Summary
Diese Studie beschreibt eine Technik zur Etablierung eines Silikose-Rattenmodells mit der Inhalation von Kieselsäure durch den ganzen Körper in einer Inhalationskammer. Die Ratten mit Silikose konnten den pathologischen Prozess der menschlichen Silikose auf einfache, kostengünstige Weise mit guter Wiederholbarkeit genau nachahmen.
Abstract
Die Hauptursache für Silikose ist das Einatmen von Kieselsäure im beruflichen Umfeld. Trotz einiger anatomischer und physiologischer Unterschiede sind Nagetiermodelle nach wie vor ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der menschlichen Silikose. Bei der Silikose muss der klassische pathologische Prozess durch die Inhalation von frisch erzeugten Quarzpartikeln induzierbar sein, d.h. durch die spezifische Induktion menschlicher Berufskrankheiten. Diese Studie beschrieb eine Technik, um den pathologischen dynamischen Evolutionsprozess der Silikose zu etablieren und effektiv nachzuahmen. Darüber hinaus wies die Technik eine gute Wiederholbarkeit auf, ohne dass eine Operation erforderlich war. Das Inhalations-Expositionssystem wurde hergestellt, validiert und für toxikologische Studien zur Inhalation lungengängiger Partikel verwendet. Die kritischen Komponenten waren wie folgt: (1) Schüttgut-SiO2-Pulvergenerator, der mit einem Luftstromregler eingestellt wurde; (2) 0,3 m3 Ganzkörper-Inhalations-Expositionskammer für bis zu 3 erwachsene Ratten; (3) ein Überwachungs- und Steuerungssystem zur Regelung von Sauerstoffkonzentration, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Druck in Echtzeit; und (4) ein Barriere- und Abfallentsorgungssystem zum Schutz der Laboranten und der Umwelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das vorliegende Protokoll die Inhalation über den ganzen Körper berichtet, und die Inhalationskammer schuf ein zuverlässiges, vernünftiges und wiederholbares Ratten-Silikose-Modell mit geringer Mortalität, weniger Verletzungen und mehr Schutz.
Introduction
Silikose, die durch das Einatmen von Kieselsäure verursacht wird, ist die schwerste Berufskrankheit in China und macht jedes Jahr mehr als 80 % der Gesamtzahl der gemeldeten Berufskrankheiten aus1. Die Ätiologie der Silikose ist klar und kann verhindert und kontrolliert werden, aber es gibt keine wirksame Behandlungsmethode2. Viele Medikamente haben sich in Grundlagenstudien als wirksam erwiesen, aber sie haben ungenaue klinischeWirkungen 3,4. Daher müssen die pathologischen und physiologischen Mechanismen der Silikose noch erforscht werden.
In vielen Studien wurde eine einmalige Infusion von Kieselsäure in die Luftröhre von Ratten oder Mäusen verwendet, um die Pathogenese der Silikosezu untersuchen 5,6. Obwohl diese Nagetier-Silikotika-Modelle in kurzer Zeit erhalten werden konnten7, waren diese Methoden immer noch mit Herausforderungen verbunden, wie z. B. Tiertraumata und hohe Mortalität. Einige Studien beinhalteten die Instillation von gespeichertem Siliziumdioxid in die Lunge, um eine unspezifische Lungenreaktion auszulösen, erwähnten jedoch keine Kieselsäureknoten bei Mäusen8. Darüber hinaus führte die chronische Exposition gegenüber Kieselsäure im beruflichen Umfeld abseits der akuten Silikose zu einer signifikant geringeren Lungenentzündung und erhöhte die Spiegel anti-apoptotischer Marker anstelle von pro-apoptotischen Markern in der Lunge9. Daher wird ein zuverlässiges, vernünftiges und wiederholbares Tiermodell benötigt, um die Pathogenese der Silikose weiter zu erforschen.
Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode zur Nachahmung des Krankheitsprozesses von Patienten mit Silikose durch Inhalation von Kieselsäure über den ganzen Körper, luftzugeführte Partikel in einer Inhalationskammer, die einen luftzugeführten Kieselsäuregenerator, eine Ganzkörperkammer und ein Abfallentsorgungssystem umfasste. Diese Methode ist einfach, leicht zu handhaben und ahmt effektiv den pathologischen dynamischen Evolutionsprozess der Silikose nach. Auch viele mögliche Mechanismen und die Pathogenese der Silikose werden mit dieser Methode identifiziert 10,11,12. Es wird erwartet, dass das vorgeschlagene Protokoll weitere Untersuchungen auf dem verwandten Gebiet der Silikoseforschung unterstützen wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden gemäß dem Leitfaden der US-amerikanischen National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Ethikausschuss der Nordchinesischen Universität für Wissenschaft und Technologie genehmigt (Protokollcode LX2019033 und 2019-3-3 der Genehmigung). Für die vorliegende Studie wurden männliche Wistar-Ratten im Alter von 3 Wochen verwendet. Alle Ratten wurden in statischen Käfigen mit Holzspänen gehalten. Die Tiere wurden in einem 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und ad libitum mit Futter und Wasser versorgt. Folgeexperimente wurden nach 1 Woche adaptiver Fütterung durchgeführt.
1. Zubereitung von Tieren
- Bei der Ankunft sollten alle Ratten in einem speziellen Raum untergebracht werden, der frei von Krankheitserregern (LSF) ist.
- Die gesunden Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt (n = 10): Kontrollratten, die reine Luft einatmeten, und Ratten mit Silikose, die Kieselsäure inhalierten.
2. Herstellung von Kieselsäure
VORSICHT: Quarzstaub, der vom menschlichen Körper eingeatmet wird, kann die Lunge schädigen. Daher müssen Personen während der Operationen Overalls, medizinische Handschuhe und Schutzmasken (N95) tragen.
- Die Kieselsäurepartikel (siehe Materialtabelle) werden vor jeder Belichtung 1,5 h lang mit einem Achatmörser gemahlen. Dies liegt daran, dass frisch gebrochener Quarz größere Mengen an aktiven Sauerstoffspezies produziert als gealterter Quarz13 und Kieselsäure mit einem Durchmesser von 1-5 μm am pathogensten ist.
- Die Kieselsäure (30 g) wird nach dem Mahlen mit einer elektronischen Waage gewogen, in einen Glasbehälter gegeben und bei 180 °C 6 h in einem elektrischen Heizlufttrockner (siehe Materialtabelle) gebacken, um Krankheitserreger von der Oberfläche der Kieselsäurepartikel zu entfernen.
3. Kieselsäure-Exposition der Ratten
- Verbinden Sie das Einspritz- und das handelsübliche Generatorsystem (siehe Materialtabelle) und geben Sie die Kieselsäure (30 g) in den Generator. Überprüfen Sie, ob die Verbindungsleitung in Ordnung ist, das Netzkabel angeschlossen ist und die Stromversorgung in Ordnung ist.
- Kontrollieren Sie den Wasserstand des Sprühturms und des Luftbefeuchters der Abgasreinigungsanlage (siehe Materialtabelle) manuell und füllen Sie Wasser nach, wenn dieser nicht ausreicht (nicht bis zur Normleitung).
- Geben Sie Leitungswasser in den Sprühturm des Abgasreinigungsgeräts und destilliertes Wasser in den Luftbefeuchter (Abbildung 1).
- Schalten Sie die Abgasableitungseinrichtung (siehe Werkstofftabelle) und den Luftquellenschalter ein, um zu überprüfen, ob sich das Innere des Abschirmschranks im Unterdruckzustand befindet.
- Vergewissern Sie sich, dass die Flüssigkeitsmischung, die Pulvermischung, die Durchflussregelventile für Reingas und das Abwasserablassventil unter der Inhalationskammer geschlossen sind.
- Setzen Sie insgesamt 10 Ratten in die Inhalationskammer (siehe Materialtabelle) und schließen Sie das Inhalationsfach und die abgeschirmten Schranktüren.
- Stellen Sie die folgenden experimentellen Parameter auf der Instrumententafel oder im Computer ein: Schrankdruck: -50 bis -30 Pa; Sauerstoffkonzentration: 21%; Schranktemperatur: 26-30 °C; Luftfeuchtigkeit: 30%-70%; Staubeintragsrate: 2,0-2,5 ml/min; und Staubkonzentration im Schrank: 60 ± 5 mg/m3.
HINWEIS: Beobachten Sie die Versuchsdaten und den Gerätestatus während des Experiments kontinuierlich. Der Alarm bei Geräteausfall veranlasste eine zeitnahe Bearbeitung.- Setzen Sie jedes Tier 3 Stunden pro Tag an 5 Tagen pro Woche kontinuierlich Kieselsäure aus und lassen Sie die Tiere in der Kontrollgruppe reine Luft einatmen.
- Nach Beendigung des Versuchs ist das Mischgas-Durchflussregelventil zu schließen und das Reingas-Durchflussventil zu öffnen. Injizieren Sie das reine Gas kontinuierlich in die Inhalationskammer.
ANMERKUNG: In der vorliegenden Studie wurde der Reingasstrom (7,0-7,5m3/h) für mindestens 20 min injiziert, bis das giftige Gas in der Inhalationskammer vollständig ersetzt war.- Schließen Sie das reine Luftstromventil, öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Ratten heraus und schicken Sie sie zurück in den pathogenfreien Raum.
- Entnehmen Sie nacheinander das Rattengestell und die Komponenten des Abzweigrohrs und legen Sie sie zur Reinigung in die Spüle. Schließen Sie nach dem Spülen das automatische Reinigungsventil und öffnen Sie die Klappe.
- Wischen Sie die Innenwand mit einem sauberen Tuch ab oder schalten Sie das reine Gas ein, um den Tank zu trocknen. Zum Schluss führen Sie die Desinfektion durch. Nach der Reinigung und Desinfektion mit 75%igem Ethanol die Abluftklappe schließen und so schnell wie möglich die Tür der Inhalationskabine leicht öffnen, um die Feuchtigkeit zu verdunsten, damit das Innere der Inhalationskabine trocken bleibt.
- Überprüfen Sie zweimal wöchentlich die Kieselsäurekonzentration im Schrank mit einem umfassenden atmosphärischen Probenehmer gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle), um die Stabilität der Kieselsäurekonzentration während des Experiments sicherzustellen. Kalibrieren Sie den atmosphärischen Probenehmer vor der Probenahme.
- Verwenden Sie eine digitale Einschalen-Analysenwaage für die gravimetrische Bestimmung. Die berechnete Kieselsäurekonzentration betrug 65 mg/m3 (Abbildung 1 und Tabelle 1).
HINWEIS: Wiegen Sie das Filterpapier vor und nach der Aufnahme von Kieselsäure. Die Konzentration der Kieselsäure wurde mit der folgenden Formel12 berechnet:
wobei W2 = Gewicht des Filterpapiers nach der Probenahme, W1 = Gewicht des Filterpapiers vor der Probenahme und V = Luftvolumen ist.
- Verwenden Sie eine digitale Einschalen-Analysenwaage für die gravimetrische Bestimmung. Die berechnete Kieselsäurekonzentration betrug 65 mg/m3 (Abbildung 1 und Tabelle 1).
4. Erfassung und Fixierung von Lungengewebe
- Euthanasie der Ratten durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (100 mg/kg Körpergewicht) und Lidocain (4 mg/kg Körpergewicht). Beurteilen Sie den Tod anhand des Verlusts des Herzschlags14.
- Am Ende des Versuchs werden die rechte untere Lunge, Niere, Leber, Milz und Knochen mindestens 24 h lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5-μm-Abschnitte geschnitten 7,15.
5. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)
- Die Paraffinabschnitte in Xylol (siehe Materialtabelle) zweimal für jeweils10 Minuten 16 entparaffinieren und jeweils 3 Minuten in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertem Wasser rehydrieren.
- Färben Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) und waschen Sie sie dann mit Wasser10.
- Legen Sie die Abschnitte in 2%igen Salzalkohol und dann in destilliertes Wasser, bis die Farbe blau wird.
- Färben Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit Eosin, dehydrieren Sie sie mit 95%igem Ethanol, machen Sie sie mit Xylol transparent, versiegeln Sie sie mit neutralem Gummi und beobachten Sie sie unter einem Lichtmikroskop12.
6. Immunhistochemische Färbung
- Waschen Sie die Paraffinabschnitte regelmäßig mit Wasser.
- Die Antigene werden 80 s lang bei hohem Druck (60 kPa) und hoher Temperatur (100 °C) exponiert und dann 15 Minuten lang mit einem endogenen Peroxidaseblocker (3%) blockiert, um die endogenen Peroxidasen zu eliminieren7.
- Die Proben werden mit Antikörpern gegen CD68 (1:200 Verdünnung - 4 μl CD68 auf 396 μl Antikörperverdünnungsmittel zugeben; siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht inkubiert.
- Die Proben werden mit einem sekundären Antikörper (HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG-Polymer; siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 30 min inkubiert und anschließend mit 1x PBS gewaschen.
- Visualisieren Sie die Immunreaktivität mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB; siehe Materialtabelle). Nach dem Auftragen von DAB auf das Gewebe ist die Färbung des Gewebes unter dem Lichtmikroskop10 zu beobachten.
HINWEIS: Die Färbezeit variierte je nach Färbezeit des Gewebes von einigen Sekunden bis zu einigen Minuten. Die Färbung wurde abgebrochen, indem die Schnitte in Wasser gelegt wurden. In dieser Studie stellte die braune Färbung des Gewebes die positive Expression von CD68 dar. Alle Antikörper wurden in 1x PBS verdünnt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit der vorgeschlagenen Methode wurden einige mögliche Mechanismen und die Pathogenese der Silikose an Ratten untersucht. Das Schema der Inhalationskammer ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Kammer bestand aus einem luftzugeführten Silica-Generator, einer Ganzkörperkammer und einem Abfallentsorgungssystem, wie zuvor17 beschrieben. Die Lungenfunktionen, die Konzentrationen von Entzündungsfaktoren im Serum und in der Lunge, die Kollagenablagerung und die Differenzierung der Myofibroblasten wurden in den vorangegangenen Studien berichtet 10,18,19. Die differentielle Expression von miRNA, lncRNA und mRNA wurde in unseren früheren Berichtenberichtet 20,21,22. In den oben genannten Multi-Batch-Studien starben keine Ratten nach der Exposition gegenüber Kieselsäure.
Die klassischen pathologischen Merkmale von Ratten mit Silikose wurden zuvor zusammengefasst23. Die Kieselknollen bestanden aus kieselsäurehaltigen Makrophagen. Abbildung 2 zeigt die Kollagenablagerung bei Ratten mit Silikose. Die polarisierte Linse enthüllte Kieselsäure in Makrophagen. Abbildung 3 zeigt die dynamische Entwicklung von silikotischen Knötchen durch immunhistochemische Färbung von CD68; Andere alternative Marker waren induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase oder Arginase-124. Wie bereits erwähnt23, zeigten die Ratten, die 24 Wochen lang Kieselsäure ausgesetzt waren, sichtbare und beobachtbare Läsionen, einschließlich Kollagenablagerungen in Kieselknötchen, periodische Säure-Schiff-positive Färbung und beeinträchtigte Lungenfunktionen. Auf der anderen Seite zeigten die anderen Organe (Herz, Milz und Leber) keine morphologischen Unterschiede zwischen Kontrollratten und Ratten mit Silikose (Abbildung 4). Die Niere von Ratten, die 24 Wochen lang Kieselsäure ausgesetzt waren, wies leichte degenerative Veränderungen in den proximalen gewundenen Tubuli auf. Der abnorme Knochenstoffwechsel war in unseren früheren Studien gut dokumentiert 10,17. Insgesamt zeigten diese Studien, dass das vorgeschlagene Protokoll das Fortschreiten der Silikose beim Menschen gut nachahmen könnte.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Apparats zur Expositionskontrolle. (A) Luftzugeführter Siliciumdioxid-Generator. (B) Ganzkörperkammer. (C) Instrumententafeln. (D) Vorrichtung zur Begrenzung der Exposition. (E) Alle Bestandteile sind zu einem Arbeitsinstrument zusammengefügt; Die Kammer besteht aus einem luftzugeführten Kieselsäuregenerator, einer Ganzkörperkammer und einem Abfallentsorgungssystem. (F,G) Luftdetektor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: H&E-Färbung und Kollagenablagerung bei Ratten mit Silikose. H&E-Färbung von Ratten, die 2 und 24 Wochen lang Kieselsäure ausgesetzt waren. Die Alveolarstruktur der Ratten war noch intakt und die Alveolarwand war nach 2-wöchiger Kieselsäureinhalation verdickt. Die Alveolarstruktur der Ratten verschwand, und nach 24-wöchiger Inhalation mit Kieselsäure bildeten sich große Fibrosebereiche. Die Kieselsäurepartikel wurden in den Lungenlappen von Ratten (2 und 24 Wochen) gefangen und die Kollagenfasern von Ratten (24 Wochen) wurden unter einem Polarisationsmikroskop beobachtet. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Dynamische Entwicklung von silikotischen Knötchen, nachgewiesen durch immunhistochemische Färbung von CD68. (A) Mit zunehmender Expositionszeit (von 2 auf 24 Wochen) nahm die Fläche der silikotischen Knötchen allmählich zu, und die benachbarten siliktischen Knötchen verschmolzen allmählich zu großen Knötchen. (B) Das Muster von Siliziumknollen. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: H&E-Färbung von Lunge, Niere, Leber, Milz und Knochen von Kontrollratten und Ratten mit Silikose. (A) H&E-Färbung von Lunge, Niere, Leber, Milz und Knochen von Kontrollratten. Maßstab: 1 mm. (B) H&E-Färbung von Lunge, Niere, Leber, Milz und Knochen von Kontrollratten. Maßstab: 50 μm. Mehrere fibrotische Läsionen unterschiedlicher Größe wurden bei Ratten, die Kieselsäure ausgesetzt waren, im Vergleich zu den Kontrollratten gebildet. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in Niere, Leber und Milz zwischen Kontrollratten und Ratten mit Silikose gefunden, aber der Knochenverlust wurde bei Ratten mit Silikose beobachtet. (C) H&E-Färbung von Lunge, Niere, Leber, Milz und Knochen von Ratten mit Silikose. Maßstab: 1 mm. (D) H&E-Färbung von Lunge, Niere, Leber, Milz und Knochen von Ratten mit Silikose. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Messzeit (min) | Volumen (L) | W1 (g) | W2 (g) | Konzentrationen (mg/m3) |
| 10 | 460 | 0.40 | 0.43 | 65.22 |
| 20 | 923 | 0.40 | 0.46 | 65.01 |
| 30 | 1404 | 0.40 | 0.49 | 64.1 |
Tabelle 1: Konzentrationen von Kieselsäure in der Ganzkörperkammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als Hauptverursacher der Silikose spielt Kieselsäure eine entscheidende Rolle bei der Formgebung. Die Kieselsäurepartikel, die von Patienten mit Pneumokoniose eingeatmet werden, sind frische, freie Kieselsäurepartikel, die durch mechanisches Schneiden hergestellt werden. Kieselsäure kann reaktive Sauerstoffspezies entweder direkt auf frisch gespaltenen Partikeloberflächen oder indirekt durch ihre Wirkung auf die Makrophagen25 erzeugen. Daher ist die Vermahlung von Kieselsäurepartikeln von großer Bedeutung. In dem vorgeschlagenen Protokoll wurde Kieselsäure mehr als 90 Minuten lang mit Achatmörtel gemahlen, um sie feiner und unregelmäßiger zu machen und die Oberfläche zu vergrößern. Wie berichtet, dürfen die luftgetragenen Konzentrationen von kristallinem Siliciumdioxid26 nicht niedriger als 0,05 mg/m3 sein. Dieses Protokoll kann jedoch ein Problem mit ungenauen Staubkonzentrationen haben. Die Unsicherheit der Staubkonzentration war hauptsächlich mit dem Fehlen eines eingebauten Staubkonzentrationsüberwachungssystems verbunden. Die tatsächliche Kieselsäurekonzentration wurde anhand der Masse vonSiO2 , die in den Staubschrank eintritt, und der Gasdurchflussrate berechnet. Das Volumen von SiO2 basierte auf der Geschwindigkeit des Drehtellers und nicht auf der Masse von SiO2 , die tatsächlich in den Schrank eintrat. Mögliche Lösungen für das Problem waren daher, das Kieselsäurevolumen in der Kammer zweimal pro Woche zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Ratten jedes Mal dem gleichen Volumen an Kieselsäure ausgesetzt waren, oder ein Konzentrationsmessgerät in der Staubkammer aufzustellen, wobei letzteres die beste Lösung war.
Die Limitationen dieses Modells waren ebenfalls offensichtlich: (1) Die Beziehung zwischen der Expositionsdosis und ihrer biologischen Wirkung ist nur näherungsweise, da sich die Atemwege von Ratten von denen des Menschen unterscheiden; (2) die Unsicherheit der Staubkonzentration bestand vor; (3) Die Methode erforderte den Kauf von Spezialausrüstung; (4) das Volumen der Staubkammer und die Anzahl der staubinfizierten Ratten waren begrenzt; (5) Das Maus-Silikose-Modell konnte nicht konstruiert werden, da die Atemwege der Mäuse eng waren und sich Quarzstaub nicht in der Lunge ablagern konnte. Außerdem war das Mausmodell billiger, und es war einfach, transgene oder KO-Mäuse zu erzeugen.
Die konventionelle Konstruktion des Silikose-Tiermodells umfasste im Wesentlichen zwei Methoden: die Bronchialinjektion und die Inhalation vonSiO2. Bei der bronchialen Injektion stand die Mortalität in engem Zusammenhang mit der Perfusionsdosis, und die invasive Operation verursachte unweigerlich zusätzliche Kollateralschäden27. Um das intratracheale Injektionsmodell zu ersetzen, etablierten einige Wissenschaftler ein Silikosemodell mit einer ultraschallzerstäubten Kieselsäuresuspension zur Inhalation28. Die Ultraschallzerstäubung konnte jedoch die Konzentration von Kieselsäure in der Luft nach der Zerstäubung nicht kontrollieren, die Wiederholbarkeit war schlecht und typische fibrotische Läsionen konnten mit dieser Modellierungsmethode nicht gebildet werden. Ein weiteres wirtschaftliches, praktisches und effektives Modell war das Maus-Nasentropfmodell29, aber diese Methode injizierte flüssige Kieselsäure in die Luftröhre und war nicht so gut wie das Einatmen. Die Expositionskontrollvorrichtung weist ein mehrfaches Luftansaugsystem auf, so dass die Kieselsäure in der Inhalationskammer gleichmäßig verteilt ist, die Daten genau sind und die Staubverteilung in der Staubkammer gleichmäßig ist. Dadurch war die Testumgebung über einen langen Zeitraum stabil und relevante Parameter konnten jederzeit beobachtet und aufgezeichnet werden.
Die Bedeutung der Etablierung von Tierkrankheits- oder Verletzungsmodellen besteht darin, den pathologischen Prozess von Krankheiten oder Verletzungen, die durch pathogene Faktoren verursacht werden, so weit wie möglich nachzuahmen. Daher ist ein gutes Tiermodell so nah wie möglich an menschlichen Krankheiten. Durch die inhalative Exposition gegenüber Kieselsäure konnten die Ratten pathogene Kieselsäurepartikel in der Staubkammer frei einatmen. Die wöchentlichen und täglichen Expositionssitzungen imitierten auch die Arbeitszeiten der Pneumokoniose-Arbeiter vollständig. Mit dieser Modellierungsmethode identifizierten wir pathologische Veränderungen wie den epithelial-mesenchymalen Übergang, die Aktivierung von Signalen des Transferwachstumsfaktors, die Aktivierung von Makrophagen und die Aktivierung von Seneszenz-bezogenen Signalen während der Silikose bei Ratten. Einige der Ergebnisse wurden in menschlichen Proben bestätigt18. In jüngster Zeit haben wir auch begonnen, die dynamischen pathologischen Veränderungen in der Evolution der Silikose mit dieser Methode zu untersuchen23.
Dieses einfache, kostengünstige und leicht wiederholbare Protokoll ist auch in einer Zeit, in der das Auftreten von Silikose in der Welt ein Comeback feiert, von großer Bedeutung30. Nach der 8-wöchigen inhalativen Exposition gegenüber 100 mg Quarz/m3 verblieben nach 6 und 12 Monaten 20 % der Kieselsäure in der Rattenlunge31. Außerdem untersuchten die Forscher, inwieweit ein Tier in einem ähnlichen Gerät Luft ein- und ausatmen kann. Die Konzentration des von den Tieren eingeatmeten Gases veränderte sich geringfügig32. Das Protokoll ist nach wie vor vielversprechend, z. B. durch die Kombination mit der Mikrocomputertomographie, um die dynamische Entwicklung der Silikose zu beobachten, und durch die Kombination mit der Transkriptomdatenbank, um den pathologischen Prozess der Silikose zu verifizieren und neue entzündungshemmende und antifibrotische systemische Therapien zu validieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82003406), der Natural Science Foundation of Hebei Province (H2022209073) und dem Science and Technology Project des Hebei Education Department (ZD2022127) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air detector (compressive atmospheric sampler) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Anatomical table | No specific brand is recommended. | ||
| Antibody of CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Electric heating air-blowing drier | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Electronic balance | OHRUS | ||
| Embedding machine | leica | ||
| Exhaust gas discharge device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Generator systems | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Gloves (thin laboratory gloves) | The secco medical | ||
| Hematoxylin and eosin | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 exposure control apparatus | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Inhalation chamber | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Injection syringe | No specific brand is recommended. | ||
| Light microscope | olympus | ||
| Object slide | shitai | ||
| PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer) | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd | s5631 | |
| Silicon dioxide | Sigma-Aldrich | ||
| Slicing machine | leica | RM2255 | |
| Waste gas treatment device | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Wet box | Cooperative plastic Products Factory | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
References
- Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114 (2019).
- The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
- Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162 (2021).
- Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656 (2022).
- Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
- Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408 (2020).
- Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
- Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
- Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
- Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301 (2012).
- Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
- Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
- Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
- Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
- Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
- Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
- Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
- Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
- Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
- Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
- Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063 (2021).
- Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
- Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
- Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C.
- Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
- Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).
