Summary
Este estudo descreve uma técnica para estabelecer um modelo de silicose em ratos com inalação de sílica por todo o corpo em uma câmara inalatória. Os ratos com silicose poderiam mimetizar de perto o processo patológico da silicose humana de maneira fácil, econômica e com boa repetibilidade.
Abstract
A principal causa de silicose é a inalação de sílica no ambiente ocupacional. Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, os modelos de roedores continuam sendo uma ferramenta essencial para o estudo da silicose humana. Para a silicose, o processo patológico clássico precisa ser induzível através da inalação de partículas de quartzo recém-geradas, o que significa induzir especificamente doença ocupacional humana. Este estudo descreveu uma técnica para estabelecer e mimetizar efetivamente o processo dinâmico patológico evolutivo da silicose. Além disso, a técnica apresentou boa repetibilidade, sem cirurgia envolvida. O sistema de exposição inalatória foi fabricado, validado e utilizado para estudos toxicológicos sobre inalação de partículas respiráveis. Os componentes críticos foram os seguintes: (1) gerador de pó SiO2 seco a granel ajustado com um controlador de fluxo de ar; (2) 0,3m3 de câmara de exposição inalatória de corpo inteiro acomodando até 3 ratos adultos; (3) um sistema de monitoramento e controle para regular a concentração de oxigênio, temperatura, umidade e pressão em tempo real; e (4) um sistema de barreira e disposição de resíduos para proteger os técnicos de laboratório e o meio ambiente. Em resumo, o presente protocolo relata a inalação por todo o corpo, e a câmara inalatória criou um modelo silicótico de rato confiável, razoável e repetível, com baixa mortalidade, menos lesões e mais proteção.
Introduction
A silicose, causada pela inalação de sílica, é a doença ocupacional mais grave na China, sendo responsável por mais de 80% do total de notificações de doenças ocupacionais a cada ano1. A etiologia da silicose é clara, podendo ser prevenida e controlada, mas não há método de tratamento efetivo disponível2. Muitos fármacos têm se mostrado eficazes em estudos básicos, mas apresentam efeitos clínicos imprecisos 3,4. Portanto, os mecanismos patológicos e fisiológicos da silicose ainda precisam ser explorados.
Muitos estudos têm utilizado a infusão única de sílica na traqueia de ratos ou camundongos para investigar a patogênese da silicose 5,6. Embora esses modelos silicóticos de roedores pudessem ser obtidos em curto espaço detempo7, esses métodos ainda apresentavam desafios, como trauma animal e alta mortalidade. Alguns estudos envolveram a instilação de sílica armazenada nos pulmões para induzir uma reação pulmonar inespecífica, mas não mencionaram nódulos silicóticos em camundongos8. Além disso, longe da silicose aguda, a exposição crônica à sílica em ambientes ocupacionais induziu inflamação pulmonar significativamente menor e elevou os níveis de marcadores antiapoptóticos, em vez de pró-apoptóticos, nos pulmões9. Portanto, um modelo animal confiável, razoável e repetível é necessário para explorar melhor a patogênese da silicose.
O presente estudo descreve um método para mimetizar o processo de doença de pacientes com silicose através da inalação de sílica através de todo o corpo, partículas liberadas pelo ar em uma câmara de inalação, que compreende um gerador de sílica liberado pelo ar, uma câmara de corpo inteiro e um sistema de descarte de resíduos. Este método é simples, fácil de operar e imita efetivamente o processo de evolução dinâmica patológica da silicose. Além disso, vários possíveis mecanismos e a patogênese da silicose são identificados por esse método 10,11,12. Espera-se que o protocolo proposto auxilie futuras investigações no campo relacionado à pesquisa em silicose.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Ciência e Tecnologia do Norte da China (código de protocolo LX2019033 e 2019-3-3 de aprovação). Ratos Wistar machos, com 3 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Todos os ratos foram mantidos em gaiolas estáticas com aparas de madeira. Os animais foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h e receberam ração e água ad libitum. Experimentos de seguimento foram conduzidos após 1 semana de alimentação adaptativa.
1. Preparo dos animais
- Na chegada, alojar todos os ratos em uma sala específica livre de patógenos (SPF).
- Dividir aleatoriamente os ratos sadios em dois grupos (n = 10): ratos controle inalando ar puro e ratos com silicose inalando sílica.
2. Preparação de sílica
CUIDADO: O pó de sílica inalado pelo corpo humano pode danificar os pulmões. Portanto, os indivíduos devem usar macacão, luvas médicas e máscaras de proteção (E95) durante as operações.
- Triturar as partículas de sílica (ver Tabela de Materiais) com uma argamassa de ágata durante 1,5 h antes de cada exposição. Isso ocorre porque o quartzo recém-fraturado produz maiores quantidades de espécies ativas de oxigênio do que o quartzo envelhecido13, e a sílica com diâmetro de 1-5 μm é a mais patogênica.
- Pesar a sílica (30 g) usando uma balança eletrônica após a moagem, colocá-la em um recipiente de vidro e assar a 180 °C por 6 h em um secador de ar de aquecimento elétrico (ver Tabela de Materiais) para eliminar patógenos da superfície das partículas de sílica.
3. Exposição à sílica nos ratos
- Conecte a injeção e os sistemas geradores disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) e coloque a sílica (30 g) no gerador. Verifique se o pipeline de conexão está normal, se o cabo de alimentação está conectado e se a fonte de alimentação está normal.
- Verifique o nível de água da torre de pulverização e o umidificador do dispositivo de tratamento de gases residuais (ver Tabela de Materiais) manualmente e adicione água se for insuficiente (não está na linha padrão).
- Adicione água da torneira à torre de pulverização do dispositivo de tratamento de gases residuais e água destilada ao umidificador (Figura 1).
- Ligue o dispositivo de descarga de gases de escape (ver Tabela de Materiais) e o interruptor da fonte de ar para confirmar se o interior do gabinete de proteção está em estado de pressão negativa.
- Confirme se a mistura de líquidos, a mistura de pó, as válvulas de controle de fluxo de gás puro e a válvula de descarga de águas residuais sob a câmara de inalação estão fechadas.
- Coloque um total de 10 ratos na câmara de inalação (ver Tabela de Materiais) e feche o compartimento de inalação e as portas do armário blindado.
- Ajuste os seguintes parâmetros experimentais no painel de instrumentos ou no computador: pressão do gabinete: -50 a -30 Pa; concentração de oxigênio: 21%; temperatura do armário: 26-30 °C; umidade: 30%-70%; taxa de entrada de poeira: 2,0-2,5 mL/min; e concentração de poeira no gabinete: 60 ± 5 mg/m3.
NOTA: Observe os dados experimentais e o estado do equipamento continuamente durante o experimento. O alarme de falha do equipamento motivou o processamento em tempo hábil.- Expor cada animal à sílica continuamente por 3 h por dia, 5 dias por semana, e permitir que os animais do grupo controle inalem ar puro.
- Após a conclusão do experimento, feche a válvula de controle de fluxo de gás misto e abra a válvula de fluxo de gás puro. Injete o gás puro continuamente na câmara de inalação.
OBS: No presente estudo, o fluxo de gás puro (7,0-7,5 m3/h) foi injetado por pelo menos 20 min até que o gás venenoso na câmara de inalação fosse completamente substituído.- Feche a válvula de fluxo de ar puro, abra a porta, retire os ratos e envie-os de volta para a sala livre de patógenos.
- Remova o rack do rato e os componentes do tubo de ramificação em sequência e coloque-os na pia para limpeza. Após o enxágue, feche a válvula de limpeza automática e abra a escotilha.
- Limpe a parede interna com um pano limpo ou ligue o gás puro para secar o tanque. Por fim, realize a desinfecção. Após limpar e desinfetar com etanol 75%, feche o portão de exaustão e, assim que possível, abra levemente a porta da cabine de inalação para evaporar a umidade, de modo que o interior da cabine de inalação permaneça seco.
- Verifique a concentração de sílica no gabinete com um amostrador atmosférico abrangente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) duas vezes por semana para garantir a estabilidade da concentração de sílica durante o experimento. Calibrar o amostrador atmosférico antes da amostragem.
- Use uma balança analítica digital de panela única para determinação gravimétrica. A concentração calculada de sílica foi de 65 mg/m3 (Figura 1 e Tabela 1).
OBS: Pesar o papel filtro antes e depois da absorção da sílica. A concentração de sílica foi calculada utilizando-se a seguinte fórmula12:
onde W2 = peso do papel de filtro após a amostragem, W1 = peso do papel de filtro antes da amostragem e V = volume do ar.
- Use uma balança analítica digital de panela única para determinação gravimétrica. A concentração calculada de sílica foi de 65 mg/m3 (Figura 1 e Tabela 1).
4. Aquisição e fixação dos tecidos pulmonares
- Eutanásia dos ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg/kg de peso corporal) e lidocaína (4 mg/kg de peso corporal). Avaliar a morte pela perda dos batimentos cardíacos14.
- Ao final do experimento, fixar o pulmão inferior direito, rim, fígado, baço e osso com paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 h, embutir em parafina e cortar em cortes de 5 μm 7,15.
5. Coloração para hematoxilina e eosina (H&E)
- Desparafinizar as seções de parafina em xilol (ver Tabela de Materiais) duas vezes por 10 min a cada16 e reidratar em etanol 100%, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80%, etanol 70% e água destilada por 3 min cada.
- Manchar os cortes com hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 5 min e, em seguida, lavar os cortes com água10.
- Coloque as secções em álcool clorídrico a 2% e depois em água destilada até que a cor mude para azul.
- Manchar os cortes com eosina por 1 min, desidratá-los com etanol 95%, torná-los transparentes com xileno, selá-los com goma neutra e observar ao microscópio de luz12.
6. Coloração imuno-histoquímica
- Lave rotineiramente as seções de parafina com água.
- Expor os antígenos a alta pressão (60 kPa) e alta temperatura (100 °C) por 80 s e, em seguida, bloquear com bloqueador da peroxidase endógena (3%) por 15 min para eliminar as peroxidases endógenas7.
- Incubar as amostras com anticorpos dirigidos contra CD68 (diluição 1:200 - adicionar 4 μL de CD68 a 396 μL de diluente de anticorpos; ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
- Incubar as amostras com um anticorpo secundário (polímero IgG de cabra anti-rato conjugado com HRP; ver Tabela de Materiais) a 37 °C durante 30 minutos e, em seguida, lavar as amostras com 1x PBS.
- Visualize a imunorreatividade com 3,3-diaminobenzidina (DAB; ver Tabela de Materiais). Após a aplicação de DAB no tecido, observar a coloração do tecido ao microscópio de luz10.
OBS: O tempo de coloração variou de poucos segundos a poucos minutos de acordo com o tempo de coloração do tecido. O procedimento de coloração foi abortado colocando-se os cortes em água. Neste estudo, a coloração marrom do tecido representou a expressão positiva de CD68. Todos os anticorpos foram diluídos em 1x PBS.
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Representative Results
Usando o método proposto, alguns mecanismos potenciais e a patogênese da silicose foram explorados em ratos. O esquema da câmara inalatória é mostrado na Figura 1. A câmara consistia de um gerador de sílica liberado a ar, uma câmara de corpo inteiro e um sistema de disposição de resíduos, conforme descrito anteriormente17. As funções pulmonares, os níveis de fatores inflamatórios no soro e pulmão, a deposição de colágeno e a diferenciação miofibroblástica foram relatados em estudos prévios 10,18,19. A expressão diferencial de miRNA, lncRNA e mRNA foi relatada em nossos relatos anteriores 20,21,22. Nenhum rato morreu após exposição à sílica nos estudos de múltiplos lotes acima mencionados.
As características patológicas clássicas de ratos com silicose foram resumidaspreviamente23. Os nódulos silicóticos consistiam de macrófagos contendo sílica. A Figura 2 apresenta a deposição de colágeno em ratos com silicose. O cristalino polarizado revelou sílica em macrófagos. A Figura 3 apresenta a evolução dinâmica dos nódulos silicóticos pela coloração imunohistoquímica de CD68; Outros marcadores alternativos incluíram óxido nítrico sintase induzível ou arginase-124. Como mencionadoanteriormente23, os ratos expostos à sílica por 24 semanas apresentaram lesões visíveis e observáveis, incluindo deposição de colágeno em nódulos silicóticos, coloração positiva para ácido periódico de Schiff e comprometimento da função pulmonar. Por outro lado, os demais órgãos (coração, baço e fígado) não apresentaram diferenças morfológicas entre ratos controle e silicose (Figura 4). O rim de ratos expostos à sílica por 24 semanas apresentou alterações degenerativas leves nos túbulos contorcidos proximais. O metabolismo ósseo anormal foi bem documentado em nossos estudos prévios10,17. De modo geral, esses estudos destacaram que o protocolo proposto poderia mimetizar bem a progressão da silicose em humanos.
Figura 1: Esquema do aparelho de controle de exposição. (A) Gerador de sílica entregue a ar. (B) Câmara de corpo inteiro. (C) Painéis de instrumentos. (D) Aparelho de controle de exposição. (E) Todos os componentes são montados para formar um instrumento de trabalho; A câmara é composta por um gerador de sílica fornecido a ar, uma câmara de corpo inteiro e um sistema de descarte de resíduos. (F,G) Detector de ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Coloração H&E e deposição de colágeno em ratos com silicose. Coloração H&E de ratos expostos à sílica por 2 e 24 semanas. A estrutura alveolar dos ratos ainda estava intacta, e a parede alveolar estava espessada após 2 semanas de inalação de sílica. A estrutura alveolar dos ratos desapareceu e grandes áreas de fibrose foram formadas após 24 semanas de inalação de sílica. As partículas de sílica foram aprisionadas nos lobos pulmonares de ratos (2 e 24 semanas), e as fibras colágenas de ratos (24 semanas) foram observadas em microscópio de luz polarizada. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Evolução dinâmica dos nódulos silicóticos detectados pela coloração imunoistoquímica de CD68. (A) À medida que o tempo de exposição aumentou (de 2 para 24 semanas), a área dos nódulos silicóticos aumentou gradualmente, e os nódulos silicóticos adjacentes gradualmente se fundiram em grandes nódulos. (B) O padrão dos nódulos de silício. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração H&E dos pulmões, rim, fígado, baço e osso de ratos controle e ratos com silicose. (A) Coloração H&E dos pulmões, rim, fígado, baço e osso de ratos controle. Barra de escala: 1 mm. (B) Coloração H&E dos pulmões, rim, fígado, baço e osso de ratos controle. Barra de escala: 50 μm. Múltiplas lesões fibróticas de tamanhos variados foram formadas em ratos expostos à sílica em comparação com os ratos controle. Não foram encontradas diferenças significativas no rim, fígado e baço entre ratos controle e ratos com silicose, mas a perda óssea foi observada em ratos com silicose. (C) Coloração H&E dos pulmões, rim, fígado, baço e osso de ratos com silicose. Barra de escala: 1 mm. (D) Coloração H&E dos pulmões, rim, fígado, baço e osso de ratos com silicose. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo de medição (min) | Volume (L) | W1 (g) | W2 (g) | Concentrações (mg/m3) |
| 10 | 460 | 0.40 | 0.43 | 65.22 |
| 20 | 923 | 0.40 | 0.46 | 65.01 |
| 30 | 1404 | 0.40 | 0.49 | 64.1 |
Tabela 1: Concentrações de sílica na câmara de corpo inteiro.
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Discussion
Como principal causa de silicose, a sílica desempenha um papel decisivo na moldagem. As partículas de sílica inaladas por pacientes com pneumoconiose são partículas frescas e livres de sílica produzidas por corte mecânico. A sílica pode gerar espécies reativas de oxigênio diretamente na superfície das partículas recém-clivadas ou indiretamente através de seu efeito sobre os macrófagos25. Portanto, a moagem de partículas de sílica é de grande importância. No protocolo proposto, a sílica foi triturada com argamassa ágata por mais de 90 min para torná-la mais fina, irregular e aumentar a área superficial. Conforme relatado, as concentrações de sílica cristalina26 no ar não devem ser inferiores a 0,05 mg/m3. No entanto, este protocolo pode ter um problema com concentrações de poeira imprecisas; A incerteza da concentração de poeira foi associada principalmente à ausência de um sistema integrado de monitoramento da concentração de poeira. A concentração real de sílica foi calculada usando a massa de SiO2 que entra no gabinete de poeira e a vazão de gás. O volume de SiO2 foi baseado na velocidade da placa rotativa, em vez da massa de SiO2 realmente entrando no gabinete. Assim, possíveis soluções para o problema foram verificar o volume de sílica na câmara duas vezes por semana para garantir que os ratos fossem expostos ao mesmo volume de sílica todas as vezes ou colocar um medidor de concentração na câmara de poeira, sendo esta última a melhor solução.
As limitações desse modelo também foram aparentes: (1) a relação entre a dose de exposição e seu efeito biológico só é aproximada porque o trato respiratório de ratos é diferente do de humanos; (2) existia a incerteza da concentração de poeira; (3) o método exigia a compra de equipamentos especiais; (4) o volume da câmara de poeira e o número de ratos infectados com poeira foram limitados; (5) o modelo de silicose em camundongos não pôde ser construído porque o trato respiratório de camundongos era estreito e a poeira de sílica não podia ser depositada nos pulmões; Além disso, o modelo de camundongo era mais barato e fácil de gerar camundongos transgênicos ou KO.
A construção convencional do modelo animal de silicose incluiu principalmente dois métodos: injeção brônquica e inalação de SiO2. Na injeção brônquica, a mortalidade esteve intimamente relacionada à dose de perfusão, e a cirurgia invasiva inevitavelmente causou dano colateral adicional27. Para substituir o modelo de injeção intratraqueal, alguns estudiosos estabeleceram um modelo de silicose utilizando uma suspensão de sílica atomizada ultrassônica para inalação28. No entanto, a atomização ultra-sônica não conseguiu controlar a concentração de sílica no ar após a atomização, a repetibilidade foi pobre e lesões fibróticas típicas não puderam ser formadas usando este método de modelagem. Outro modelo econômico, prático e eficaz foi o modelo29 de gotejamento nasal de camundongo, mas esse método injetou sílica líquida na traqueia e não foi tão bom quanto inalá-la. O aparelho de controle de exposição possui um sistema de entrada de ar múltiplo para que a sílica na câmara de inalação seja distribuída uniformemente, os dados sejam precisos e a distribuição de poeira na câmara de poeira seja uniforme. Assim, o ambiente de teste permaneceu estável por um longo tempo, e parâmetros relevantes foram observados e registrados a qualquer momento.
A importância de estabelecer modelos de doenças ou lesões em animais é mimetizar o processo patológico de doença ou lesão causada por fatores patogênicos na maior medida possível. Portanto, um bom modelo animal é o mais próximo possível da doença humana. Por exposição inalatória à sílica, os ratos poderiam inalar livremente partículas patogênicas de sílica na câmara de poeira. As sessões de exposição semanal e diária também mimetizavam integralmente a jornada de trabalho dos trabalhadores com pneumoconioses. Usando este método de modelagem, identificamos alterações patológicas como transição epitélio-mesenquimal, ativação de sinais de fator de crescimento de transferência, ativação de macrófagos e ativação de sinais relacionados à senescência durante silicose em ratos. Alguns dos resultados foram confirmados em amostras humanas18. Recentemente, também começamos a estudar as alterações patológicas dinâmicas na evolução da silicose por esse método23.
Esse protocolo simples, de baixo custo e de fácil repetibilidade também é de grande importância em um momento em que a incidência da silicose está voltando ao mundo30. Após 8 semanas de exposição inalatória a 100 mg de quartzo/m3, 20% de sílica permaneceu nos pulmões de ratos após 6 e 12 meses31. Além disso, os pesquisadores investigaram até que ponto um animal em um dispositivo semelhante poderia inspirar e expirar ar; A concentração do gás inalado pelos animais alterou-se discretamente32. O protocolo ainda é muito promissor, por exemplo, ao combiná-lo com a microtomografia computadorizada para observar a evolução dinâmica da silicose e combiná-lo com o banco de dados do transcriptoma para verificar o processo patológico da silicose e validar novas terapias sistêmicas anti-inflamatórias e antifibróticas.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82003406), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Hebei (H2022209073) e pelo Projeto de Ciência e Tecnologia do Departamento de Educação de Hebei (ZD2022127).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air detector (compressive atmospheric sampler) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Anatomical table | No specific brand is recommended. | ||
| Antibody of CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Electric heating air-blowing drier | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Electronic balance | OHRUS | ||
| Embedding machine | leica | ||
| Exhaust gas discharge device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Generator systems | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Gloves (thin laboratory gloves) | The secco medical | ||
| Hematoxylin and eosin | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 exposure control apparatus | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Inhalation chamber | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Injection syringe | No specific brand is recommended. | ||
| Light microscope | olympus | ||
| Object slide | shitai | ||
| PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer) | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd | s5631 | |
| Silicon dioxide | Sigma-Aldrich | ||
| Slicing machine | leica | RM2255 | |
| Waste gas treatment device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Wet box | Cooperative plastic Products Factory | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
References
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