साथ अत्यधिक मेल खाता है, यह देखते हुए कि पीडीएसी 052 और पीडीएसी 060 में एक टिकाऊ प्रतिक्रिया थी (कोई ट्यूमर गतिविधि का पता नहीं चला) लेकिन अंततः दोनों को स्थानीय ट्यूमर प्रगति (प्रतिरोधी क्लोन की उपस्थिति के कारण) का निदान किया गया था। पारंपरिक 3 डी रीडआउट (एटीपी-आधारित परख और आकार / संख्या) की तुलना में, इस उन्नत स्क्रीनिंग पाइपलाइन से इन 'रोगियों-इन-द-लैब' से अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक जानकारी निकालकर पूर्वानुमानित प्रदर्शन में वृद्धि होने की उम्मीद है। इस परिकल्पना का परीक्षण अब लेखकों की प्रयोगशाला में नैदानिक पीडीटीओ नमूनों की स्क्रीनिंग करके किया जा रहा है ताकि विवो प्रतिक्रिया और नैदानिक परिणाम के साथ पूर्व विवो को सहसंबंधित किया जा सके।

दवा प्रतिक्रिया के तंत्र में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, साइटोटॉक्सिसिटी रंगों के अलावा पारंपरिक फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग अभिकर्मक, कोशिका मृत्यु के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस विधि के साथ संगत हैं। हमने पहले सिस्प्लैटिन उपचार 8 के बाद एपोप्टोसिस के कैसपेज़-निर्भर प्रेरण का अध्ययन करने के लिए सर्टोरियस कैस्पेज़ 3/7 ग्रीनअभिकर्मक के साथ इस विधि की संगतता दिखाई है। ऑक्सीडेटिव तनाव (सेलआरओएक्स अभिकर्मकों) या हाइपोक्सिया (छवि-आईटी हाइपोक्सिया अभिकर्मकों) का अध्ययन करने के लिए अन्य रंगों के साथ संगतता का परीक्षण किया जाना बाकी है। हालांकि, इन अभिकर्मकों को पहले से ही 3 डी इन विट्रो मॉडल14,15 में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।

छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर अन्य प्लेट प्रारूपों या संवर्धन विधियों (जैसे, माइक्रोकैविटी प्लेट्स, ईसीएम गुंबद) के साथ भी संगत है यदि ऑर्गेनोइड्स की स्पष्ट, इन-फोकस छवियों को कैप्चर किया जा सकता है। यह अक्सर गुंबदों में सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स के लिए चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि वे विभिन्न जेड-प्लेन में बढ़ते हैं, जिसके लिए माइक्रोस्कोप की जेड-स्टैकिंग कार्यक्षमता की आवश्यकता होती है जो हमेशा उपलब्ध नहीं होती है। इसलिए, हम पर्याप्त गुणवत्ता की छवियों को सुनिश्चित करने के लिए फ्लैट-बॉटम यूएलए 384-वेल माइक्रोप्लेट के उपयोग की सलाह देते हैं।

इसके अलावा, विश्लेषण अन्य लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम के साथ संगत है, जैसा कि पहले इनक्यूसाइट ज़ूम सिस्टम8 के साथ कैप्चर किए गए चरण-कंट्रास्ट छवियों के लिए दिखाया गया था। स्पार्क साइटो लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम की एक सीमा जिसका उपयोग इस पांडुलिपि में किया गया था, गतिज माप के लिए एक-प्लेट क्षमता है। हालांकि, स्पार्क मोशन विस्तार इसकी क्षमता को 40 माइक्रोप्लेट तक बढ़ाता है जिसे थोक में स्क्रीन किया जा सकता है। इन-हाउस विकसित सॉफ्टवेयर की संगतता को इन और अन्य प्रणालियों में विस्तारित किया जाएगा ताकि छवि और डेटा विश्लेषण पाइपलाइनों को मानकीकृत और स्वचालित करने के लक्ष्य के साथ एक मंच-अज्ञेय समाधान प्रदान किया जा सके। वेब-आधारित एप्लिकेशन में इंटरैक्टिव ग्राफिंग टूल और स्वचालित दवा मीट्रिक गणना भी शामिल होगी, जैसा कि इस पेपर में दिखाया गया है, मैनुअल विश्लेषण समय को कम करने के लिए।

लेबल-मुक्त पीडीटीओ विभाजन एल्गोरिथ्म को अलग-अलग रूपात्मक अंतर (ठोस, अर्ध-ठोस, सिस्टिक) के साथ विभिन्न इन-हाउस विकसित स्फेरॉइड और पीडीटीओ मॉडल पर प्रशिक्षित और परीक्षण किया गया था, और परिणामस्वरूप उच्च सटीकता के साथ इनका पता लगाया जा सकताहै। मॉडल की एक सीमा यह है कि सिस्टिक पीडीटीओ को शामिल करने से सीडिंग के बाद कुएं में मौजूद बुलबुले का अवांछित पता लगाने में वृद्धि हुई। हालांकि, रात भर इनक्यूबेशन इन बुलबुले में से अधिकांश को हटाने के लिए पर्याप्त था, जिससे गुणात्मक टाइमपॉइंट 0 स्कैन की अनुमति मिली। ऑर्गेनॉइड छवि विभाजन और विधि की सटीकता को अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा मान्य करने की आवश्यकता है, और उनकी प्रतिक्रिया के आधार पर, सॉफ्टवेयर को एक मजबूत और स्वचालित छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म प्राप्त करने के लिए आगे प्रशिक्षित किया जा सकता है। इसके अलावा, हम इस विधि द्वारा निर्धारित पूर्व विवो दवा प्रतिक्रिया को रोगी में नैदानिक प्रतिक्रिया से सहसंबंधित करने के लिए अधिक नैदानिक डेटा प्राप्त करने का लक्ष्य रखते हैं ताकि चिकित्सा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए सर्वोत्तम मापदंडों की पहचान की जा सके और कार्यात्मक सटीक कैंसर दवा 16 के लिए इस विधिको विकसित किया जा सके।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध का एक हिस्सा विभिन्न दाताओं से दान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जिसमें शामिल हैं डेडे शिल्डे वीजेडडब्ल्यू तथा श्री विली फ्लोरेन। यह काम आंशिक रूप से फ्लेमिश रिसर्च फाउंडेशन, 12एस 9221 एन (एएल), जी044420 एन (एसवी, ए एल, ईजी), 1 एस 27021 एन (एमएल), और एंटवर्प विश्वविद्यालय के औद्योगिक अनुसंधान कोष, पीएस आईडी 45151 (एसवी, ए एल, सीडी) द्वारा वित्त पोषित है। चित्र 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Greiner 657160
8-Channel p300 (GEN 2) pipette Opentrons
300 µL Tips Opentrons
384-well flat-bottom ULA microplate Corning 4588 minimum volume 50 µL 
384-well flat-bottom ULA Phenoplate Perkin Elmer 6057802 minimum volume 75 µL 
A8301 Tocris Bioscience 2939
ADF+++ Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin
Advanced DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 12634
B27 ThermoFisher Scientific 17504044
Breathe easy sealing membrane Sigma-Aldrich Z380059
Caspase 3/7 Green  Sartorius 4440
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Bio-Rad Laboratories 1450017
CellTiter-Glo 3D Promega G9681 ATP-assay
Cooler for 25 mL reservoir VWR (Diversified Biotech) 490006-908
Cooling element 12 x 8 x 3 cm Bol.com 9200000107744702 For custom microplate holder OT-2
Cultrex Organoid Harvesting Solution R&D systems 3700-100-01
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2  R&D systems 3533-010-02 extracellular matrix (ECM)
Cytotox Green Sartorius 4633
Cytotox Red Sartorius 4632
D300e Tecan Digital drug dispenser
D300e Control v3.3.5 Tecan Control software D300e
FGF10 Peprotech 100-26
Full Medium ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin
Gastrin Sigma-Aldrich G9145
Gemcitabine Selleck Chemicals S1714
GlutaMAX ThermoFisher Scientific 35050
HEPES ThermoFisher Scientific 15630056
Hoechst 33342 Solution (20 mM) ThermoFisher Scientific 62259
Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)
N-acetyl-cysteine Sigma-Aldrich A9165-25G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-100G
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium Immunoprecise N002
Opentrons App v6.0.1 Opentrons OT-2 control software
Opentrons Protocol Designer Tool Opentrons https://designer.opentrons.com/
Orbits data compression tool www.orbits-oncology.com or contact corresponding author
Orbits image analysis webapp University of Antwerp www.orbits-oncology.com or contact corresponding author
OT-2 Opentrons Pipetting robot
Paclitaxel Selleck Chemicals S1150
Pasteur Pipette 230 mm  Novolab A33696
Peniciline-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140
Prism 9 GraphPad
Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium Immunoprecise N003
Spark Cyto 600 Tecan Live-cell imaging and multi-mode platereader
SparkControl v3.1 Tecan Spark Cyto control software
Staurosporine Tocris Bioscience 1285
Sterile 25 mL reservoir VWR (Diversified Biotech) 10141-922
T8 plus cassette Tecan
TC20 Bio-Rad Laboratories automated cell counter
TrypLE ThermoFisher Scientific 12604-021 dissociation enzyme
Tween-20 Acros Organics 233360010
WNT Surrogate-Fc-Fusion protein Immunoprecise N001
Y-27632 Selleck Chemicals S1049

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