Summary
Her præsenteres en protokol til induktion og analyse af in vitro neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er). Kvantificering af DNA, cathelicidin (LL37) og enzymaktivitet gav data, der viser variabiliteten i sammensætningen og morfologien af NET'er induceret af mikrobielle og kemiske stimuli under lignende kontrollerede forhold.
Abstract
Neutrofiler fungerer som den første linje af cellulært forsvar i et medfødt immunrespons ved at anvende forskellige mekanismer, såsom dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er). Denne undersøgelse analyserer de morfologiske og sammensætningsmæssige ændringer i NET'er induceret af mikrobielle og kemiske stimuli ved hjælp af standardiserede in vitro-metoder til NET-induktion og karakterisering med humane celler. De her beskrevne procedurer tillader analyse af NET-morfologi (lytisk eller ikke-lytisk) og sammensætning (DNA-proteinstrukturer og enzymatisk aktivitet) og virkningen af opløselige faktorer eller cellulær kontakt på sådanne egenskaber. Derudover kan de teknikker, der er beskrevet her, ændres for at evaluere effekten af eksogene opløselige faktorer eller cellulær kontakt på NET-sammensætningen.
De anvendte teknikker inkluderer oprensning af polymorfonukleære celler fra humant perifert blod ved hjælp af en dobbeltdensitetsgradient (1,079-1,098 g / ml), hvilket garanterer optimal renhed og levedygtighed (≥ 95%) som demonstreret ved Wrights farvning, trypanblå udelukkelse og flowcytometri, herunder FSC versus SSC-analyse og 7AAD-farvning. NET-dannelse induceres med mikrobielle (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Candida albicans) og kemiske (phorbol myristate acetat, HOCl) stimuli, og NET'erne er karakteriseret ved DNA-DAPI-farvning, immunostaining for det antimikrobielle peptid cathelicidin (LL37) og kvantificering af enzymatisk aktivitet (neutrofil elastase, cathepsin G og myeloperoxidase). Billederne erhverves gennem fluorescensmikroskopi og analyseres med ImageJ.
Introduction
Neutrofiler er de mest rigelige leukocytter i blodbanen og spiller en væsentlig rolle under clearance af patogene midler ved flere mekanismer, herunder frigivelse af store kromatinstrukturer sammensat af DNA og flere nukleare, cytoplasmatiske og granulære antibakterielle proteiner 1,2. Den direkte forudgående beskrivelse af denne antimikrobielle rolle af neutrofiler blev lavet af Takei et al.3 i 1996. Disse forfattere rapporterede en ny form for død, der adskiller sig fra apoptose og nekrotose hos neutrofiler, viste morfologiske ændringer, der udviser nuklear ruptur, efterfulgt af spild ud af nukleoplasmaet ind i cytoplasmaet og en stigning i membranpermeabilitet fra 3 timers inkubation med phorbolmyristatacetat (PMA)2,3. Det var dog først i 2004, at udtrykket "neutrofile ekstracellulære fælder (NETs)" blev brugt4.
NET-dannelse er blevet observeret under forskellige forhold, såsom bakterielle, svampe5, virale6 og parasitære infektioner til neutralisering, drab og forebyggelse af mikrobiel spredning7. Andre undersøgelser viser, at det også kan forekomme i ikke-patogene tilstande ved sterile stimuli, såsom cytokiner, mononatriumurinsyre eller kolesterolkrystaller, autoantistoffer, immunkomplekser og aktiverede blodplader7. Lipopolysaccharid (LPS), interleukin-8 (IL-8) og PMA var blandt de første in vitro-stimuli beskrevet som NET-inducere, og in vivo NET-involvering i patogene processer blev demonstreret i to modeller for akut inflammation: eksperimentel dysenteri og spontan human blindtarmsbetændelse4. DNA er en vigtig NET-komponent. Dens passende struktur og sammensætning er nødvendig for sekvestrering og drab af mikroorganismer ved at levere en høj lokal koncentration af antimikrobielle molekyler mod de fangede mikrober, som det fremgår af en kort deoxyribonuklease (DNase) behandling, der opløser NET'er og deres mikrobicidegenskaber4. Udover DNA omfatter NET'er vedhæftede proteiner såsom histoner, neutrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3, lactoferrin, gelatinase, myeloperoxidase (MPO) og antimikrobielle peptider (AMP'er) såsom det kationiske proinflammatoriske peptid cathelicidin LL-37 blandt andre 8,9. Sådanne aggregater kan danne større tråde med diametre op til 50 nm. Disse faktorer kan forstyrre de mikrobielle virulensfaktorer eller integriteten af patogencellemembranen; Derudover kan AMP'erne stabilisere det NET-afledte DNA mod nedbrydning af bakterienukleaser10.
De specifikke mekanismer, der regulerer NET-dannelse, er endnu ikke helt afklaret. Den bedst karakteriserede vej, der fører til NET-frigivelse, er gennem ERK-signalering, hvilket fører til NADPH-oxidaseaktivering og produktion af reaktive iltarter (ROS) samt øget intracellulært calcium, der udløser aktivering af MPO-vejen. Dette omdanner igen hydrogenperoxid til hypochlorsyre, der aktiverer NE ved oxidation11,12. NE er ansvarlig for at nedbryde cytoskelettets actinfilamenter for at blokere fagocytose og translokere dem til kernen til behandling ved proteolytisk spaltning og deaminering ved PAD4, der driver desensibilisering af kromatinfibre, der associeres med granulat og cytoplasmatiske proteiner, og frigives derefter ekstracellulært7. Disse proteaser omfatter dem, der frigives fra azurosomkomplekset af azurofilgranulerne og andre proteaser såsom cathepsin G13.
Afhængigt af de morfologiske ændringer i neutrofiler klassificeres NET'er i to typer: selvmords- eller lytisk NET-dannelse, der fører til celledød4, og vital eller ikke-lytisk NET-dannelse produceret af levedygtige celler medieret af en vesikulær frigivelse af nukleært eller mitokondrie-DNA med en rest af en anukleeret cytoplast med fagocytisk kapacitet14,15. Generelt præsenterer NET'er sammensat af mitokondrie-DNA en langstrakt fiber14-morfologi, mens de, der er struktureret af nukleært DNA, har et skylignende udseende3. Det vides imidlertid ikke, hvordan neutrofilen vælger sin DNA-oprindelse. I modsætning til tidligere undersøgelser, der beskrev NETs kanoniske veje som kræver flere timer, aktiveres den vitale vej hurtigt på kun 5-60 min15.
På trods af disse fremskridt varierer NET-sammensætningen afhængigt af stimulus; for eksempel inducerer forskellige mucoide og ikke-mucoide stammer af P. aeruginosa dannelsen af NET'er indeholdende 33 almindelige proteiner og op til 50 variable proteiner7. Det er således nødvendigt at homogenisere teknikker, der muliggør generering af objektive konklusioner i forskergrupper. Dette papir beskriver en protokol med forskellige teknikker, der muliggør sammenligning og evaluering af sammensætningen, strukturen og morfologien af NET'er induceret med forskellige mikroorganismer: Staphylococcus aureus (gram-positiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gram-negativ bakterie) og Candida albicans (svamp) samt kemiske stimuli (PMA, HOCl) hos humane neutrofiler fra raske individer. De repræsentative resultater viser heterogeniteten af NET'er afhængigt af deres inducerende stimulus under sammenlignelige in vitro-forhold, karakteriseret ved DNA-DAPI-farvning, immunostaining for LL37 og kvantificering af enzymatisk aktivitet (NE, CG og MPO).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøverne blev taget som donationer fra klinisk raske deltagere efter informeret samtykke. Alle eksperimenter blev udført med tilladelse fra Human Research Ethics Committee ved Det Biokemiske Fakultet, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' i Oaxaca.
BEMÆRK: Inklusionskriterierne i undersøgelsen var utydelig køn og alder og klinisk sunde ifølge deltagernes svar på et spørgeskema forud for indtagelse af en blodprøve. En hæmatologisk analyse blev udført for at bestemme celletallet og udelukke infektioner eller anæmi samt C-reaktiv proteintest for at udelukke betændelse i donoren.
1. Perifer blodindsamling og opnåelse af erytrocyt- og leukocytpakken
- Opsaml 10 ml perifert blod ved venipunktur i rør med 1,8 mg/ml K2· EDTA som antikoagulant (se materialetabel) fra klinisk raske personer efter at have indhentet informeret samtykke. Udfør derefter standard blodbiometri og C-reaktiv proteintest for at udelukke infektion eller betændelse, hvilket sikrer prøvens kvalitet.
- Den perifere blodprøve centrifugeres ved 82 x g i 15 minutter for at fjerne det blodpladerige plasma, efterfulgt af en anden centrifugering ved 630 x g i 5 minutter. Kassér det resterende plasma for at opnå erytrocyt- og leukocytpakningen.
- Fortynd det i forholdet 1: 1 (v / v) med 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS).
2. Polymorfonukleær neutrofil (PMN) oprensning ved anvendelse af en dobbeltdensitetsgradient
BEMÆRK: Udfør neutrofil oprensning umiddelbart efter blodet er opsamlet, fordi de har en begrænset in vitro levetid på ca. 8 timer.
- Afsæt følgende i et sterilt 10 ml glasrør (se materialetabel) i rækkefølge: 1 ml 1,098 g / ml densitetsopløsning, 1 ml 1,079 g / ml densitetsopløsning (se materialetabel) og derefter 4 ml af den fortyndede erytrocyt- og leukocytpakke. Hæld over væggene uden at bryde overfladespændingen mellem lagene for at forhindre dem i at blande.
- Der centrifugeres ved 320 x g i 20 minutter ved 4 °C, idet acceleration/deceleration undgås, således at centrifugens høje kræfter ikke forstyrrer gradienten.
- Den fase, der svarer til granulocytter (figur 1A), opsuges ved pipettering, og overføres til et andet sterilt 10 ml glasrør. Vask med 4 ml 1x DPBS ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Kassér supernatanten og behandl cellerne med osmotisk shock for at fjerne de resterende erytrocytter. Der tilsættes 4 ml 0,2 % saltopløsning i 2 minutter ved 4 °C og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten. Derefter tilsættes 4 ml isotonisk opløsning (0,65% saltvand) i 5 minutter ved 4 °C for at genoprette membranintegriteten og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: 0,2% saltopløsning er et hypotonisk medium med en lavere koncentration af opløst stof i forhold til det intracellulære RBC-medium. Kontakt med hypotonisk medium tillader vand at diffundere ind i RBC, hvilket fører til deres hævelse og hæmolyse. Denne fjernelse af RBC fra supernatanten blev bekræftet ved mikroskopisk observation. - Fjern supernatanten. Resuspender cellerne i 4 ml 1x DPBS for at fjerne cellulært affald, og centrifuger derefter ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Til sidst skal cellepelleten genbruges i 2 ml kold Hanks buffer (balanced salt solution).
3. Neutrofil morfologi og levedygtighed (figur 1B)
- Trypan blå udelukkelsestest
- 5 μL af cellesuspensionen fortyndes i 20 μL 0,4 % trypanblåt (forholdet 1:5). Tæl cellerne i et Neubauer-kammer og bestem cellelevedygtighed ved hjælp af en udelukkelsestest. Overvej de celler, der opretholder integriteten af deres membran uden at gennemtrænge farvestoffet som levedygtigt.
- Monter 5 μL af cellesuspensionen på et objektglas; tør og plet med Wrights plet i 15 s. Fastgør straks prøven med fosfatbuffer pH 6,4 i 30 s. Vask med tilstrækkeligt destilleret vand og observer morfologien under et optisk mikroskop (100x).
- 7AAD-farvning og flowcytometrianalyse
- Tilsæt 1 x 105 celler for at strømme cytometrirør, og plet med 1 μL 7AAD i 100 μL FACS-buffer (1x DPBS, 0,1% natriumazid og 10% autologt dekomplementeret plasma) i 15 minutter ved 4 °C i mørke.
- Vask med 500 μL FACS-buffer ved 300 x g i 10 min. Cellerne fikseres med 500 μL 2% paraformaldehyd, og opbevares ved 4 °C, indtil de analyseres i flowcytometeret.
- For en død cellekontrol fikseres 1 x 105 celler med 200 μL 4% paraformaldehyd i 30 minutter og vaskes med 500 μL 1x PBS ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Tag supernatanten af, og kassér den. Derefter tilsættes 200 μL 0,1% Triton X-100 i 1 time ved 4 °C. Der vaskes med 500 μL 1x PBS og bejdses med 7AAD som i trin 3.2.1.
- Ved hjælp af et flowcytometer (se Materialetabel) skal du udføre FSC versus SSC-analyse for at analysere cellerenhed og SSC versus 7AAD-farvning for at analysere cellens levedygtighed. Læs 3 x 104 hændelser i 100 μL optagelsesvolumen ved medium flow (1.000 celler/s) i de polymorfonukleære indstillinger (FSC, 400-490 og SSC, 300-320).
- Analyser de fangede data i flowcytometersoftwaren (se Materialetabel), og bestem procentdelen af renhed og positive celler for 7AAD i den polymorfonukleære population, præsenteret gennem prikplot og histogrammer.
4. CFSE-farvning af mikroorganismer
- Tilsæt 1 x 108 bakterier eller 1 x 106 svampepseudohyfer i 1,5 ml mikrorør, og plet med 200 μL 5 μM carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) opløst i 1x PBS. Bland i nogle sekunder, og inkuber ved 37 °C i 10 minutter i mørke.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 500 μL dekomplementeret plasma, og centrifugeres ved 620 x g i 10 minutter for pseudohyfer eller ved 1.800 x g i 10 minutter for bakterier.
- Supernatanterne kasseres, og pellets vaskes med 1 ml 1x PBS med centrifugering som beskrevet i trin 4.2. Til sidst resuspenderes mikroorganismerne i 250 μL 1x PBS.
- Der fremstilles 50 μL alikvoter i mikrorør på 1,5 ml med 2 x 107 bakterier (MOI: 100) eller 2 x 105 pseudohyphae (MOI:1) til NET-induktion.
5. NET induktion
- Anbring 10 mm x 10 mm sterile glasdæksler i en plade med 24 huller, og dæk med 10 μL 0,001% poly-L-lysin i 1 time ved stuetemperatur. Vask to gange med 100 μL 1x PBS, lufttør og bestråle med UV-lys i 15 min.
- HBSS-opløsningen af neutrofilsuspensionen i trin 2.5 erstattes med RPMI 1640-medium suppleret med 10 % autologt plasma. Til 24-brøndpladen (trin 5.1) tilsættes 350 μL af denne cellesuspension til en slutkoncentration på 2 x 105 neutrofiler/hul.
- Lad cellerne klæbe til bunden af brøndene ved at inkubere i 20 minutter ved 37 °C med 5 % CO2.
- Tilsæt stimuli for at inducere NET-dannelse i 50 μL: mikrobiel stimuli-gram-positiv bakterie S. aureus (ATCC 25923), gram-negativ bakterie P. aeruginosa (ATCC 10145) ved MOI 100 og pseudohyphae af C. albicans (ATCC 10231) ved MOI: 1; biokemiske stimuli-PMA (200 nM) og HOCl (4,5 mM) og kontrol med stimulus fraværende (50 μL HBSS).
- Der opnås et slutvolumen på 400 μL pr. hul. Bland på en pladeryster ved 140 rpm i 30 s, og inkuber i 4 timer ved 37 °C og 5% CO2.
6. Visualisering af NETs ved fluorescensmikroskopi
- DNA og LL37 immunfarvning
- Efter NET-induktion fjernes supernatanterne fra hullerne ved omhyggelig pipettering, og cellerne fikseres med 300 μL 4% paraformaldehyd i 30 minutter.
- Cellerne vaskes med 200 μL 1x PBS uden centrifugering, og der tilsættes 200 μL blokerende buffer (10% dekomplementeret plasma i 1x PBS) i 30 min.
- For LL-37 plet permeabiliseres cellerne med 200 μL 0,2% Triton X-100 i 1x PBS i 10 minutter for at tillade antistoffet at komme ind i cellerne. Vask 2x forsigtigt med 1x PBS for at fjerne overskydende vaskemiddel.
- Monter dækslikkerne på glasrutsjebaner (fire dækslips på hvert dias). DNA pletter cellerne med 2 μL DAPI (se materialetabel), forsegler dæksedlerne og opbevares ved -20 °C, indtil de analyseres ved konfokal fluorescensmikroskopi.
- Erhvervelse og analyse af fluorescerende billeder
- Tag NET-billeder for at kvantificere deres komponenter, og brug de tilsvarende filtre i det konfokale fluorescensmikroskop (se materialetabel) til at erhverve billederne med computerens software.
BEMÆRK: Overvej at DNA'et er farvet med DAPI (blå farve), der viser excitation ved 360 nm og emission ved 460 nm. Mikroorganismerne er farvet med CFSE (grøn farve), som har en excitation på 492 nm og en emission på 521 nm. LL37-peptidet er mærket med anti-LL37 Alexa Fluor 594-antistof (rød farve), som har en excitation på 594 nm og en emission på 614 nm. - Kalibrer mikroskopet. Placer lysbilledet, og fokuser ved hjælp af differentiel interferenskontrast (DIC) med normalt lys tændt. Vælg Live for at projicere billedet på skærmen.
- Sluk lyset, og vælg den fluorochrome tilsvarende kanal. Vælg f.eks. filter 365 nm/blå for DAPI, 43 HE DsRed for Alexa 594 eller 38 HE GFP for CFSE.
- Juster indstillingerne med isotypekontrolantistoffet for LL37 og ufarvede celler for DAPI og CFSE. Indstil de samme indstillinger for eksponeringstid, spænding, kontrast og objektiv for at tage alle billederne under de samme forhold.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev eksponeringstiden, spændingen og kontrasten indstillet til henholdsvis 1,0 ms, 4,0 V og 0,0 med et 40x mål. Disse værdier kan justeres for at lette den bedste billedoptagelse for prøverne. - Vælg Fastgør for at tage billedet. Gem fem billeder (fire ekstremer og midten) pr. brønd og af colokalisering (fletning) af DNA/LL37/CFSE.
- Definer de tre klasser af pixels som baggrund med de uafhængige billeder af hver farve, og analyser værdien for det gennemsnitlige grå signal pr. område med Image J-softwaren.
- Tag NET-billeder for at kvantificere deres komponenter, og brug de tilsvarende filtre i det konfokale fluorescensmikroskop (se materialetabel) til at erhverve billederne med computerens software.
7. Kvantificering af enzymatisk aktivitet
- I en plade med 96 huller tilsættes 90 μL cellesuspension i HBSS indeholdende 1 x 10 5 neutrofiler til NET-induktion, og der inkuberes i 20 minutter ved 37 °C og5 % CO2.
- Der tilsættes straks 10 μL af de tilsvarende stimuli (koncentration som i trin 5.4) og inkuberes i 4 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
- Supernatanterne kasseres, og cellerne vaskes med 100 μl HBSS. Behandl med 1 E/ml DNase i 10 minutter ved 37 °C for at fremme frigivelsen af DNA-proteinstrukturer, og centrifuger ved 1.800 x g i 10 minutter.
- Gendan supernatanterne og evaluer enzymaktiviteten i supernatanten ved hjælp af kolorimetriske reaktioner som tidligere beskrevet af White et al.17.
- Bestem den maksimale enzymaktivitet af NE, CG og MPO i neutrofiler under de samme eksperimentelle betingelser uden at tilføje stimuli til NET-induktion. Derefter fryses celleprøven ved -70 °C og optø ved 37 °C i et vandbad, hvilket genererer et temperaturchok for at favorisere frigivelsen af intracellproteiner ved cellelyse. Der centrifugeres ved 1 800 x g i 10 minutter, og supernatanterne genvindes.
- Der tilsættes 50 μL supernatant til hvert hul i plader med 96 huller, og derefter tilsættes 50 μL af hvert substrat som angivet i trin 7.7.
- Der tilsættes 0,5 M N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilin som substrat for NE og 1 mM N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid for CG. Inkuber i 3 timer ved stuetemperatur. Til MPO tilsættes 1,6 mM 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Efter inkubation tilsættes 50 μL stopopløsning (0,5 MH2SO4) for MPO, og absorbansen måles ved 405 nm for NE og CG og 450 nm for MPO ved hjælp af et spektrofotometer.
- De opnåede værdier sammenlignes med de tilsvarende kalibreringskurver, og resultaterne af hver tilstand sammenlignes i forhold til den maksimale enzymaktivitet (100 %).
8. Statistisk analyse
- Analysér måledataene i tre eksemplarer for hvert uafhængigt eksperiment (n = 10), og udfør en ANOVA til statistisk analyse ved at sammenligne grupper med et 95% konfidensniveau.
Figur 1: PMN-oprensning og NET-induktionsprotokol. (A) Plasma blev fjernet fra det perifere blod for at opnå erytrocyt- og leukocytpakningen og fortyndet 1:1 (v/v) med 1x DPBS. Derefter blev 4 ml af fortyndingen tilsat langs væggen til gradientrøret med dobbelt densitet og centrifugeret ved 320 x g i 20 minutter ved 4 °C, hvorved forskellige cellelag blev separeret, og det svarende til PMN blev genvundet. (B) De rensede celler blev talt, og deres morfologi blev analyseret ved Wrights farvning. Levedygtigheden blev bestemt ved trypanblå udelukkelse og 7AAD-farvning ved hjælp af flowcytometri. Når optimal neutrofil renhed og levedygtighed blev verificeret, blev NET-dannelse induceret ved at tilføje mikrober (S. aureus, P. aeruginosa og C. albicans) eller kemikalier (PMA, HOCl) i 24-brøndsplader til analyse ved fluorescensmikroskopi med DAPI-DNA, anti-LL37 Alexa Fluor 594 og mikroorganisme-CFSE-farvning. Til enzymkvantificering blev NET'er induceret i 96-brøndsplader i 3 timer og behandlet med DNase efterfulgt af tilsætning af substrater for hvert enzym: NE, CG og MPO; farveændringer blev kvantificeret ved spektrofotometri. DPBS = Dulbeccos fosfatbufferede saltvand; PBMC = mononukleære celler i perifert blod; PMN = Polymorfonukleære neutrofiler; NE = Neutrofil elastase; CG = Cathepsin G; MPO = Myeloperoxidase; PMA = Phorbol myristatacetat; HOCl = Hypochlorsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renhed og levedygtighed af neutrofiler
De dynamiske cellulære faser visualiseres i røret fra dobbeltdensitetsgradientrensningen. Inden for disse lag er laget svarende til granulocytter over densitetslaget på 1,079 g / ml, adskilt fra faserne af perifere blodmononukleocytter (PBMC'er) og erytrocytter (figur 1A). Morfologien af de oprensede celler blev verificeret med Wrights farvning ved at observere celler med segmenterede kerner forbundet med trådlignende filamenter svarende til modne neutrofiler (figur 2A). På grund af den reducerede halveringstid for neutrofiler er levedygtighed et afgørende punkt for følgende NET-induktionseksperimenter. Derfor blev cellelevedygtighed verificeret med trypanblå udelukkelsesfarvning, der evaluerede plasmamembranens integritet, når farvestoffet ikke trænger ind (figur 2B). Derudover interkalerer 7AAD i cytosin- og guaninbaser af DNA og udsender fluorescens, hvilket letter udelukkelsen af døde celler (figur 2C, D). Disse procedurer resulterede i en celle renhed på 98,9% ± 0,06% og en celle levedygtighed på 95,5% ± 4,2% i 10 udførte eksperimenter.
Figur 2: Morfologi og levedygtighed af nyrensede neutrofiler. (A) Efter gradientrensning blev den typiske neutrofile morfologi bekræftet af Wrights farvning (100x). Cellerne viste en multilobet kerne, der er karakteristisk for modne neutrofiler i blodbanen og (B) optimal levedygtighed ved trypanblå udelukkelse uden membranforstyrrelse. (C) Analyse af SSC versus FSC ved flowcytometri bekræfter en population svarende til PMN, hvilket opnår en cellerenhed på 98,9% ± 0,06% (n = 10). (D) PMN-punktplots præsenteres (ufarvede celler, venstre paneler vs. 7AAD-farvede celle højre paneler) med deres respektive histogrammer (ufarvet blå vs. farvet rød), hvilket indikerer en høj cellelevedygtighed på 95,5% ± 4,2% (n = 10) i de nyligt isolerede neutrofiler sammenlignet kontrolcellerne permeabiliseret med 0,1% Triton (nedre paneler) for at validere resultaterne. 7AAD-farvestoffet binder sig til DNA og er udelukket fra levedygtige celler, så forbehandling af vaskemiddel forårsagede ændringer i cellemembranen og tillod indtrængen af 7AAD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Morfologi og sammensætning af NET'er induceret af kemiske og mikrobiologiske stimuli
Figur 3 viser repræsentative billeder, der beviser in vitro NET-induktion ved virkningen af kemiske (PMA, HOCl) eller mikrobielle (C. albicans, S. aureus og P. aeruginosa) midler efter 4 timers inkubation (figur 3A). NET-sammensætningen blev bestemt ved DNA/LL37-farvning, og billederne blev taget til kvantificering af gennemsnitlige gråværdier i området med ImageJ (figur 3B,C). Selvmord (lytisk) eller vital (ikke-lytisk) NET-dannelse blev beskrevet ud fra deres morfologi. Til sammenligning viste ustimulerede kontrolneutrofiler dyrket i HBSS i 4 timer LL37 lokaliseret i cytoplasmaet med kondenseret multilobed-segmenteret kromatin (figur 3A 1-3), karakteristisk for disse hvileceller.
PMA er en potent ROS-inducer gennem PKC-aktivering og fungerer således som en positiv kontrol til at inducere selvmordsdannelse (lytisk). Billederne af PMA-inducerede NET'er viser netværk med rigelig kromatindekondensation, der danner skylignende strukturer forbundet med selvmordsvejen (figur 3A 4-6), hvor neutrofilen dør på grund af rigeligt DNA, der frigives i det ekstracellulære rum, der dækker store dele af det analyserede område. Inden for disse overskyede områder, der dækker DNA'et, blev LL37 colokaliseret, både intra- og ekstracellulært i høje koncentrationer (figur 3A 6, B-C). I modsætning hertil er HOCl en fysiologisk, biokemisk forbindelse genereret som et produkt af MPO's oxidative aktivitet. NET'er dannet med HOCl viste mindre DNA-spredning i det ekstracellulære rum med trådformet morfologi, der ser ud til at være afledt af cellemembranen (figur 3A 7-9). Sådanne morfologiske egenskaber svarer til den vitale NET-dannelse, og de viste ikke kolokalisering af LL37 med DNA-filamenterne; LL37 forblev lokaliseret på det nukleare niveau (figur 3A 7-9,C). Disse resultater indikerer, at disse kemiske agenser under lignende kontrollerede betingelser viser forskelle i sammensætningen af de frigivne NETs, både DNA og LL37.
Analyse af NET'er induceret af mikroorganismer viste, at pseudohyfer af C. albicans inducerede netværk med lave koncentrationer af DNA frigivet i det ekstracellulære rum med filamentøse strukturer, hvilket fremhævede tilstedeværelsen af anucleated cytoplastlignende strukturer, der er karakteristiske for den vitale NET-dannelse (figur 3A 10-13), som ikke observeres med HOCl og S. aureus der aktiverer den samme vej. I mellemtiden colokaliserer LL37 med DNA på cellulært niveau, og lave koncentrationer er forbundet med pseudohyfer, der afgrænser deres udbredelse. Begge komponenter viste ikke statistisk signifikante forskelle fra kontrollen med HBSS (figur 3B,C). S. aureus er en af de mest almindelige patogene bakterier på verdensplan, med evnen til at inducere NET'er, der viser en vitallignende morfologi som tidligere rapporteret i flere undersøgelser15,19. Rigeligt DNA blev frigivet i statistisk signifikante koncentrationer som trådformede strukturer, der kolokaliserede med LL37 og dannede bakterieklynger, hvilket indikerer, at stilladset kan afgrænse og favorisere eliminering af bakterierne (figur 3A 14-17). På den anden side inducerede den gramnegative bakterie P. aeruginosa frigivelsen af store koncentrationer af DNA med en uklar morfologi forbundet med selvmordsNET-dannelsen og LL37 signifikant colokaliseret med DNA og bakterier (figur 3A 18-21, B, C).
Visualisering af NETs ved fluorescensmikroskopi viste, at NETs induceret af HOCl, S. aureus og C. albicans præsenterer vitallignende morfologi med filamentøse strukturer. Imidlertid førte kun S. aureus til frigivelse af statistisk signifikante mængder DNA. Morfologien af de to andre stimuli (PMA og P. aeruginosa)-inducerede NETs svarer til typen af selvmords-NET-dannelse med statistisk signifikante mængder DNA og LL37 sammenlignet med ustimulerede neutrofiler. Der var rigelige skylignende DNA-strukturer, mere signifikante i NET'er induceret af P. aeruginosa end dem, der blev induceret af PMA.
Figur 3: DNA og LL37 sammensætning og morfologi af NETs induceret af kemiske og mikrobielle stimuli. (A) Humane blodafledte neutrofiler blev stimuleret med PMA (4-6), HOCl (7-9), pseudohyfer af C. albicans (10-13), S. aureus (14-17), P. aeruginosa (18-21) og en ustimuleret kontrol (1-3) i HBSS i 4 timer. NETs blev visualiseret ved hjælp af DNA-DAPI (blå), anti-LL37 Alexa Fluor 594 (rød), eller isotypekontrol, og mikroorganismer blev forfarvet med 5 μM CFSE (grøn). Billeder viser repræsentative fluorescensmikroskopiresultater fra 10 uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer. (B-C) Grafer viser gennemsnit ± SD af gennemsnitlig grå værdi af signalet pr. område for de angivne farver på fem billeder (fire ekstremer og midten) pr. brønd og analyseret med ImageJ-softwaren til (B) DAPI-DNA og (C) Alexa Fluor 594-LL37-farvning. ANOVA blev udført for at sammenligne grupper af eksperimentelle tilstande med et konfidensniveau på 95%. * = p ≤ 0,05. HBSS = Hanks afbalancerede saltopløsning; PMA = phorbol myrisat acetat; HOCl = hypochlorsyre. Tilpasset fra Sosa-Luis et al.16 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Enzymatisk aktivitet af NE, CG og MPO i NET'er induceret af kemiske og mikrobiologiske stimuli
Et andet mål med denne undersøgelse var at kvantificere aktiviteten af enzymer beskrevet som centrale komponenter i NET'er, såsom NE, CG og MPO, som er rigelige med antimikrobiel aktivitet afledt af azurofile granulater. Derfor blev NET'er induceret, og cellenetværkene blev behandlet med DNase, hvilket favoriserede frigivelsen af strukturassocierede proteiner, og enzymaktivitet blev bestemt ved hjælp af kolorimetriske assays. Analysen viste restaktivitet for NE (2,3% ± 0,6%), CG (6,2% ± 2,7%) og MPO (21,4% ± 2,0%) forbundet med DNA-strukturer afledt af alle NET'er sammenlignet med den maksimale aktivitet opnået fra lyserede hvilende neutrofiler taget som 100% (figur 4). NETs induceret af de fleste stimuli viste lave enzymaktivitetsværdier for NE og CG, undtagen S. aureus for NE og PMA for CG, som viste statistisk signifikans. På den anden side steg MPO-aktiviteten i alle stimuli uden nogen statistisk signifikant forskel mellem dem, men var signifikant mellem grupperne af kemiske stimuli versus mikroorganismer.
Disse resultater demonstrerer gennemførligheden af den præsenterede protokol og giver information om heterogeniteten i NET-sammensætning ved at kvantificere DNA, LL37 og enzymaktivitet (NE, CG og MPO) med forskellige stimuli under de samme in vitro-betingelser . Resultaterne afslører, at neutrofilerne kan reagere forskelligt og specifikt på hver stimulus ved at danne passende DNA-strukturer med forskellige antimikrobielle proteiner under NET-dannelse.
Figur 4: Resterende enzymatisk aktivitet i NETs induceret af kemiske og mikrobielle stimuli. Kolorimetriske assays blev brugt til at evaluere den enzymatiske aktivitet i NETs efter frigørelse af DNA-proteinstrukturer af DNase for kun at analysere NET-bundne proteiner. Grafen viser den gennemsnitlige ± SD for procentdelen af resterende enzymatisk aktivitet i NETs induceret af hver kemisk eller mikrobiel stimuli sammenlignet med den maksimale enzymatiske aktivitet (i supernatanterne af neutrofiler lyseret ved fryseoptøning ved -70 °C) opnået for NE (3,54 ± 2,52 E/ml), CG (34,90 ± 25,85 E/ml) og MPO (0,29 ± 0,13 E/ml). Basal viser den enzymatiske aktivitet i supernatanterne af neutrofilerne, der opbevares i HBSS-bufferen. Statistisk analyse blev udført med data fra 10 uafhængige eksperimenter af ANOVA for at sammenligne grupper af eksperimentelle tilstande med et konfidensniveau på 95%. * og ** = p ≤ 0,05 sammenlignet med alle andre stimuli. = p ≤ 0,05 sammenligning af de signalerede grupper af stimuli. NE = neutrofil elastase; CG = cathepsin G; MPO = myeloperoxidase; PMA = phorbol myrisat acetat; HOCl = hypochlorsyre. Tilpasset fra Sosa-Luis et al.16 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der skal opnås en meget ren population af levedygtige neutrofiler for at fremkalde frigivelse af NET, da disse celler har en begrænset ex vivo-levetid på gennemsnitligt 8 timer, en periode, inden for hvilken alle forsøgene skal udføres. Til dette formål er den ideelle metode dobbeltdensitetsgradienten til optimering af rensningstiden ved at isolere ikke-aktiverede celler, der er mere lydhøre over for eksogen stimulering, i modsætning til Ficoll-Histopaque gradient eller Dextran sedimenteringsteknikker17. En anden fordel ved dobbeltdensitetsgradientmetoden er dens relativt lave omkostninger sammenlignet med celleberigelsesteknikker med høj renhed såsom fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og magnetisk aktiveret cellesortering (MACS), der er afhængige af celleoverfladeantigenerne, såsom CD16hi i neutrofiler. Ud over en høj pris kan disse sorteringsmetoder også forårsage utilsigtet aktivering af målcellerne under antistof-antigen-interaktionen og øge ex vivo-tiden for neutrofiler, da disse to teknikker generelt anvendes efter densitetsgradientrensning. Cellemorfologi og levedygtighed udelukker ændringer i de rensede neutrofiler og bekræfter, at de observerede ændringer er specifikke som reaktion på de tilsatte stimuli versus de hvilende neutrofiler under de samme eksperimentelle betingelser uden stimulering (figur 2). Dette bekræfter protokollens effektivitet som en aseptisk og reproducerbar metode til neutrofil isolering uden at ændre cellelevedygtighed og morfologi. Dette bidrag fra eosinofiler, som almindeligvis findes i blod med tal under 2%, blev udelukket og ændrede ikke den statistiske betydning af resultaterne, da eosinofiler ikke blev observeret i prøven på Wrights farvning ved analyse af forskellige felter (figur 2A). Dette kunne bekræftes ved flowcytometri ved hjælp af CD16-markøren, som ikke er til stede i eosinofiler, men er til stede i høje koncentrationer i neutrofiler.
I undersøgelsen af NETs er der konsensus og uoverensstemmelser18; Forskellige undersøgelser har rapporteret modstridende resultater som reaktion på de samme stimuli, hvilket kan skyldes forskelle i neutrofilisolationsprotokollerne, den forlængede forsøgstid, der aktiverer neutrofilerne spontant, bufferne og forskellige koncentrationer af den samme anvendte stimulus. Derfor er det vigtigt at homogenisere protokollerne med eksplicitte detaljer, så protokollerne konsekvent kan replikeres for at muliggøre sammenligninger. De mest almindelige anvendte metoder er immuncytokemi og immunhistokemi, som muliggør identifikation af strukturer indeholdende ekstracellulært DNA, der colokaliserer med granulatafledte proteiner18, der normalt inkluderer komponenter med bakteriedræbende aktivitet, der er i stand til at ødelægge virulensfaktorer8, såsom NE, MPO, CG og LL37. Derudover anbefaler nylige undersøgelser til overvågning af NET-dannelse at analysere denne proces ved hjælp af live-celle-metoder i realtid såsom intravital mikroskopi 1,18. Få undersøgelser som denne undersøgelse forener de eksperimentelle betingelser for at sammenligne sammensætningen af NET'er under forskellige stimuli (bakterier, svampe og kemikalier)1,9 ved hjælp af teknikken fluorescensmikroskopi til at visualisere dispersionen af DNA-DAPI, LL37-Alexa 594 og dens colokalisering med mikroorganismer-CFSE. Ligeledes frigiver behandlingen med DNase kun de proteiner, der er forbundet med DNA-strukturen af NET'erne, så den spektrofotometriske teknik sikrer kvantificering af den enzymatiske aktivitet af MPO, NE og CG, hvilket udelukker, at de kommer fra degranulering.
NET-morfologi kan defineres som selvmord eller vital, med mulighed for at differentiere dem i henhold til dispersionen vedtaget af DNA i det ekstracellulære rum. Den selvmordsvej er kendetegnet ved en skylignende struktur, mens den vitale vej er en trådformet form15,19,20. Baseret på dette viser figur 3, at PMA og P. aeruginosa repræsenterer en selvmordstruet NET-type. Disse resultater validerer denne teknik ved at replikere under vores betingelser, hvad der blev beskrevet af Brinckman et al. med PMA, den mest almindeligt anvendte forbindelse til at inducere NET'er ved at udløse aktiveringen af c-Raf, MEK, Akt, ERK og proteinkinase C (PKC), som igen aktiverer NADPH-oxidase11 og forårsager en kraftig stigning i intracellulær ROS. Derudover udelukker resultaterne muligheden for, at eksterne artefakter, inkubationstider eller den korte mekaniske omrøring, der blev anvendt i denne undersøgelse, forårsagede spontan in vitro-frigivelse af NET'er med et skylignende udseende, som nogle forfattere har nævnt17, da hvilende neutrofiler uden stimulering post 4 h viste en multilobet kerne med intakt kromatin (figur 3A 1-3).
Tilsvarende NETs induceret med HOCl, C. albicans og S. aureus præsenterede filamentøs morfologi, svarende til den vitale NET-morfologi (figur 3A 7-17). Denne vej er kendetegnet ved, at neutrofiler reagerer på en unik og oxidantuafhængig måde uden cellelyse eller endda brud på plasmamembranen, kun spirende vesikler med nukleært DNA15. Dette resultat validerer igen potentialet i denne teknik til at skelne begge morfologiske udseende af NET-produktion som selvmord eller vital. Med hensyn til NET-sammensætning viste resultaterne opnået ved hjælp af denne metode statistisk signifikans i differentialkravene i LL37 for PMA- og P. aeruginosa-stimulering (figur 3C). NE (kun for S. aureus) og MPO-aktiviteten var højere i mikroorganismerne versus den kemiske gruppe (figur 4). Disse oplysninger beviser igen neutrofilselektivitet i at reagere på hver stimulus, som rapporteret af Kenny et al.5 , når man sammenligner forskellige stimuli i NET-produktion in vitro. Det blev beskrevet, at produktionen af NET i nogle tilfælde har brug for ROS eller har forskellige krav til specifikke enzymer såsom PAD4, mens tilstedeværelsen af disse molekyler i andre tilfælde er irrelevant for deres produktion5.
En begrænsning af teknikken til kvantificering af DNA i det ekstracellulære rum beskrevet i denne undersøgelse er, at DNA også kan komme fra andre former for celledød med en nekrotisk morfotype, og det er umuligt for denne teknik at skelne mellem dem. Det er imidlertid blevet rapporteret, at NETs kan differentieres fra denne proces ved at bekræfte tilstedeværelsen af granulære proteiner18. Ligeledes er DNA'ets oprindelse ukendt, hvilket kan bekræftes ved at amplificere organelspecifikke, mitokondrie eller nukleare gener ved PCR19. En anden svaghed er at skelne NETs fra andre fibrøse strukturer såsom fibrin; En sådan skelnen ville kræve sofistikerede teknikker såsom højopløsnings scanningelektronmikroskopi20. Afslutningsvis tillader de præsenterede teknikker in vitro-karakterisering (under lignende betingelser) af sammensætningen og morfologien af NET'er induceret med forskellige stimuli, hvilket viser selektiviteten af neutrofiler i frigivelsen af nogle af deres komponenter (DNA, LL37, NE, CG, MPO) til en bestemt stimulus. Disse teknikker kan tilpasses til at evaluere virkningen af eksogene opløselige faktorer eller cellulær kontakt på sådanne NET-egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et grundvidenskabeligt tilskud (#285480) fra CONACyT og af Institut for Klinisk Immunologisk Forskning ved Det Biokemiske Fakultet, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A., S.A.S.L og W.J.R.R. har ph.d.-stipendier af CONACyT-numre # 799779, # 660793 og # 827788, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL - Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory - CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
