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Immunology and Infection

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/64522
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 3, 1
1Clinical Immunology Research Department of Biochemical Sciences Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca, 2Department of Molecular Biomedicine, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, 3CONACYT- Medicine and Surgery Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca, 4Molecular Immunology Research Department of Medicine and Surgery Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca

Summary

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Abstract

Les neutrophiles fonctionnent comme la première ligne de défense cellulaire dans une réponse immunitaire innée en utilisant divers mécanismes, tels que la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Cette étude analyse les changements morphologiques et compositionnels des TNE induits par des stimuli microbiens et chimiques à l’aide de méthodologies in vitro normalisées pour l’induction et la caractérisation des TNE avec des cellules humaines. Les procédures décrites ici permettent d’analyser la morphologie (lytique ou non lytique) et la composition des NET (structures ADN-protéines et activité enzymatique), ainsi que l’effet des facteurs solubles ou du contact cellulaire sur ces caractéristiques. De plus, les techniques décrites ici pourraient être modifiées pour évaluer l’effet des facteurs solubles exogènes ou du contact cellulaire sur la composition des TNE.

Les techniques appliquées comprennent la purification de cellules polymorphonucléaires du sang périphérique humain à l’aide d’un double gradient de densité (1,079-1,098 g / mL), garantissant une pureté et une viabilité optimales (≥ 95%), comme démontré par la coloration de Wright, l’exclusion du bleu de trypan et la cytométrie en flux, y compris l’analyse FSC versus SSC et la coloration 7AAD. La formation de TNE est induite par des stimuli microbiens (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Candida albicans) et chimiques (acétate de myristate de phorbol, HOCl), et les TNE sont caractérisées par une coloration de l’ADN-DAPI, une immunocoloration pour le peptide antimicrobien cathélicidine (LL37) et une quantification de l’activité enzymatique (élastase neutrophile, cathepsine G et myéloperoxydase). Les images sont acquises par microscopie à fluorescence et analysées avec ImageJ.

Introduction

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine, jouant un rôle essentiel lors de la clairance des agents pathogènes par plusieurs mécanismes, dont la libération de grandes structures chromatiniques composées d’ADN et de plusieurs protéines antibactériennes nucléaires, cytoplasmiques et granulaires 1,2. L’antécédent direct décrivant ce rôle antimicrobien des neutrophiles a été fait par Takei et al.3 en 1996. Ces auteurs ont rapporté une nouvelle forme de mort différente de l’apoptose et de la nécroptose chez les neutrophiles, ont montré des changements morphologiques présentant une rupture nucléaire, suivie d’un débordement du nucléoplasme dans le cytoplasme, et une augmentation de la perméabilité de la membrane à partir de 3 h d’incubation avec l’acétate de myristate de phorbol (PMA)2,3. Cependant, ce n’est qu’en 2004 que le terme « pièges extracellulaires (TNE) » a été utilisé4.

La formation de TNE a été observée dans diverses conditions, telles que les infections bactériennes, fongiques5, virales6 et parasitaires, pour neutraliser, tuer et prévenir la dissémination microbienne7. D’autres études montrent qu’il peut également se produire dans des conditions non pathogènes par des stimuli stériles, tels que des cytokines, des cristaux d’acide urique monosodique ou de cholestérol, des auto-anticorps, des complexes immunitaires et des plaquettes activées7. Le lipopolysaccharide (LPS), l’interleukine-8 (IL-8) et la PMA ont été parmi les premiers stimuli in vitro décrits comme des inducteurs NET, et l’implication in vivo des TNE dans les processus pathogènes a été démontrée dans deux modèles d’inflammation aiguë : la dysenterie expérimentale et l’appendicite humaine spontanée4. L’ADN est une composante essentielle de la TNE. Sa structure et sa composition appropriées sont nécessaires à la séquestration et à la destruction des micro-organismes en délivrant une forte concentration locale de molécules antimicrobiennes vers les microbes capturés, comme le démontre un bref traitement par désoxyribonucléase (DNase) qui désintègre les TNE et leurs propriétés microbicides4. Outre l’ADN, les TNE comprennent des protéines attachées telles que les histones, l’élastase neutrophile (NE), la cathepsine G (CG), la protéinase 3, la lactoferrine, la gélatinase, la myéloperoxydase (MPO) et les peptides antimicrobiens (AMP) tels que le peptide cationique pro-inflammatoire cathélicidine LL-37, entre autres, 8,9. Ces agrégats peuvent former des fils plus grands avec des diamètres allant jusqu’à 50 nm. Ces facteurs peuvent perturber les facteurs de virulence microbienne ou l’intégrité de la membrane cellulaire pathogène; de plus, les AMPs peuvent stabiliser l’ADN dérivé de NET contre la dégradation par les nucléases bactériennes10.

Les mécanismes spécifiques régulant la formation des TNE n’ont pas encore été complètement clarifiés. La voie la mieux caractérisée menant à la libération de NET est la signalisation ERK, qui conduit à l’activation de la NADPH oxydase et à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ainsi qu’à une augmentation du calcium intracellulaire qui déclenche l’activation de la voie MPO. Cela transforme à son tour le peroxyde d’hydrogène en acide hypochloreux, activant NE par oxydation11,12. L’entérite nécrotique est responsable de la dégradation des filaments d’actine du cytosquelette pour bloquer la phagocytose et de leur translocation vers le noyau pour traitement par clivage protéolytique et désamination par PAD4 qui entraînent la désensibilisation des fibres de chromatine, qui s’associent aux protéines granulaires et cytoplasmiques, et sont ensuite libérées extracellulairement7. Ces protéases comprennent celles libérées par le complexe azurosome des granules azurophiles et d’autres protéases telles que la cathepsine G13.

Selon les changements morphologiques des neutrophiles, les TNE sont classées en deux types : la formation de TNE suicidaires ou lytiques conduisant à la mort cellulaire4, et la formation de TNE vitale ou non lytique produite par des cellules viables médiées par une libération vésiculeuse d’ADN nucléaire ou mitochondrial, avec un reste d’un cytoplaste anucléé ayant une capacité phagocytaire14,15. Généralement, les TNE composées d’ADN mitochondrial présentent une morphologie allongéede fibres 14, tandis que celles structurées d’ADN nucléaire ont une apparence nuageuse3. Cependant, on ne sait pas comment le neutrophile choisit son origine ADN. Contrairement aux études précédentes qui décrivaient les voies canoniques des TNE comme nécessitant plusieurs heures, la voie vitale est rapidement activée en seulement 5 à 60 minutes15.

Malgré ces avancées, la composition de l’EVF varie en fonction du stimulus; par exemple, différentes souches mucoïdes et non mucoïdes de P. aeruginosa induisent la formation de TNE contenant 33 protéines communes et jusqu’à 50 protéines variables7. Ainsi, il est nécessaire d’homogénéiser les techniques qui permettent la génération de conclusions objectives dans les groupes de recherche. Cet article décrit un protocole avec diverses techniques qui permettent de comparer et d’évaluer la composition, la structure et la morphologie des TNE induites par différents micro-organismes: Staphylococcus aureus (bactérie à Gram positif), Pseudomonas aeruginosa (bactérie à Gram négatif) et Candida albicans (champignon), ainsi que des stimuli chimiques (PMA, HOCl) dans les neutrophiles humains d’individus sains. Les résultats représentatifs démontrent l’hétérogénéité des TNE en fonction de leur stimulus inducteur dans des conditions in vitro comparables, caractérisées par la coloration de l’ADN-DAPI, l’immunomarquage pour LL37 et la quantification de l’activité enzymatique (NE, CG et MPO).

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Protocol

Les échantillons de sang ont été prélevés sous forme de dons de participants cliniquement sains après consentement éclairé. Toutes les expériences ont été réalisées avec l’autorisation du Comité d’éthique de la recherche humaine de la Faculté des sciences biochimiques de l’Université autonome Benito Juárez d’Oaxaca.

REMARQUE : Les critères d’inclusion dans l’étude étaient le sexe et l’âge indistincts, et cliniquement sains selon les réponses des participants à un questionnaire avant le prélèvement d’un échantillon de sang. Une analyse hématologique a été effectuée pour déterminer le nombre de cellules et exclure les infections ou l’anémie, ainsi que le test de la protéine C-réactive pour exclure l’inflammation chez le donneur.

1. Prélèvement de sang périphérique et obtention de l’emballage érythrocytaire et leucocytaire

  1. Prélever 10 mL de sang périphérique par ponction veineuse dans des tubes contenant 1,8 mg/mL de K2· L’EDTA comme anticoagulant (voir le tableau des matières) provenant de personnes cliniquement saines après avoir obtenu un consentement éclairé. Ensuite, effectuez une biométrie sanguine standard et un test de protéine C-réactive pour exclure une infection ou une inflammation, garantissant ainsi la qualité de l’échantillon.
  2. Centrifuger l’échantillon de sang périphérique à 82 x g pendant 15 min pour éliminer le plasma riche en plaquettes, suivi d’une deuxième centrifugation à 630 x g pendant 5 min. Jeter le plasma restant pour obtenir l’emballage érythrocytaire et leucocytes.
  3. Diluez-le dans un rapport 1:1 (v/v) avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.

2. Purification des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) à l’aide d’un gradient de densité double

REMARQUE: Effectuer la purification des neutrophiles immédiatement après le prélèvement du sang, car ils ont une durée de vie in vitro limitée d’environ 8 heures.

  1. Déposer les éléments suivants dans un tube de verre stérile de 10 mL (voir le tableau des matières) dans l’ordre : 1 mL de solution de densité de 1,098 g/mL, 1 mL de solution de densité de 1,079 g/mL (voir le tableau des matières), puis 4 mL de l’emballage érythrocytaire et leucocytaire dilué. Verser sur les murs sans rompre la tension superficielle entre les couches pour éviter qu’elles ne se mélangent.
  2. Centrifuger à 320 x g pendant 20 min à 4 °C, en évitant l’accélération/décélération afin que les forces élevées de la centrifugeuse ne perturbent pas la pente.
  3. Aspirer la phase qui correspond aux granulocytes (figure 1A) par pipetage, et transférer dans un autre tube de verre stérile de 10 mL. Laver avec 4 mL de 1x DPBS à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
  4. Jeter le surnageant et traiter les cellules avec un choc osmotique pour éliminer les érythrocytes restants. Ajouter 4 mL de solution saline à 0,2 % pendant 2 min à 4 °C et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Jetez le surnageant. Ajouter ensuite 4 mL de la solution isotonique (solution saline à 0,65 %) pendant 5 min à 4 °C pour rétablir l’intégrité de la membrane, et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
    NOTE: La solution saline à 0,2% est un milieu hypotonique, avec une concentration de soluté inférieure à celle du milieu intracellulaire RBC. Le contact avec le milieu hypotonique permet à l’eau de diffuser dans les globules rouges, entraînant leur gonflement et leur hémolyse. Cette élimination des globules rouges du surnageant a été confirmée par une observation microscopique.
  5. Retirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 4 mL de 1x DPBS pour éliminer les débris cellulaires, puis centrifugez à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Enfin, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 2 ml de tampon de solution saline équilibrée (HBSS) de Hank froid.

3. Morphologie et viabilité des neutrophiles (figure 1B)

  1. Test d’exclusion du bleu trypan
    1. Diluer 5 μL de la suspension cellulaire dans 20 μL de bleu de trypan à 0,4 % (rapport 1:5). Compter les cellules dans une chambre de Neubauer et déterminer la viabilité cellulaire à l’aide d’un test d’exclusion. Considérez les cellules qui maintiennent l’intégrité de leur membrane sans perméabiliser le colorant comme viables.
    2. Monter 5 μL de la suspension cellulaire sur une glissière; sécher et tacher avec la teinture de Wright pendant 15 s. Fixer immédiatement l’échantillon avec un tampon phosphate pH 6,4 pendant 30 s. Laver avec suffisamment d’eau distillée et observer la morphologie au microscope optique (100x).
  2. 7AAD-coloration et analyse de cytométrie en flux
    1. Ajouter 1 x 105 cellules dans des tubes de cytométrie en flux et colorer avec 1 μL de 7AAD dans 100 μL de tampon FACS (1x DPBS, 0,1% d’azoture de sodium et 10% de plasma autologue décomplété) pendant 15 min à 4 °C dans l’obscurité.
    2. Laver avec 500 μL de tampon FACS à 300 x g pendant 10 min. Fixer les cellules avec 500 μL de paraformaldéhyde à 2% et conserver à 4 °C jusqu’à leur analyse dans le cytomètre en flux.
    3. Pour un contrôle des cellules mortes, fixer 1 x 105 cellules avec 200 μL de paraformaldéhyde à 4% pendant 30 min, et laver avec 500 μL de 1x PBS à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez le surnageant et jetez-le. Ajouter ensuite 200 μL de Triton X-100 à 0,1 % pendant 1 h à 4 °C. Laver avec 500 μL de 1x PBS et teindre avec 7AAD comme à l’étape 3.2.1.
    4. À l’aide d’un cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux), effectuer une analyse FSC versus SSC pour analyser la pureté cellulaire et SSC versus coloration 7AAD pour analyser la viabilité cellulaire. Lire 3 x 104 événements dans 100 μL de volume d’absorption à débit moyen (1 000 cellules/s) dans les milieux polymorphonucléaires (FSC, 400-490 et SSC, 300-320).
    5. Analyser les données saisies dans le logiciel de cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux) et déterminer le pourcentage de pureté et de cellules positives pour 7AAD dans la population polymorphonucléaire, présenté au moyen de diagrammes de points et d’histogrammes.

4. Coloration des micro-organismes par le CFSE

  1. Ajouter 1 x 108 bactéries ou 1 x 106 pseudohyphes fongiques dans des microtubes de 1,5 mL et colorer avec 200 μL de carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) dissous dans 1x PBS. Mélanger pendant quelques secondes et incuber à 37 °C pendant 10 min dans l’obscurité.
  2. Arrêter la réaction en ajoutant 500 μL de plasma décomplété, et centrifuger à 620 x g pendant 10 min pour les pseudohyphes ou à 1 800 x g pendant 10 min pour les bactéries.
  3. Jeter les surnageants et laver les granulés avec 1 mL de 1x PBS par centrifugation comme à l’étape 4.2. Enfin, remettre les micro-organismes en suspension dans 250 μL de 1x PBS.
  4. Préparer 50 μL d’aliquotes dans des microtubes de 1,5 mL avec 2 x 107 bactéries (MOI : 100) ou 2 x 105 pseudohyphes (MOI:1) pour l’induction NET.

5. Induction NET

  1. Placer des lamelles de verre stérile de 10 mm x 10 mm dans une plaque de 24 puits et couvrir de 10 μL de poly-L-lysine à 0,001 % pendant 1 h à température ambiante. Laver deux fois avec 100 μL de 1x PBS, sécher à l’air et irradier à la lumière UV pendant 15 min.
  2. Remplacer la solution HBSS de la suspension de neutrophiles à l’étape 2.5 par un milieu RPMI 1640 complété par du plasma autologue à 10%. Dans la plaque de 24 puits (étape 5.1), ajouter 350 μL de cette suspension cellulaire, pour une concentration finale de 2 x 105 neutrophiles/puits.
  3. Laisser les cellules adhérer au fond des puits en incubant pendant 20 min à 37 °C avec 5% de CO2.
  4. Ajouter les stimuli pour induire la formation de TNE dans 50 μL : la bactérie S. aureus (ATCC 25923), la bactérie à Gram négatif P. aeruginosa (ATCC 10145) à MOI 100 et les pseudohyphes de C. albicans (ATCC 10231) à MOI:1; stimuli biochimiques-PMA (200 nM) et HOCl (4,5 mM), et contrôle avec stimulus absent (50 μL de HBSS).
  5. Obtenir un volume final de 400 μL par puits. Mélanger sur une plaque agitatrice à 140 tr/min pendant 30 s et incuber pendant 4 h à 37 °C et 5% de CO2.

6. Visualisation des TNE par microscopie à fluorescence

  1. Immunomarquage de l’ADN et du LL37
    1. Après induction NET, retirer les surnageants des puits en les pipetant soigneusement, et fixer les cellules avec 300 μL de paraformaldéhyde à 4% pendant 30 min.
    2. Laver les cellules avec 200 μL de 1x PBS sans centrifugation, et ajouter 200 μL de tampon bloquant (10% de plasma décomplété dans 1x PBS) pendant 30 min.
    3. Pour la coloration LL-37, perméabiliser les cellules avec 200 μL de Triton X-100 à 0,2% dans 1x PBS pendant 10 minutes pour permettre à l’anticorps de pénétrer dans les cellules. Lavez 2x soigneusement avec 1x PBS pour enlever l’excès de détergent.
    4. Montez les lames de couverture sur des lames de verre (quatre lamelles de couverture sur chaque glissière). Colorer les cellules avec 2 μL de DAPI (voir Tableau des matériaux), sceller les lamelles de couverture et stocker à -20 °C jusqu’à leur analyse par microscopie confocale à fluorescence.
  2. Acquisition et analyse d’images fluorescentes
    1. Prenez des images NET pour quantifier leurs composants et utilisez les filtres correspondants dans le microscope confocale à fluorescence (voir Tableau des matériaux) pour acquérir les images avec le logiciel de l’ordinateur.
      REMARQUE: Considérez que l’ADN est coloré avec DAPI (couleur bleue), montrant une excitation à 360 nm et une émission à 460 nm. Les micro-organismes sont colorés avec CFSE (couleur verte), qui a une excitation de 492 nm et une émission de 521 nm. Le peptide LL37 est marqué avec l’anticorps anti-LL37 Alexa Fluor 594 (couleur rouge), qui a une excitation de 594 nm et une émission de 614 nm.
    2. Calibrer le microscope. Placez la diapositive et effectuez la mise au point à l’aide du contraste d’interférence différentiel (DIC) avec la lumière normale allumée. Choisissez En direct pour projeter l’image sur le moniteur.
    3. Éteignez la lumière et sélectionnez le canal correspondant au fluorochrome. Par exemple, sélectionnez filtre 365 nm/bleu pour DAPI, 43 HE DsRed pour Alexa 594 ou 38 HE GFP pour CFSE.
    4. Ajustez les paramètres avec l’anticorps témoin isotype pour LL37 et les cellules non colorées pour DAPI et CFSE. Réglez le même temps d’exposition, la même tension, le même contraste et les mêmes réglages d’objectif pour capturer toutes les images dans les mêmes conditions.
      REMARQUE: Dans cette étude, le temps d’exposition, la tension et le contraste ont été fixés à 1,0 ms, 4,0 V et 0,0, respectivement, avec un objectif 40x. Ces valeurs peuvent être ajustées pour faciliter la meilleure capture d’image pour les échantillons.
    5. Sélectionnez Accrochage pour capturer l’image. Enregistrer cinq images (quatre extrêmes et le centre) par puits, et de la colocalisation (fusion) de l’ADN / LL37 / CFSE.
    6. Définissez les trois classes de pixels comme arrière-plan avec les images indépendantes de chaque couleur et analysez la valeur du signal gris moyen par zone avec le logiciel Image J.

7. Quantification de l’activité enzymatique

  1. Dans une plaque de 96 puits, ajouter 90 μL de suspension cellulaire dans HBSS contenant 1 x 10 5 neutrophiles pour l’induction NET, et incuber pendant 20 min à 37 °C et5 % de CO2.
  2. Immédiatement, ajouter 10 μL des stimuli correspondants (concentration comme à l’étape 5.4) et incuber pendant 4 h à 37 °C avec 5% de CO2.
  3. Jetez les surnageants et lavez les cellules avec 100 μL de HBSS. Traiter avec 1 U/mL de DNase pendant 10 min à 37 °C pour favoriser la libération des structures ADN-protéine, et centrifuger à 1 800 x g pendant 10 min.
  4. Récupérer les surnageants et évaluer l’activité enzymatique du surnageant à l’aide de réactions colorimétriques décrites précédemment par White et coll.17.
  5. Déterminer l’activité enzymatique maximale de NE, CG et MPO dans les neutrophiles dans les mêmes conditions expérimentales sans ajouter de stimuli pour l’induction NET. Ensuite, congeler l’échantillon cellulaire à -70 °C et décongeler à 37 °C au bain-marie, générant un choc thermique pour favoriser la libération de protéines intracellulaires par lyse cellulaire. Centrifuger à 1 800 x g pendant 10 min et récupérer les surnageants.
  6. Ajouter 50 μL du surnageant à chaque puits dans des plaques de 96 puits, puis ajouter 50 μL de chaque substrat comme indiqué à l’étape 7.7.
  7. Ajouter 0,5 M de N-méthoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitro aniline comme substrat pour NE, et 1 mM de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide pour CG. Incuber pendant 3 h à température ambiante. Pour le MPO, ajouter 1,6 mM de 3,3',5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et incuber pendant 30 min à température ambiante.
  8. Après incubation, ajouter 50 μL de la solution stop (0,5 MH2SO4)pour le MPO et mesurer l’absorbance à 405 nm pour l’entérite ne nétiques et CG et à 450 nm pour le MPO, à l’aide d’un spectrophotomètre.
  9. Comparer les valeurs obtenues avec les courbes d’étalonnage correspondantes et montrer les résultats de chaque condition par rapport à l’activité enzymatique maximale (100%).

8. Analyse statistique

  1. Analyser les données de mesure en triple exemplaire pour chaque expérience indépendante (n = 10) et effectuer une ANOVA pour l’analyse statistique en comparant les groupes avec un niveau de confiance de 95%.

Figure 1
Figure 1 : Purification PMN et protocole d’induction NET. (A) Le plasma a été retiré du sang périphérique pour obtenir l’emballage érythrocytaire et leucocytaire et dilué 1:1 (v/v) avec 1x DPBS. Ensuite, 4 mL de la dilution ont été ajoutés le long de la paroi au tube à gradient de double densité, et centrifugés à 320 x g pendant 20 min à 4 °C, obtenant la séparation des différentes couches cellulaires et récupérant celle correspondant à PMN. (B) Les cellules purifiées ont été comptées et leur morphologie a été analysée par coloration de Wright. La viabilité a été déterminée par exclusion du bleu de trypan et coloration 7AAD par cytométrie en flux. Une fois la pureté et la viabilité optimales des neutrophiles vérifiées, la formation de TNE a été induite par l’ajout de microbes (S. aureus, P. aeruginosa et C. albicans) ou de produits chimiques (PMA, HOCl) dans des plaques à 24 puits pour analyse par microscopie à fluorescence avec ADN-DAPI, anti-LL37 Alexa Fluor 594 et coloration micro-organisme-CFSE. Pour la quantification enzymatique, les TNE ont été induites dans des plaques de 96 puits pendant 3 h et traitées avec de la DNase, suivies de l’ajout de substrats pour chaque enzyme : NE, CG et MPO; Les changements de couleur ont été quantifiés par spectrophotométrie. DPBS = solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco; PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique; PMN = neutrophiles polymorphonucléaires; NE = élastase neutrophile; CG = cathepsine G; MPO = Myéloperoxydase; PMA = acétate de myristate de Phorbol; HOCl = Acide hypochloreux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

Pureté et viabilité des neutrophiles
Les phases cellulaires dynamiques sont visualisées dans le tube à partir de la purification à double gradient de densité. Au sein de ces couches, la couche correspondant aux granulocytes est supérieure à la couche de densité de 1,079 g/mL, ce qui se distingue des phases des mononucléocytes du sang périphérique (PBMC) et des érythrocytes (Figure 1A). La morphologie des cellules purifiées a été vérifiée avec la coloration de Wright en observant des cellules avec des noyaux segmentés reliés à des filaments filiformes correspondant à des neutrophiles matures (Figure 2A). En raison de la demi-vie réduite des neutrophiles, la viabilité est un point crucial pour les expériences d’induction de TNE suivantes. Par conséquent, la viabilité cellulaire a été vérifiée avec la coloration d’exclusion du bleu de trypan, évaluant l’intégrité de la membrane plasmique lorsque le colorant ne pénètre pas (Figure 2B). De plus, le 7AAD s’intercale dans les bases cytosine et guanine de l’ADN et émet une fluorescence, ce qui facilite l’exclusion des cellules mortes (Figure 2C,D). Ces procédures ont abouti à une pureté cellulaire de 98,9% ± 0,06% et une viabilité cellulaire de 95,5% ± 4,2% dans 10 expériences réalisées.

Figure 2
Figure 2 : Morphologie et viabilité des neutrophiles fraîchement purifiés. (A) Après purification par gradient, la morphologie typique des neutrophiles a été confirmée par la coloration de Wright (100x). Les cellules ont montré un noyau multilobé caractéristique des neutrophiles matures dans la circulation sanguine et (B) une viabilité optimale par exclusion du bleu de trypan sans perturbation de la membrane. (C) L’analyse de la SSC par rapport à la FSC par cytométrie de flux confirme une population correspondant à PMN, obtenant une pureté cellulaire de 98,9% ± 0,06% (n = 10). (D) Les diagrammes de points PMN sont présentés (cellules non colorées, panneaux de gauche vs panneaux droits de cellules colorées 7AAD) avec leurs histogrammes respectifs (bleu non coloré vs rouge), indiquant une viabilité cellulaire élevée de 95,5% ± 4,2% (n = 10) dans les neutrophiles fraîchement isolés par rapport aux cellules témoins perméabilisées avec 0,1% de Triton (panneaux inférieurs) pour valider les résultats. Le colorant 7AAD se lie à l’ADN et est exclu des cellules viables, de sorte que le prétraitement au détergent a provoqué des altérations de la membrane cellulaire et a permis l’entrée de 7AAD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Morphologie et composition des TNE induites par des stimuli chimiques et microbiologiques
La figure 3 montre des images représentatives prouvant in vitro l’induction de NET par l’action d’agents chimiques (PMA, HOCl) ou microbiens (C. albicans, S. aureus et P. aeruginosa) après 4 h d’incubation (Figure 3A). La composition NET a été déterminée par coloration ADN/LL37, et les images ont été capturées pour la quantification des valeurs moyennes de gris dans la zone avec ImageJ (Figure 3B,C). La formation de TNE suicidaire (lytique) ou vitale (non lytique) a été décrite en fonction de leur morphologie. En comparaison, les neutrophiles témoins non stimulés cultivés dans HBSS pendant 4 h ont montré LL37 localisé dans le cytoplasme avec une chromatine condensée multilobée segmentée (Figure 3A 1-3), caractéristique de ces cellules au repos.

La PMA est un puissant inducteur de ROS par activation PKC, fonctionnant ainsi comme un contrôle positif pour induire la formation de TNE suicidaires (lytiques). Les images des TNE induites par la PMA montrent des réseaux avec une décondensation abondante de la chromatine formant des structures ressemblant à des nuages associées à la voie du suicide (Figure 3A 4-6), dans lesquelles les neutrophiles meurent en raison de la libération abondante d’ADN dans l’espace extracellulaire couvrant de grandes proportions de la zone analysée. Dans ces zones nuageuses couvrant l’ADN, LL37 a été colocalisé, à la fois intra- et extracellulaire en concentrations élevées (Figure 3A 6, B-C). En revanche, HOCl est un composé physiologique et biochimique généré en tant que produit de l’activité oxydative du MPO. Les TNE formées avec HOCl ont montré une dispersion mineure de l’ADN dans l’espace extracellulaire avec une morphologie filamenteuse qui semble être dérivée de la membrane cellulaire (Figure 3A 7-9). Ces caractéristiques morphologiques correspondent à la formation vitale de NET, et elles n’ont pas montré de colocalisation de LL37 avec les filaments d’ADN; LL37 est resté localisé au niveau nucléaire (Figure 3A 7-9,C). Ces résultats indiquent que dans des conditions contrôlées similaires, ces agents chimiques présentent des divergences dans la composition des TNE libérées, à la fois l’ADN et la LL37.

L’analyse des TNE induites par des microorganismes a montré que les pseudohyphes de C. albicans induisaient des réseaux avec de faibles concentrations d’ADN libéré dans l’espace extracellulaire avec des structures filamenteuses, mettant en évidence la présence de structures anucléées de type cytoplaste caractéristiques de la formation vitale de TNE (Figure 3A 10-13), qui ne sont pas observées avec HOCl et S. aureus qui activent cette même voie. Pendant ce temps, LL37 colocalise avec l’ADN au niveau cellulaire, et de faibles concentrations sont associées aux pseudohyphes, délimitant leur propagation. Les deux composantes n’ont pas montré de différences statistiquement significatives par rapport au témoin avec HBSS (Figure 3B, C). S. aureus est l’une des bactéries pathogènes les plus courantes dans le monde, avec la capacité d’induire des TNE montrant une morphologie vitale comme indiqué précédemment dans plusieurs études15,19. L’ADN abondant a été libéré à des concentrations statistiquement significatives sous forme de structures filamenteuses qui colocalisaient avec LL37 et formaient des grappes bactériennes, indiquant que l’échafaudage pourrait délimiter et favoriser l’élimination de la bactérie (Figure 3A 14-17). D’autre part, la bactérie à Gram négatif P. aeruginosa a induit la libération de grandes concentrations d’ADN avec une morphologie trouble associée à la formation de NET suicidaire, et LL37 significativement colocalisé avec l’ADN et les bactéries (Figure 3A 18-21,B,C).

La visualisation des TNE par microscopie à fluorescence a montré que les TNE induites par HOCl , S. aureus et C. albicans présentent une morphologie vitale avec des structures filamenteuses. Cependant, seul S. aureus a conduit à la libération de quantités statistiquement significatives d’ADN. La morphologie des TNE induites par les deux autres stimuli (PMA et P. aeruginosa) correspond au type de formation de TNE suicidaire, avec des quantités statistiquement significatives d’ADN et de LL37 par rapport aux neutrophiles non stimulés. Il y avait d’abondantes structures d’ADN ressemblant à des nuages, plus significatives dans les TNE induites par P. aeruginosa que celles induites par la PMA.

Figure 3
Figure 3 : Composition et morphologie de l’ADN et de la LL37 des TNE induites par des stimuli chimiques et microbiens. (A) Les neutrophiles dérivés du sang humain ont été stimulés avec PMA (4-6), HOCl (7-9), pseudohyphes de C. albicans (10-13), S. aureus (14-17), P. aeruginosa (18-21) et un témoin non stimulé (1-3) dans HBSS, pendant 4 h. Les TNE ont été visualisées à l’aide de DNA-DAPI (bleu), anti-LL37 Alexa Fluor 594 (rouge), ou contrôle des isotypes, et les micro-organismes ont été pré-colorés avec 5 μM CFSE (vert). Les images montrent des résultats de microscopie à fluorescence représentatifs de 10 expériences indépendantes réalisées en triplicate. (B-C) Les graphiques montrent des moyennes ± SD de la valeur moyenne de gris du signal par zone pour les couleurs indiquées de cinq images (quatre extrêmes et le centre) par puits et analysées avec le logiciel ImageJ pour (B) DAPI-DNA et (C) Alexa Fluor 594-LL37. L’ANOVA a été réalisée pour comparer des groupes de conditions expérimentales avec un niveau de confiance de 95 %. * = p ≤ 0,05. HBSS = solution saline équilibrée de Hank; PMA = acétate de myristate de phorbol; HOCl = acide hypochloreux. Adapté de Sosa-Luis et al.16 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Activité enzymatique de l’EN, du CG et du MPO dans les TNE induite par des stimuli chimiques et microbiologiques
Un autre objectif de cette étude était de quantifier l’activité des enzymes décrites comme des composants centraux dans les TNE, telles que l’EN, la CG et la MPO, qui sont abondantes avec une activité antimicrobienne dérivée de granules azurophiles. Par conséquent, des TNE ont été induites et les réseaux cellulaires ont été traités avec de la DNase, favorisant la libération de protéines associées à la structure, et l’activité enzymatique a été déterminée à l’aide de tests colorimétriques. L’analyse a montré une activité résiduelle pour l’entérite nécrotique (2,3 % ± 0,6 %), la CG (6,2 % ± 2,7 %) et la MPO (21,4 % ± 2,0 %) associée aux structures d’ADN dérivées de toutes les TNE, comparativement à l’activité maximale obtenue à partir des neutrophiles lysés au repos pris à 100 % (figure 4). Les TNE induites par la plupart des stimuli ont montré de faibles valeurs d’activité enzymatique pour l’entérite nécrotique et la CG, à l’exception de S. aureus pour l’entérite nécrotique et de la PMA pour l’entérine et de la PMA pour l’entériorat de l’entérine et de la CG, qui ont montré une signification statistique. D’autre part, l’activité MPO a augmenté dans tous les stimuli sans aucune différence statistiquement significative entre eux, mais était significative entre les groupes de stimuli chimiques par rapport aux micro-organismes.

Ces résultats démontrent la faisabilité du protocole présenté, fournissant des informations sur l’hétérogénéité de la composition des TNE en quantifiant l’activité de l’ADN, du LL37 et de l’enzyme (NE, CG et MPO) avec différents stimuli dans les mêmes conditions in vitro . Les résultats révèlent que les neutrophiles peuvent répondre différemment et spécifiquement à chaque stimulus en formant des structures d’ADN appropriées avec diverses protéines antimicrobiennes lors de la formation de TNE.

Figure 4
Figure 4 : Activité enzymatique résiduelle dans les TNE induite par des stimuli chimiques et microbiens. Des essais colorimétriques ont été utilisés pour évaluer l’activité enzymatique dans les TNE après désengagement des structures ADN-protéines par la DNase pour analyser uniquement les protéines liées aux TNE. Le graphique montre l’écart-type moyen ± du pourcentage d’activité enzymatique résiduelle dans les TNE induites par chaque stimulus chimique ou microbien par rapport à l’activité enzymatique maximale (dans les surnageants des neutrophiles lysés par congélation-décongélation à -70 °C) obtenue pour l’entérite nécrotique (3,54 ± 2,52 U/mL), la CG (34,90 ± 25,85 U/mL) et la MPO (0,29 ± 0,13 U/mL). Basal montre l’activité enzymatique dans les surnageants des neutrophiles conservés dans le tampon HBSS. L’analyse statistique a été effectuée avec les données de 10 expériences indépendantes par ANOVA pour comparer des groupes de conditions expérimentales avec un niveau de confiance de 95%. * et ** = p ≤ 0,05 par rapport à tous les autres stimuli. = p ≤ 0,05 en comparant les groupes de stimuli signalés. NE = élastase neutrophile; CG = cathepsine G; MPO = myéloperoxydase; PMA = acétate de myristate de phorbol; HOCl = acide hypochloreux. Adapté de Sosa-Luis et al.16 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Une population très pure de neutrophiles viables doit être obtenue pour induire la libération de TNE, car ces cellules ont une durée de vie ex vivo limitée de 8 h en moyenne, période au cours de laquelle toutes les expériences doivent être effectuées. Pour cela, la méthodologie idéale est le gradient de double densité pour optimiser le temps de purification en isolant les cellules non activées plus sensibles à la stimulation exogène, contrairement au gradient de Ficoll-Histopaque ou aux techniques de sédimentation de Dextran17. Un autre avantage de la méthode à double gradient de densité est son coût relativement faible par rapport aux techniques d’enrichissement cellulaire de haute pureté telles que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) qui reposent sur les antigènes de surface cellulaire, tels que CD16hi dans les neutrophiles. Outre un coût élevé, ces méthodes de tri peuvent également provoquer une activation involontaire des cellules cibles lors de l’interaction anticorps-antigène et augmenter le temps ex vivo des neutrophiles, car ces deux techniques sont généralement utilisées après purification du gradient de densité. La morphologie et la viabilité cellulaires excluent les altérations des neutrophiles purifiés et confirment que les changements observés sont spécifiques en réponse aux stimuli ajoutés par rapport aux neutrophiles au repos dans les mêmes conditions expérimentales sans stimulation (Figure 2). Cela corrobore l’efficacité du protocole en tant que méthode aseptique et reproductible pour l’isolement des neutrophiles sans altérer la viabilité et la morphologie cellulaires. Cette contribution des éosinophiles, que l’on trouve couramment dans le sang avec des comptes inférieurs à 2%, a été exclue et n’a pas modifié la signification statistique des résultats, car les éosinophiles n’ont pas été observés dans l’échantillon sur la coloration de Wright lors de l’analyse de divers champs (Figure 2A). Cela pourrait être confirmé par cytométrie en flux utilisant le marqueur CD16, qui n’est pas présent dans les éosinophiles mais est présent en concentrations élevées dans les neutrophiles.

Dans l’étude des TNE, il existe des consensus et des divergences18; Diverses études ont rapporté des résultats contradictoires en réponse aux mêmes stimuli, ce qui pourrait être dû à des différences dans les protocoles d’isolement des neutrophiles, au temps d’expérimentation prolongé qui active spontanément les neutrophiles, aux tampons et aux différentes concentrations du même stimulus utilisé. Par conséquent, il est essentiel d’homogénéiser les protocoles avec des détails explicites afin que les protocoles puissent être reproduits de manière cohérente pour permettre des comparaisons. Les méthodes les plus couramment utilisées sont l’immunocytochimie et l’immunohistochimie, qui permettent d’identifier des structures contenant de l’ADN extracellulaire colocalisant avec des protéines dérivées de granules18 qui comprennent généralement des composants ayant une activité bactéricide capables de détruire les facteurs de virulence8, tels que NE, MPO, CG et LL37. De plus, des études récentes pour la surveillance de la formation de TNE recommandent d’analyser ce processus à l’aide de méthodes de cellules vivantes en temps réel telles que la microscopie intravitale 1,18. Peu d’études comme celle-ci unifient les conditions expérimentales pour comparer la composition des TNE sous différents stimuli (bactéries, champignons et produits chimiques)1,9, en utilisant la technique de la microscopie à fluorescence pour visualiser la dispersion de l’ADN-DAPI, LL37-Alexa 594, et sa colocalisation avec les microorganismes-CFSE. De même, le traitement par DNase ne libère que les protéines associées à la structure de l’ADN des TNE, de sorte que la technique spectrophotométrique assure la quantification de l’activité enzymatique de MPO, NE et CG, excluant qu’elles proviennent de la dégranulation.

La morphologie des NET peut être définie comme suicidaire ou vitale, avec la possibilité de les différencier en fonction de la dispersion adoptée par l’ADN dans l’espace extracellulaire. La voie suicidaire est caractérisée par une structure en forme de nuage, tandis que la voie vitale est une forme filamenteuse15,19,20. Sur cette base, la figure 3 indique que la PMA et P. aeruginosa représentent un type de TNE suicidaire. Ces résultats valident cette technique en reproduisant dans nos conditions ce qui a été décrit par Brinckman et al. avec PMA, le composé le plus couramment utilisé pour induire des TNE en déclenchant l’activation de c-Raf, MEK, Akt, ERK et protéine kinase C (PKC), qui à leur tour activent la NADPH oxydase11 et provoquent une forte augmentation des ROS intracellulaires. De plus, les résultats excluent la possibilité que des artefacts externes, des temps d’incubation ou la brève agitation mécanique utilisée dans cette étude aient causé la libération spontanée in vitro de TNE avec un aspect nuageux comme certains auteurs l’ont mentionné17, puisque les neutrophiles au repos sans stimulation après 4 h ont montré un noyau multilobé avec une chromatine intacte (Figure 3A 1-3).

De même, les TNE induites avec HOCl, C. albicans, et S. aureus présentait une morphologie filamenteuse, correspondant à la morphologie vitale des NET (Figure 3A 7-17). Cette voie est caractérisée par des neutrophiles répondant de manière unique et indépendante de l’oxydant sans lyse cellulaire ni même rupture de la membrane plasmique, seul bourgeonnement des vésicules avec l’ADN nucléaire15. Ce résultat valide à nouveau le potentiel de cette technique pour discerner les deux apparences morphologiques de la production de TNE comme suicidaires ou vitales. En ce qui concerne la composition de l’EVN, les résultats obtenus à l’aide de cette méthodologie ont montré une signification statistique dans les exigences différentielles de LL37 pour la stimulation de la PMA et de P. aeruginosa (Figure 3C). L’activité NE (seulement pour S. aureus) et l’activité MPO étaient plus élevées dans les microorganismes que dans le groupe chimique (figure 4). Cette information prouve encore une fois la sélectivité des neutrophiles dans la réponse à chaque stimulus, comme l’ont rapporté Kenny et al.5 en comparant différents stimuli dans la production de TNE in vitro. Il a été décrit que, dans certains cas, la production de TNE nécessite des ROS ou a des exigences différentielles d’enzymes spécifiques telles que PAD4, tandis que dans d’autres, la présence de ces molécules n’est pas pertinente pour leur production5.

Une limite de la technique de quantification de l’ADN dans l’espace extracellulaire décrite dans cette étude est que l’ADN peut également provenir d’autres formes de mort cellulaire avec un morphotype nécrotique, et il est impossible pour cette technique de les distinguer. Cependant, il a été rapporté que les TNE peuvent être différenciées de ce processus en confirmant la présence de protéines granulaires18. De même, l’origine de l’ADN est inconnue, ce qui peut être confirmé en amplifiant les gènes spécifiques aux organites, mitochondriaux ou nucléaires par PCR19. Une autre faiblesse est de distinguer les TNE d’autres structures fibreuses telles que la fibrine; Un tel discernement nécessiterait des techniques sophistiquées telles que la microscopie électronique à balayage à haute résolution20. En conclusion, les techniques présentées permettent de caractériser in vitro (dans des conditions similaires) la composition et la morphologie des TNE induites avec différents stimuli, montrant la sélectivité des neutrophiles dans la libération de certains de leurs composants (ADN, LL37, NE, CG, MPO) à un stimulus spécifique. Ces techniques peuvent être adaptées pour évaluer l’effet des facteurs solubles exogènes ou du contact cellulaire sur ces caractéristiques NET.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention de science fondamentale (#285480) de CONACyT et par le Département de recherche en immunologie clinique de la Faculté des sciences biochimiques de l’Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L et W.J.R.R. ont des bourses doctorales de CONACyT numéros #799779, #660793 et #827788, respectivement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well plate for cell culture Corning 3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Pharmingen 51-668981E
96 Well plate for cell culture Costar 3596 Flat bottom
Agitator CRM Globe CRM-OS1
Antibody LL37 Santa Cruz Biotechnology sc-166770
Blood collection tubes BD VACUTAINER 368171 K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Sigma-Aldrich 21878
Centrifuge Hettich 1406-01
Coverslip Madesa M03-CUB-22X22 22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) Caisson 1201022
Falcon tubes 50 mL CORNING 430829
Flow Cytometry Tubes Miltenyi Biotec 5 mL - Without caps
FlowJo Software BD Biosciences Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope DM 2000 LEICA
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057
Incubator NUAIRE UN-4750
MACSQuant Analyzer Miltenyi Biotec Flow cytometer
Microplate reader photometer Clarkson Laboratory - CL
Microtubes 1.5 mL Zhejiang Runlab Tech 35200N wire snap
Minitab Software Minitab Statistical analysis
Needles BD VACUTAINER 301746 Diameter 1.34 mm
Optical microscope VELAB VE-B50
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x) Caisson PBL07-500ML
Pyrex culture tubes CORNING CLS982025 N°9820
RPMI 1640 1x Corning 10-104-CV contains Glutagro
Slides Madesa PDI257550 22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4% SIGMA T8154-100ML

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References

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Immunologie et infection numéro 189
Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques
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Almaraz-Arreortua, A., Sosa-Luis, S. … More

Almaraz-Arreortua, A., Sosa-Luis, S. A., Ríos-Ríos, W. d. J., Romero-Tlalolini, M. d. l. Á., Aguilar-Ruiz, S. R., Baltiérrez-Hoyos, R., Torres Aguilar, H. Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli. J. Vis. Exp. (189), e64522, doi:10.3791/64522 (2022).

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