Summary
本研究描述了一种建立矽肺大鼠模型的技术，该模型在吸入室中通过全身吸入二氧化硅。患有矽肺的大鼠可以以一种简单、具有成本效益的方式密切模拟人类矽肺病的病理过程，并具有良好的可重复性。
Abstract
矽肺的主要原因是在职业环境中吸入二氧化硅。尽管在解剖学和生理学上存在一些差异，但啮齿动物模型仍然是研究人类矽肺病的重要工具。对于矽肺病，经典的病理过程需要 通过 吸入新鲜产生的石英颗粒来诱导，这意味着特异性地诱发人类职业病。本研究描述了一种建立并有效模拟矽肺病病理动态进化过程的技术。此外，该技术具有良好的可重复性，不涉及手术。吸入暴露系统被制造、验证并用于可吸入颗粒吸入的毒理学研究。关键部件如下：（1）用气流控制器调节的散装干式SiO2 粉末发生器;（2） 0.3 m3 全身吸入暴露室，最多可容纳 3 只成年大鼠;（3）实时调节氧气浓度、温度、湿度、压力的监测控制系统;（4）用于保护实验室技术人员和环境的屏障和废物处理系统。综上所述，本方案 报告了全身 吸入情况，吸入室创建了可靠、合理、可重复的大鼠硅化模型，死亡率低，伤害少，保护性强。
Introduction
吸入二氧化硅引起的矽肺病是我国最严重的职业病，占每年职业病报告总数的80%以上1。矽肺病的病因明确，可以预防和控制，但没有有效的治疗方法2。许多药物在基础研究中已被证明是有效的，但它们的临床效果并不精确3,4。因此，矽肺的病理生理机制仍有待探索。
许多研究使用一次性将二氧化硅输注到大鼠或小鼠的气管中来研究矽肺病的发病机制 5,6。尽管这些啮齿动物硅质模型可以在短时间内获得7，但这些方法仍然存在挑战，例如动物创伤和高死亡率。一些研究涉及将储存的二氧化硅滴入肺部以诱导非特异性肺反应，但没有提到小鼠的硅结节8。此外，除了急性矽肺病之外，在职业环境中长期暴露于二氧化硅可显著降低肺部炎症，并升高肺部抗凋亡标志物（而不是促凋亡标志物）的水平9。因此，需要一个可靠、合理、可重复的动物模型来进一步探究矽肺病的发病机制。
本研究描述了一种模拟矽肺患者疾病过程的方法，即通过全身吸入二氧化硅，在吸入室中空气输送颗粒，吸入室包括空气输送的二氧化硅发生器、全身室和废物处理系统。该方法简单易操作，有效模拟了矽肺病的病理动态演化过程。此外，使用这种方法确定了矽肺病的许多可能机制和发病机制10,11,12。预计拟议的方案将有助于在矽肺病研究的相关领域进行进一步研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验均根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并经华北理工大学伦理委员会批准（协议代码LX2019033和批准的2019-3-3）。本研究使用3周龄的雄性Wistar大鼠。所有大鼠都被关在带有刨花的静态笼子里。动物保持在12小时/12小时的光/暗循环中，并 随意提供食物和水。适应性喂养1周后进行后续实验。
1.动物准备
- 抵达后，将所有老鼠安置在特定的无病原体 （SPF） 房间内。
- 将健康大鼠随机分为两组（n = 10）：吸入纯净空气的对照大鼠和吸入二氧化硅的矽肺大鼠。
2. 二氧化硅制备
注意：人体吸入的二氧化硅粉尘会损害肺部。因此，个人在手术期间必须穿戴工作服、医用手套和防护口罩 （N95）。
- 在每次暴露之前，用玛瑙研钵研磨二氧化硅颗粒（见 材料表）1.5小时。这是因为新破裂的石英比老化的石英 13 产生更多的活性氧，而直径为 1-5 μm 的二氧化硅最具致病性。
- 研磨后使用电子天平称量二氧化硅（30g），将其放入玻璃容器中，并在180°C下在电加热吹风干燥器中烘烤6小时（见 材料表），以消除二氧化硅颗粒表面的病原体。
3.二氧化硅暴露于大鼠
- 连接喷射和市售的发生器系统（参见 材料表）并将二氧化硅（30 g）放入发生器中。检查连接管路是否正常，电源线是否已连接，电源是否正常。
- 手动检查喷淋塔和废气处理装置加湿器的水位（见 物料表），不足时加水（不达标线）。
- 将自来水加入废气处理装置的喷淋塔，将蒸馏水加入加湿器（图1）。
- 打开废气排放装置（见 物料表）和气源开关，确认屏蔽柜内部是否处于负压状态。
- 确认吸入室下方的液体混合、粉末混合、纯气流量控制阀、废水排放阀已关闭。
- 将总共10只大鼠置于吸入室中（见 材料表），并关闭吸入室和屏蔽的柜门。
- 在仪表板或计算机中设置以下实验参数：箱体压力：-50至-30Pa;氧气浓度：21%;柜体温度：26-30°C;湿度：30%-70%;粉尘进入率：2.0-2.5 mL/min;柜内粉尘浓度：60 ± 5 mg/m3.
注意： 在实验过程中连续观察实验数据和设备状态。设备故障报警提示及时处理。- 将每只动物每天连续暴露于二氧化硅3小时，每周5天，并让对照组中的动物吸入纯净的空气。
- 实验完成后，关闭混合气体流量控制阀，打开纯气流量阀。将纯气体连续注入吸入室。
注：在本研究中，将纯气体流量（7.0-7.5 m3 / h）注入至少20分钟，直到吸入室中的有毒气体完全置换。- 关闭纯净气流阀，打开门，将老鼠取出，并将它们送回无病原体的房间。
- 依次拆下老鼠架和支管组件，并将它们放入水槽中进行清洁。冲洗后，关闭自动清洁阀并打开舱口。
- 用干净的布擦拭内壁，或打开纯气干燥水箱。最后，进行消毒。用75%乙醇清洗消毒后，关闭排气门，尽快轻轻打开吸入舱门，将水分蒸发掉，使吸入舱内部保持干燥。
- 按照制造商的说明（见 材料表），每周两次使用全面的大气采样器检查柜中的二氧化硅浓度，以确保实验过程中二氧化硅浓度的稳定性。采样前校准大气采样器。
- 使用数字单盘分析天平进行重量测定。计算出的二氧化硅浓度为65 mg/m3 （图1 和 表1）。
注意： 在吸收二氧化硅之前和之后称量滤纸。使用以下公式12 计算二氧化硅的浓度：
其中 W2 = 取样后滤纸的重量，W1 = 取样前滤纸的重量，V = 空气体积。
- 使用数字单盘分析天平进行重量测定。计算出的二氧化硅浓度为65 mg/m3 （图1 和 表1）。
4. 肺组织的采集和固定
- 通过腹膜内注射戊巴比妥（100mg / kg体重）和利多卡因（4mg / kg体重）对大鼠实施安乐死。通过心跳丢失来评估死亡14.
- 在实验结束时，用4%多聚甲醛固定右下肺，肾，肝，脾和骨至少24小时，包埋在石蜡中，并切成5μm部分7,15。
5. 苏木精和伊红（H&E）染色
- 将石蜡切片在二甲苯中脱蜡（见 材料表）两次，每次10分钟，每次16分钟，并在100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇和蒸馏水中再水化3分钟。
- 用苏木精（见 材料表）染色切片5分钟，然后用水洗涤切片10。
- 将切片放入 2% 盐醇中，然后放入蒸馏水中，直到颜色变为蓝色。
- 用曙红染色切片1分钟，用95%乙醇脱水，用二甲苯使它们透明，用中性胶密封，并在光学显微镜下观察12。
6. 免疫组化染色
- 定期用水清洗石蜡切片。
- 将抗原在高压（60kPa）和高温（100°C）下暴露80秒，然后用内源性过氧化物酶阻滞剂（3%）封闭15分钟以消除内源性过氧化物酶7。
- 将样品与针对CD68的抗体（1：200稀释 - 将4μLCD68加入396μL抗体稀释剂;参见 材料表）在4°C下孵育过夜。
- 将样品与二抗（HRP偶联的山羊抗小鼠IgG聚合物;参见 材料表）在37°C孵育30分钟，然后用1x PBS洗涤样品。
- 用3,3-二氨基联苯胺（DAB;见 材料表）观察免疫反应性。将DAB施加到组织后，在光学显微镜10下观察组织的染色。
注意：根据组织的染色时间，染色时间从几秒钟到几分钟不等。通过将切片放入水中而中止了染色程序。在这项研究中，组织的棕色染色代表CD68的阳性表达。所有抗体均在 1x PBS 中稀释。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
利用所提出的方法，探讨了大鼠矽肺病的一些潜在机制和发病机制。吸入室的示意图如图1所示。如前所述，该腔室由空气输送的二氧化硅发生器、全身腔室和废物处理系统组成17。肺功能、血清和肺中炎症因子水平、胶原沉积和肌成纤维细胞分化在先前的研究中报道 10,18,19。miRNA、lncRNA 和 mRNA 的差异表达在我们之前的报道中报道20、21、22。在上述多批次研究中，没有大鼠在二氧化硅暴露后死亡。
矽肺大鼠的典型病理特征在前面总结了23。矽肺结节由含二氧化硅的巨噬细胞组成。图2显示了矽肺病大鼠的胶原沉积。偏光透镜揭示了巨噬细胞中的二氧化硅。图 3 显示了通过对 CD68 进行免疫组织化学染色的矽肺结节的动态演变;其他替代标志物包括诱导型一氧化氮合酶或精氨酸酶-124。如前所述23，暴露于二氧化硅24周的大鼠表现出可见和可观察到的病变，包括硅结节中的胶原沉积，高碘酸-希夫阳性染色和肺功能受损。另一方面，其他器官（心脏、脾脏和肝脏）在对照组大鼠和矽肺大鼠之间没有表现出形态学差异（图4）。暴露于二氧化硅24周的大鼠肾脏在近端卷曲小管中具有轻度退行性变化。异常的骨代谢在我们之前的研究中得到了很好的记录10,17。总体而言，这些研究强调，拟议的方案可以很好地模拟人类矽肺病的进展。
图1：曝光控制装置示意图。 （A） 空气输送的二氧化硅发生器。（B） 全身腔室。（C） 仪表板。（四）暴露控制装置。（E） 所有部件组装成工作仪器;该腔室包括一个空气输送的二氧化硅发生器、一个全身腔室和一个废物处理系统。（女，女）空气探测器。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：矽肺病大鼠的H&E染色和胶原沉积。 对暴露于二氧化硅的大鼠进行 2 周和 24 周的 H&E 染色。大鼠肺泡结构仍然完好，吸入二氧化硅2周后肺泡壁增厚。吸入二氧化硅24周后，大鼠肺泡结构消失，大面积纤维化形成。将二氧化硅颗粒捕获在大鼠肺叶（2周和24周）中，并在偏振光显微镜下观察大鼠（24周）的胶原纤维。比例尺：50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：CD68 免疫组织化学染色检测出的矽肺结节的动态演变。 （A）随着暴露时间的增加（从2周到24周），矽肺结节面积逐渐增加，相邻的矽肺结节逐渐融合成大结节。（B）硅结节的形态。比例尺：50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：对照大鼠和矽肺病大鼠的肺、肾、肝、脾和骨的H&E染色。 （A）对照大鼠的肺、肾、肝、脾、骨的H&E染色。比例尺：1 mm。 （B）对照大鼠的肺、肾、肝、脾和骨骼进行H&E染色。比例尺：50μm。与对照组大鼠相比，暴露于二氧化硅的大鼠中形成了多个不同大小的纤维化病变。对照组大鼠和矽肺病大鼠的肾脏、肝脏和脾脏没有显著差异，但在矽肺大鼠中观察到骨质流失。（C）矽肺病大鼠肺、肾、肝、脾、骨的H&E染色。比例尺：1 mm。 （D） 矽肺病大鼠肺、肾、肝、脾和骨骼的 H&E 染色。比例尺：50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 测量时间（分钟） | 容积 （L） | W1 （克） | W2 （克） | 浓度 （mg/m3） |
| 10 | 460 | 0.40 | 0.43 | 65.22 |
| 20 | 923 | 0.40 | 0.46 | 65.01 |
| 30 | 1404 | 0.40 | 0.49 | 64.1 |
表1：全身腔室中二氧化硅的浓度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
作为矽肺病的主要原因，二氧化硅在成型中起着决定性的作用。尘肺病患者吸入的二氧化硅颗粒是通过机械切割产生的新鲜游离二氧化硅颗粒。二氧化硅可以直接在新鲜裂解的颗粒表面上产生活性氧，也可以通过其对巨噬细胞的影响间接产生活性氧25。因此，二氧化硅颗粒的研磨非常重要。在拟议的方案中，二氧化硅用玛瑙砂浆研磨超过90分钟，使其更细，更不规则，并增加表面积。据报道，结晶二氧化硅26 的空气传播浓度不得低于0.05 mg/m3。但是，该协议可能存在粉尘浓度不准确的问题;粉尘浓度的不确定性主要与缺乏内置的粉尘浓度监测系统有关。实际二氧化硅浓度是使用进入集尘柜的SiO2 的质量和气体流速计算的。SiO2 的体积基于转盘的速度，而不是实际进入机柜的 SiO2 的质量。因此，该问题的可能解决方案是每周两次检查腔室中二氧化硅的体积，以确保大鼠每次都暴露于相同体积的二氧化硅中，或者在粉尘室中放置浓度测量装置，后者是最佳解决方案。
该模型的局限性也很明显：（1）暴露剂量与其生物学效应之间的关系只是近似的，因为大鼠的呼吸道与人类的呼吸道不同;（2）粉尘浓度存在不确定性;（3）该方法需要购买专用设备;（4）粉尘室容积和粉尘感染大鼠数量有限;（5）由于小鼠呼吸道狭窄，二氧化硅粉尘无法沉积在肺部，无法构建小鼠矽肺模型;此外，小鼠模型更便宜，并且很容易产生转基因或KO小鼠。
矽肺动物模型的常规构建主要包括支气管注射和吸入SiO2两种方法。在支气管注射中，死亡率与灌注剂量密切相关，侵入性手术不可避免地造成额外的附带损害27。为了取代气管内注射模型，一些学者建立了使用超声雾化二氧化硅悬浮液吸入的矽肺模型28。然而，超声雾化不能控制雾化后空气中二氧化硅的浓度，重复性差，使用这种建模方法无法形成典型的纤维化病变。另一种经济、实用、有效的模型是小鼠滴鼻模型29，但这种方法将液态二氧化硅注入气管，不如吸入。暴露控制装置具有多重进气系统，使吸入室内的二氧化硅分布均匀，数据准确，粉尘室内的粉尘分布均匀。因此，测试环境长期稳定，随时观察和记录相关参数。
建立动物病伤模型的意义在于尽可能模拟病原因素引起的病害或损伤的病理过程。因此，一个好的动物模型尽可能接近人类疾病。通过吸入暴露于二氧化硅，大鼠可以在尘室中自由吸入致病性二氧化硅颗粒。每周和每天的暴露会议也完全模仿了尘肺病工人的工作时间。使用这种建模方法，我们确定了大鼠矽肺期间的病理变化，例如上皮-间充质转化、转移生长因子信号的激活、巨噬细胞的激活以及衰老相关信号的激活。一些结果在人类样本中得到证实 18.最近，我们也开始研究这种方法在矽肺病演变中的动态病理变化23。
这种简单、低成本且易于重复的方案在矽肺病发病率在世界范围内卷土重来的时候也非常重要30.吸入暴露于100mg石英/m3后8周，6个月和12个月后，20%的二氧化硅仍留在大鼠肺部31。此外，研究人员还调查了类似设备中的动物吸入和呼出空气的程度;动物吸入的气体浓度略有变化32.例如，通过将其与显微计算机断层扫描相结合以观察矽肺病的动态演变，并将其与转录组数据库相结合以验证矽肺病的病理过程并验证新的抗炎和抗纤维化全身疗法，该协议仍然具有很大的前景。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由国家自然科学基金（82003406）、河北省自然科学基金（H2022209073）和河北省教育厅（ZD2022127）科技项目资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air detector (compressive atmospheric sampler) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Anatomical table | No specific brand is recommended. | ||
| Antibody of CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Electric heating air-blowing drier | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Electronic balance | OHRUS | ||
| Embedding machine | leica | ||
| Exhaust gas discharge device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Generator systems | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Gloves (thin laboratory gloves) | The secco medical | ||
| Hematoxylin and eosin | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 exposure control apparatus | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Inhalation chamber | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Injection syringe | No specific brand is recommended. | ||
| Light microscope | olympus | ||
| Object slide | shitai | ||
| PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer) | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd | s5631 | |
| Silicon dioxide | Sigma-Aldrich | ||
| Slicing machine | leica | RM2255 | |
| Waste gas treatment device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Wet box | Cooperative plastic Products Factory | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
References
- Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114 (2019).
- The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
- Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162 (2021).
- Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656 (2022).
- Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
- Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408 (2020).
- Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
- Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
- Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
- Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301 (2012).
- Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
- Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
- Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
- Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
- Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
- Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
- Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
- Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
- Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
- Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
- Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063 (2021).
- Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
- Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
- Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
- Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
- Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).
