Summary
Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.
Abstract
Os neutrófilos funcionam como a primeira linha de defesa celular em uma resposta imune inata, empregando diversos mecanismos, como a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Este estudo analisa as alterações morfológicas e composicionais em TNEs induzidas por estímulos microbianos e químicos utilizando metodologias padronizadas in vitro para indução e caracterização da TNE com células humanas. Os procedimentos aqui descritos permitem a análise da morfologia da NET (lítica ou não lítica) e da composição (estruturas DNA-proteína e atividade enzimática), e o efeito de fatores solúveis ou contato celular sobre tais características. Além disso, as técnicas aqui descritas poderiam ser modificadas para avaliar o efeito de fatores solúveis exógenos ou de contato celular na composição da TNE.
As técnicas aplicadas incluem a purificação de células polimorfonucleares do sangue periférico humano usando um gradiente de densidade dupla (1,079-1,098 g/mL), garantindo pureza e viabilidade ideais (≥ 95%), conforme demonstrado pela coloração de Wright, exclusão de azul de tripano e citometria de fluxo, incluindo análise FSC versus SSC e coloração 7AAD. A formação de NET é induzida com estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans) e químicos (acetato de miristato de phorbol, HOCl), e os TNEs são caracterizados por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para o peptídeo antimicrobiano catelicidina (LL37) e quantificação da atividade enzimática (elastase de neutrófilos, catepsina G e mieloperoxidase). As imagens são adquiridas por microscopia de fluorescência e analisadas com ImageJ.
Introduction
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na corrente sanguínea, desempenhando um papel essencial durante a depuração de agentes patogênicos por diversos mecanismos, incluindo a liberação de grandes estruturas cromatina compostas de DNA e várias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas e granulares 1,2. O antecedente direto descrevendo esse papel antimicrobiano dos neutrófilos foi feito por Takei et al.3 em 1996. Esses autores relataram uma nova forma de morte diferente da apoptose e necroptose em neutrófilos, mostraram alterações morfológicas exibindo ruptura nuclear, seguidas de derramamento do nucleoplasma para o citoplasma, e um aumento na permeabilidade da membrana a partir de 3 h de incubação com acetato de miristato de forbol (PMA)2,3. No entanto, foi somente em 2004 que o termo "armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs)" foi utilizado4.
A formação de NET tem sido observada em diversas condições, como infecções bacterianas, fúngicas5, virais6 e parasitárias, para neutralizar, matar e prevenir a disseminação microbiana7. Outros estudos mostram que também pode ocorrer em condições não patogênicas por estímulos estéreis, como citocinas, ácido úrico monossódico ou cristais de colesterol, autoanticorpos, imunocomplexos e plaquetas ativadas7. Lipopolissacarídeo (LPS), interleucina-8 (IL-8) e PMA estavam entre os primeiros estímulos in vitro descritos como indutores de NET, e o envolvimento in vivo da TNE em processos patogênicos foi demonstrado em dois modelos de inflamação aguda: disenteria experimental e apendicite humana espontânea4. O DNA é um componente essencial da NET. Sua estrutura e composição adequadas são necessárias para o sequestro e morte de microrganismos, fornecendo uma alta concentração local de moléculas antimicrobianas em direção aos micróbios capturados, como demonstrado por um breve tratamento com desoxirribonuclease (DNase) que desintegra TNEs e suas propriedades microbicidas4. Além do DNA, os TNEs compreendem proteínas aderentes, como histonas, elastase de neutrófilos (NE), catepsina G (GC), proteinase 3, lactoferrina, gelatinase, mieloperoxidase (MPO) e peptídeos antimicrobianos (AMPs), como o peptídeo pró-inflamatório catiônico catelicidina LL-37, entre outros 8,9. Tais agregados podem formar roscas maiores com diâmetros de até 50 nm. Esses fatores podem perturbar os fatores de virulência microbiana ou a integridade da membrana celular do patógeno; além disso, os AMPs podem estabilizar o DNA derivado da TNE contra a degradação por nucleases bacterianas10.
Os mecanismos específicos que regulam a formação da NET ainda não foram completamente esclarecidos. A via mais bem caracterizada que leva à liberação de NET é através da sinalização ERK, que leva à ativação da NADPH oxidase e à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), bem como ao aumento do cálcio intracelular que desencadeia a ativação da via MPO. Este, por sua vez, transforma o peróxido de hidrogênio em ácido hipocloroso, ativando o NE por oxidação11,12. O NE é responsável por degradar os filamentos de actina do citoesqueleto para bloquear a fagocitose e translocá-los para o núcleo para processamento por clivagem proteolítica e desaminação por PAD4 que impulsionam a dessensibilização das fibras cromatinas, que se associam a proteínas granulográficas e citoplasmáticas, e são então liberadas extracelularmente7. Essas proteases incluem aquelas liberadas do complexo azurossomo dos grânulos azurófilos e outras proteases, como a catepsina G13.
Dependendo das alterações morfológicas nos neutrófilos, os TNEs são classificados em dois tipos: formação de TNE suicida ou lítica levando à morte celular4 e formação de TNE vital ou não lítica produzida por células viáveis mediadas por uma liberação vesicular de DNA nuclear ou mitocondrial, com remanescente de citoplasto anucleado com capacidade fagocítica14,15. Geralmente, TNEs compostos de DNA mitocondrial apresentam morfologia de fibra alongada14, enquanto aqueles estruturados de DNA nuclear têm aparência de nuvem3. No entanto, não se sabe como o neutrófilo escolhe sua origem no DNA. Ao contrário de estudos anteriores que descreveram as vias canônicas dos TNEs como exigindo várias horas, a via vital é rapidamente ativada em apenas 5-60 min15.
Apesar desses avanços, a composição da TNE varia de acordo com o estímulo; por exemplo, diferentes cepas mucoides e não mucoides de P. aeruginosa induzem a formação de TNEs contendo 33 proteínas comuns e até 50 proteínas variáveis7. Assim, faz-se necessário homogeneizar técnicas que permitam a geração de conclusões objetivas em grupos de pesquisa. Este trabalho descreve um protocolo com várias técnicas que permitem comparar e avaliar a composição, estrutura e morfologia de TNEs induzidos com diferentes microrganismos: Staphylococcus aureus (bactéria gram-positiva), Pseudomonas aeruginosa (bactéria gram-negativa) e Candida albicans (fungo), bem como estímulos químicos (PMA, HOCl) em neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis. Os resultados representativos demonstram a heterogeneidade dos TNEs dependendo de seu estímulo indutor em condições in vitro comparáveis, caracterizadas por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para LL37 e quantificação da atividade enzimática (NE, GC e MPO).
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Protocol
As amostras de sangue foram obtidas como doações de participantes clinicamente saudáveis após consentimento informado. Todos os experimentos foram realizados com a permissão do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Faculdade de Ciências Bioquímicas da Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca.
NOTA: Os critérios de inclusão no estudo foram sexo e idade indistintos e clinicamente saudáveis de acordo com as respostas dos participantes a um questionário antes de uma amostra de sangue. Uma análise hematológica foi realizada para determinar a contagem de células e descartar infecções ou anemia, bem como o teste de proteína C-reativa para descartar inflamação no doador.
1. Coleta de sangue periférico e obtenção da embalagem de eritrócitos e leucócitos
- Coletar 10 mL de sangue periférico por punção venosa em tubos com 1,8 mg/mL de K2· EDTA como anticoagulante (ver Tabela de Materiais) de indivíduos clinicamente saudáveis após a obtenção do consentimento informado. Em seguida, realize a biometria sanguínea padrão e o teste de proteína C-reativa para descartar infecção ou inflamação, garantindo a qualidade da amostra.
- Centrifugar a amostra de sangue periférico a 82 x g durante 15 min para remover o plasma rico em plaquetas, seguido de uma segunda centrifugação a 630 x g durante 5 min. Descarte o plasma restante para obter a embalagem de eritrócitos e leucócitos.
- Diluí-lo na proporção de 1:1 (v/v) com 1x solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco.
2. Purificação de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) usando um gradiente de dupla densidade
NOTA: Realizar a purificação de neutrófilos imediatamente após a coleta do sangue, porque eles têm uma vida útil in vitro limitada de cerca de 8 h.
- Depositar o seguinte num tubo de vidro estéril de 10 ml (ver Tabela de Materiais) por ordem: 1 ml de solução de densidade de 1,098 g/ml, 1 ml de solução de densidade de 1,079 g/ml (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, 4 ml da embalagem diluída de eritrócitos e leucócitos. Despeje sobre as paredes sem quebrar a tensão superficial entre as camadas para evitar que elas se misturem.
- Centrífuga a 320 x g durante 20 min a 4 °C, evitando a aceleração/desaceleração de modo a que as altas forças da centrífuga não perturbem o gradiente.
- Aspirar a fase que corresponde aos granulócitos (Figura 1A) por pipetagem e transferir para outro tubo de vidro estéril de 10 mL. Lavar com 4 ml de 1x DPBS a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante e trate as células com choque osmótico para remover os eritrócitos restantes. Adicionar 4 mL de solução salina a 0,2% por 2 min a 4 °C e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 4 mL da solução isotônica (solução salina a 0,65%) por 5 min a 4 °C para restaurar a integridade da membrana e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C.
NOTA: A solução salina a 0,2% é um meio hipotônico, com menor concentração de soluto em relação à do meio intracelular eritrocitária. O contato com o meio hipotônico permite que a água se difunda no eritrócito, levando ao seu inchaço e hemólise. Esta remoção de hemácias do sobrenadante foi confirmada por observação microscópica. - Remova o sobrenadante. Ressuspeite as células em 4 mL de 1x DPBS para remover detritos celulares e, em seguida, centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C. Finalmente, ressuspenda o pellet celular em 2 mL de tampão de solução salina balanceada de Hank (HBSS) frio.
3. Morfologia e viabilidade dos neutrófilos (Figura 1B)
- Teste de exclusão azul de tripano
- Diluir 5 μL da suspensão celular em 20 μL de azul de tripano a 0,4% (proporção de 1:5). Conte as células em uma câmara de Neubauer e determine a viabilidade celular usando um teste de exclusão. Considere as células que mantêm a integridade de sua membrana sem permeabilizar o corante como viáveis.
- Montagem de 5 μL da suspensão celular numa lâmina; seco e manchado com a mancha de Wright por 15 s. Fixar imediatamente a amostra com tampão fosfato pH 6,4 durante 30 s. Lave com água destilada suficiente e observe a morfologia sob um microscópio óptico (100x).
- Análise de coloração 7AAD e citometria de fluxo
- Adicione 1 x 105 células aos tubos de citometria de fluxo e core com 1 μL de 7AAD em 100 μL de tampão FACS (1x DPBS, azida de sódio a 0,1% e plasma descomplementado autólogo a 10%) por 15 min a 4 °C no escuro.
- Lavar com 500 μL de tampão FACS a 300 x g durante 10 min. Fixar as células com 500 μL de paraformaldeído a 2% e armazenar a 4 °C até à sua análise no citómetro de fluxo.
- Para um controle de células mortas, fixar 1 x 105 células com 200 μL de paraformaldeído a 4% por 30 min e lavar com 500 μL de 1x PBS a 300 x g por 10 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e descarregue. Em seguida, adicione 200 μL de Triton X-100 a 0,1% por 1 h a 4 °C. Lave com 500 μL de 1x PBS e deixe com 7AAD como na etapa 3.2.1.
- Usando um citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais), realize a análise FSC versus SSC para analisar a pureza celular e a coloração SSC versus 7AAD para analisar a viabilidade celular. Leia 3 x 104 eventos em 100 μL de volume de absorção em fluxo médio (1.000 células/s) nas configurações polimorfonucleares (FSC, 400-490 e SSC, 300-320).
- Analisar os dados capturados no software do citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais) e determinar a porcentagem de pureza e células positivas para 7DAA na população polimorfonuclear, apresentada através de gráficos de pontos e histogramas.
4. Coloração CFSE de microrganismos
- Adicionar 1 x 108 bactérias ou 1 x 106 pseudo-hifas fúngicas em microtubos de 1,5 mL e corar com 200 μL de 5 μM de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) dissolvido em 1x PBS. Misturar durante alguns segundos e incubar a 37 °C durante 10 minutos no escuro.
- Pare a reação adicionando 500 μL de plasma descomplementado e centrifugar a 620 x g por 10 min para pseudo-hifas ou a 1.800 x g por 10 min para bactérias.
- Rejeitar os sobrenadantes e lavar os pellets com 1 ml de 1x PBS com centrifugação como no passo 4.2. Finalmente, ressuspenda os microrganismos em 250 μL de 1x PBS.
- Preparar alíquotas de 50 μL em microtubos de 1,5 mL com 2 x 107 bactérias (MOI: 100) ou 2 x 105 pseudo-hifas (MOI:1) para indução NET.
5. Indução NET
- Coloque as tampas de vidro estéril de 10 mm x 10 mm em uma placa de 24 poços e cubra com 10 μL de poli-L-lisina a 0,001% por 1 h à temperatura ambiente. Lave duas vezes com 100 μL de 1x PBS, seque ao ar e irradie com luz UV por 15 min.
- Substitua a solução HBSS da suspensão de neutrófilos no passo 2.5 por um meio RPMI 1640 suplementado com plasma autólogo a 10%. À placa de 24 poços (passo 5.1), adicionar 350 μL desta suspensão celular, para uma concentração final de 2 x 105 neutrófilos/poço.
- Permitir que as células adiram ao fundo dos poços incubando por 20 min a 37 °C com 5% de CO2.
- Adicione os estímulos para induzir a formação de NET em 50 μL: estímulos microbianos-gram-positivos bactéria S. aureus (ATCC 25923), bactéria gram-negativa P. aeruginosa (ATCC 10145) no MOI 100 e pseudo-hifas de C. albicans (ATCC 10231) no MOI:1; estímulos bioquímicos-PMA (200 nM) e HOCl (4,5 mM), e controle com estímulo ausente (50 μL de HBSS).
- Obter um volume final de 400 μL por poço. Misturar num agitador de placas a 140 rpm durante 30 s e incubar durante 4 h a 37 °C e 5% de CO2.
6. Visualização de TNEs por microscopia de fluorescência
- DNA e imunocoloração LL37
- Após a indução NET, remova os sobrenadantes dos poços pipetando cuidadosamente e fixe as células com 300 μL de paraformaldeído a 4% por 30 min.
- Lave as células com 200 μL de 1x PBS sem centrifugação e adicione 200 μL de tampão de bloqueio (10% de plasma descomplementado em 1x PBS) por 30 min.
- Para a coloração LL-37, permeabilizar as células com 200 μL de Triton X-100 a 0,2% em PBS 1x por 10 min para permitir que o anticorpo entre nas células. Lave 2x cuidadosamente com 1x PBS para remover o excesso de detergente.
- Monte as tampas em lâminas de vidro (quatro folhas de cobertura em cada lâmina). O DNA cora as células com 2 μL de DAPI (ver Tabela de Materiais), sela as folhas de cobertura e armazena a -20 °C até sua análise por microscopia de fluorescência confocal.
- Aquisição e análise de imagens fluorescentes
- Pegue imagens NET para quantificar seus componentes e use os filtros correspondentes no microscópio de fluorescência confocal (consulte Tabela de materiais) para adquirir as imagens com o software do computador.
NOTA: Considere que o DNA é corado com DAPI (cor azul), mostrando excitação a 360 nm e emissão a 460 nm. Os microrganismos são corados com CFSE (cor verde), que tem uma excitação de 492 nm e uma emissão de 521 nm. O peptídeo LL37 é marcado com anticorpo anti-LL37 Alexa Fluor 594 (cor vermelha), que tem uma excitação de 594 nm e uma emissão de 614 nm. - Calibre o microscópio. Coloque o slide e o foco usando contraste de interferência diferencial (DIC) com a luz normal acesa. Escolha Live para projetar a imagem no monitor.
- Desligue a luz e selecione o canal correspondente do fluorocromo. Por exemplo, selecione filtro 365 nm/azul para DAPI, 43 HE DsRed para Alexa 594 ou GFP 38 HE para CFSE.
- Ajuste as configurações com o anticorpo de controle de isotipo para LL37 e células não coradas para DAPI e CFSE. Defina as mesmas configurações de tempo de exposição, tensão, contraste e lente para capturar todas as imagens sob as mesmas condições.
NOTA: Neste estudo, o tempo de exposição, a tensão e o contraste foram fixados em 1,0 ms, 4,0 V e 0,0, respectivamente, com objetivo de 40x. Esses valores podem ser ajustados para facilitar a melhor captura de imagem para as amostras. - Selecione Ajustar para capturar a imagem. Salve cinco imagens (quatro extremos e o centro) por poço, e da colocalização (fusão) de DNA/LL37/CFSE.
- Defina as três classes de pixels como plano de fundo com as imagens independentes de cada cor e analise o valor do Sinal Cinza Médio por área com o software Image J.
- Pegue imagens NET para quantificar seus componentes e use os filtros correspondentes no microscópio de fluorescência confocal (consulte Tabela de materiais) para adquirir as imagens com o software do computador.
7. Quantificação da atividade enzimática
- Em uma placa de 96 poços, adicionar 90 μL de suspensão celular em HBSS contendo 1 x 10 5 neutrófilos para indução NET e incubar por 20 min a 37 °C e5 % de CO2.
- Imediatamente adicionar 10 μL dos estímulos correspondentes (concentração como na etapa 5.4) e incubar por 4 h a 37 °C com 5% de CO2.
- Descarte os sobrenadantes e lave as células com 100 μL de HBSS. Tratar com 1 U/mL de DNase por 10 min a 37 °C para favorecer a liberação de estruturas DNA-proteína e centrifugar a 1.800 x g por 10 min.
- Recuperar os sobrenadantes e avaliar a atividade enzimática no sobrenadante utilizando reações colorimétricas conforme descrito anteriormente por White et al.17.
- Determinar a atividade enzimática máxima de NE, CG e MPO em neutrófilos sob as mesmas condições experimentais sem adicionar nenhum estímulo para indução NET. Em seguida, congelar a amostra celular a -70 °C e descongelar a 37 °C em banho-maria, gerando um choque de temperatura para favorecer a liberação de proteínas intracelulares por lise celular. Centrifugar a 1.800 x g por 10 min e recuperar os sobrenadantes.
- Adicionar 50 μL do sobrenadante a cada poço em placas de 96 poços e, em seguida, adicionar 50 μL de cada substrato, conforme indicado na etapa 7.7.
- Adicionar 0,5 M de N-metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitro anilina como substrato para NE, e 1 mM de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide para CG. Incubar durante 3 h à temperatura ambiente. No caso da OSM, adicionar 1,6 mM de 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Após incubação, adicionar 50 μL da solução de parada (0,5 M H2SO4) para MPO e medir a absorbância a 405 nm para NE e CG e 450 nm para MPO, usando um espectrofotômetro.
- Comparar os valores obtidos com as curvas de calibração correspondentes e mostrar os resultados de cada condição em relação à atividade enzimática máxima (100%).
8. Análise estatística
- Analise os dados de medição em triplicado para cada experimento independente (n = 10) e realize uma ANOVA para análise estatística, comparando grupos com um nível de confiança de 95%.
Figura 1: Purificação de PMN e protocolo de indução NET. (A) O plasma foi retirado do sangue periférico para obtenção da embalagem de eritrócitos e leucócitos e diluído 1:1 (v/v) com 1x DPBS. Em seguida, 4 mL da diluição foram adicionados ao longo da parede ao tubo de gradiente de dupla densidade, e centrifugados a 320 x g por 20 min a 4 °C, obtendo-se a separação das diferentes camadas celulares e recuperando-se a correspondente ao PMN. (B) As células purificadas foram contadas e sua morfologia foi analisada pela coloração de Wright. A viabilidade foi determinada pela exclusão do azul de tripano e coloração da DAAA 7 por citometria de fluxo. Uma vez verificada a pureza e a viabilidade ideais dos neutrófilos, a formação de NET foi induzida pela adição de micróbios (S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans) ou produtos químicos (PMA, HOCl) em placas de 24 poços para análise por microscopia de fluorescência com DAPI-DNA, anti-LL37 Alexa Fluor 594 e coloração de microrganismos-CFSE. Para quantificação enzimática, os TNEs foram induzidos em placas de 96 poços por 3 h e tratados com DNase, seguidos da adição de substratos para cada enzima: NE, GC e MPO; as alterações de cor foram quantificadas por espectrofotometria. DPBS = solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco; PBMC = Células mononucleares do sangue periférico; PMN = neutrófilos polimorfonucleares; NE = Elastase de neutrófilos; GC = Catepsina G; MPO = Mieloperoxidase; PMA = Acetato de miristato de Phorbol; HOCl = Ácido hipocloroso. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Pureza e viabilidade dos neutrófilos
As fases celulares dinâmicas são visualizadas no tubo a partir da purificação do gradiente de dupla densidade. Dentro dessas camadas, a camada correspondente aos granulócitos está acima da camada de densidade de 1,079 g/mL, distinta das fases de mononucleócitos do sangue periférico (PBMCs) e eritrócitos (Figura 1A). A morfologia das células purificadas foi verificada com a coloração de Wright por meio da observação de células com núcleos segmentados conectados com filamentos em forma de fio correspondentes a neutrófilos maduros (Figura 2A). Devido à meia-vida reduzida dos neutrófilos, a viabilidade é um ponto crucial para os seguintes experimentos de indução NET. Assim, a viabilidade celular foi verificada com a coloração de exclusão azul de tripano, avaliando-se a integridade da membrana plasmática quando o corante não penetra (Figura 2B). Além disso, a 7AAD intercala nas bases de citosina e guanina do DNA e emite fluorescência, o que facilita a exclusão de células mortas (Figura 2C,D). Esses procedimentos resultaram em uma pureza celular de 98,9% ± 0,06% e uma viabilidade celular de 95,5% ± 4,2% em 10 experimentos realizados.
Figura 2: Morfologia e viabilidade de neutrófilos recém-purificados. (A) Após a purificação do gradiente, a morfologia típica dos neutrófilos foi confirmada pela coloração de Wright (100x). As células apresentaram um núcleo multilobado característico de neutrófilos maduros na corrente sanguínea e (B) viabilidade ótima por exclusão de azul de tripano sem ruptura da membrana. (C) A análise do CSC versus FSC por citometria de fluxo confirma uma população correspondente ao PMN, obtendo-se pureza celular de 98,9% ± 0,06% (n = 10). (D) Os gráficos de pontos PMN são apresentados (células não coradas, painéis esquerdos vs. painéis direitos de células coradas com 7AAD) com seus respectivos histogramas (azul-não corado vs. vermelho-corado), indicando uma alta viabilidade celular de 95,5% ± 4,2% (n = 10) nos neutrófilos recém-isolados em comparação com as células controle permeabilizadas com Triton 0,1% (painéis inferiores) para validar os resultados. O corante 7AAD liga-se ao ADN e é excluído das células viáveis, pelo que o pré-tratamento com detergente causou alterações na membrana celular e permitiu a entrada do 7AAD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Morfologia e composição de TNEs induzidos por estímulos químicos e microbiológicos
A Figura 3 mostra imagens representativas comprovando a indução da TNE in vitro pela ação de agentes químicos (PMA, HOCl) ou microbianos (C. albicans, S. aureus e P. aeruginosa) após 4 h de incubação (Figura 3A). A composição NET foi determinada pela coloração DNA/LL37, e as imagens foram capturadas para quantificação dos valores médios de cinza na área com ImageJ (Figura 3B,C). A formação de TNE suicida (lítica) ou vital (não lítica) foi descrita com base em sua morfologia. Em comparação, neutrófilos controle não estimulados cultivados em HBSS por 4 h mostraram LL37 localizado no citoplasma com cromatina condensada segmentada multilobada (Figura 3A 1-3), característica dessas células em repouso.
A PMA é um potente indutor de EROs através da ativação da PKC, funcionando assim como um controle positivo para induzir a formação suicida (lítica) de NET. As imagens de TNEs induzidos por PMA mostram redes com abundante descondensação de cromatina formando estruturas semelhantes a nuvens associadas à via do suicídio (Figura 3A 4-6), nas quais o neutrófilo morre devido à liberação abundante de DNA no espaço extracelular cobrindo grandes proporções da área analisada. Dentro dessas áreas turvas que cobrem o DNA, o LL37 foi colocalizado, tanto intra quanto extracelularmente em altas concentrações (Figura 3A 6, B-C). Em contraste, o HOCl é um composto fisiológico e bioquímico gerado como um produto da atividade oxidativa da MPO. TNEs formados com HOCl apresentaram menor dispersão de DNA no espaço extracelular com morfologia filamentosa que parece ser derivada da membrana celular (Figura 3A 7-9). Tais características morfológicas correspondem à formação da NET vital, e não apresentaram colocalização do LL37 com os filamentos de DNA; O LL37 permaneceu localizado no nível nuclear (Figura 3A 7-9,C). Esses resultados indicam que, em condições controladas semelhantes, esses agentes químicos apresentam divergências na composição dos TNEs liberados, tanto de DNA quanto de LL37.
A análise dos TNEs induzidos por microrganismos mostrou que pseudo-hifas de C. albicans induziram redes com baixas concentrações de DNA liberado no espaço extracelular com estruturas filamentosas, destacando a presença de estruturas anucleadas semelhantes a citoplastos, características da formação de TNE vital (Figura 3A 10-13), que não são observadas com HOCl e S. aureus que ativam esse mesmo caminho. Enquanto isso, o LL37 colocaliza-se com o DNA no nível celular, e baixas concentrações estão associadas a pseudo-hifas, delimitando sua propagação. Ambos os componentes não apresentaram diferenças estatisticamente significantes em relação ao controle com HBSS (Figura 3B,C). S. aureus é uma das bactérias patogênicas mais comuns em todo o mundo, com a capacidade de induzir TNEs apresentando morfologia vital, conforme relatado anteriormente em vários estudos15,19. DNA abundante foi liberado em concentrações estatisticamente significativas como estruturas filamentosas que se colocalizaram com LL37 e formaram aglomerados bacterianos, indicando que o andaime poderia delimitar e favorecer a eliminação das bactérias (Figura 3A 14-17). Por outro lado, a bactéria gram-negativa P. aeruginosa induziu a liberação de grandes concentrações de DNA com morfologia turva associada à formação de NET suicida, e LL37 significativamente colocalizada com DNA e bactérias (Figura 3A 18-21,B,C).
A visualização de TNEs por microscopia de fluorescência mostrou que os TNEs induzidos por HOCl, S. aureus e C. albicans apresentam morfologia vital com estruturas filamentosas. No entanto, apenas S. aureus levou à liberação de quantidades estatisticamente significativas de DNA. A morfologia dos outros dois estímulos induzidos por TNEs induzidos por PMA e P. aeruginosa corresponde ao tipo de formação de TNE suicida, com quantidades estatisticamente significativas de DNA e LL37 em comparação com neutrófilos não estimulados. Havia abundantes estruturas de DNA semelhantes a nuvens, mais significativas em TNEs induzidos por P. aeruginosa do que naqueles induzidos por PMA.
Figura 3: Composição e morfologia do DNA e LL37 dos TNEs induzidos por estímulos químicos e microbianos. (A) Neutrófilos derivados do sangue humano foram estimulados com PMA (4-6), HOCl (7-9), pseudo-hifas de C. albicans (10-13), S. aureus (14-17), P. aeruginosa (18-21) e controle não estimulado (1-3) em HBSS, por 4 h. TNEs foram visualizados usando DNA-DAPI (azul), anti-LL37 Alexa Fluor 594 (vermelho), ou controle isotipo, e os microrganismos foram pré-corados com CFSE 5 μM (verde). As imagens mostram resultados representativos da microscopia de fluorescência de 10 experimentos independentes realizados em triplicata. (B-C) Os gráficos mostram médias ± DP do valor cinza médio do sinal por área para as cores indicadas de cinco imagens (quatro extremos e o centro) por poço e analisadas com o software ImageJ para coloração (B) DAPI-DNA e (C) Alexa Fluor 594-LL37. A ANOVA foi realizada para comparar grupos de condições experimentais com um nível de confiança de 95%. * = p ≤ 0,05. HBSS = solução salina balanceada de Hank; PMA = acetato de miristato de forbol; HOCl = ácido hipocloroso. Adaptado de Sosa-Luis et al.16 com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Atividade enzimática de NE, GC e MPO em TNEs induzida por estímulos químicos e microbiológicos
Outro objetivo deste estudo foi quantificar a atividade de enzimas descritas como componentes centrais em TNEs, como NE, GC e MPO, que são abundantes com atividade antimicrobiana derivada de grânulos azurofílicos. Portanto, TNEs foram induzidos e as redes celulares foram tratadas com DNase, favorecendo a liberação de proteínas associadas à estrutura, e a atividade enzimática foi determinada por meio de ensaios colorimétricos. A análise mostrou atividade residual para NE (2,3% ± 0,6%), GC (6,2% ± 2,7%) e MPO (21,4% ± 2,0%) associada a estruturas de DNA derivadas de todos os TNEs, em comparação com a atividade máxima obtida de neutrófilos em repouso lisados tomada como 100% (Figura 4). TNEs induzidos pela maioria dos estímulos apresentaram baixos valores de atividade enzimática para NE e GC, exceto S. aureus para NE e PMA para GC, que apresentaram significância estatística. Por outro lado, a atividade da MPO aumentou em todos os estímulos sem diferença estatisticamente significativa entre eles, mas foi significativa entre os grupos de estímulos químicos versus microrganismos.
Esses resultados demonstram a viabilidade do protocolo apresentado, fornecendo informações sobre a heterogeneidade na composição da NET, quantificando DNA, LL37 e atividade enzimática (NE, GC e MPO) com diferentes estímulos sob as mesmas condições in vitro . Os resultados revelam que os neutrófilos podem responder diferencial e especificamente a cada estímulo, formando estruturas de DNA adequadas com várias proteínas antimicrobianas durante a formação da NET.
Figura 4: Atividade enzimática residual em TNEs induzida por estímulos químicos e microbianos. Ensaios colorimétricos foram utilizados para avaliar a atividade enzimática em TNEs após o desacoplamento das estruturas DNA-proteína pela DNase para analisar apenas proteínas ligadas à TNE. O gráfico mostra a média ± DP da porcentagem de atividade enzimática residual em TNEs induzida por cada estímulo químico ou microbiano em comparação com a atividade enzimática máxima (nos sobrenadantes dos neutrófilos lisados por congelamento-descongelamento a -70 °C) obtida para NE (3,54 ± 2,52 U/mL), GC (34,90 ± 25,85 U/mL) e MPO (0,29 ± 0,13 U/mL). Basal mostra a atividade enzimática nos sobrenadantes dos neutrófilos mantidos em tampão HBSS. A análise estatística foi realizada com dados de 10 experimentos independentes por ANOVA para comparar grupos de condições experimentais com um nível de confiança de 95%. * e ** = p ≤ 0,05 em comparação com todos os outros estímulos. = p ≤ 0,05 comparando os grupos sinalizados de estímulos. NE = elastase de neutrófilos; GC = catepsina G; MPO = mieloperoxidase; PMA = acetato de miristato de forbol; HOCl = ácido hipocloroso. Adaptado de Sosa-Luis et al.16 com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma população altamente pura de neutrófilos viáveis deve ser obtida para induzir a liberação de TNEs, uma vez que essas células têm uma vida útil ex vivo limitada de 8 h em média, um período dentro do qual todos os experimentos devem ser realizados. Para tanto, a metodologia ideal é o gradiente de dupla densidade para otimizar o tempo de purificação, isolando células não ativadas mais responsivas à estimulação exógena, em contraste com o gradiente Ficoll-Histopaque ou as técnicas de sedimentação de Dextran17. Outra vantagem do método de gradiente de dupla densidade é seu custo relativamente baixo em comparação com técnicas de enriquecimento celular de alta pureza, como a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e a classificação celular ativada magneticamente (MACS) que dependem dos antígenos da superfície celular, como o CD16hi em neutrófilos. Além de um alto custo, esses métodos de classificação também podem causar ativação não intencional das células-alvo durante a interação anticorpo-antígeno e aumentar o tempo ex vivo dos neutrófilos, pois essas duas técnicas são geralmente usadas após a purificação do gradiente de densidade. A morfologia celular e a viabilidade descartam alterações nos neutrófilos purificados e confirmam que as alterações observadas são específicas em resposta aos estímulos adicionados versus os neutrófilos em repouso nas mesmas condições experimentais sem estimulação (Figura 2). Isso corrobora a eficiência do protocolo como método asséptico e reprodutível para isolamento de neutrófilos sem alterar a viabilidade e a morfologia celular. Essa contribuição dos eosinófilos, comumente encontrados no sangue com contagens abaixo de 2%, foi descartada e não alterou a significância estatística dos resultados, uma vez que os eosinófilos não foram observados na amostra na coloração de Wright ao analisar vários campos (Figura 2A). Isso pode ser confirmado pela citometria de fluxo usando o marcador CD16, que não está presente nos eosinófilos, mas está presente em altas concentrações nos neutrófilos.
No estudo dos TNEs, há consensos e discrepâncias18; vários estudos têm relatado resultados contraditórios em resposta aos mesmos estímulos, o que pode ser devido a diferenças nos protocolos de isolamento de neutrófilos, o tempo prolongado de experimentação que ativa os neutrófilos espontaneamente, os tampões e diferentes concentrações do mesmo estímulo utilizado. Portanto, é essencial homogeneizar os protocolos com detalhes explícitos para que os protocolos possam ser replicados de forma consistente para permitir comparações. Os métodos mais utilizados são a imunocitoquímica e a imuno-histoquímica, que possibilitam a identificação de estruturas contendo DNA extracelular colocalizando-se com proteínas derivadas de grânulos18 que geralmente incluem componentes com atividade bactericida capazes de destruir fatores de virulência8, como NE, MPO, CG e LL37. Além disso, estudos recentes para o monitoramento da formação de TNE recomendam a análise desse processo utilizando métodos de células vivas em tempo real, como a microscopia intravital 1,18. Poucos estudos como este unificam as condições experimentais para comparar a composição de TNEs sob diferentes estímulos (bactérias, fungos e produtos químicos)1,9, utilizando a técnica de microscopia de fluorescência para visualizar a dispersão do DNA-DAPI, LL37-Alexa 594, e sua colocalização com microrganismos-CFSE. Da mesma forma, o tratamento com DNase libera apenas as proteínas associadas à estrutura do DNA dos TNEs, de modo que a técnica espectrofotométrica garante quantificar a atividade enzimática da MPO, NE, e CG, descartando que elas provenham da degranulação.
A morfologia da TNE pode ser definida como suicida ou vital, com a possibilidade de diferenciá-los de acordo com a dispersão adotada pelo DNA no espaço extracelular. A via suicida é caracterizada por uma estrutura semelhante a uma nuvem, enquanto a via vital é uma forma filamentosa15,19,20. Com base nisso, a Figura 3 indica que PMA e P. aeruginosa representam um tipo de TNE suicida. Esses resultados validam essa técnica replicando sob nossas condições o que foi descrito por Brinckman et al. com PMA, o composto mais comumente usado para induzir TNEs, desencadeando a ativação de c-Raf, MEK, Akt, ERK e proteína quinase C (PKC), que por sua vez ativam a NADPH oxidase11 e causam um aumento acentuado nas EROs intracelulares. Além disso, os resultados descartam a possibilidade de artefatos externos, tempos de incubação ou a breve agitação mecânica utilizada neste estudo terem causado a liberação espontânea in vitro de TNEs com aparência de nuvem, como alguns autores mencionaram17, uma vez que neutrófilos em repouso sem estimulação pós-4 h apresentaram núcleo multilobado com cromatina intacta (Figura 3A 1-3).
Da mesma forma, TNEs induzidos com HOCl, C. albicans, e S. Aureu apresentou morfologia filamentosa, correspondendo à morfologia da NET vital (Figura 3A 7-17). Essa via é caracterizada por neutrófilos respondendo de forma única e oxidante-independente, sem lise celular ou mesmo ruptura da membrana plasmática, apenas brotamento de vesículas com DNA nuclear15. Esse resultado novamente valida o potencial dessa técnica para discernir tanto as aparências morfológicas da produção de NET quanto suicidas ou vitais. Em relação à composição da NET, os resultados obtidos por meio dessa metodologia mostraram significância estatística nos requisitos diferenciais do LL37 para estimulação de PMA e P. aeruginosa (Figura 3C). A atividade de NE (apenas para S. aureus) e MPO foi maior nos microrganismos em relação ao grupo químico (Figura 4). Essa informação comprova novamente a seletividade dos neutrófilos na resposta a cada estímulo, conforme relatado por Kenny et al.5 ao comparar diferentes estímulos na produção de NET in vitro. Foi descrito que em alguns casos a produção de NET necessita de ERO ou possui requisitos diferenciais de enzimas específicas como a PAD4, enquanto em outros a presença dessas moléculas é irrelevante para sua produção5.
Uma limitação da técnica de quantificação do DNA no espaço extracelular descrita neste estudo é que o DNA também pode vir de outras formas de morte celular com morfotipo necrótico, sendo impossível que essa técnica discerna entre elas. No entanto, tem sido relatado que os TNEs podem ser diferenciados desse processo, confirmando a presença de proteínas granulares18. Da mesma forma, a origem do DNA é desconhecida, o que pode ser confirmado pela amplificação de genes organelas específicas, mitocondriais ou nucleares por PCR19. Outra fraqueza é distinguir TNEs de outras estruturas fibrosas, como a fibrina; tal discernimento exigiria técnicas sofisticadas, como a microscopia eletrônica de varredura de alta resolução20. Em conclusão, as técnicas apresentadas permitem a caracterização in vitro (em condições semelhantes) da composição e morfologia dos TNEs induzidos com diferentes estímulos, mostrando a seletividade dos neutrófilos na liberação de alguns de seus componentes (DNA, LL37, NE, CG, MPO) a um estímulo específico. Essas técnicas podem ser adaptadas para avaliar o efeito de fatores solúveis exógenos ou de contato celular sobre tais características da NET.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de ciência básica (#285480) do CONACyT e pelo Departamento de Pesquisa em Imunologia Clínica da Faculdade de Ciências Bioquímicas da Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L e W.J.R.R. têm bolsas de doutorado dos números CONACyT #799779, #660793 e #827788, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL - Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory - CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
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