Summary
מחקר זה מתאר טכניקה לביסוס מודל חולדות סיליקוזיס עם שאיפת סיליקה דרך כל הגוף בתא שאיפה. החולדות עם סיליקוזיס יכולות לחקות מקרוב את התהליך הפתולוגי של סיליקוזיס אנושי בצורה קלה, חסכונית עם חזרתיות טובה.
Abstract
הגורם העיקרי לסיליקוזיס הוא שאיפת סיליקה בסביבה התעסוקתית. למרות כמה הבדלים אנטומיים ופיזיולוגיים, מודלים של מכרסמים ממשיכים להיות כלי חיוני לחקר סיליקוזיס אנושי. עבור סיליקוזיס, התהליך הפתולוגי הקלאסי צריך להיות מושרה באמצעות שאיפת חלקיקי קוורץ טריים, כלומר גרימת מחלה תעסוקתית אנושית באופן ספציפי. מחקר זה תיאר טכניקה לביסוס וחיקוי יעיל של תהליך האבולוציה הפתולוגית הדינמית של סיליקוזיס. יתר על כן, הטכניקה הייתה בעלת יכולת חזרה טובה ללא ניתוח מעורב. מערכת החשיפה לשאיפה יוצרה, אומתה ושימשה למחקרים טוקסיקולוגיים על שאיפת חלקיקים הניתנים לנשימה. הרכיבים הקריטיים היו כדלקמן: (1) מחולל אבקה SiO2 יבש בתפזורת המותאם לבקר זרימת אוויר; (2) 0.3 מ'3 תא חשיפה לאינהלציה של כל הגוף המכיל עד 3 חולדות בוגרות; (3) מערכת ניטור ובקרה לוויסות ריכוז, טמפרטורה, לחות ולחץ חמצן בזמן אמת; (4) מערכת חסמים וסילוק פסולת להגנה על טכנאי המעבדות ועל הסביבה. לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מדווח על השאיפה דרך כל הגוף, ותא האינהלציה יצר מודל סיליקוטי אמין, סביר וניתן לחזור על עצמו עם תמותה נמוכה, פחות פציעות ויותר הגנה.
Introduction
סיליקוזיס, הנגרמת על ידי שאיפת סיליקה, היא מחלת המקצוע החמורה ביותר בסין, המהווה יותר מ -80% מכלל הדיווחים על מחלות מקצוע מדי שנה1. האטיולוגיה של סיליקוזיס ברורה, וניתן למנוע אותה ולשלוט בה, אך אין שיטת טיפול יעילה זמינה2. תרופות רבות הוכחו כיעילות במחקרים בסיסיים, אך יש להן השפעות קליניות לא מדויקות 3,4. לכן, המנגנונים הפתולוגיים והפיזיולוגיים של סיליקוזיס עדיין צריכים להיחקר.
מחקרים רבים השתמשו בעירוי חד פעמי של סיליקה לקנה הנשימה של חולדות או עכברים כדי לחקור את הפתוגנזה של סיליקוזיס 5,6. למרות שניתן היה להשיג מודלים סיליקוטיים אלה של מכרסמים בזמן קצר7, לשיטות אלה עדיין היו אתגרים, כגון טראומה של בעלי חיים ותמותה גבוהה. כמה מחקרים כללו החדרת סיליקה מאוחסנת לריאות כדי לגרום לתגובת ריאות לא ספציפית, אך לא הזכירו גושים סיליקוטיים בעכברים8. יתר על כן, הרחק מסיליקוזיס חריף, חשיפה כרונית לסיליקה בסביבות תעסוקתיות גרמה לדלקת ריאות נמוכה משמעותית והעלתה את רמות הסמנים האנטי-אפופטוטיים, ולא סמנים פרו-אפופטוטיים, בריאות9. לכן, יש צורך במודל אמין, סביר וניתן לחזור על עצמו כדי לחקור את הפתוגנזה של סיליקוזיס עוד יותר.
המחקר הנוכחי מתאר שיטה לחיקוי תהליך המחלה של חולי סיליקוזיס באמצעות שאיפת סיליקה דרך כל הגוף, חלקיקים המועברים באוויר בתא שאיפה, שכלל מחולל סיליקה המועבר באוויר, תא גוף שלם ומערכת לסילוק פסולת. שיטה זו פשוטה, קלה לתפעול ומחקה ביעילות את תהליך האבולוציה הפתולוגית הדינמית של סיליקוזיס. כמו כן, מנגנונים אפשריים רבים ואת הפתוגנזה של סיליקוזיס מזוהים באמצעות שיטה זו 10,11,12. הפרוטוקול המוצע צפוי לסייע בחקירות נוספות בתחום הקשור לחקר סיליקוזיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה לאתיקה של אוניברסיטת צפון סין למדע וטכנולוגיה (קוד פרוטוקול LX2019033 ואישור 2019-3-3). חולדות וויסטאר זכריות, בנות 3 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי. כל החולדות הוחזקו בכלובים סטטיים עם שבבי עץ. בעלי החיים הוחזקו במחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, וסופקו להם מזון ומים עד לליביטום. ניסויי מעקב נערכו לאחר שבוע של הזנה אדפטיבית.
1. הכנת בעלי חיים
- עם ההגעה, אכסנו את כל החולדות בחדר ספציפי ללא פתוגן (SPF).
- חלקו באופן אקראי את החולדות הבריאות לשתי קבוצות (n = 10): חולדות בקרה השואפות אוויר טהור וחולדות עם סיליקוזיס השואפות סיליקה.
2. הכנת סיליקה
אזהרה: אבק סיליקה הנשאף על ידי גוף האדם עלול להזיק לריאות. לכן, אנשים חייבים ללבוש סרבל, כפפות רפואיות ומסכות מגן (N95) במהלך המבצעים.
- טחנו את חלקיקי הסיליקה (ראו טבלת חומרים) במכתש אגת למשך שעה וחצי לפני כל חשיפה. הסיבה לכך היא שקוורץ שבור טרי מייצר כמויות גדולות יותר של מיני חמצן פעיל מאשר קוורץ13 מיושן, וסיליקה בקוטר של 1-5 מיקרומטר היא הפתוגנית ביותר.
- שוקלים את הסיליקה (30 גרם) באמצעות איזון אלקטרוני לאחר הטחינה, מניחים אותה במיכל זכוכית ואופים אותה בטמפרטורה של 180 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות במייבש חימום חשמלי (ראו טבלת חומרים) כדי לסלק פתוגנים מפני השטח של חלקיקי הסיליקה.
3. חשיפה לסיליקה לחולדות
- חבר את ההזרקה ואת מערכות הגנרטורים הזמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים) והכנס את הסיליקה (30 גרם) לגנרטור. בדוק אם צינור החיבור תקין, כבל החשמל מחובר וספק הכוח תקין.
- בדקו ידנית את מפלס מגדל ההתזה ואת מכשיר האדים של המכשיר לטיפול בגז פסולת (ראו טבלת חומרים), והוסיפו מים אם הם אינם מספיקים (לא עד לקו התקן).
- הוסיפו מי ברז למגדל ההתזה של מתקן הטיפול בגז הפסולת ומים מזוקקים למכשיר האדים (איור 1).
- הפעל את התקן פריקת גז הפליטה (ראה טבלת חומרים) ואת מתג מקור האוויר כדי לוודא אם החלק הפנימי של ארון המיגון נמצא במצב לחץ שלילי.
- ודא שערבוב הנוזלים, ערבוב האבקה, שסתומי בקרת זרימת הגז הטהור ושסתום הזרמת השפכים מתחת לתא השאיפה סגורים.
- הכניסו בסך הכל 10 חולדות לתא האינהלציה (ראו טבלת חומרים), וסגרו את תא האינהלציה ואת דלתות הארונות המרושתים.
- הגדר את הפרמטרים הניסיוניים הבאים בלוח המכשירים או במחשב: לחץ ארון: -50 עד -30 Pa; ריכוז חמצן: 21%; טמפרטורת הארון: 26-30 מעלות צלזיוס; לחות: 30%-70%; קצב כניסת אבק: 2.0-2.5 מ"ל/דקה; וריכוז אבק בארון: 60 ± 5 מ"ג/מ"ר3.
הערה: התבונן בנתוני הניסוי ובמצב הציוד ברציפות במהלך הניסוי. אזעקת הכשל בציוד הניעה עיבוד בזמן.- חשוף כל בעל חיים לסיליקה ברציפות במשך 3 שעות ביום, 5 ימים בשבוע, ואפשר לבעלי החיים בקבוצת הביקורת לשאוף אוויר טהור.
- עם השלמת הניסוי, סגור את שסתום בקרת זרימת הגז המעורב, ופתח את שסתום זרימת הגז הטהור. יש להזריק את הגז הטהור ברציפות לתוך תא השאיפה.
הערה: במחקר הנוכחי, זרימת הגז הטהור (7.0-7.5 מ' 3/שעה) הוזרק במשך 20 דקות לפחות עד שהגז הרעיל בתא השאיפה הוחלף לחלוטין.- סגרו את שסתום זרימת האוויר הטהור, פתחו את הדלת, הוציאו את החולדות החוצה ושלחו אותן חזרה לחדר נטול הפתוגנים.
- הוציאו את מתלה החולדות ואת רכיבי צינור ההסתעפות ברצף והניחו אותם בכיור לניקוי. לאחר השטיפה, סגור את שסתום הניקוי האוטומטי ופתח את הצוהר.
- נגבו את הדופן הפנימית במטלית נקייה, או הפעילו את הגז הטהור כדי לייבש את המיכל. לבסוף, לבצע את החיטוי. לאחר ניקוי וחיטוי עם אתנול 75%, סגור את שער הפליטה ופתח מעט בהקדם האפשרי את דלת תא השאיפה כדי לאדות את הלחות, כך שהחלק הפנימי של תא השאיפה יישאר יבש.
- בדוק את ריכוז הסיליקה בארון עם דוגם אטמוספרי מקיף בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) פעמיים בשבוע כדי להבטיח את יציבות ריכוז הסיליקה במהלך הניסוי. כיילו את הדוגם האטמוספרי לפני הדגימה.
- השתמש באיזון אנליטי דיגיטלי של מחבת אחת לקביעה כבידתית. ריכוז הסיליקה המחושב היה 65 מ"ג/מ"ר3 (איור 1 וטבלה 1).
הערה: יש לשקול את נייר הסינון לפני ואחרי ספיגת סיליקה. ריכוז הסיליקה חושב באמצעות הנוסחההבאה 12:
כאשר W2 = משקל נייר הסינון לאחר הדגימה, W1 = משקל נייר הסינון לפני הדגימה, ו-V = נפח האוויר.
- השתמש באיזון אנליטי דיגיטלי של מחבת אחת לקביעה כבידתית. ריכוז הסיליקה המחושב היה 65 מ"ג/מ"ר3 (איור 1 וטבלה 1).
4. רכישה וקיבוע של רקמות הריאה
- הרדימו את החולדות על ידי הזרקה תוך-צפקית של פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ולידוקאין (4 מ"ג/ק"ג משקל גוף). להעריך את המוות על ידי אובדן פעימות הלב14.
- בסוף הניסוי, תקנו את הריאה התחתונה הימנית, הכליות, הכבד, הטחול והעצם עם 4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות לפחות, הטמיעו בפרפין וחתכו למקטעיםשל 5 מיקרומטר 7,15.
5. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
- יש לפרק את חלקי הפרפין בקסילול (ראו טבלת חומרים) פעמיים למשך 10 דקות כל16, ולהזרים נוזלים ב-100% אתנול, 95% אתנול, 90% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול ומים מזוקקים למשך 3 דקות כל אחד.
- מכתימים את החלקים בהמטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שוטפים את החלקים במים10.
- מניחים את החלקים באלכוהול הידרוכלורי 2% ולאחר מכן במים מזוקקים עד שהצבע משתנה לכחול.
- הכתימו את החלקים עם אאוסין למשך דקה אחת, ייבשו אותם עם 95% אתנול, הפכו אותם לשקופים עם קסילן, אטמו אותם עם מסטיק נייטרלי, והתבוננו תחת מיקרוסקופ אור12.
6. צביעה אימונוהיסטוכימית
- באופן שגרתי לשטוף את קטעי פרפין עם מים.
- חשוף את האנטיגנים בלחץ גבוה (60 kPa) ובטמפרטורה גבוהה (100 ° C) במשך 80 שניות ולאחר מכן לחסום עם חוסם peroxidase אנדוגני (3%) במשך 15 דקות כדי לחסל peroxidases אנדוגני7.
- לדגור על הדגימות עם נוגדנים המכוונים נגד CD68 (דילול 1:200 - להוסיף 4 μL של CD68 ל 396 μL של דילול נוגדנים; ראה טבלה של חומרים) ב 4 ° C במשך הלילה.
- יש לדגור על הדגימות עם נוגדן משני (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer; ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטפו את הדגימות עם 1x PBS.
- דמיינו את התגובה החיסונית עם 3,3-diaminobenzidine (DAB; ראו טבלת חומרים). לאחר מריחת DAB על הרקמה, יש להתבונן בצביעת הרקמה תחת מיקרוסקופ אור10.
הערה: זמן הצביעה השתנה בין מספר שניות למספר דקות בהתאם לזמן הצביעה של הרקמה. הליך הצביעה בוטל על ידי הנחת החלקים במים. במחקר זה, הצביעה החומה של הרקמה ייצגה את הביטוי החיובי של CD68. כל הנוגדנים דוללו ב-1x PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות השיטה המוצעת, כמה מנגנונים פוטנציאליים ואת הפתוגנזה של סיליקוזיס נחקרו בחולדות. הסכימה של תא האינהלציה מוצגת באיור 1. התא כלל מחולל סיליקה המועבר באוויר, תא גוף שלם ומערכת לסילוק פסולת, כפי שתואר קודם לכן17. תפקודי הריאות, רמות הגורמים הדלקתיים בסרום ובריאה, שקיעת קולגן והתמיינות מיופיברובלסט דווחו במחקרים הקודמים 10,18,19. הביטוי הדיפרנציאלי של miRNA, lncRNA ו-mRNA דווח בדוחות הקודמים שלנו 20,21,22. אף חולדה לא מתה לאחר חשיפה לסיליקה במחקרים מרובי אצווה שהוזכרו לעיל.
המאפיינים הפתולוגיים הקלאסיים של חולדות עם סיליקוזיס סוכמו בעבר23. הגושים הסיליקוטיים הורכבו מקרופאגים המכילים סיליקה. איור 2 מציג את שקיעת הקולגן בחולדות עם סיליקוזיס. העדשה המקוטבת חשפה סיליקה במקרופאגים. איור 3 מציג את האבולוציה הדינמית של גושים סיליקוטיים על-ידי צביעה אימונוהיסטוכימית של CD68; סמנים חלופיים אחרים כללו אינדוקציה תחמוצת החנקן סינתאז או Arginase-124. כאמור23, החולדות שנחשפו לסיליקה במשך 24 שבועות הראו נגעים נראים לעין ונצפים, כולל שקיעת קולגן בגושים סיליקוטיים, צביעה חיובית תקופתית של חומצה שיף ותפקודי ריאות לקויים. מצד שני, האיברים האחרים (לב, טחול וכבד) לא הראו הבדלים מורפולוגיים בין חולדות ביקורת וחולדות עם סיליקוזיס (איור 4). הכליה של חולדות שנחשפו לסיליקה במשך 24 שבועות סבלה משינויים ניווניים קלים בצינוריות המפותלות הפרוקסימליות. חילוף החומרים החריג בעצמות תועד היטב במחקרים הקודמים שלנו 10,17. בסך הכל, מחקרים אלה הדגישו כי הפרוטוקול המוצע יכול לחקות היטב את התקדמות הסיליקוזיס בבני אדם.
איור 1: סכמטי של מנגנון בקרת החשיפה. (A) מחולל סיליקה המועבר באוויר. (B) תא גוף שלם. (C) לוחות מכשירים. (ד) מכשיר בקרת חשיפה. (ה) כל הרכיבים מורכבים ליצירת כלי עבודה; התא כולל מחולל סיליקה המועבר באוויר, תא גוף שלם ומערכת לסילוק פסולת. (ו,ז) גלאי אוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צביעת H&E ושקיעת קולגן בחולדות עם סיליקוזיס. צביעת H&E של חולדות שנחשפו לסיליקה במשך 2 ו -24 שבועות. המבנה הנאדי של חולדות היה עדיין שלם, ודופן הנאדיות התעבתה לאחר שבועיים של שאיפת סיליקה. המבנה הנאדי של חולדות נעלם, ושטחים גדולים של פיברוזיס נוצרו לאחר 24 שבועות של שאיפת סיליקה. חלקיקי הסיליקה נלכדו באונות הריאה של חולדות (שבועיים ו-24 שבועות), וסיבי הקולגן של חולדות (24 שבועות) נצפו במיקרוסקופ אור מקוטב. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אבולוציה דינמית של גושים סיליקוטיים שזוהו על-ידי צביעה אימונוהיסטוכימית של CD68. (A) ככל שזמן החשיפה גדל (משבועיים ל-24 שבועות), שטח הגושים הסיליקוטיים גדל בהדרגה, והגושים הסיליקוטיים הסמוכים התמזגו בהדרגה לגושים גדולים. (B) התבנית של גושי סיליקון. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צביעת H&E של הריאות, הכליות, הכבד, הטחול והעצם של חולדות ביקורת וחולדות עם סיליקוזיס. (A) צביעת H&E של הריאות, הכליות, הכבד, הטחול והעצם של חולדות ביקורת. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. (B) צביעת H&E של הריאות, הכליות, הכבד, הטחול והעצם של חולדות ביקורת. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. נגעים פיברוטיים מרובים בגדלים שונים נוצרו בחולדות שנחשפו לסיליקה בהשוואה לחולדות הביקורת. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בכליות, בכבד ובטחול בין חולדות ביקורת לחולדות עם סיליקוזיס, אך אובדן העצם נצפה בחולדות עם סיליקוזיס. (C) צביעת H&E של הריאות, הכליות, הכבד, הטחול והעצם של חולדות עם סיליקוזיס. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. (D) צביעת H&E של הריאות, הכליות, הכבד, הטחול והעצם של חולדות עם סיליקוזיס. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מדידת זמן (מינימום) | נפח (L) | W1 (גרם) | W2 (גרם) | ריכוזים (מ"ג/מטר3) |
| 10 | 460 | 0.40 | 0.43 | 65.22 |
| 20 | 923 | 0.40 | 0.46 | 65.01 |
| 30 | 1404 | 0.40 | 0.49 | 64.1 |
טבלה 1: ריכוזי סיליקה בתא הגוף כולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כגורם המוביל לסיליקוזיס, סיליקה ממלאת תפקיד מכריע בעיצוב. חלקיקי הסיליקה הנשאפים על ידי חולים עם פנאומוקוניוזיס הם חלקיקי סיליקה טריים וחופשיים המיוצרים על ידי חיתוך מכני. סיליקה יכולה לייצר מיני חמצן תגובתיים ישירות על משטחי חלקיקים שזה עתה נבקעו או בעקיפין באמצעות השפעתה על המקרופאגים25. לכן, טחינה של חלקיקי סיליקה הוא בעל חשיבות גבוהה. בפרוטוקול המוצע, סיליקה נטחנה בטיט אגת במשך יותר מ-90 דקות כדי להפוך אותה לעדינה יותר, לא סדירה יותר ולהגדיל את שטח הפנים. כפי שדווח, אסור שהריכוזים באוויר של סיליקה גבישית26 יהיו נמוכים מ-0.05 מ"ג/מ"ק3. עם זאת, פרוטוקול זה עשוי להיות בעיה עם ריכוזי אבק לא מדויקים; אי הוודאות של ריכוז האבק הייתה קשורה בעיקר להיעדר מערכת ניטור מובנית של ריכוז אבק. ריכוז הסיליקה בפועל חושב באמצעות המסה של SiO2 הנכנסת לארון האבק וקצב זרימת הגז. הנפח של SiO2 התבסס על מהירות הלוח הסיבובי, ולא על המסה של SiO2 שנכנסה בפועל לארון. לפיכך, פתרונות אפשריים לבעיה היו בדיקת נפח הסיליקה בתא פעמיים בשבוע כדי לוודא שהחולדות נחשפו לאותו נפח סיליקה בכל פעם, או הצבת מכשיר למדידת ריכוז בתא האבק, כאשר האחרון היה הפתרון הטוב ביותר.
כמו כן ניכרו מגבלותיו של מודל זה: (1) הקשר בין מנת החשיפה לבין השפעתה הביולוגית הוא משוער בלבד, משום שדרכי הנשימה של חולדות שונות מאלו של בני אדם; (2) הייתה קיימת אי-ודאות של ריכוז אבק; (3) השיטה המחייבת רכישת ציוד מיוחד; (4) נפח תא האבק ומספר החולדות הנגועות באבק הוגבלו; (5) לא ניתן היה לבנות את מודל הסיליקוזיס של עכברים משום שדרכי הנשימה של עכברים היו צרות ולא ניתן היה לשקוע אבק סיליקה בריאות; כמו כן, מודל העכבר היה זול יותר, והיה קל לייצר עכברים טרנסגניים או KO.
הבנייה הקונבנציונלית של מודל בעלי החיים סיליקוזיס כללה בעיקר שתי שיטות: הזרקת סימפונות ושאיפת SiO2. בהזרקת סימפונות, התמותה הייתה קשורה קשר הדוק למנת הזילוח, והניתוח הפולשני גרם בהכרח לנזק משני נוסף27. כדי להחליף את מודל ההזרקה התוך-טרכאלית, כמה חוקרים ביססו מודל סיליקוזיס באמצעות תרחיף סיליקה אטום קולי לשאיפה28. עם זאת, אטומיזציה קולית לא יכלה לשלוט בריכוז הסיליקה באוויר לאחר האטומיזציה, יכולת החזרה הייתה גרועה, ולא ניתן היה ליצור נגעים פיברוטיים טיפוסיים בשיטת דוגמנות זו. מודל חסכוני, מעשי ויעיל נוסף היה דגם טפטוף האף של עכברמודל 29, אך שיטה זו הזריקה סיליקה נוזלית לקנה הנשימה ולא הייתה טובה כמו שאיפתה. למנגנון בקרת החשיפה מערכת יניקת אוויר מרובה כך שהסיליקה בתא השאיפה מפוזרת באופן שווה, הנתונים מדויקים ופיזור האבק בתא האבק אחיד. לפיכך, סביבת הבדיקה הייתה יציבה במשך זמן רב, ופרמטרים רלוונטיים נצפו ונרשמו בכל עת.
המשמעות של ביסוס מודלים של מחלות או פציעות בבעלי חיים היא לחקות ככל האפשר את התהליך הפתולוגי של מחלה או פציעה הנגרמת על ידי גורמים פתוגניים. לכן, מודל טוב של בעלי חיים קרוב ככל האפשר למחלות אנושיות. על ידי חשיפה לסיליקה בשאיפה, החולדות יכלו לשאוף בחופשיות חלקיקי סיליקה פתוגניים בתא האבק. מפגשי החשיפה השבועיים והיומיים גם חיקו באופן מלא את שעות העבודה של עובדי פנאומוקוניוזיס. באמצעות שיטת מידול זו, זיהינו שינויים פתולוגיים כגון מעבר אפיתל-מזנכימלי, הפעלת אותות של גורמי גדילה העברה, הפעלת מקרופאגים והפעלת אותות הקשורים להזדקנות במהלך סיליקוזיס בחולדות. חלק מהתוצאות אושרו בדגימות אנושיות18. לאחרונה, התחלנו גם לחקור את השינויים הפתולוגיים הדינמיים באבולוציה של סיליקוזיס בשיטה זו23.
פרוטוקול פשוט זה, בעלות נמוכה וקל לחזרה הוא גם בעל חשיבות רבה בתקופה שבה שכיחות הסיליקוזיס עושה קאמבק בעולם30. לאחר חשיפה של 8 שבועות ל-100 מ"ג קוורץ/מ"ר3, 20% מהסיליקה נשארה בריאות החולדות לאחר 6 ו-12 חודשים31. כמו כן, החוקרים בדקו את המידה שבה בעל חיים במכשיר דומה יכול לשאוף ולנשוף אוויר; ריכוז הגז ששאפו בעלי החיים השתנה מעט32. הפרוטוקול עדיין טומן בחובו הבטחה גדולה, למשל, על ידי שילובו עם טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת כדי לבחון את האבולוציה הדינמית של סיליקוזיס ושילובו עם מסד הנתונים של התמליל כדי לאמת את התהליך הפתולוגי של סיליקוזיס ולאמת טיפולים מערכתיים אנטי דלקתיים ואנטי-פיברוטיים חדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82003406), הקרן למדעי הטבע של מחוז הביי (H2022209073), ופרויקט המדע והטכנולוגיה של מחלקת החינוך של חביי (ZD2022127).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air detector (compressive atmospheric sampler) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Anatomical table | No specific brand is recommended. | ||
| Antibody of CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Electric heating air-blowing drier | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Electronic balance | OHRUS | ||
| Embedding machine | leica | ||
| Exhaust gas discharge device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Generator systems | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Gloves (thin laboratory gloves) | The secco medical | ||
| Hematoxylin and eosin | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 exposure control apparatus | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Inhalation chamber | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Injection syringe | No specific brand is recommended. | ||
| Light microscope | olympus | ||
| Object slide | shitai | ||
| PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer) | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd | s5631 | |
| Silicon dioxide | Sigma-Aldrich | ||
| Slicing machine | leica | RM2255 | |
| Waste gas treatment device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Wet box | Cooperative plastic Products Factory | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
References
- Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114 (2019).
- The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
- Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162 (2021).
- Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656 (2022).
- Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
- Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408 (2020).
- Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
- Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
- Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
- Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301 (2012).
- Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
- Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
- Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
- Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
- Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
- Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
- Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
- Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
- Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
- Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
- Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063 (2021).
- Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
- Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
- Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C.
- Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
- Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).
