Summary
Presentert her er en protokoll for induksjon og analyse av in vitro nøytrofile ekstracellulære feller (NETs). Kvantifisering av DNA, cathelicidin (LL37) og enzymaktivitet ga data som viser variasjonen i sammensetningen og morfologien til NETs indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli under lignende kontrollerte forhold.
Abstract
Neutrofiler fungerer som den første linjen av cellulært forsvar i en medfødt immunrespons ved å benytte ulike mekanismer, for eksempel dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs). Denne studien analyserer morfologiske og sammensetningsendringer i NETs indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli ved hjelp av standardiserte in vitro-metoder for NET-induksjon og karakterisering med humane celler. Prosedyrene beskrevet her tillater analyse av NET-morfologi (lytisk eller ikke-lytisk) og sammensetning (DNA-proteinstrukturer og enzymatisk aktivitet), og effekten av løselige faktorer eller cellulær kontakt på slike egenskaper. I tillegg kan teknikkene beskrevet her modifiseres for å evaluere effekten av eksogene løselige faktorer eller cellulær kontakt på NET-sammensetning.
De anvendte teknikkene inkluderer rensing av polymorfonukleære celler fra humant perifert blod ved bruk av en dobbel tetthetsgradient (1.079-1.098 g / ml), som garanterer optimal renhet og levedyktighet (≥ 95%) som demonstrert av Wrights farging, trypanblå eksklusjon og flowcytometri, inkludert FSC versus SSC-analyse og 7AAD-farging. NET-dannelse induseres med mikrobielle (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Candida albicans) og kjemiske (phorbol myristateacetat, HOCl) stimuli, og NETs er preget av DNA-DAPI-farging, immunostaining for det antimikrobielle peptidet cathelicidin (LL37) og kvantifisering av enzymatisk aktivitet (nøytrofil elastase, cathepsin G og myeloperoksidase). Bildene er anskaffet gjennom fluorescensmikroskopi og analysert med ImageJ.
Introduction
Neutrofiler er de mest tallrike leukocytter i blodet, og spiller en viktig rolle under klaring av patogene midler ved flere mekanismer, inkludert frigjøring av store kromatinstrukturer sammensatt av DNA og flere kjernefysiske, cytoplasmatiske og granulære antibakterielle proteiner 1,2. Den direkte forløperen som beskriver denne antimikrobielle rollen til nøytrofiler ble laget av Takei et al.3 i 1996. Disse forfatterne rapporterte en ny form for død forskjellig fra apoptose og nekroptose hos nøytrofiler, viste morfologiske endringer som viste nukleær ruptur, etterfulgt av utslipp ut av nukleoplasma inn i cytoplasma, og en økning i membranpermeabilitet fra 3 timers inkubasjon med phorbol myristateacetat (PMA) 2,3. Det var imidlertid ikke før 2004 at begrepet "nøytrofile ekstracellulære feller (NETs)" ble brukt4.
NET-dannelse har blitt observert under forskjellige forhold, for eksempel bakteriell, sopp5, viral6 og parasittiske infeksjoner, for å nøytralisere, drepe og forhindre mikrobiell spredning7. Andre studier viser at det også kan forekomme i ikke-patogene forhold ved sterile stimuli, som cytokiner, mononatrium urinsyre eller kolesterolkrystaller, autoantistoffer, immunkomplekser og aktiverte blodplater. Lipopolysakkarid (LPS), interleukin-8 (IL-8) og PMA var blant de første in vitro-stimuliene beskrevet som NET-induktorer, og in vivo NET-involvering i patogene prosesser ble demonstrert i to modeller av akutt betennelse: eksperimentell dysenteri og spontan human blindtarmbetennelse4. DNA er en viktig NET-komponent. Dens passende struktur og sammensetning er nødvendig for sekvestrering og drap av mikroorganismer ved å levere en høy lokal konsentrasjon av antimikrobielle molekyler mot de fangede mikrober, som demonstrert ved en kort deoksyribonuklease (DNase) behandling som desintegrerer NETs og deres mikrobicidale egenskaper4. Foruten DNA består NETs av festede proteiner som histoner, nøytrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3, laktoferrin, gelatinase, myeloperoksidase (MPO) og antimikrobielle peptider (AMPs) som det kationiske proinflammatoriske peptidet cathelicidin LL-37 blant andre 8,9. Slike aggregater kan danne større tråder med diametre opp til 50 nm. Disse faktorene kan forstyrre de mikrobielle virulensfaktorene eller integriteten til patogencellemembranen; I tillegg kan AMP-ene stabilisere NET-avledet DNA mot nedbrytning av bakterielle nukleaser10.
De spesifikke mekanismene som regulerer NET-dannelse er ennå ikke helt avklart. Den best karakteriserte veien som fører til NET-frigjøring er gjennom ERK-signalering, noe som fører til NADPH-oksidaseaktivering og reaktiv oksygenart (ROS) produksjon, samt økt intracellulært kalsium som utløser aktivering av MPO-banen. Dette forvandler igjen hydrogenperoksid til hypoklorsyre, og aktiverer NE ved oksidasjon11,12. NE er ansvarlig for å nedbryte aktinfilamentene i cytoskelettet for å blokkere fagocytose og translokere dem til kjernen for behandling ved proteolytisk spaltning og deaminering av PAD4 som driver desensibiliseringen av kromatinfibre, som assosieres med granulat- og cytoplasmatiske proteiner, og frigjøres deretter ekstracellulært7. Disse proteasene inkluderer de som frigjøres fra azurosomkomplekset av azurofile granulater og andre proteaser som cathepsin G13.
Avhengig av de morfologiske endringene i nøytrofiler, er NET klassifisert i to typer: suicidal eller lytisk NET-formasjon som fører til celledød4, og vital eller ikke-lytisk NET-formasjon produsert av levedyktige celler mediert av en vesikulær frigjøring av nukleært eller mitokondrielt DNA, med en rest av en anukleert cytoplast med fagocytisk evne14,15. Vanligvis presenterer NETs sammensatt av mitokondrielt DNA en langstrakt fiber14 morfologi, mens de som er strukturert av nukleært DNA har et skylignende utseende3. Det er imidlertid ikke kjent hvordan nøytrofilen velger sin DNA-opprinnelse. I motsetning til tidligere studier som beskrev de kanoniske banene til NETs som krever flere timer, aktiveres den vitale banen raskt på bare 5-60 minutter15.
Til tross for disse fremskrittene varierer NET-sammensetningen avhengig av stimulansen; For eksempel induserer forskjellige mucoid og ikke-mucoid stammer av P. aeruginosa dannelsen av NETs som inneholder 33 vanlige proteiner og opptil 50 variable proteiner7. Dermed er det nødvendig å homogenisere teknikker som tillater generering av objektive konklusjoner i forskningsgrupper. Dette papiret beskriver en protokoll med ulike teknikker som tillater sammenligning og evaluering av sammensetningen, strukturen og morfologien til NETs indusert med forskjellige mikroorganismer: Staphylococcus aureus (gram-positiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gram-negativ bakterie) og Candida albicans (sopp), samt kjemiske stimuli (PMA, HOCl) i humane nøytrofiler fra friske individer. De representative resultatene viser heterogeniteten til NETs avhengig av deres induserende stimulus under sammenlignbare in vitro-forhold, preget av DNA-DAPI-farging, immunostaining for LL37 og kvantifisering av enzymatisk aktivitet (NE, CG og MPO).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøvene ble innhentet som donasjoner fra klinisk friske deltakere etter informert samtykke. Alle eksperimenter ble utført med tillatelse fra Human Research Ethics Committee ved Fakultet for biokjemiske vitenskaper, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' i Oaxaca.
MERK: Inklusjonskriteriene i studien var utydelig kjønn og alder, og klinisk sunne i henhold til deltakernes svar på et spørreskjema før blodprøvetaking. En hematologisk analyse ble utført for å bestemme celletallet og utelukke infeksjoner eller anemi, samt C-reaktivt proteintest for å utelukke betennelse hos donor.
1. Perifer blodinnsamling og oppnåelse av erytrocyt- og leukocyttpakken
- Samle 10 ml perifert blod ved venepunksjon i rør med 1,8 mg / ml K2 · EDTA som antikoagulant (se materialtabell) fra klinisk friske personer etter å ha innhentet informert samtykke. Deretter utfører du standard blodbiometri og C-reaktiv proteintest for å utelukke infeksjon eller betennelse, og sikrer kvaliteten på prøven.
- Sentrifuger den perifere blodprøven ved 82 x g i 15 minutter for å fjerne det blodplaterike plasmaet, etterfulgt av en andre sentrifugering ved 630 x g i 5 minutter. Kast gjenværende plasma for å oppnå erytrocyt- og leukocyttpakken.
- Fortynn den i forholdet 1:1 (v/v) med 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS).
2. Polymorfonukleær nøytrofil (PMN) rensing ved bruk av en dobbel tetthetsgradient
MERK: Utfør nøytrofil rensing umiddelbart etter at blodet er samlet, fordi de har en begrenset in vitro levetid på ca. 8 timer.
- Legg følgende i et sterilt 10 ml glassrør (se materialtabell) i rekkefølge: 1 ml oppløsning med tetthet på 1,098 g/ml, 1 ml oppløsning med tetthet på 1,079 g/ml (se materialtabell), og deretter 4 ml av den fortynnede erytrocyt- og leukocyttpakken. Hell over veggene uten å bryte overflatespenningen mellom lagene for å forhindre at de blandes.
- Sentrifuge ved 320 x g i 20 minutter ved 4 °C, unngå akselerasjon/retardasjon slik at sentrifugens høye krefter ikke forstyrrer gradienten.
- Aspirer fasen som tilsvarer granulocytter (figur 1A) ved pipettering, og overfør til et annet sterilt 10 ml glassrør. Vask med 4 ml 1x DPBS ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten og behandle cellene med osmotisk sjokk for å fjerne de resterende erytrocyttene. Tilsett 4 ml 0,2 % saltoppløsning i 2 minutter ved 4 °C, og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten. Tilsett deretter 4 ml isotonisk oppløsning (0,65 % saltvann) i 5 minutter ved 4 °C for å gjenopprette membranintegritet, og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: 0,2% saltoppløsning er et hypotonisk medium, med en lavere løsningsmiddelkonsentrasjon i forhold til RBC intracellulært medium. Kontakt med hypotoniskmedium tillater vann å diffundere inn i RBC, noe som fører til hevelse og hemolyse. Denne fjerningen av RBC fra supernatanten ble bekreftet ved mikroskopisk observasjon. - Fjern supernatanten. Resuspend cellene i 4 ml 1x DPBS for å fjerne cellulært rusk, og sentrifuger deretter ved 300 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Til slutt resuspenderer du cellepelleten i 2 ml kald Hanks balanserte saltløsning (HBSS) buffer.
3. Nøytrofil morfologi og levedyktighet (figur 1B)
- Trypan blå eksklusjonstest
- Fortynn 5 μL av cellesuspensjonen i 20 μL på 0,4% trypanblå (1:5-forhold). Tell cellene i et Neubauer-kammer og bestem cellens levedyktighet ved hjelp av en eksklusjonstest. Tenk på cellene som opprettholder integriteten til membranen uten å permeabilisere fargestoffet som levedyktig.
- Monter 5 μL av cellesuspensjonen på et lysbilde; tørr og flekk med Wrights flekk i 15 s. Fest prøven umiddelbart med fosfatbuffer pH 6,4 i 30 s. Vask med tilstrekkelig destillert vann og observer morfologien under et optisk mikroskop (100x).
- 7AAD-farging og flowcytometrianalyse
- Tilsett 1 x 105 celler i flowcytometrirør, og beis med 1 μL 7AAD i 100 μL FACS-buffer (1x DPBS, 0,1 % natriumazid og 10 % autologt dekomplementert plasma) i 15 minutter ved 4 °C i mørket.
- Vask med 500 μL FACS-buffer ved 300 x g i 10 minutter. Fest cellene med 500 μL av 2% paraformaldehyd, og oppbevar ved 4 ° C til analysen i flowcytometeret.
- For en dødcellekontroll, fest 1 x 105 celler med 200 μL 4% paraformaldehyd i 30 minutter, og vask med 500 μL 1x PBS ved 300 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Trekk av supernatanten og kast. Tilsett deretter 200 μL 0,1% Triton X-100 i 1 time ved 4 °C. Vask med 500 μL 1x PBS og flekk med 7AAD som i trinn 3.2.1.
- Ved hjelp av et flowcytometer (se materialtabell), utfør FSC versus SSC-analyse for å analysere cellerenhet og SSC versus 7AAD-farging for å analysere cellens levedyktighet. Les 3 x 104 hendelser i 100 μL opptaksvolum ved mediumstrøm (1000 celler/s) i polymorfonukleære omgivelser (FSC, 400-490 og SSC, 300-320).
- Analyser de fangede dataene i flowcytometerprogramvaren (se materialtabell), og bestem prosentandelen renhet og positive celler for 7AAD i den polymorfonukleære populasjonen, presentert gjennom prikkplott og histogrammer.
4. CFSE-farging av mikroorganismer
- Tilsett 1 x 108 bakterier eller 1 x 106 sopp pseudohyphae i 1,5 ml mikrorør, og flekk med 200 μL 5 μM karboksyfluoresceinsein succinimidyl ester (CFSE) oppløst i 1x PBS. Bland i noen sekunder, og inkuber ved 37 °C i 10 minutter i mørket.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 500 μL dekomplementert plasma og sentrifuge ved 620 x g i 10 minutter for pseudohyphae eller ved 1,800 x g i 10 minutter for bakterier.
- Kast supernatantene og vask pellets med 1 ml 1x PBS med sentrifugering som i trinn 4.2. Til slutt, resuspend mikroorganismer i 250 μL av 1x PBS.
- Forbered 50 μL aliquots i mikrorør på 1,5 ml med 2 x 107 bakterier (MOI: 100) eller 2 x 105 pseudohyphae (MOI: 1) for NET-induksjon.
5. NET induksjon
- Plasser 10 mm x 10 mm sterile glassdeksler i en 24-brønns plate og dekk med 10 μL 0,001% poly-L-lysin i 1 time ved romtemperatur. Vask to ganger med 100 μL 1x PBS, lufttørk og berør med UV-lys i 15 minutter.
- Erstatt HBSS-oppløsningen av nøytrofilsuspensjonen i trinn 2.5 med RPMI 1640-medium supplert med 10 % autologt plasma. Til 24-brønnsplaten (trinn 5.1), tilsett 350 μL av denne cellesuspensjonen, for en endelig konsentrasjon på 2 x 105 nøytrofiler / brønn.
- La cellene feste seg til bunnen av brønnene ved å inkubere i 20 minutter ved 37 °C med 5 % CO2.
- Legg til stimuli for å indusere NET-dannelse i 50 μL: mikrobielle stimuli-gram-positive bakterien S. aureus (ATCC 25923), gram-negativ bakterie P. aeruginosa (ATCC 10145) ved MOI 100, og pseudohyphae av C. albicans (ATCC 10231) ved MOI: 1; biokjemiske stimuli-PMA (200 nM) og HOCl (4,5 mM), og kontroll med stimulus fraværende (50 μL HBSS).
- Få et endelig volum på 400 μL per brønn. Bland på en tallerken shaker ved 140 o / min i 30 s, og inkuber i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
6. Visualisering av NETs ved fluorescensmikroskopi
- DNA og LL37 immunostaining
- Etter NET-induksjon, fjern supernatantene fra brønnene ved pipettering forsiktig, og fest cellene med 300 μL på 4% paraformaldehyd i 30 minutter.
- Vask cellene med 200 μL 1x PBS uten sentrifugering, og tilsett 200 μL blokkeringsbuffer (10% dekomplementert plasma i 1x PBS) i 30 minutter.
- For LL-37 flekk, permeabilize cellene med 200 μL av 0,2% Triton X-100 i 1x PBS i 10 minutter for å tillate antistoffet å komme inn i cellene. Vask 2x forsiktig med 1x PBS for å fjerne overflødig vaskemiddel.
- Monter dekslene på glassglass (fire omslagsslipp på hvert lysbilde). DNA flekker cellene med 2 μL DAPI (se materialtabell), forsegler dekslene og lagrer ved -20 ° C til analysen ved konfokal fluorescensmikroskopi.
- Innsamling og analyse av fluorescerende bilder
- Ta NET-bilder for å kvantifisere komponentene, og bruk de tilsvarende filtrene i det konfokale fluorescensmikroskopet (se Materialtabell) for å skaffe bildene med datamaskinens programvare.
MERK: Tenk på at DNA er farget med DAPI (blå farge), som viser eksitasjon ved 360 nm og utslipp ved 460 nm. Mikroorganismene er farget med CFSE (grønn farge), som har en eksitering på 492 nm og et utslipp på 521 nm. LL37-peptidet er merket med anti-LL37 Alexa Fluor 594 antistoff (rød farge), som har en eksitering på 594 nm og et utslipp på 614 nm. - Kalibrer mikroskopet. Plasser lysbildet og fokus ved hjelp av differensialinterferenskontrast (DIC) med normalt lys på. Velg Live for å projisere bildet på skjermen.
- Slå av lyset og velg den tilsvarende fluorokromkanalen. Velg for eksempel filter 365 nm/blått for DAPI, 43 HE DsRed for Alexa 594 eller 38 HE GFP for CFSE.
- Juster innstillingene med isotypekontrollantistoffet for LL37 og celler uten farge for DAPI og CFSE. Still inn samme eksponeringstid, spenning, kontrast og linseinnstillinger for å ta alle bildene under de samme forholdene.
MERK: I denne studien ble eksponeringstiden, spenningen og kontrasten satt til henholdsvis 1,0 ms, 4,0 V og 0,0 med et 40x mål. Disse verdiene kan justeres for å legge til rette for best mulig bildeopptak for prøvene. - Velg Fest for å ta bildet. Lagre fem bilder (fire ekstremer og midten) per brønn, og av colocalization (flette) av DNA / LL37 / CFSE.
- Definer de tre bildepunktklassene som bakgrunn med de uavhengige bildene av hver farge, og analyser verdien for Mean Gray Signal per område med Image J-programvaren.
- Ta NET-bilder for å kvantifisere komponentene, og bruk de tilsvarende filtrene i det konfokale fluorescensmikroskopet (se Materialtabell) for å skaffe bildene med datamaskinens programvare.
7. Kvantifisering av enzymatisk aktivitet
- I en 96-brønns plate, tilsett 90 μL cellesuspensjon i HBSS som inneholder 1 x 10 5 nøytrofiler for NET-induksjon, og inkuber i 20 minutter ved 37 ° C og5 % CO2.
- Tilsett umiddelbart 10 μL av de tilsvarende stimuliene (konsentrasjon som i trinn 5.4) og inkuber i 4 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
- Kast supernatantene og vask cellene med 100 μL HBSS. Behandle med 1 U / ml DNase i 10 minutter ved 37 ° C for å favorisere frigjøring av DNA-proteinstrukturer, og sentrifuge ved 1,800 x g i 10 minutter.
- Gjenopprett supernatantene og evaluer enzymaktiviteten i supernatanten ved hjelp av kolorimetriske reaksjoner som tidligere beskrevet av White et al.17.
- Bestem den maksimale enzymaktiviteten til NE, CG og MPO i nøytrofiler under de samme eksperimentelle forholdene uten å legge til noen stimuli for NET-induksjon. Frys deretter celleprøven ved -70 ° C og tine ved 37 ° C i et vannbad, og generere et temperatursjokk for å favorisere frigjøring av intracellproteiner ved cellelyse. Sentrifuge på 1,800 x g i 10 minutter og gjenopprette supernatants.
- Tilsett 50 μL av supernatanten til hver brønn i 96-brønnsplater, og tilsett deretter 50 μL av hvert substrat som angitt i trinn 7.7.
- Tilsett 0,5 M N-metoksysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitro anilin som substrat for NE, og 1 mM N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide for CG. Inkuber i 3 timer ved romtemperatur. For MPO, tilsett 1,6 mM av 3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Etter inkubasjon, tilsett 50 μL av stoppoppløsningen (0,5 M H2SO4) for MPO og mål absorbansen ved 405 nm for NE og CG og 450 nm for MPO, ved hjelp av et spektrofotometer.
- Sammenlign verdiene oppnådd med de tilsvarende kalibreringskurvene og vis resultatene av hver tilstand i forhold til maksimal enzymaktivitet (100%).
8. Statistisk analyse
- Analyser måledataene i tre eksemplarer for hvert uavhengige eksperiment (n = 10) og utfør en ANOVA for statistisk analyse ved å sammenligne grupper med et 95 % konfidensnivå.
Figur 1: PMN-rensing og NET-induksjonsprotokoll. (A) Plasma ble fjernet fra perifert blod for å oppnå erytrocyt- og leukocyttpakken og fortynnet 1:1 (v/v) med 1x DPBS. Deretter ble 4 ml av fortynningen tilsatt langs veggen til dobbeltdensitetsgradientrøret, og sentrifugert ved 320 x g i 20 minutter ved 4 ° C, oppnå separasjon av forskjellige cellelag og gjenopprette det som tilsvarer PMN. (B) De rensede cellene ble talt, og deres morfologi ble analysert av Wrights farging. Levedyktighet ble bestemt ved trypanblå eksklusjon og 7AAD-farging ved hjelp av flowcytometri. Når optimal nøytrofil renhet og levedyktighet ble verifisert, ble NET-dannelse indusert ved å tilsette mikrober (S. aureus, P. aeruginosa og C. albicans) eller kjemikalier (PMA, HOCl) i 24-brønnsplater for analyse ved fluorescensmikroskopi med DAPI-DNA, anti-LL37 Alexa Fluor 594 og mikroorganisme-CFSE-farging. For enzymkvantifisering ble NETs indusert i 96-brønnsplater i 3 timer og behandlet med DNase, etterfulgt av tilsetning av substrater for hvert enzym: NE, CG og MPO; fargeendringer ble kvantifisert ved spektrofotometri. DPBS = Dulbeccos fosfatbufrede saltvann; PBMC = Perifert blod mononukleære celler; PMN = Polymorfonukleære nøytrofiler; NE = Neutrofil elastase; CG = Cathepsin G; MPO = myeloperoksidase; PMA = Phorbol myristatacetat; HOCl = Hypoklorsyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renhet og levedyktighet av nøytrofiler
De dynamiske cellulære fasene visualiseres i røret fra den doble tetthetsgradientrensingen. Innenfor disse lagene er laget som tilsvarer granulocytter over tetthetslaget på 1,079 g/ml, skilt fra fasene av perifere mononukleocytter (PBMC) og erytrocytter (figur 1A). Morfologien til de rensede cellene ble verifisert med Wrights farging ved å observere celler med segmenterte kjerner forbundet med trådlignende filamenter tilsvarende modne nøytrofiler (figur 2A). På grunn av den reduserte halveringstiden til nøytrofiler, er levedyktighet et avgjørende punkt for følgende NET-induksjonseksperimenter. Derfor ble cellens levedyktighet verifisert med trypanblå eksklusjonsfarging, og evaluerte integriteten til plasmamembranen når fargestoffet ikke trenger inn (figur 2B). I tillegg interkalerer 7AAD i cytosin- og guaninbaser av DNA og avgir fluorescens, noe som letter utelukkelsen av døde celler (figur 2C, D). Disse prosedyrene resulterte i en cellerenhet på 98,9% ± 0,06% og en celle levedyktighet på 95,5% ± 4,2% i 10 utførte eksperimenter.
Figur 2: Morfologi og levedyktighet for nyrensede nøytrofiler. (A) Etter gradientrensing ble den typiske nøytrofile morfologien bekreftet av Wrights farging (100x). Cellene viste en multilobed kjerne karakteristisk for modne nøytrofiler i blodet og (B) optimal levedyktighet ved trypanblå eksklusjon uten membranforstyrrelser. (C) Analyse av SSC versus FSC ved flowcytometri bekrefter en populasjon tilsvarende PMN, og oppnår cellerenhet på 98,9 % ± 0,06 % (n = 10). (D) PMN-punktplott presenteres (ufargede celler, venstre paneler vs. 7AAD-fargede celle høyre paneler) med sine respektive histogrammer (ufarget-blå vs. farget rød), noe som indikerer en høy celle levedyktighet på 95,5% ± 4,2% (n = 10) i de nylig isolerte nøytrofile sammenlignet kontrollcellene permeabilisert med 0,1% Triton (lavere paneler) for å validere resultatene. 7AAD-fargestoffet binder seg til DNA og utelukkes fra levedyktige celler, slik at vaskemiddelforbehandling forårsaket endringer i cellemembranen og tillot oppføring av 7AAD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Morfologi og sammensetning av NETs indusert av kjemiske og mikrobiologiske stimuli
Figur 3 viser representative bilder som påviser in vitro NET-induksjon ved virkningen av kjemiske (PMA, HOCl) eller mikrobielle (C. albicans, S. aureus og P. aeruginosa) midler etter 4 timers inkubasjon (figur 3A). NET-sammensetningen ble bestemt ved DNA/LL37-farging, og bildene ble tatt for kvantifisering av gjennomsnittlige gråverdier i området med ImageJ (figur 3B,C). Suicidal (lytisk) eller vital (ikke-lytisk) NET-dannelse ble beskrevet basert på deres morfologi. Til sammenligning viste ustimulerte kontrollnøytrofiler dyrket i HBSS i 4 timer LL37 lokalisert i cytoplasma med kondensert multilobed-segmentert kromatin (figur 3A 1-3), karakteristisk for disse hvilende cellene.
PMA er en potent ROS-induktor gjennom PKC-aktivering, og fungerer dermed som en positiv kontroll for å indusere suicidal (lytisk) NET-dannelse. Bildene av PMA-induserte NET viser nettverk med rikelig kromatindekondensasjon som danner skylignende strukturer assosiert med selvmordsveien (figur 3A 4-6), der nøytrofilen dør på grunn av at rikelig DNA slippes ut i det ekstracellulære rommet som dekker store deler av det analyserte området. Innenfor disse uklare områdene som dekket DNA, ble LL37 colocalized, både intra- og ekstracellulært i høye konsentrasjoner (figur 3A 6, B-C). I motsetning til dette er HOCl en fysiologisk, biokjemisk forbindelse generert som et produkt av den oksidative aktiviteten til MPO. NETs dannet med HOCl viste mindre DNA-dispersjon i det ekstracellulære rommet med filamentøs morfologi som ser ut til å være avledet fra cellemembranen (figur 3A 7-9). Slike morfologiske egenskaper tilsvarer den vitale NET-formasjonen, og de viste ikke colocalization av LL37 med DNA-filamenter; LL37 forble lokalisert på atomnivå (Figur 3A 7-9,C). Disse resultatene indikerer at disse kjemiske midlene under lignende kontrollerte forhold viser divergenser i sammensetningen av de frigjorte NETene, både DNA og LL37.
Analyse av NET indusert av mikroorganismer viste at pseudohyphae av C. albicans induserte nettverk med lave konsentrasjoner av DNA frigjort i det ekstracellulære rommet med filamentøse strukturer, og fremhevet tilstedeværelsen av anukleerte cytoplastlignende strukturer som er karakteristiske for den vitale NET-formasjonen (figur 3A 10-13), som ikke observeres med HOCl og S. aureus som aktiverer den samme banen. I mellomtiden colokaliserer LL37 med DNA på mobilnivå, og lave konsentrasjoner er assosiert med pseudohyfer, og avgrenser forplantningen. Begge komponentene viste ikke statistisk signifikante forskjeller fra kontrollen med HBSS (figur 3B,C). S. aureus er en av de vanligste patogene bakteriene over hele verden, med evnen til å indusere NETs som viser en vital-lignende morfologi som tidligere rapportert i flere studier15,19. Rikelig DNA ble frigjort i statistisk signifikante konsentrasjoner som filamentøse strukturer som colocalized med LL37 og dannet bakterieklynger, noe som indikerer at stillaset kan avgrense og favorisere eliminering av bakteriene (figur 3A 14-17). På den annen side induserte den gramnegative bakterien P. aeruginosa frigjøring av store konsentrasjoner av DNA med en uklar morfologi assosiert med selvmord NET-formasjonen, og LL37 signifikant colocalized med DNA og bakterier (Figur 3A 18-21, B, C).
Visualisering av NETs ved fluorescensmikroskopi viste at NETs indusert av HOCl, S. aureus og C. albicans presenterer vital-lignende morfologi med filamentøse strukturer. Imidlertid førte bare S. aureus til frigjøring av statistisk signifikante mengder DNA. Morfologien til de to andre stimuli (PMA og P. aeruginosa)-induserte NETs tilsvarer typen selvmord NET-dannelse, med statistisk signifikante mengder DNA og LL37 sammenlignet med ustimulerte nøytrofiler. Det var rikelig med skylignende DNA-strukturer, mer signifikante i NETs indusert av P. aeruginosa enn de som ble indusert av PMA.
Figur 3: DNA og LL37 sammensetning og morfologi av NETs indusert av kjemiske og mikrobielle stimuli. (A) Humane blodavledede nøytrofiler ble stimulert med PMA (4-6), HOCl (7-9), pseudohyphae av C. albicans (10-13), S. aureus (14-17), P. aeruginosa (18-21), og en ustimulert kontroll (1-3) i HBSS, i 4 timer. NETs ble visualisert ved hjelp av DNA-DAPI (blå), anti-LL37 Alexa Fluor 594 (rød), eller isotypekontroll, og mikroorganismer ble forhåndsfarget med 5 μM CFSE (grønn). Bilder viser representative fluorescensmikroskopiresultater av 10 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (BC) Grafer viser gjennomsnitt ± SD av gjennomsnittlig grå verdi av signalet per område for de angitte fargene på fem bilder (fire ekstremer og midten) per brønn og analysert med ImageJ-programvaren for (B) DAPI-DNA og (C) Alexa Fluor 594-LL37-farging. ANOVA ble utført for å sammenligne grupper av eksperimentelle tilstander med et konfidensnivå på 95 %. * = p ≤ 0,05. HBSS = Hanks balanserte saltløsning; PMA = phorbol myristatacetat; HOCl = hypoklorsyre. Tilpasset fra Sosa-Luis et al.16 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Enzymatisk aktivitet av NE, CG og MPO i NETs indusert av kjemiske og mikrobiologiske stimuli
Et annet mål med denne studien var å kvantifisere aktiviteten til enzymer beskrevet som sentrale komponenter i NETs, som NE, CG og MPO, som er rikelig med antimikrobiell aktivitet avledet fra azurofile granulater. Derfor ble NETs indusert og cellenettverkene ble behandlet med DNase, favoriserer frigjøring av strukturassosierte proteiner, og enzymaktivitet ble bestemt ved hjelp av kolorimetriske analyser. Analysen viste gjenværende aktivitet for NE (2,3% ± 0,6%), CG (6,2% ± 2,7%) og MPO (21,4% ± 2,0%) assosiert med DNA-strukturer avledet fra alle NETs, sammenlignet med maksimal aktivitet oppnådd fra lysed hvilende nøytrofiler tatt som 100% (figur 4). NETs indusert av de fleste stimuli viste lave enzymaktivitetsverdier for NE og CG, unntatt S. aureus for NE og PMA for CG, som viste statistisk signifikans. På den annen side økte MPO-aktiviteten i alle stimuli uten noen statistisk signifikant forskjell mellom dem, men var signifikant mellom gruppene av kjemiske stimuli versus mikroorganismer.
Disse resultatene demonstrerer gjennomførbarheten av den presenterte protokollen, og gir informasjon om heterogeniteten i NET-sammensetningen ved å kvantifisere DNA, LL37 og enzymaktivitet (NE, CG og MPO) med forskjellige stimuli under samme in vitro-forhold . Resultatene viser at nøytrofile stoffer kan differensielt og spesifikt reagere på hver stimulus ved å danne egnede DNA-strukturer med forskjellige antimikrobielle proteiner under NET-dannelse.
Figur 4: Gjenværende enzymatisk aktivitet i NETs indusert av kjemiske og mikrobielle stimuli. Kolorimetriske analyser ble brukt til å evaluere den enzymatiske aktiviteten i NETs etter å ha koblet fra DNA-proteinstrukturer av DNase for å analysere bare NET-bundne proteiner. Grafen viser gjennomsnittlig ± SD av prosentandelen gjenværende enzymatisk aktivitet i NETs indusert av hver kjemisk eller mikrobiell stimuli sammenlignet med den maksimale enzymatiske aktiviteten (i supernatantene til nøytrofile lyset ved frysetining ved -70 ° C) oppnådd for NE (3,54 ± 2,52 U / ml), CG (34,90 ± 25,85 U / ml) og MPO (0,29 ± 0,13 U / ml). Basal viser den enzymatiske aktiviteten i supernatantene til nøytrofile som holdes i HBSS-bufferen. Statistisk analyse ble utført med data fra 10 uavhengige eksperimenter av ANOVA for å sammenligne grupper av eksperimentelle forhold med et konfidensnivå på 95%. * og ** = p ≤ 0,05 sammenlignet med alle andre stimuli. = p ≤ 0,05 sammenligne de signaliserte gruppene av stimuli. NE = nøytrofil elastase; CG = cathepsin G; MPO = myeloperoksidase; PMA = phorbol myristatacetat; HOCl = hypoklorsyre. Tilpasset fra Sosa-Luis et al.16 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En svært ren populasjon av levedyktige nøytrofiler må oppnås for å indusere frigjøring av NETs siden disse cellene har en begrenset ex vivo levetid på 8 timer i gjennomsnitt, en periode hvor alle forsøkene må utføres. For dette formål er den ideelle metoden den doble tetthetsgradienten for å optimalisere rensetiden ved å isolere ikke-aktiverte celler som er mer lydhøre overfor eksogen stimulering, i motsetning til Ficoll-Histopaque gradient eller Dextran sedimenteringsteknikker17. En annen fordel med metoden med dobbel tetthetsgradient er den relativt lave kostnaden sammenlignet med høy renhetscelleberikelsesteknikker som fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og magnetisk aktivert cellesortering (MACS) som er avhengige av celleoverflateantigenene, for eksempel CD16hi i nøytrofiler. Foruten en høy kostnad, kan disse sorteringsmetodene også forårsake utilsiktet aktivering av målcellene under antistoff-antigen-interaksjonen, og øke ex vivo-tiden for nøytrofiler, da disse to teknikkene vanligvis brukes etter tetthetsgradientrensing. Cellemorfologi og levedyktighet utelukker endringer i de rensede nøytrofile og bekrefter at de observerte endringene er spesifikke som respons på de tilsatte stimuliene versus de hvilende nøytrofile under de samme eksperimentelle forholdene uten stimulering (figur 2). Dette bekrefter effektiviteten av protokollen som en aseptisk og reproduserbar metode for nøytrofil isolasjon uten å endre cellens levedyktighet og morfologi. Dette bidraget av eosinofiler, som ofte finnes i blod med teller under 2%, ble utelukket og endret ikke den statistiske signifikansen av resultatene, da eosinofiler ikke ble observert i prøven på Wrights farging ved analyse av ulike felt (figur 2A). Dette kan bekreftes ved flowcytometri ved bruk av CD16-markøren, som ikke finnes i eosinofiler, men er tilstede i høye konsentrasjoner i nøytrofiler.
I studiet av NETs er det konsensus og avvik18; Ulike studier har rapportert motstridende resultater som respons på de samme stimuliene, noe som kan skyldes forskjeller i nøytrofile isolasjonsprotokoller, den forlengede eksperimenteringstiden som aktiverer nøytrofile spontant, bufferne og forskjellige konsentrasjoner av samme stimulus som brukes. Derfor er det viktig å homogenisere protokollene med eksplisitte detaljer slik at protokollene konsekvent kan replikeres for å tillate sammenligninger. De vanligste metodene som brukes er immunocytokjemi og immunhistokjemi, som muliggjør identifisering av strukturer som inneholder ekstracellulær DNA-kolokalisering med granulatavledede proteiner18 som vanligvis inkluderer komponenter med bakteriedrepende aktivitet som er i stand til å ødelegge virulensfaktorer8, som NE, MPO, CG og LL37. I tillegg anbefaler nyere studier for overvåking av NET-formasjon å analysere denne prosessen ved hjelp av sanntids levende cellemetoder som intravital mikroskopi 1,18. Få studier som denne studien forener de eksperimentelle forholdene for å sammenligne sammensetningen av NETs under forskjellige stimuli (bakterier, sopp og kjemikalier)1,9, ved hjelp av teknikken for fluorescensmikroskopi for å visualisere spredningen av DNA-DAPI, LL37-Alexa 594, og dens colocalization med mikroorganismer-CFSE. På samme måte frigjør behandlingen med DNase bare de proteinene som er forbundet med DNA-strukturen til NETs, slik at den spektrofotometriske teknikken sikrer kvantifisering av den enzymatiske aktiviteten til MPO, NE og CG, og utelukker at de kommer fra degranulering.
NET-morfologi kan defineres som suicidal eller vital, med mulighet for å differensiere dem i henhold til dispersjonen vedtatt av DNA i det ekstracellulære rommet. Selvmordsveien er preget av en skylignende struktur, mens den vitale banen er en filamentøs form15,19,20. Basert på dette indikerer figur 3 at PMA og P. aeruginosa representerer en suicidal NET-type. Disse resultatene validerer denne teknikken ved å replikere under våre forhold det som ble beskrevet av Brinckman og medarbeidere med PMA, den mest brukte forbindelsen for å indusere NETs ved å utløse aktiveringen av c-Raf, MEK, Akt, ERK og proteinkinase C (PKC), som igjen aktiverer NADPH-oksidase11 og forårsaker en kraftig økning i intracellulær ROS. I tillegg utelukker resultatene muligheten for at eksterne artefakter, inkubasjonstider eller den korte mekaniske agitasjonen som ble brukt i denne studien, forårsaket spontan in vitro-frigjøring av NET med et skylignende utseende som noen forfattere har nevnt17, siden hvilende nøytrofiler uten stimulering etter 4 timer viste en multilobed kjerne med intakt kromatin (figur 3A 1-3).
Tilsvarende NETs indusert med HOCl, C. albicans, og S. aureus presenterte filamentøs morfologi, tilsvarende vital NET-morfologi (Figur 3A 7-17). Denne banen er preget av at nøytrofiler reagerer på en unik og oksidantuavhengig måte uten cellelyse eller til og med brudd på plasmamembranen, bare spirende vesikler med nukleært DNA15. Dette resultatet validerer igjen potensialet i denne teknikken for å skjelne både morfologiske utseende av NET-produksjon som suicidal eller vital. Når det gjelder NET-sammensetning, viste resultatene oppnådd ved bruk av denne metoden statistisk signifikans i differensialkravene til LL37 for PMA og P. aeruginosa-stimulering (figur 3C). NE (kun for S. aureus) og MPO-aktivitet var høyere i mikroorganismene versus den kjemiske gruppen (figur 4). Denne informasjonen viser igjen nøytrofil selektivitet i å reagere på hver stimulus, som rapportert av Kenny et al.5 når man sammenligner forskjellige stimuli i NET-produksjon in vitro. Det ble beskrevet at produksjonen av NET i noen tilfeller trenger ROS eller har differensielle krav til spesifikke enzymer som PAD4, mens i andre er tilstedeværelsen av disse molekylene irrelevantfor produksjonen.
En begrensning av teknikken for å kvantifisere DNA i det ekstracellulære rommet som er beskrevet i denne studien, er at DNA også kan komme fra andre former for celledød med en nekrotisk morfotype, og det er umulig for denne teknikken å skille mellom dem. Det har imidlertid blitt rapportert at NET kan differensieres fra denne prosessen ved å bekrefte tilstedeværelsen av granulære proteiner18. På samme måte er opprinnelsen til DNA ukjent, noe som kan bekreftes ved å forsterke organelle-spesifikke, mitokondrielle eller nukleære gener ved PCR19. En annen svakhet er å skille NETs fra andre fibrøse strukturer som fibrin; slik dømmekraft ville kreve sofistikerte teknikker som høyoppløselig skanning elektronmikroskopi20. Avslutningsvis tillater de presenterte teknikkene in vitro-karakterisering (under lignende forhold) av sammensetningen og morfologien til NETs indusert med forskjellige stimuli, og viser selektiviteten til nøytrofiler i frigjøringen av noen av komponentene deres (DNA, LL37, NE, CG, MPO) til en bestemt stimulus. Disse teknikkene kan tilpasses for å evaluere effekten av eksogene løselige faktorer eller cellulær kontakt på slike NET-egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et grunnleggende vitenskapsstipend (# 285480) fra CONACyT og av Institutt for klinisk immunologiforskning ved fakultetet for biokjemiske vitenskaper, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L og W.J.R.R. har doktorgradsstipend i henholdsvis CONACyT-nummer #799779, #660793 og #827788.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL - Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory - CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
