Summary
تصف هذه الدراسة تقنية لإنشاء نموذج فئران السيليكا مع استنشاق السيليكا من خلال الجسم كله في غرفة الاستنشاق. يمكن للفئران المصابة بالسحار السيليكي عن كثب العملية المرضية لداء السيليكاتس البشري بطريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة مع قابلية جيدة للتكرار.
Abstract
السبب الرئيسي للسحار السيليسي هو استنشاق السيليكا في البيئة المهنية. على الرغم من بعض الاختلافات التشريحية والفسيولوجية ، لا تزال نماذج القوارض أداة أساسية لدراسة السحار السيليسي البشري. بالنسبة للسحار السيليسي ، يجب أن تكون العملية المرضية الكلاسيكية قابلة للتحفيز عن طريق استنشاق جزيئات الكوارتز المتولدة حديثا ، مما يعني على وجه التحديد إحداث مرض مهني بشري. وصفت هذه الدراسة تقنية لإنشاء ومحاكاة عملية التطور الديناميكي المرضي للسحار السيليسي بشكل فعال. علاوة على ذلك ، كانت هذه التقنية قابلة للتكرار بشكل جيد دون إجراء عملية جراحية. تم تصنيع نظام التعرض للاستنشاق والتحقق من صحته واستخدامه في دراسات السموم حول استنشاق الجسيمات القابلة للتنفس. وكانت المكونات الحاسمة على النحو التالي: (1) مولد مسحوق SiO2 الجاف السائب المعدل باستخدام وحدة تحكم في تدفق الهواء؛ (2) مولد مسحوق SiO 2 جاف السائب تم تعديله باستخدام جهاز تحكم في تدفق الهواء؛ (2) مولد مسحوق SiO 2 جاف السائب تم تعديله باستخدام جهاز تحكم في تدفق الهواء. (2) 0.3 م3 غرفة التعرض لاستنشاق الجسم بالكامل تستوعب ما يصل إلى 3 فئران بالغة ؛ (3) نظام مراقبة وتحكم لتنظيم تركيز الأكسجين ودرجة الحرارة والرطوبة والضغط في الوقت الفعلي ؛ و (4) حاجز ونظام التخلص من النفايات لحماية فنيي المختبرات والبيئة. باختصار ، يبلغ البروتوكول الحالي عن الاستنشاق عبر الجسم كله ، وأنشأت غرفة الاستنشاق نموذجا موثوقا ومعقولا وقابلا للتكرار لسيليكوتيك الفئران مع معدل وفيات منخفض وإصابة أقل وحماية أكبر.
Introduction
السحار السيليسي ، الذي يسببه استنشاق السيليكا ، هو أخطر مرض مهني في الصين ، حيث يمثل أكثر من 80٪ من إجمالي عدد تقارير الأمراض المهنية كل عام1. مسببات السحار السيليسي واضحة ، ويمكن الوقاية منها والسيطرة عليها ، ولكن لا توجد طريقة علاج فعالة متاحة2. أثبتت العديد من الأدوية فعاليتها في الدراسات الأساسية ، لكن لها تأثيرات سريرية غير دقيقة 3,4. لذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى استكشاف الآليات المرضية والفسيولوجية للسحار.
استخدمت العديد من الدراسات ضخ السيليكا لمرة واحدة في القصبة الهوائية للجرذان أو الفئران للتحقيق في التسبب في السحارالسيليسي 5,6. على الرغم من أنه يمكن الحصول على نماذج سيليكوتيك القوارض هذه في وقت قصير7 ، إلا أن هذه الأساليب لا تزال تواجه تحديات ، مثل صدمة وارتفاع معدل الوفيات. تضمنت بعض الدراسات غرس السيليكا المخزنة في الرئتين للحث على تفاعل رئوي غير محدد ، لكنها لم تذكر العقيدات السيليكية في الفئران8. علاوة على ذلك ، بعيدا عن داء السيليكا الحاد ، أدى التعرض المزمن للسيليكا في البيئات المهنية إلى انخفاض الالتهاب الرئوي بشكل ملحوظ ورفع مستويات العلامات المضادة لموت الخلايا المبرمج ، بدلا من العلامات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج ، في الرئتين9. لذلك ، هناك حاجة إلى نموذج حيواني موثوق ومعقول وقابل للتكرار لاستكشاف التسبب في السحار السيليسي بشكل أكبر.
تصف الدراسة الحالية طريقة لمحاكاة عملية المرض للمرضى الذين يعانون من داء السيليكا من خلال استنشاق السيليكا عبر الجسم كله ، والجسيمات التي يتم توصيلها بالهواء في غرفة الاستنشاق ، والتي تتألف من مولد السيليكا الذي يتم توصيله بالهواء ، وغرفة الجسم بالكامل ، ونظام التخلص من النفايات. هذه الطريقة بسيطة وسهلة التشغيل وتحاكي بشكل فعال عملية التطور الديناميكي المرضي للسحار السيليسي. أيضا ، يتم تحديد العديد من الآليات الممكنة والتسبب في السحار السيليسي باستخدام هذه الطريقة10،11،12. ومن المتوقع أن يساعد البروتوكول المقترح في إجراء مزيد من التحقيقات في مجال أبحاث السحار السيليسي ذي الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على وفقا لدليل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة لرعاية واستخدام المختبر ووافقت عليها لجنة أخلاقيات جامعة شمال الصين للعلوم والتكنولوجيا (رمز البروتوكول LX2019033 و 2019-3-3 من الموافقة). تم استخدام ذكور فئران Wistar ، التي يبلغ عمرها 3 أسابيع ، في هذه الدراسة. تم الاحتفاظ بجميع الفئران في أقفاص ثابتة مع نشارة الخشب. تم الحفاظ على في دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة ، وتم تزويدها بالطعام والماء حسب الحاجة. أجريت تجارب المتابعة بعد 1 أسبوع من التغذية التكيفية.
1. إعداد
- عند الوصول ، قم بإيواء جميع الفئران في غرفة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF).
- قسم الفئران السليمة بشكل عشوائي إلى مجموعتين (ن = 10): الفئران الضابطة التي تستنشق الهواء النقي والجرذان المصابة بالسيليكا التي تستنشق السيليكا.
2. إعداد السيليكا
تنبيه: غبار السيليكا الذي يستنشقه جسم الإنسان يمكن أن يتلف الرئتين. لذلك ، يجب على الأفراد ارتداء وزرة وقفازات طبية وأقنعة واقية (N95) أثناء العمليات.
- قم بتأريض جزيئات السيليكا (انظر جدول المواد) بمدافع الهاون من العقيق لمدة 1.5 ساعة قبل كل تعرض. وذلك لأن الكوارتز المكسور حديثا ينتج كميات أكبر من أنواع الأكسجين النشطة مقارنة بالكوارتز13 القديم ، والسيليكا التي يبلغ قطرها 1-5 ميكرومتر هي الأكثر إمراضا.
- قم بوزن السيليكا (30 جم) باستخدام ميزان إلكتروني بعد الطحن ، وضعها في وعاء زجاجي ، واخبزها على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 6 ساعات في مجفف نفخ هواء كهربائي للتدفئة (انظر جدول المواد) للقضاء على مسببات الأمراض من سطح جزيئات السيليكا.
3. التعرض السيليكا للفئران
- قم بتوصيل الحقن وأنظمة المولدات المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) وضع السيليكا (30 جم) في المولد. تحقق مما إذا كان خط أنابيب التوصيل طبيعيا ، وأن سلك الطاقة متصل ، وأن مصدر الطاقة طبيعي.
- تحقق من مستوى الماء في برج الرش ومرطب جهاز معالجة غاز النفايات (انظر جدول المواد) يدويا ، وأضف الماء إذا كان غير كاف (لا يصل إلى الخط القياسي).
- أضف ماء الصنبور إلى برج الرش لجهاز معالجة غاز النفايات والماء المقطر إلى المرطب (الشكل 1).
- قم بتشغيل جهاز تفريغ غاز العادم (انظر جدول المواد) ومفتاح مصدر الهواء لتأكيد ما إذا كان الجزء الداخلي من خزانة التدريع في حالة ضغط سلبي.
- تأكد من إغلاق خلط السائل وخلط المسحوق وصمامات التحكم في تدفق الغاز النقي وصمام تصريف مياه الصرف الصحي أسفل غرفة الاستنشاق.
- ضع ما مجموعه 10 فئران في غرفة الاستنشاق (انظر جدول المواد) ، وأغلق حجرة الاستنشاق وأبواب الخزانة المغطاة.
- اضبط المعلمات التجريبية التالية على لوحة العدادات أو في الكمبيوتر: ضغط الخزانة: -50 إلى -30 باسكال ؛ تركيز الأكسجين: 21٪ ؛ درجة حرارة الخزانة: 26-30 °C ؛ الرطوبة: 30٪ -70٪ ؛ معدل دخول الغبار: 2.0-2.5 مل / دقيقة ؛ وتركيز غبار الخزانة: 60 ± 5 مجم / م3.
ملاحظة: راقب البيانات التجريبية وحالة المعدات بشكل مستمر أثناء التجربة. دفع إنذار فشل المعدات المعالجة في الوقت المناسب.- تعريض كل للسيليكا بشكل مستمر لمدة 3 ساعات في اليوم ، 5 أيام في الأسبوع ، والسماح للحيوانات في المجموعة الضابطة باستنشاق الهواء النقي.
- عند الانتهاء من التجربة ، أغلق صمام التحكم في تدفق الغاز المختلط ، وافتح صمام تدفق الغاز النقي. حقن الغاز النقي باستمرار في غرفة الاستنشاق.
ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم حقن تدفق الغاز النقي (7.0-7.5 م3 / ساعة) لمدة 20 دقيقة على الأقل حتى تم استبدال الغاز السام في غرفة الاستنشاق بالكامل.- أغلق صمام تدفق الهواء النقي ، وافتح الباب ، وأخرج الفئران ، وأرسلها مرة أخرى إلى الغرفة الخالية من مسببات الأمراض.
- قم بإزالة رف الفئران ومكونات الأنبوب الفرعي بالتسلسل وضعها في الحوض للتنظيف. بعد الشطف ، أغلق صمام التنظيف التلقائي وافتح الفتحة.
- امسح الجدار الداخلي بقطعة قماش نظيفة ، أو قم بتشغيل الغاز النقي لتجفيف الخزان. أخيرا ، نفذ التطهير. بعد التنظيف والتطهير باستخدام 75٪ من الإيثانول ، أغلق بوابة العادم ، وفي أسرع وقت ممكن ، افتح باب كابينة الاستنشاق قليلا لتبخير الرطوبة ، بحيث يظل الجزء الداخلي من كابينة الاستنشاق جافا.
- تحقق من تركيز السيليكا في الخزانة باستخدام جهاز أخذ عينات شامل في الغلاف الجوي باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) مرتين في الأسبوع لضمان استقرار تركيز السيليكا أثناء التجربة. معايرة جهاز أخذ العينات في الغلاف الجوي قبل أخذ العينات.
- استخدم ميزان تحليلي رقمي أحادي المقلاة لتحديد الجاذبية. كان تركيز السيليكا المحسوب 65 ملغم / م3 (الشكل 1 والجدول 1).
ملاحظة: قم بوزن ورق الترشيح قبل وبعد امتصاص السيليكا. تم حساب تركيز السيليكا باستخدام الصيغةالتالية 12:
حيث W2 = وزن ورق الترشيح بعد أخذ العينات ، W1 = وزن ورق الترشيح قبل أخذ العينات ، و V = حجم الهواء.
- استخدم ميزان تحليلي رقمي أحادي المقلاة لتحديد الجاذبية. كان تركيز السيليكا المحسوب 65 ملغم / م3 (الشكل 1 والجدول 1).
4. اكتساب وتثبيت أنسجة الرئة
- القتل الرحيم للفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال (100 مغ/كغ من وزن الجسم) وليدوكائين (4 مغ/كغ من وزن الجسم). تقييم الوفاة بفقدان نبضاتالقلب 14.
- في نهاية التجربة ، قم بإصلاح الرئة السفلية اليمنى والكلى والكبد والطحال والعظام بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة على الأقل ، وقم بتضمينها في البارافين ، ومقطعة إلى 5 أقسام ميكرومتر 7,15.
5. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E)
- قم بإزالة البارافين من أقسام البارافين في الزيلول (انظر جدول المواد) مرتين لمدة 10 دقائق لكلمنهما 16 ، وأعد ترطيبها في 100٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، وماء مقطر لمدة 3 دقائق لكل منهما.
- تلطيخ الأقسام بالهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل الأقسام بالماء10.
- ضع المقاطع في 2٪ كحول هيدروكلوريك ثم في ماء مقطر حتى يتغير اللون إلى اللون الأزرق.
- تلطيخ المقاطع مع eosin لمدة 1 دقيقة ، وتجفيفها مع الإيثانول 95 ٪ ، وجعلها شفافة مع الزيلين ، وختمها مع اللثة محايدة ، ومراقبة تحت المجهر الضوئي12.
6. تلطيخ كيميائي مناعي
- اغسل أقسام البارافين بالماء بشكل روتيني.
- قم بتعريض المستضدات عند ضغط عال (60 كيلو باسكال) ودرجة حرارة عالية (100 درجة مئوية) لمدة 80 ثانية ثم قم بحظرها باستخدام مانع بيروكسيديز داخلي المنشأ (3٪) لمدة 15 دقيقة للقضاء على البيروكسيديزالداخلي 7.
- احتضان العينات بأجسام مضادة موجهة ضد CD68 (1: 200 تخفيف - أضف 4 ميكرولتر من CD68 إلى 396 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة ؛ انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي (بوليمر IgG المضاد للفأر المقترن HRP ؛ انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسل العينات باستخدام 1x PBS.
- تصور التفاعل المناعي مع 3،3-ديامينوبنزيدين (DAB ؛ انظر جدول المواد). بعد تطبيق DAB على الأنسجة ، لاحظ تلطيخ الأنسجة تحت المجهر الضوئي10.
ملاحظة: يختلف وقت التلوين من بضع ثوان إلى بضع دقائق وفقا لوقت تلطيخ الأنسجة. تم إجهاض عملية التلوين عن طريق وضع الأقسام في الماء. في هذه الدراسة ، يمثل التلوين البني للأنسجة التعبير الإيجابي ل CD68. تم تخفيف جميع الأجسام المضادة في 1x PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الطريقة المقترحة ، تم استكشاف بعض الآليات المحتملة والتسبب في السحار السيليسي في الفئران. يظهر الرسم التخطيطي لغرفة الاستنشاق في الشكل 1. تتكون الغرفة من مولد سيليكا يتم توصيله بالهواء ، وغرفة لكامل الجسم ، ونظام للتخلص من النفايات ، كما هو موضح سابقا17. تم الإبلاغ عن وظائف الرئة ومستويات العوامل الالتهابية في المصل والرئة وترسب الكولاجين وتمايز الخلايا الليفية العضلية في الدراسات السابقة10،18،19. تم الإبلاغ عن التعبير التفاضلي ل miRNA و lncRNA و mRNA في تقاريرنا السابقة20،21،22. لم تموت أي فئران بعد التعرض للسيليكا في الدراسات متعددة الدفعات المذكورة أعلاه.
تم تلخيص الخصائص المرضية الكلاسيكية للفئران المصابة بالسيليكاتس سابقا23. تتكون العقيدات السيليكاتية من الضامة المحتوية على السيليكا. يعرض الشكل 2 ترسب الكولاجين في الفئران المصابة بالسحار السيليسي. كشفت العدسة المستقطبة عن السيليكا في البلاعم. ويعرض الشكل 3 التطور الدينامي للعقيدات السيليكية عن طريق تلطيخ CD68 الكيميائي المناعي؛ وشملت العلامات البديلة الأخرى سينسيز أكسيد النيتريك المستحث أو أرجيناز-124. كما ذكرنا سابقا23 ، أظهرت الفئران التي تعرضت للسيليكا لمدة 24 أسبوعا آفات مرئية ويمكن ملاحظتها ، بما في ذلك ترسب الكولاجين في العقيدات السيليكاتية ، وتلطيخ إيجابي دوري لحمض شيف ، وضعف وظائف الرئة. من ناحية أخرى ، لم تظهر الأعضاء الأخرى (القلب والطحال والكبد) اختلافات مورفولوجية بين الفئران الضابطة والجرذان المصابة بالسحار السيليسي (الشكل 4). كان لدى كلية الفئران التي تعرضت للسيليكا لمدة 24 أسبوعا تغيرات تنكسية خفيفة في الأنابيب الملتوية القريبة. تم توثيق التمثيل الغذائي غير الطبيعي للعظام بشكل جيد في دراساتنا السابقة10,17. بشكل عام ، أبرزت هذه الدراسات أن البروتوكول المقترح يمكن أن يحاكي تطور السحار السيليسي في البشر بشكل جيد.
الشكل 1: رسم تخطيطي لجهاز التحكم في التعرض. (أ) مولد السيليكا المنفذ من الهواء. (ب) غرفة الجسم كله. (ج) لوحات العدادات. (د) جهاز التحكم في التعرض. (ه) تجميع جميع المكونات لتشكيل أداة عمل؛ تتكون الغرفة من مولد سيليكا يتم توصيله بالهواء ، وغرفة لكامل الجسم ، ونظام للتخلص من النفايات. (و ، ز) كاشف الهواء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تلطيخ H&E وترسب الكولاجين في الفئران المصابة بالسحار السيليسي. تلطيخ H& E للفئران المعرضة للسيليكا لمدة 2 و 24 أسبوعا. كان الهيكل السنخي للفئران لا يزال سليما ، وكان الجدار السنخي سميكا بعد 2 أسابيع من استنشاق السيليكا. اختفى الهيكل السنخي للفئران ، وتشكلت مناطق كبيرة من التليف بعد 24 أسبوعا من استنشاق السيليكا. تم احتجاز جزيئات السيليكا في فصوص الرئة للفئران (2 و 24 أسبوعا) ، ولوحظت ألياف الكولاجين للفئران (24 أسبوعا) تحت مجهر ضوئي مستقطب. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التطور الدينامي للعقيدات السيليكية المكتشفة عن طريق التلوين الكيميائي المناعي ل CD68. (أ) مع ازدياد وقت التعرض (من 2 إلى 24 أسبوعا)، ازدادت مساحة العقيدات السيليكاتية تدريجيا، واندمجت العقيدات السيليكية المجاورة تدريجيا في عقيدات كبيرة. ب: نمط عقيدات السيليكون. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تلطيخ H&E للرئتين والكلى والكبد والطحال والعظام للجرذان والجرذان المصابة بالسحار السيليسي. أ: تلطيخ H&E للرئتين والكلى والكبد والطحال وعظام الفئران الضابطة. شريط المقياس: 1 مم. (B) تلطيخ H& E للرئتين والكلى والكبد والطحال وعظام الفئران الضابطة. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. تشكلت آفات ليفية متعددة بأحجام مختلفة في الفئران المعرضة للسيليكا مقارنة بالفئران الضابطة. لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في الكلى والكبد والطحال بين الفئران الضابطة والجرذان المصابة بالسحار السيليكي ، ولكن لوحظ فقدان العظام في الفئران المصابة بالسيليكا. ج: تلطيخ H&E للرئتين والكلى والكبد والطحال وعظام الفئران المصابة بالسحار السيليسي. شريط المقياس: 1 مم. (د) تلطيخ H& E للرئتين والكلى والكبد والطحال وعظام الفئران المصابة بالسحار السيليسي. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| قياس الوقت (دقيقة) | الحجم (L) | W1 (ز) | W2 (ز) | التركيزات (ملغم / م3) |
| 10 | 460 | 0.40 | 0.43 | 65.22 |
| 20 | 923 | 0.40 | 0.46 | 65.01 |
| 30 | 1404 | 0.40 | 0.49 | 64.1 |
الجدول 1: تركيزات السيليكا في غرفة الجسم كله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باعتبارها السبب الرئيسي للسحار السيليكي ، تلعب السيليكا دورا حاسما في الصب. جزيئات السيليكا التي يستنشقها المرضى الذين يعانون من التهاب الرئة هي جزيئات السيليكا الطازجة والحرة التي تنتجها القطع الميكانيكي. يمكن أن تولد السيليكا أنواع الأكسجين التفاعلية إما مباشرة على أسطح الجسيمات المشقوقة حديثا أو بشكل غير مباشر من خلال تأثيرها على الضامة25. لذلك ، فإن طحن جزيئات السيليكا له أهمية عالية. في البروتوكول المقترح ، تم طحن السيليكا بمدافع الهاون العقيق لأكثر من 90 دقيقة لجعلها أكثر دقة وغير منتظمة وزيادة مساحة السطح. كما ورد ، يجب ألا تقل تركيزات السيليكا البلورية26 المحمولة جوا عن 0.05 مجم / م3. ومع ذلك ، قد يواجه هذا البروتوكول مشكلة في تركيزات الغبار غير الدقيقة ؛ ارتبط عدم اليقين في تركيز الغبار بشكل أساسي بعدم وجود نظام مدمج لمراقبة تركيز الغبار. تم حساب تركيز السيليكا الفعلي باستخدام كتلة SiO2 التي تدخل خزانة الغبار ومعدل تدفق الغاز. كان حجم SiO2 يعتمد على سرعة اللوحة الدوارة ، بدلا من كتلة SiO2 التي تدخل الخزانة بالفعل. ومن ثم ، كانت الحلول الممكنة للمشكلة هي فحص حجم السيليكا في الغرفة مرتين في الأسبوع للتأكد من تعرض الفئران لنفس الحجم من السيليكا في كل مرة أو وضع جهاز قياس التركيز في غرفة الغبار ، وهذا الأخير هو الحل الأفضل.
كانت قيود هذا النموذج واضحة أيضا: (1) العلاقة بين جرعة التعرض وتأثيرها البيولوجي تقريبية فقط لأن الجهاز التنفسي للفئران يختلف عن الجهاز التنفسي للبشر. (2) وجود عدم اليقين في تركيز الغبار ؛ (3) الطريقة المطلوبة لشراء معدات خاصة ؛ (4) كان حجم غرفة الغبار وعدد الفئران المصابة بالغبار محدودا ؛ (5) لا يمكن بناء نموذج السحار السيليسي للفأر لأن الجهاز التنفسي للفئران كان ضيقا ولا يمكن ترسيب غبار السيليكا في الرئتين ؛ أيضا ، كان نموذج الماوس أرخص ، وكان من السهل توليد الفئران المعدلة وراثيا أو KO.
تضمن البناء التقليدي للنموذج الحيواني السيليسي بشكل أساسي طريقتين: حقن الشعب الهوائية واستنشاق SiO2. في حقن الشعب الهوائية ، كانت الوفيات مرتبطة ارتباطا وثيقا بجرعة التروية ، وتسببت الجراحة الغازية حتما في أضرار جانبية إضافية27. لاستبدال نموذج الحقن داخل القصبة الهوائية ، أنشأ بعض العلماء نموذجا لمرض السيليكا باستخدام تعليق السيليكا الذري بالموجات فوق الصوتية للاستنشاق28. ومع ذلك ، لم يتمكن الانحلال بالموجات فوق الصوتية من التحكم في تركيز السيليكا في الهواء بعد الانحلال ، وكانت قابلية التكرار ضعيفة ، ولا يمكن تشكيل آفات ليفية نموذجية باستخدام طريقة النمذجة هذه. نموذج آخر اقتصادي وعملي وفعال كان نموذج التنقيط الأنفيللفأر 29 ، لكن هذه الطريقة حقنت السيليكا السائلة في القصبة الهوائية ولم تكن جيدة مثل استنشاقها. يحتوي جهاز التحكم في التعرض على نظام سحب هواء متعدد بحيث يتم توزيع السيليكا في غرفة الاستنشاق بالتساوي ، والبيانات دقيقة ، وتوزيع الغبار في غرفة الغبار موحد. وبالتالي ، كانت بيئة الاختبار مستقرة لفترة طويلة ، وتم ملاحظة المعلمات ذات الصلة وتسجيلها في أي وقت.
تكمن أهمية إنشاء نماذج للأمراض أو الإصابات الحيوانية في محاكاة العملية المرضية للمرض أو الإصابة التي تسببها العوامل المسببة للأمراض إلى أقصى حد ممكن. لذلك ، فإن النموذج الحيواني الجيد هو أقرب ما يكون إلى الأمراض البشرية قدر الإمكان. عن طريق استنشاق التعرض للسيليكا ، يمكن للفئران استنشاق جزيئات السيليكا المسببة للأمراض بحرية في غرفة الغبار. كما تحاكي جلسات التعرض الأسبوعية واليومية تماما ساعات عمل العاملين في التهاب الرئة. باستخدام طريقة النمذجة هذه ، حددنا التغيرات المرضية مثل الانتقال الظهاري - اللحمة المتوسطة ، وتفعيل إشارات عامل نمو النقل ، وتنشيط الضامة ، وتنشيط الإشارات المتعلقة بالشيخوخة أثناء السحار السيليسي في الفئران. تم تأكيد بعض النتائج في العينات البشرية18. في الآونة الأخيرة ، بدأنا أيضا في دراسة التغيرات المرضية الديناميكية في تطور السحار السيليسي بهذه الطريقة23.
هذا البروتوكول البسيط والمنخفض التكلفة والقابل للتكرار بسهولة له أهمية كبيرة أيضا في وقت يعود فيه حدوث داء السيليكاتس في العالم30. بعد التعرض للاستنشاق لمدة 8 أسابيع إلى 100 ملغ من الكوارتز / م3 ، بقي 20٪ من السيليكا في رئتي الفئران بعد 6 و 12 شهرا31. أيضا ، حقق الباحثون في مدى قدرة في جهاز مماثل على استنشاق الهواء وزفيره. تغير تركيز الغاز الذي تستنشقه قليلا32. لا يزال البروتوكول يحمل وعدا كبيرا ، على سبيل المثال ، من خلال دمجه مع التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لمراقبة التطور الديناميكي للسحار السيليسي ودمجه مع قاعدة بيانات النسخ للتحقق من العملية المرضية للسحار السيليسي والتحقق من صحة العلاجات الجهازية الجديدة المضادة للالتهابات والمضادة للتليف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82003406) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة خبي (H2022209073) ، ومشروع العلوم والتكنولوجيا التابع لإدارة التعليم في خبي (ZD2022127).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air detector (compressive atmospheric sampler) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Anatomical table | No specific brand is recommended. | ||
| Antibody of CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Electric heating air-blowing drier | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Electronic balance | OHRUS | ||
| Embedding machine | leica | ||
| Exhaust gas discharge device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Generator systems | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Gloves (thin laboratory gloves) | The secco medical | ||
| Hematoxylin and eosin | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 exposure control apparatus | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Inhalation chamber | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Injection syringe | No specific brand is recommended. | ||
| Light microscope | olympus | ||
| Object slide | shitai | ||
| PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer) | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd | s5631 | |
| Silicon dioxide | Sigma-Aldrich | ||
| Slicing machine | leica | RM2255 | |
| Waste gas treatment device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Wet box | Cooperative plastic Products Factory | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
References
- Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114 (2019).
- The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
- Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162 (2021).
- Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656 (2022).
- Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
- Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408 (2020).
- Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
- Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
- Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
- Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301 (2012).
- Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
- Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
- Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
- Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
- Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
- Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
- Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
- Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
- Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
- Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
- Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063 (2021).
- Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
- Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
- Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C.
- Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
- Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).
