Morfologisk og kompositorisk analyse av nøytrofile ekstracellulære feller indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli

Summary

Presentert her er en protokoll for induksjon og analyse av in vitro nøytrofile ekstracellulære feller (NETs). Kvantifisering av DNA, cathelicidin (LL37) og enzymaktivitet ga data som viser variasjonen i sammensetningen og morfologien til NETs indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli under lignende kontrollerte forhold.

Abstract

Neutrofiler fungerer som den første linjen av cellulært forsvar i en medfødt immunrespons ved å benytte ulike mekanismer, for eksempel dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs). Denne studien analyserer morfologiske og sammensetningsendringer i NETs indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli ved hjelp av standardiserte in vitro-metoder for NET-induksjon og karakterisering med humane celler. Prosedyrene beskrevet her tillater analyse av NET-morfologi (lytisk eller ikke-lytisk) og sammensetning (DNA-proteinstrukturer og enzymatisk aktivitet), og effekten av løselige faktorer eller cellulær kontakt på slike egenskaper. I tillegg kan teknikkene beskrevet her modifiseres for å evaluere effekten av eksogene løselige faktorer eller cellulær kontakt på NET-sammensetning.

De anvendte teknikkene inkluderer rensing av polymorfonukleære celler fra humant perifert blod ved bruk av en dobbel tetthetsgradient (1.079-1.098 g / ml), som garanterer optimal renhet og levedyktighet (≥ 95%) som demonstrert av Wrights farging, trypanblå eksklusjon og flowcytometri, inkludert FSC versus SSC-analyse og 7AAD-farging. NET-dannelse induseres med mikrobielle (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Candida albicans) og kjemiske (phorbol myristateacetat, HOCl) stimuli, og NETs er preget av DNA-DAPI-farging, immunostaining for det antimikrobielle peptidet cathelicidin (LL37) og kvantifisering av enzymatisk aktivitet (nøytrofil elastase, cathepsin G og myeloperoksidase). Bildene er anskaffet gjennom fluorescensmikroskopi og analysert med ImageJ.

Introduction

Neutrofiler er de mest tallrike leukocytter i blodet, og spiller en viktig rolle under klaring av patogene midler ved flere mekanismer, inkludert frigjøring av store kromatinstrukturer sammensatt av DNA og flere kjernefysiske, cytoplasmatiske og granulære antibakterielle proteiner ^1,2. Den direkte forløperen som beskriver denne antimikrobielle rollen til nøytrofiler ble laget av Takei et ^al.3 i 1996. Disse forfatterne rapporterte en ny form for død forskjellig fra apoptose og nekroptose hos nøytrofiler, viste morfologiske endringer som viste nukleær ruptur, etterfulgt av utslipp ut av nukleoplasma inn i cytoplasma, og en økning i membranpermeabilitet fra 3 timers inkubasjon med phorbol myristateacetat (PMA) ^2,3. Det var imidlertid ikke før 2004 at begrepet “nøytrofile ekstracellulære feller (NETs)” ble brukt⁴.

NET-dannelse har blitt observert under forskjellige forhold, for eksempel bakteriell, sopp⁵, viral⁶ og parasittiske infeksjoner, for å nøytralisere, drepe og forhindre mikrobiell spredning⁷. Andre studier viser at det også kan forekomme i ikke-patogene forhold ved sterile stimuli, som cytokiner, mononatrium urinsyre eller kolesterolkrystaller, autoantistoffer, immunkomplekser og aktiverte blodplater. Lipopolysakkarid (LPS), interleukin-8 (IL-8) og PMA var blant de første in vitro-stimuliene beskrevet som NET-induktorer, og in vivo NET-involvering i patogene prosesser ble demonstrert i to modeller av akutt betennelse: eksperimentell dysenteri og spontan human blindtarmbetennelse⁴. DNA er en viktig NET-komponent. Dens passende struktur og sammensetning er nødvendig for sekvestrering og drap av mikroorganismer ved å levere en høy lokal konsentrasjon av antimikrobielle molekyler mot de fangede mikrober, som demonstrert ved en kort deoksyribonuklease (DNase) behandling som desintegrerer NETs og deres mikrobicidale egenskaper⁴. Foruten DNA består NETs av festede proteiner som histoner, nøytrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3, laktoferrin, gelatinase, myeloperoksidase (MPO) og antimikrobielle peptider (AMPs) som det kationiske proinflammatoriske peptidet cathelicidin LL-37 blant andre ^8,9. Slike aggregater kan danne større tråder med diametre opp til 50 nm. Disse faktorene kan forstyrre de mikrobielle virulensfaktorene eller integriteten til patogencellemembranen; I tillegg kan AMP-ene stabilisere NET-avledet DNA mot nedbrytning av bakterielle nukleaser¹⁰.

De spesifikke mekanismene som regulerer NET-dannelse er ennå ikke helt avklart. Den best karakteriserte veien som fører til NET-frigjøring er gjennom ERK-signalering, noe som fører til NADPH-oksidaseaktivering og reaktiv oksygenart (ROS) produksjon, samt økt intracellulært kalsium som utløser aktivering av MPO-banen. Dette forvandler igjen hydrogenperoksid til hypoklorsyre, og aktiverer NE ved oksidasjon^11,12. NE er ansvarlig for å nedbryte aktinfilamentene i cytoskelettet for å blokkere fagocytose og translokere dem til kjernen for behandling ved proteolytisk spaltning og deaminering av PAD4 som driver desensibiliseringen av kromatinfibre, som assosieres med granulat- og cytoplasmatiske proteiner, og frigjøres deretter ekstracellulært⁷. Disse proteasene inkluderer de som frigjøres fra azurosomkomplekset av azurofile granulater og andre proteaser som cathepsin G¹³.

Avhengig av de morfologiske endringene i nøytrofiler, er NET klassifisert i to typer: suicidal eller lytisk NET-formasjon som fører til celledød⁴, og vital eller ikke-lytisk NET-formasjon produsert av levedyktige celler mediert av en vesikulær frigjøring av nukleært eller mitokondrielt DNA, med en rest av en anukleert cytoplast med fagocytisk evne^14,15. Vanligvis presenterer NETs sammensatt av mitokondrielt DNA en langstrakt fiber¹⁴ morfologi, mens de som er strukturert av nukleært DNA har et skylignende utseende³. Det er imidlertid ikke kjent hvordan nøytrofilen velger sin DNA-opprinnelse. I motsetning til tidligere studier som beskrev de kanoniske banene til NETs som krever flere timer, aktiveres den vitale banen raskt på bare 5-60 minutter¹⁵.

Til tross for disse fremskrittene varierer NET-sammensetningen avhengig av stimulansen; For eksempel induserer forskjellige mucoid og ikke-mucoid stammer av P. aeruginosa dannelsen av NETs som inneholder 33 vanlige proteiner og opptil 50 variable proteiner⁷. Dermed er det nødvendig å homogenisere teknikker som tillater generering av objektive konklusjoner i forskningsgrupper. Dette papiret beskriver en protokoll med ulike teknikker som tillater sammenligning og evaluering av sammensetningen, strukturen og morfologien til NETs indusert med forskjellige mikroorganismer: Staphylococcus aureus (gram-positiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gram-negativ bakterie) og Candida albicans (sopp), samt kjemiske stimuli (PMA, HOCl) i humane nøytrofiler fra friske individer. De representative resultatene viser heterogeniteten til NETs avhengig av deres induserende stimulus under sammenlignbare in vitro-forhold, preget av DNA-DAPI-farging, immunostaining for LL37 og kvantifisering av enzymatisk aktivitet (NE, CG og MPO).

Protocol

Blodprøvene ble innhentet som donasjoner fra klinisk friske deltakere etter informert samtykke. Alle eksperimenter ble utført med tillatelse fra Human Research Ethics Committee ved Fakultet for biokjemiske vitenskaper, Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ i Oaxaca. MERK: Inklusjonskriteriene i studien var utydelig kjønn og alder, og klinisk sunne i henhold til deltakernes svar på et spørreskjema før blodprøvetaking. En hematologisk analyse ble utført for å bestemme celletallet og ut…

Representative Results

Renhet og levedyktighet av nøytrofilerDe dynamiske cellulære fasene visualiseres i røret fra den doble tetthetsgradientrensingen. Innenfor disse lagene er laget som tilsvarer granulocytter over tetthetslaget på 1,079 g/ml, skilt fra fasene av perifere mononukleocytter (PBMC) og erytrocytter (figur 1A). Morfologien til de rensede cellene ble verifisert med Wrights farging ved å observere celler med segmenterte kjerner forbundet med trådlignende filamenter tilsvarend…

Discussion

En svært ren populasjon av levedyktige nøytrofiler må oppnås for å indusere frigjøring av NETs siden disse cellene har en begrenset ex vivo levetid på 8 timer i gjennomsnitt, en periode hvor alle forsøkene må utføres. For dette formål er den ideelle metoden den doble tetthetsgradienten for å optimalisere rensetiden ved å isolere ikke-aktiverte celler som er mer lydhøre overfor eksogen stimulering, i motsetning til Ficoll-Histopaque gradient eller Dextran sedimenteringsteknikker^17<…

Materials

24 Well plate for cell culture	Corning	3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	51-668981E
96 Well plate for cell culture	Costar	3596	Flat bottom
Agitator	CRM Globe	CRM-OS1
Antibody LL37	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
Blood collection tubes	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Sigma-Aldrich	21878
Centrifuge	Hettich	1406-01
Coverslip	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS)	Caisson	1201022
Falcon tubes 50 mL	CORNING	430829
Flow Cytometry Tubes	Miltenyi Biotec		5 mL – Without caps
FlowJo Software	BD Biosciences		Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope	DM 2000	LEICA
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Incubator	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec		Flow cytometer
Microplate reader photometer	Clarkson Laboratory – CL
Microtubes 1.5 mL	Zhejiang Runlab Tech	35200N	wire snap
Minitab Software	Minitab		Statistical analysis
Needles	BD VACUTAINER	301746	Diameter 1.34 mm
Optical microscope	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x)	Caisson	PBL07-500ML
Pyrex culture tubes	CORNING	CLS982025	N°9820
RPMI 1640 1x	Corning	10-104-CV	contains Glutagro
Slides	Madesa	PDI257550	22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4%	SIGMA	T8154-100ML