Morfologisk og sammensætningsanalyse af neutrofile ekstracellulære fælder induceret af mikrobielle og kemiske stimuli

Summary

Her præsenteres en protokol til induktion og analyse af in vitro neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er). Kvantificering af DNA, cathelicidin (LL37) og enzymaktivitet gav data, der viser variabiliteten i sammensætningen og morfologien af NET’er induceret af mikrobielle og kemiske stimuli under lignende kontrollerede forhold.

Abstract

Neutrofiler fungerer som den første linje af cellulært forsvar i et medfødt immunrespons ved at anvende forskellige mekanismer, såsom dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er). Denne undersøgelse analyserer de morfologiske og sammensætningsmæssige ændringer i NET’er induceret af mikrobielle og kemiske stimuli ved hjælp af standardiserede in vitro-metoder til NET-induktion og karakterisering med humane celler. De her beskrevne procedurer tillader analyse af NET-morfologi (lytisk eller ikke-lytisk) og sammensætning (DNA-proteinstrukturer og enzymatisk aktivitet) og virkningen af opløselige faktorer eller cellulær kontakt på sådanne egenskaber. Derudover kan de teknikker, der er beskrevet her, ændres for at evaluere effekten af eksogene opløselige faktorer eller cellulær kontakt på NET-sammensætningen.

De anvendte teknikker inkluderer oprensning af polymorfonukleære celler fra humant perifert blod ved hjælp af en dobbeltdensitetsgradient (1,079-1,098 g / ml), hvilket garanterer optimal renhed og levedygtighed (≥ 95%) som demonstreret ved Wrights farvning, trypanblå udelukkelse og flowcytometri, herunder FSC versus SSC-analyse og 7AAD-farvning. NET-dannelse induceres med mikrobielle (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Candida albicans) og kemiske (phorbol myristate acetat, HOCl) stimuli, og NET’erne er karakteriseret ved DNA-DAPI-farvning, immunostaining for det antimikrobielle peptid cathelicidin (LL37) og kvantificering af enzymatisk aktivitet (neutrofil elastase, cathepsin G og myeloperoxidase). Billederne erhverves gennem fluorescensmikroskopi og analyseres med ImageJ.

Introduction

Neutrofiler er de mest rigelige leukocytter i blodbanen og spiller en væsentlig rolle under clearance af patogene midler ved flere mekanismer, herunder frigivelse af store kromatinstrukturer sammensat af DNA og flere nukleare, cytoplasmatiske og granulære antibakterielle proteiner ^1,2. Den direkte forudgående beskrivelse af denne antimikrobielle rolle af neutrofiler blev lavet af Takei et ^al.3 i 1996. Disse forfattere rapporterede en ny form for død, der adskiller sig fra apoptose og nekrotose hos neutrofiler, viste morfologiske ændringer, der udviser nuklear ruptur, efterfulgt af spild ud af nukleoplasmaet ind i cytoplasmaet og en stigning i membranpermeabilitet fra 3 timers inkubation med phorbolmyristatacetat (PMA)^2,3. Det var dog først i 2004, at udtrykket “neutrofile ekstracellulære fælder (NETs)” blev brugt⁴.

NET-dannelse er blevet observeret under forskellige forhold, såsom bakterielle, svampe⁵, virale⁶ og parasitære infektioner til neutralisering, drab og forebyggelse af mikrobiel spredning⁷. Andre undersøgelser viser, at det også kan forekomme i ikke-patogene tilstande ved sterile stimuli, såsom cytokiner, mononatriumurinsyre eller kolesterolkrystaller, autoantistoffer, immunkomplekser og aktiverede blodplader⁷. Lipopolysaccharid (LPS), interleukin-8 (IL-8) og PMA var blandt de første in vitro-stimuli beskrevet som NET-inducere, og in vivo NET-involvering i patogene processer blev demonstreret i to modeller for akut inflammation: eksperimentel dysenteri og spontan human blindtarmsbetændelse⁴. DNA er en vigtig NET-komponent. Dens passende struktur og sammensætning er nødvendig for sekvestrering og drab af mikroorganismer ved at levere en høj lokal koncentration af antimikrobielle molekyler mod de fangede mikrober, som det fremgår af en kort deoxyribonuklease (DNase) behandling, der opløser NET’er og deres mikrobicidegenskaber⁴. Udover DNA omfatter NET’er vedhæftede proteiner såsom histoner, neutrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3, lactoferrin, gelatinase, myeloperoxidase (MPO) og antimikrobielle peptider (AMP’er) såsom det kationiske proinflammatoriske peptid cathelicidin LL-37 blandt andre ^8,9. Sådanne aggregater kan danne større tråde med diametre op til 50 nm. Disse faktorer kan forstyrre de mikrobielle virulensfaktorer eller integriteten af patogencellemembranen; Derudover kan AMP’erne stabilisere det NET-afledte DNA mod nedbrydning af bakterienukleaser¹⁰.

De specifikke mekanismer, der regulerer NET-dannelse, er endnu ikke helt afklaret. Den bedst karakteriserede vej, der fører til NET-frigivelse, er gennem ERK-signalering, hvilket fører til NADPH-oxidaseaktivering og produktion af reaktive iltarter (ROS) samt øget intracellulært calcium, der udløser aktivering af MPO-vejen. Dette omdanner igen hydrogenperoxid til hypochlorsyre, der aktiverer NE ved oxidation^11,12. NE er ansvarlig for at nedbryde cytoskelettets actinfilamenter for at blokere fagocytose og translokere dem til kernen til behandling ved proteolytisk spaltning og deaminering ved PAD4, der driver desensibilisering af kromatinfibre, der associeres med granulat og cytoplasmatiske proteiner, og frigives derefter ekstracellulært⁷. Disse proteaser omfatter dem, der frigives fra azurosomkomplekset af azurofilgranulerne og andre proteaser såsom cathepsin G¹³.

Afhængigt af de morfologiske ændringer i neutrofiler klassificeres NET’er i to typer: selvmords- eller lytisk NET-dannelse, der fører til celledød⁴, og vital eller ikke-lytisk NET-dannelse produceret af levedygtige celler medieret af en vesikulær frigivelse af nukleært eller mitokondrie-DNA med en rest af en anukleeret cytoplast med fagocytisk kapacitet^14,15. Generelt præsenterer NET’er sammensat af mitokondrie-DNA en langstrakt fiber^14-morfologi, mens de, der er struktureret af nukleært DNA, har et skylignende udseende³. Det vides imidlertid ikke, hvordan neutrofilen vælger sin DNA-oprindelse. I modsætning til tidligere undersøgelser, der beskrev NETs kanoniske veje som kræver flere timer, aktiveres den vitale vej hurtigt på kun 5-60 min¹⁵.

På trods af disse fremskridt varierer NET-sammensætningen afhængigt af stimulus; for eksempel inducerer forskellige mucoide og ikke-mucoide stammer af P. aeruginosa dannelsen af NET’er indeholdende 33 almindelige proteiner og op til 50 variable proteiner⁷. Det er således nødvendigt at homogenisere teknikker, der muliggør generering af objektive konklusioner i forskergrupper. Dette papir beskriver en protokol med forskellige teknikker, der muliggør sammenligning og evaluering af sammensætningen, strukturen og morfologien af NET’er induceret med forskellige mikroorganismer: Staphylococcus aureus (gram-positiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gram-negativ bakterie) og Candida albicans (svamp) samt kemiske stimuli (PMA, HOCl) hos humane neutrofiler fra raske individer. De repræsentative resultater viser heterogeniteten af NET’er afhængigt af deres inducerende stimulus under sammenlignelige in vitro-forhold, karakteriseret ved DNA-DAPI-farvning, immunostaining for LL37 og kvantificering af enzymatisk aktivitet (NE, CG og MPO).

Protocol

Blodprøverne blev taget som donationer fra klinisk raske deltagere efter informeret samtykke. Alle eksperimenter blev udført med tilladelse fra Human Research Ethics Committee ved Det Biokemiske Fakultet, Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ i Oaxaca. BEMÆRK: Inklusionskriterierne i undersøgelsen var utydelig køn og alder og klinisk sunde ifølge deltagernes svar på et spørgeskema forud for indtagelse af en blodprøve. En hæmatologisk analyse blev udført for at bestemme celletallet …

Representative Results

Renhed og levedygtighed af neutrofilerDe dynamiske cellulære faser visualiseres i røret fra dobbeltdensitetsgradientrensningen. Inden for disse lag er laget svarende til granulocytter over densitetslaget på 1,079 g / ml, adskilt fra faserne af perifere blodmononukleocytter (PBMC’er) og erytrocytter (figur 1A). Morfologien af de oprensede celler blev verificeret med Wrights farvning ved at observere celler med segmenterede kerner forbundet med trådlignende filamenter …

Discussion

Der skal opnås en meget ren population af levedygtige neutrofiler for at fremkalde frigivelse af NET, da disse celler har en begrænset ex vivo-levetid på gennemsnitligt 8 timer, en periode, inden for hvilken alle forsøgene skal udføres. Til dette formål er den ideelle metode dobbeltdensitetsgradienten til optimering af rensningstiden ved at isolere ikke-aktiverede celler, der er mere lydhøre over for eksogen stimulering, i modsætning til Ficoll-Histopaque gradient eller Dextran sedimenteringsteknikker<su…

Materials

24 Well plate for cell culture	Corning	3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	51-668981E
96 Well plate for cell culture	Costar	3596	Flat bottom
Agitator	CRM Globe	CRM-OS1
Antibody LL37	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
Blood collection tubes	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Sigma-Aldrich	21878
Centrifuge	Hettich	1406-01
Coverslip	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS)	Caisson	1201022
Falcon tubes 50 mL	CORNING	430829
Flow Cytometry Tubes	Miltenyi Biotec		5 mL – Without caps
FlowJo Software	BD Biosciences		Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope	DM 2000	LEICA
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Incubator	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec		Flow cytometer
Microplate reader photometer	Clarkson Laboratory – CL
Microtubes 1.5 mL	Zhejiang Runlab Tech	35200N	wire snap
Minitab Software	Minitab		Statistical analysis
Needles	BD VACUTAINER	301746	Diameter 1.34 mm
Optical microscope	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x)	Caisson	PBL07-500ML
Pyrex culture tubes	CORNING	CLS982025	N°9820
RPMI 1640 1x	Corning	10-104-CV	contains Glutagro
Slides	Madesa	PDI257550	22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4%	SIGMA	T8154-100ML