Summary
CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten werden geïntegreerd in het schema van Booleaanse poorten in Saccharomyces cerevisiae. De nieuwe kleine logische circuits toonden goede prestaties en verdiepten het begrip van zowel op dCas9/dCas12a gebaseerde transcriptiefactoren als de eigenschappen van anti-CRISPR-eiwitten.
Abstract
Synthetisch gen Booleaanse poorten en digitale circuits hebben een breed scala aan toepassingen, van medische diagnostiek tot milieuzorg. De ontdekking van de CRISPR-Cas-systemen en hun natuurlijke remmers - de anti-CRISPR-eiwitten (Acrs) - biedt een nieuw hulpmiddel om in vivo digitale gencircuits te ontwerpen en te implementeren. Hier beschrijven we een protocol dat het idee van de "Design-Build-Test-Learn" biologische engineeringcyclus volgt en gebruik maakt van dCas9 / dCas12a samen met hun bijbehorende Acrs om kleine transcriptionele netwerken op te zetten, waarvan sommige zich gedragen als Booleaanse poorten, in Saccharomyces cerevisiae. Deze resultaten wijzen op de eigenschappen van dCas9/dCas12a als transcriptiefactoren. In het bijzonder, om maximale activering van genexpressie te bereiken, moet dSpCas9 interageren met een gemanipuleerd steiger-RNA dat meerdere kopieën van het VP64-activeringsdomein (AD) verzamelt. Daarentegen wordt dCas12a bij het C-eindpunt gefuseerd met het sterke VP64-p65-Rta (VPR) AD. Bovendien wordt de activiteit van beide Cas-eiwitten niet versterkt door de hoeveelheid sgRNA/crRNA in de cel te verhogen. In dit artikel wordt ook uitgelegd hoe u Booleaanse poorten kunt bouwen op basis van de CRISPR-dCas-Acr-interactie. Het AcrIIA4 gefuseerde hormoonbindende domein van de menselijke oestrogeenreceptor is de kern van een NOT-poort die reageert op β-oestradiol, terwijl AcrVA's gesynthetiseerd door de induceerbare GAL1-promotor het mogelijk maken om zowel JA- als NOT-poorten na te bootsen met galactose als input. In de laatste circuits vertoonde AcrVA5, samen met dLbCas12a, het beste logische gedrag.
Introduction
In 2011 stelden onderzoekers een computationele methode voor en ontwikkelden een bijbehorend stuk software voor het automatische ontwerp van digitale synthetische gencircuits1. Een gebruiker moest het aantal ingangen (drie of vier) opgeven en de waarheidstabel van het circuit invullen; Dit leverde alle benodigde informatie op om de circuitstructuur af te leiden met behulp van technieken uit elektronica. De waarheidstabel werd vertaald in twee Booleaanse formules via de Karnaugh-kaartmethode2. Elke Booleaanse formule bestaat uit clausules die logische bewerkingen (som of vermenigvuldiging) beschrijven tussen (een deel van) de circuitingangen en hun negaties (de letterlijke elementen). Clausules worden op hun beurt opgeteld (OF) of vermenigvuldigd (EN) om de circuituitgang te berekenen. Elk circuit kan worden gerealiseerd volgens een van de twee overeenkomstige formules: een geschreven in POS-vorm (product van sommen) en de andere in SOP-representatie (som van producten). De eerste bestaat uit een vermenigvuldiging van clausules (d.w.z. Booleaanse poorten) die een logische som van de letterlijke poorten bevatten. Dit laatste daarentegen is een optelsom van clausules waarbij de letterlijke woorden worden vermenigvuldigd.
Elektrische circuits kunnen worden gerealiseerd, op een breadboard, door verschillende poorten fysiek met elkaar te bedraden. De elektrische stroom maakt de uitwisseling van signalen tussen poorten mogelijk, wat leidt tot de berekening van de uitgang.
In de biologie is de situatie complexer. Een Booleaanse poort kan worden gerealiseerd als een transcriptie-eenheid (TU; d.w.z. de sequentie "promotor-coderende regio-terminator" in eukaryote cellen), waar transcriptie of translatie (of beide) worden gereguleerd. Zo vormen ten minste twee soorten moleculen een biologische bedrading: de transcriptiefactoreiwitten en de niet-coderende, antisense RNA's1.
Een gen digitaal circuit is georganiseerd in twee of drie lagen poorten, namelijk: 1) de ingangslaag, die is gemaakt van YES (buffer) en NOT poorten en zet de input chemicaliën om in bedradingsmoleculen; 2) de interne laag, die bestaat uit evenveel TU's als er clausules zijn in de overeenkomstige Booleaanse formule. Als het circuit is ontworpen volgens de SOP-formule, produceert elke clausule in de interne laag de circuituitgang (bijvoorbeeld fluorescentie) in een zogenaamde gedistribueerde uitgangsarchitectuur. Als het product van de som (POS) -formule wordt gebruikt, is een 3) laatste laag vereist, die een enkele multiplicatieve poort bevat die de bedradingsmoleculen van de interne laag verzamelt.
Over het algemeen kunnen in de synthetische biologie veel verschillende schema's worden ontworpen voor hetzelfde circuit. Ze verschillen in het aantal en het soort van zowel TU's als bedradingsmoleculen. Om de eenvoudigste oplossing te kiezen die in gistcellen kan worden geïmplementeerd, wordt elk circuitontwerp geassocieerd met een complexiteitsscore S, gedefinieerd als
waarbij A staat voor het aantal activatoren, R voor het aantal repressoren en a voor de hoeveelheid antisense RNA-moleculen. Als activators of repressors afwezig zijn in het circuit, is hun bijdrage aan S nul. Daarom is het moeilijker om een circuitschema in het laboratorium (hoge S) te realiseren wanneer het een groot aantal orthogonale transcriptiefactoren vereist. Dit betekent dat nieuwe activatoren en repressors de novo moeten worden ontworpen om de volledige bedrading in de digitale circuits te realiseren. In principe kunnen nieuwe DNA-bindende eiwitten worden samengesteld met behulp van Zinc Finger-eiwitten3 en TAL-effectoren4 als sjablonen. Deze optie lijkt echter te zwaar en tijdrovend; daarom moet men vooral vertrouwen op kleine RNA's en translatieregulatie om complexe gencircuits te voltooien.
Oorspronkelijk werd deze methode ontwikkeld om digitale schakelingen in bacteriën te fabriceren. Inderdaad, in eukaryote cellen is het in plaats van antisense RNA's geschikter om te spreken van microRNA's (miRNA's) of kleine interfererende RNA's (siRNA's)5. De RNAi-route is echter niet aanwezig in de gist S. cerevisiae. Daarom moet men kiezen voor volledig transcriptionele netwerken. Stel dat een circuit vijf activators en vijf repressors nodig heeft; de complexiteitsscore zou S = 32 zijn. De complexiteit van het circuit kan worden verminderd door de 10 transcriptiefactoren te vervangen door een enkele dCas96 (nuclease-deficiënt Cas9) gefuseerd tot een activeringsdomein (AD). Zoals getoond in7, werkt dCas9-AD als een repressor in gist bij het binden van een promotor tussen de TATA-box en de TSS (transcriptiestartplaats) en als een activator bij het goed binden stroomopwaarts van de TATA-box. Zo kan men 10 transcriptiefactoren vervangen door een enkel dCas9-AD fusie-eiwit en 10 sgRNA's (single guide RNA's) voor een totale complexiteitsscore van S = 11. Het is snel en gemakkelijk om tien sgRNA's te synthetiseren, terwijl, zoals eerder opgemerkt, de assemblage van 10 eiwitten veel langer en ingewikkelder werk zou vereisen.
Als alternatief kan men twee orthogonale dCas-eiwitten gebruiken (bijv. dCas9 en dCas12a): één om te fuseren tot een AD, en de andere kaal of in combinatie met een repressiedomein. De complexiteitsscore zou met slechts één eenheid toenemen (S = 12). Vandaar dat CRISPR-dCas-systemen de sleutel zijn tot de constructie van zeer ingewikkelde digitale gencircuits in S. cerevisiae.
Dit artikel karakteriseert diep de efficiëntie van zowel dCas9- als dCas12a-gebaseerde repressoren en activatoren in gist. De resultaten tonen aan dat ze geen hoge hoeveelheid sgRNA nodig hebben om hun activiteit te optimaliseren, dus episomale plasmiden worden bij voorkeur vermeden. Bovendien zijn op dCas9 gebaseerde activatoren veel effectiever bij het gebruik van een steiger-RNA (scRNA) dat kopieën van de VP64 AD rekruteert. Daarentegen werkt dCas12a goed wanneer het rechtstreeks is samengevoegd met de sterke VPR AD. Bovendien vereist een synthetisch geactiveerde promotor een variabel aantal doellocaties, afhankelijk van de configuratie van de activator (bijvoorbeeld drie bij gebruik van dCas12a-VPR, zes voor dCas9-VP64 en slechts één met dCas9 en een scRNA). Als repressor lijkt dCas12a scherper bij het binden van het coderende gebied in plaats van de promotor.
Als nadeel hebben CRISPR-dCas9/dCas12a echter geen directe interactie met chemicaliën. Daarom kunnen ze van geen nut zijn in de invoerlaag. Om deze reden zijn alternatieve Booleaanse poortontwerpen met anti-CRISPR-eiwitten (Acrs) onderzocht. Acrs werken in op (d)Cas-eiwitten en remmen hun werking8. Daarom zijn ze een middel om de activiteit van CRISPR-(d)Cas-systemen te moduleren. Dit artikel analyseert grondig de interacties tussen type II Acrs en (d)Cas9, evenals type V Acrs en (d)Cas12a in S. cerevisiae. Omdat Acrs veel kleiner zijn dan Cas-eiwitten, werd een NOT-poort die reageert op het oestrogeen β-estradiol gebouwd door het hormoonbindende domein van de menselijke oestrogeenreceptor9-HBD (hER) - te fuseren met AcrIIA4. Daarnaast werden een handvol JA- en NOT-poorten gerealiseerd die dCas12a(-AD) constitutief en AcrVA's uitdrukten bij inductie met galactose. Op dit moment dienen deze poorten alleen als proof of concept. Ze vertegenwoordigen echter ook de eerste stap naar een diepgaande heroverweging van het algoritme om het computationele automatische ontwerp van synthetische gen-digitale circuits in gistcellen uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp en constructie van de sgRNA/crRNA expressie cassette
OPMERKING: Er zijn twee soorten sgRNA/crRNA-expressiecassettes: SNR5210-met één term bestaat uit de RNA-polymerase III-afhankelijke SNR52-promotor, de sgRNA/crRNA-sequentie en de SUP4-terminator; een andere - afgekort als RGR11 - bestaat uit de RNA polymerase II-afhankelijke ADH1 promotor, de RGR (ribozym-guide RNA-ribozym) structuur die twee ribozymen bevat (een hamerkop ribozym-HH, en een hepatitis delta virus ribozym-HDV) en de sequentie van het sgRNA/crRNA daartussenin, en de ADH1 terminator. De sgRNA-leidende Cas9-homologen zijn gemaakt van een spacersequentie en de karakteristieke directe herhaling12, terwijl het crRNA voor Cas12a-eiwitten de directe herhaling omvat gevolgd door de spacersequentie13,14 (zie aanvullende tabel 1 voor alle DNA-sequenties die in deze studie worden gebruikt).
- Ontwerp de spacersequentie voor Cas9/Cas12a-gemedieerde transcriptionele activering.
- Gebruik de bacteriële lexoperatorsequentie (lexOp genaamd) om de doellocatie15,16 te zijn en plaats deze in de CYC1-promotor die de expressie van het met gist versterkte groene fluorescerende eiwit (yEGFP) aandrijft17. Daarom wordt de spacer-reeks gedefinieerd door en complementair aan de ingevoegde lexOp.
- Controleer de orthogonaliteit van de afstandsvolgorde via het CRISPRDIRECT-gereedschap18.
- Plak de lexOp-sequentie geflankeerd door de PAM-reeks in het tekstveld, definieer de PAM-sequentie als NRG voor dCas9 en TTTV voor dCas12a en geef de soort uit de vervolgkeuzelijst op als Budding Yeast (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genome. Klik op Ontwerpen. Zorg ervoor dat er geen overeenkomende doelsite is in 20mer + PAM of in 12mer + PAM-zoekopdracht.
- Construeer de sgRNA/crRNA-expressiecassette.
- Gebruik touchdown PCR om de DNA-sequenties van standaard biologische delen te versterken, zoals promotors, coderende sequenties en terminators.
- Bereid een reactiemengsel dat bestaat uit: 20-40 ng DNA-sjabloon, 1 μL 10 μM voorwaartse primer (d.w.z. ot25, sgRNA/crRNA-expressieplasmideconstructie), 1 μL 10 μM omgekeerde primer (d.w.z. ot26, sgRNA/crRNA-expressieplasmideconstructie), 5 μL 2,5 mM dNTP-mix, 0,5 μL DNA-polymerase, 10 μL 5x DNA-polymerasereactiebuffer, en dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot een totaal volume van 50 μL.
OPMERKING: Zie aanvullende tabel 2 voor een lijst van primers die in dit onderzoek zijn gebruikt. - Voer het touchdown PCR-programma uit op een thermocycler:
Fase 1: 98 °C gedurende 30 s.
Fase 2 met 10 cycli: 98 °C gedurende 10 s, 68 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 15 s.
Fase 3 met 25 cycli: 98 °C gedurende 10 s, 59 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 15 s.
Etappe 4: 72 °C gedurende 2 min.
Houd ten slotte op 4 °C totdat de vervolgexperimenten worden gestart.
OPMERKING: De 68 °C in fase 2 en 59 °C in fase 3 zijn afhankelijk van de smelttemperaturen van zowel voorwaartse als omgekeerde primers, variërend van verschillende paren primers. De tijd bij 72 °C in fase 2 en 3 wordt bepaald door de lengte van het PCR-product en de snelheid van het DNA-polymerase.
- Bereid een reactiemengsel dat bestaat uit: 20-40 ng DNA-sjabloon, 1 μL 10 μM voorwaartse primer (d.w.z. ot25, sgRNA/crRNA-expressieplasmideconstructie), 1 μL 10 μM omgekeerde primer (d.w.z. ot26, sgRNA/crRNA-expressieplasmideconstructie), 5 μL 2,5 mM dNTP-mix, 0,5 μL DNA-polymerase, 10 μL 5x DNA-polymerasereactiebuffer, en dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot een totaal volume van 50 μL.
- Isoleer de PCR-producten via gelelektroforese (100 V, 30 min). Elueer de DNA-sequenties uit de agarosegel via een DNA-gelextractiekit (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Een 0,8% agarosegel is vereist voor fragmenten langer dan 500 nt, een 1,5% agarosegel voor fragmenten tussen 100 nt en 500 nt en een 2% agarosegel voor fragmenten korter dan 100 nt. - Plaats de TU die sgRNA/crRNA tot expressie brengt in een pRSII404/424 shuttlevector19, die het ampicillineresistentiegen en het gistselecteerbare auxotrofe markergen-TRP1 bevat.
- Vergist de shuttlevector bij 37 °C gedurende 1 uur met de twee restrictie-enzymen SacI en Acc65I. Bereid het reactiemengsel door 5 μg van de shuttlevector, de aanbevolen hoeveelheden enzymen, de verteringsbuffer (volgens de enzyminstructies) en ddH2O toe te voegen tot een totaal volume van 30 μL.
- Controleer de shuttlevectorvertering via gelelektroforese (zie substap 1.3.2). Inactiveer vervolgens de twee enzymen bij 65 °C gedurende 20 minuten.
- Gebruik de Gibson-assemblagemethode 20 om de gezuiverde PCR-producten in de opengesneden shuttlevector in te brengen door het equimolaire DNA-mengsel gedurende 1 uur bij50 °C binnen te laten.
- Transformeer Escherichia coli DH5α competente cellen met het bovenstaande Gibson reactiemengsel via de heat shock transformatiemethode21. Breng de getransformeerde E. coli-cellen over op Luria-Bertani (LB) agarplaten die ampicilline bevatten (0,1 g / L). Plaats de platen in de couveuse bij 37 °C en laat de cellen een nacht groeien.
- Pluk vier kolonies uit de LB-agarplaat en kweek ze afzonderlijk gedurende een nacht bij 37 °C in een LB-oplossing die ampicilline bevat (0,1 g/l). Gebruik vervolgens de mini-voorbereidingsprocedure om plasmiden uit de E. coli-cellen te extraheren22.
- Gebruik de primers ot18 en ot19 (zie aanvullende tabel 2 voor oligosequenties) om de ingevoegde transcriptie-eenheid te sequencen en te bevestigen via de Sanger-methode23.
OPMERKING: In latere experimenten zullen de geconstrueerde en bevestigde plasmiden via het PEG/LiAc-protocol24 in het gistgenoom worden ingebracht.
- Gebruik touchdown PCR om de DNA-sequenties van standaard biologische delen te versterken, zoals promotors, coderende sequenties en terminators.
2. Ontwerp en bouw van de steiger RNA-expressiecassette
OPMERKING: Het scaffold guide RNA (scRNA) bestaat uit de sgRNA-sequentie en de MS2-haarspeldstructuren25. Twee soorten MS2 haarspeldstructuren worden gebruikt in dit werk: wild-type MS2 hairpin-wt, en f6 MS2 coat protein (MCP) aptamer-f6.
- Synthetiseer een scRNA-sjabloon die geschikt is voor verschillende spacersequenties (d.w.z. pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
OPMERKING: In deze studie werd het scRNA-sjabloon gesynthetiseerd door een gensynthesebedrijf (zie tabel met materialen). - Ontwerp de juiste primers (zie aanvullende tabel 2) om PCR uit te voeren op de benodigde afstandsreeksen.
- Volg de procedures in stap 1.3 om een scRNA-expressiecassette te maken.
3. dSpCas9 engineering en expressie plasmide constructie
- Verkrijg het plasmide pTPGI_dSpCas9_VP64 (zie tabel met materialen).
- Construeer de acceptorvector pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, gebaseerd op de pRSII406 shuttlevector, via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3). Het plasmide biedt een sterke constitutieve promotor-pGPD en een terminator-CYC1t.
- Verwerk het pTPGI_dCas9_VP64 plasmide en de nieuw geconstrueerde acceptorvector (5 μg gedurende 1 uur of 10 μg gedurende de nacht - zie stap 1.3.3.1 als referentie) met XbaI en XhoI bij 37 °C. Scheid en zuiver het inlegfragment en de acceptorvector zoals in stap 1.3.2.
- Ligate het gezuiverde insertfragment en de acceptorvector met T4 DNA-ligase bij 16 °C gedurende 8 uur. Bereid de ligatieoplossing door 50-100 ng van de gezuiverde acceptorvector, gezuiverde doelfragmenten in equimolaire hoeveelheid met de acceptorvector, 1,5 μL T4-buffer, 0,5 μL T4-ligase en ddH2O toe te voegen tot een totaal volume van 15 μL.
- Volg de stappen 1.3.3.3 en 1.3.3.4. Bevestig vervolgens dat het nieuw geconstrueerde plasmide correct is door vertering met XbaI en Xhol (37 °C, 1 uur) en gelelektroforese (zie stap 1.3.2).
4. dCas12a engineering en plasmidebouw
- Construeer de plasmiden die dCas12a-AD tot expressie brengen.
- Synthetiseer twee gistcodon-geoptimaliseerde dCas12a-eiwitten (denAsCas12a en dLbCas12a) geflankeerd door BamHI- en Xhol-restrictie-enzymplaatsen.
OPMERKING: In deze studie werden de twee voor gistcodon geoptimaliseerde dCas12a-eiwitten gesynthetiseerd door een gensynthesebedrijf (zie tabel met materialen). - Construeer de acceptorvector pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3), waarbij de "promotor" pGPD of pGAL1 is, "sp" een korte willekeurige reeks vertegenwoordigt en "AD" VPR of VP64 is.
- Breng elk dCas12a-eiwit in de twee nieuw geconstrueerde acceptorvectoren in via vertering met BamHI en XhoI en ligatie met T4 DNA-ligase (zie stap 3.3 en 3.4).
- Synthetiseer twee gistcodon-geoptimaliseerde dCas12a-eiwitten (denAsCas12a en dLbCas12a) geflankeerd door BamHI- en Xhol-restrictie-enzymplaatsen.
- Construeer de plasmiden die een kale dCas12a uitdrukken.
- Construeer een acceptorvector voor de galactose-induceerbare expressiecassettes van dCas12a als pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t met behulp van touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3).
- Verwerk de plasmiden die de dCas12a-eiwitten en de bovenstaande acceptorvector bevatten met BamHI en Xhol en ligate ze vervolgens met T4 DNA-ligase om het plasmide pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t te krijgen (zie stap 3.3 en 3.4).
- Verwerk het plasmide verkregen in stap 4.2.2 met Acc65I en BamHI, en vervang vervolgens pGAL1 door pGPD via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode om pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t te construeren.
5. Anti-CRISPR eiwit engineering en plasmide constructie
OPMERKING: Er zijn drie soorten promotors gebruikt om Acrs-expressie te stimuleren: een induceerbare promotor-pGAL1, vier gistconstitutieve promotors-pGPD, pACT1, pTEF1 en pTEF2, en een synthetische constitutieve promotor-genCYC1t_pCYC1noTATA26.
- Verkrijg de plasmiden met de sequenties van type II Acrs (AcrIIA2, AcrIIA427 en AcrIIA5 28) en type V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 en AcrVA529) van een gensynthesebedrijf.
- Construeer de plasmiden op basis van de pRSII403 shuttle vector om Acrs uit te drukken.
- Maak AcrIIA-expressiecassettes.
OPMERKING: Gebruik touchdown PCR om vier verschillende promotors (d.w.z. pGPD, pACT1, pTEF2 en genCYC1t_pCYC1noTATA), de drie soorten AcrIIA en twee terminators (ADH1t en CYC1t) te versterken. Bouw een reeks TU's die AcrIIAs uitdrukken, onder verschillende promotors, via de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3). - Maak AcrVA-expressiecassettes.
- Synthetiseer de acceptorsequentie: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, waarbij "sp" een willekeurige sequentie is die later zal worden vervangen door AcrVA's.
OPMERKING: In deze studie werden de acceptorsequenties gesynthetiseerd door een gensynthesebedrijf (Table of Materials). - Verzamel de acceptorvectoren pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, waarbij de "promotor" is: pGAL1, pTEF1 en genCYC1t_pCYC1noTATA. Gebruik de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3).
- Plaats elk van de drie AcrVA's in de acceptorvector beschreven in stap 5.2.2.2 (via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode [zie stap 1.3]) om een set plasmiden te bouwen die AcrVA's produceren.
- Synthetiseer de acceptorsequentie: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, waarbij "sp" een willekeurige sequentie is die later zal worden vervangen door AcrVA's.
- Maak AcrIIA-expressiecassettes.
- Verder ingenieur AcrIIA4 door zijn sequentie uit te breiden met de sequenties van de GS-linker en HBD (hER). Dit maakt de bouw van een β-oestradiol-responsief circuit mogelijk.
- Gebruik touchdown PCR om GS-HBD- en AcrIIA4-onderdelen afzonderlijk te verkrijgen (zie stap 1.3.1).
- Plaats AcrIIA4, GS-HBD en de shuttlevector in het Gibson-mengsel en construeer het volledige plasmide via de Gibson-methode (zie stap 1.3.3).
6. crRNA-detectie: RT-qPCR en het ontwerp van primers
OPMERKING: crRNA-detectie werd bereikt via RT-qPCR, die in drie stappen is georganiseerd.
- Voer de RNA-extractie en -zuivering uit gistcellen uit via een RNA-kit.
- Kweek gistcellen 's nachts in 2 ml synthetisch gedefinieerd compleet medium (SDC, 1 L volume: 20 g glucose, 2 g AA-mix, 6,7 g YNB, 396 mg Leucine, 79,2 mg tryptofaan, 79,2 mg histidine en 79,2 mg uracil) met behulp van een 24-well plaat (240 rpm, 30 °C).
- Verdun 's ochtends de celcultuur (1:100) tot 2 ml verse SDC en laat de gistcellen nog 4 uur groeien bij 30 °C, 240 tpm.
- Oogst de volledige 2 ml van de celoplossing en centrifugeer gedurende 2 minuten op 20,238 x g . Verwijder het supernatant voorzichtig omdat de celkorrel klein is.
- Extraheer het RNA uit gistcellen met behulp van een RNA-kit.
- Controleer de RNA-kwaliteit.
- Bereid een 1% agarose gel. Meng 5 μL van elk RNA-monster met 1 μL DNA-ladingskleurstof. Laad vervolgens het mengsel op de gel en laat het lopen.
- Zorg ervoor dat twee duidelijke banden op ~ 4.000 nt en ~ 2.000 nt, overeenkomend met ribosomaal RNA (25S / 18S), aanwezig zijn op de gel. Een verdere wazige band is te zien bij ~80 nt voor tRNA.
- Gebruik de RNA-monsters onmiddellijk voor cDNA-synthese of bewaar ze bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
- Omgekeerde transcriptie: Gebruik de stam-lusmethode 30 om de eerste streng cDNA te vormen die overeenkomt met het crRNA (40 nt). Voor de reverse transcriptie van het sgRNA (bijna 100 nt) is de procedure dezelfde als die voor de cDNA-synthese van het referentiegen ACT1.
OPMERKING: De methode voor de omgekeerde transcriptie van het crRNA verschilt van die gebruikt met het sgRNA en het ACT1 mRNA. Omdat het crRNA erg kort is, werd het behandeld als een microRNA en gebruikte het de microRNA reverse transcriptiemethode (stam-loop benadering) om het overeenkomstige cDNA te verkrijgen. Twee cDNA-synthesekits (een stam-luskit voor het crRNA en een gebruikelijke reverse transcriptiekit voor het ACT1-gen ) werden gebruikt bij de kwantificering van crRNA. Dezelfde hoeveelheid RNA werd gebruikt in de twee kits (zie Tabel met materialen) om de experimentresultaten vergelijkbaar te maken. De primer die met de stengel-luskit werd gebruikt, was ontworpen volgens de stamlussequentie en de laatste zes nucleotiden aan het 3'-uiteinde van het crRNA (voor de stamlus- en primersequentie, zie aanvullende tabel 2).- Stem-loop methode voor crRNA reverse transcriptie
- Haal het RNA-sjabloon, de primer en de buffers uit de vriezer en laat ze smelten op ijs.
- Genomische DNA-verwijdering: Bereid eerst 10 μL van het reactiemengsel volgens de instructies van de kit. Doe het mengsel gedurende 2 minuten in een thermische cycler bij 42 °C. Breng het ten slotte over op ijs.
- Synthese van de eerste cDNA-streng: Bereid 20 μL van het reactiemengsel door 10 μL van het mengsel toe te voegen vanaf stap 6.2.1.2, 1 μL steel-lusprimer (2 μM-concentratie), 2 μL 10x RT-reactiebuffer, 2 μL reverse transcriptie-enzymmengsel (met het reverse transcriptase) en 5 μL RNase-vrije H2O.
- Plaats het reactiemengsel in een thermische cycler en voer het volgende programma uit: 25 °C gedurende 5 minuten, 50 °C gedurende 15 minuten en 85 °C gedurende 5 minuten. Gebruik het product onmiddellijk voor de qPCR-reactie of bewaar het bij -80 °C.
- sgRNA en ACT1 mRNA reverse transcriptie
- Eerste reactie: Bereid een mengsel van 13 μL voor, bestaande uit de primermix, dNTP-mix, RNA-sjabloon (50 pg-5 μg) en RNase-vrij water (afgezien van de RNA-sjabloon, allemaal geleverd door de kit), volgens de instructies van de kit. Gebruik 1 μg RNA-sjabloon. Doe het mengsel gedurende 10 minuten in een thermische cycler bij 70 °C.
- Tweede reactie (cDNA-synthese): Bereid het reactiemengsel door de reagentia (zoals beschreven in de kitinstructies) toe te voegen aan de 13 μL van de eerste reactieoplossing tot een eindvolume van 20 μL. Plaats het mengsel gedurende 15 minuten in een thermische cycler bij 50 °C en vervolgens nog eens 5 minuten bij 85 °C. Gebruik het product onmiddellijk voor de qPCR-reactie of bewaar het bij -80 °C.
- Stem-loop methode voor crRNA reverse transcriptie
- SYBR-kit voor qPCR: Ct-waardedetectie
OPMERKING: De omgekeerde primer die in de qPCR van het crRNA wordt gebruikt, is gefixeerd omdat deze overeenkomt met het omgekeerde complement van de stamlussequentie (zie aanvullende tabel 2). De voorwaartse primer daarentegen is variabel en hangt af van de volgorde van het crRNA. De voorwaartse en omgekeerde primers voor het sgRNA en ACT1 mRNA qPCR zijn ontworpen op https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Twee primers worden geselecteerd wanneer het verschil tussen hun smelttemperaturen niet groter is dan 2 °C (zie aanvullende tabel 2). Elk monster wordt gemeten in drie replicaties.- Bereid het qPCR-reactiemengsel volgens de instructies van de fabrikant voor de SYBR-kit.
- Stel het volgende qPCR-programma in op een real-time PCR-machine.
Preïncubatie: 10 min bij 95 °C.
PCR-stadium: 15 s bij 95 °C, gevolgd door 34 s bij 55 °C. Stel de cyclus van de PCR-fase in op 45 keer. Smeltfase: 10 s bij 95 °C, gevolgd door 60 s bij 65 °C en ten slotte 1 s bij 97 °C. - Bereken de relatieve mRNA-expressiewaarden via de Pfafl-formule31.
7. Immunofluorescentie om Cas-eiwitten te detecteren
OPMERKING: Cas-eiwitten (CasP) zijn gefuseerd tot een His_tag.
- Gistcelpreparaat
- Pluk wat gistcellen met behulp van een steriele lus en kweek ze in 5 ml YPD-rijk medium gedurende een nacht bij 240 tpm bij 30 °C. Voeg 's ochtends 500 μL van de celoplossing toe aan 20 ml verse YPD en laat ze groeien bij 240 tpm bij 30 °C tot OD600 0,6 bereikt.
- Neem 5 ml van de cultuur en meng het met 500 μL 37% formaldehyde. Laat het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur (RT) staan. Oogst de cellen door centrifugeren op 1.500 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen met 1 ml fixatiebuffer (0,1 M KH 2 PO4, 0,5 M MgCl2, 3,7% formaldehyde, pH = 6,5). Houd de celoplossing gedurende 20 minuten bij RT.
- Centrifugeer de celoplossing gedurende 5 minuten op 1.500 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in 1 ml wasbuffer (0,1 M KH 2 PO 4,1,2M sorbitol, pH = 6,5) aangevuld met 4 μL bèta-mercaptoethanol en4 μL lysaatoplossing (5 mg/ml). Breng de celoplossing gedurende 20 minuten in een incubator bij 37 °C.
- Centrifugeer de celoplossing gedurende 5 minuten op 1.500 x g en gooi het supernatant weg. Was de celpellet tweemaal met 1 ml PBS door centrifugeren (1.500 x g gedurende 5 minuten).
- Resuspendeer de cellen in 100 μL PBS plus 0,05% Tween 20 en voeg 4 μL BSA-oplossing (10 mg/ml) toe. Houd de celoplossing gedurende 20 minuten bij RT.
- Incubatie met primair antilichaam
- Voeg het primaire antilichaam van de Anti-His-tag toe aan het mengsel in stap 7.1.6 met een verdunning van 1:400. Houd de oplossing 2 uur op RT.
- Centrifugeer het mengsel in stap 7.2.1 bij 1.500 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 1 ml PBST en centrifugeer (1.500 x g) gedurende 5 minuten toe om de celpellet te wassen. Herhaal deze bewerking twee keer. Gooi ten slotte het supernatant weg en suspensie de cellen in 100 μL 1x PBST.
- Microscopie cel detectie
- Monteer de cellen op een dia; neem 2 μL van de celoplossing uit stap 7.2.2 en plaats deze op een glazen glaasje. Bedek het met een coverslip.
- Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Schakel de fluorescerende lichtbron, microscoop en computer in. Noteer het nummer van de fluorescerende lichtbron en open de microscoopsoftware op de computer.
- Plaats de dia op het microscooppodium. Kies de 40x objectieflens en observeer de cellen onder het groene licht (550 nm). Beweeg de grove scherpstelknop totdat de contouren van gistcellen verschijnen. Verplaats de fijne scherpstelknop om de cellen scherp te stellen.
- Detecteer de cellen met de microscoopsoftware. Sluit het gezichtsveld van de microscoop en schakel over naar het computerscherm. Klik op Live, wacht 3-5 s en klik op Capture om een foto te maken. Sla de afbeelding op.
- Schakel de computer, microscoop en fluorescerende lichtbron uit.
8. Data-acquisitie: FACS
OPMERKING: Groene fluorescentie wordt gedetecteerd via flowcytometrie (d.w.z. fluorescentie-geactiveerde celsortering [FACS] metingen). Gistcellen worden over het algemeen gekweekt bij 30 °C en 240 rpm om FACS-experimenten uit te voeren. Cellen kunnen echter enkele voorzorgsmaatregelen vereisen, afhankelijk van hun genetische inhoud. Cellen die het dCas12a-VPR-gen bevatten (gecontroleerd door de GPD-constitutieve promotor) moeten gedurende 24 uur in de SDC-oplossing worden gekweekt. Daarna worden cellen verdund in een verhouding van 1:100 in verse SDC en nog eens 12 uur gekweekt voordat de fluorescentie-intensiteit wordt gemeten. Cellen gemodificeerd met het AcrIIA4-HBD(hER)- gen vereisen ook verdunning. Bovendien moet OD600 worden gecontroleerd. Ten eerste mogen de cellen 's nachts (meer dan 14 uur) in SDC groeien. In de ochtend wordt OD600 gemeten. Vervolgens wordt de cultuur verdund in SDC, geleverd met een diverse concentratie β-oestradiol, tot OD600 = 0,1. Vóór FACS-experimenten worden de cellen nog eens 7 uur gekweekt, zodat OD600 0,8-1,0 bereikt. Cellen die dCas9-VP64 of dCas12a-VP64 tot expressie brengen, worden gedurende 20-24 uur in SDC gekweekt zonder verdunning en verdere groei vóór de metingen aan de FACS-machine.
- Schakel de FACS-machine 20 minuten voor de metingen in om de laser op te warmen.
- Bereid de monsters voor (verdunning): meng 20 μL van de celcultuur met 300 μL ddH2O.
- Voer de FACS-software uit op de computer die is aangesloten op de FACS-machine en maak een nieuw experiment. Stel de meetparameters in (d.w.z. FSC(SSC)-A/H/W en histogram).
- Selecteer het filter op basis van de excitatie- en emissiegolflengten van de monsters. Het doeleiwit hier is bijvoorbeeld yEGFP, waarvan de excitatie- en emissiegolflengten respectievelijk 488 nm en 507 nm zijn. Selecteer dus het FITC- of GFP-filter (excitatiegolflengte: 488 nm; emissiegolflengte: 527/32 nm). Stel het aantal acquisitiecellen in op 10.000.
- Pas de FITC-filterspanning aan door de intensiteit van fluorescerende kralen te meten. Zorg ervoor dat het relatieve verschil in de intensiteit van de kralen tussen twee opeenvolgende experimenten niet groter is dan 5%.
- Was de machine met ddH2O gedurende enkele seconden om eventuele overtollige kralen te verwijderen.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van het monster. Klik op Preview en wacht 3-5 s voor de stabiliteit van de monsterinjectie. Klik ten slotte op Verwerven.
- Meet de kralen opnieuw aan het einde van het experiment. De spanning is de spanning die werd gebruikt tijdens de eerste kralenmeting (zie stap 8.4, 438-441 V). Controleer of het relatieve verschil tussen de afmetingen van de twee kralen groter is dan 5%.
- Exporteer de FACS-gegevens als FCS-bestanden.
- Analyseer de FCS-bestanden met R Studio-software.
9. Data-analyse
OPMERKING: Gebruik het Flowcore R Bioconductor-pakket 32 binnen R studio. De FCS-bestanden werden geanalyseerd met behulp van een script geschreven in R-taal.
- Open R studio en laad het script Bdverse analyse. R om de FCS-bestanden te analyseren.
- Stel de experimentnaam (ename), de map (pad) in waar de FCS-bestanden zich bevinden
Opgeslagen (dir_d) en waar de resultaatbestanden worden gemaakt (dir_r). - Stel het fluorescentiekanaal in. Bijvoorbeeld, select_ch = "GPA-A" als groene fluorescentie werd gemeten.
- Stel het aantal monsters in dat is gemeten (s_num).
- Stel de afmetingen van elke dot plot (sxlim, sylim) in. Stel de maximale lengte van de x- en y-as in voor staafplots en boxplots (xlimit, ylimit). xlimit moet groter zijn dan of gelijk zijn aan s_num.
- Kies de gating-methode door de # uit de overeenkomstige regels te verwijderen.
OPMERKING: morphGate is een automatische gating-methode die wordt uitgevoerd door het script (d.w.z. het gebied van de puntplots waar de cellen dichter zijn, wordt herkend en geselecteerd door het programma). polygonGate en rectangleGate vereisen om naar de puntplots te kijken en de hoekpunten van een veelhoek of de zijkant van een rechthoek te definiëren die de zone omvat waar de meeste cellen liggen. - Selecteer het object flowSet gated, dat overeenkomt met de gekozen gatingmethode. Selecteer de resolutie van de puntplot (res; moet ten minste gelijk zijn aan 256).
- Verwijder het commentaar flt_low <- filter_low(sp) om metingen te verwijderen waarbij de fluorescentie negatief is. Verwijder het commentaar flt_sp <- filter(flt_lw) om uitschieters als gevolg van andere experimenten te verwijderen.
- Druk op Bron en voer het script uit. Alle bestanden met de resultaten van de analyse worden in dir_r gemaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sgRNA/crRNA-expressie door een RNA-polymerase III-type promotor
Ten eerste had dit werk betrekking op de engineering van het transcriptionele activeringscircuit (circuit 1) weergegeven in figuur 1A. Het bevatte drie basiscomponenten: 1) het gen dat codeert voor yEGFP (de reporter), dat werd voorafgegaan door een reeks verschillende synthetische promotors die doellocaties leverden voor dCas9 / dCas12a-AD; 2) een voor gistcodon geoptimaliseerde versie van dCas9 of dCas12a gefuseerd met een activeringsdomein (respectievelijk VP64 en VPR) en met een of twee nucleaire lokalisatiesequenties (NLS'en). Beide dCas-eiwitten werden geproduceerd door een sterke constitutieve promotor-pGPD; en 3) een sgRNA/crRNA-sequentie die dCas9/dCas12a-AD naar de doellocaties leidde. De activeringsefficiëntie van dCas9/dCas12a-gebaseerde activatoren werd gevisualiseerd en weerspiegeld door de fluorescentie-intensiteit van de reporter (gemeten via FACS-experimenten).
Eén dCas9-eiwit (dSpCas9) en twee dCas12a-eiwitten (denAsCas12a en dLbCas12a) werden getest. Een 3,36-voudige activering werd bereikt met dSpCas9 uitgebreid, op zijn C-eindpunt, met de VP64 AD en het binden van een synthetische promotor-upstream van yEGFP - met zes kopieën van de lexOp-doelsite. Het sgRNA werd in een integratieve shuttlevector geplaatst en getranscribeerd door de RNA-polymerase III-afhankelijke SNR52-promotor (SNR52i-configuratie , zie figuur 1B). In het geval van dCas12a retourneerde denAsCas12a-VPR de hoogste activering (4,45-voudig) van een synthetische promotor met drie operatoren wanneer het crRNA werd uitgedrukt via de SNR52i-configuratie (figuur 1C). Onder dezelfde omstandigheden bereikte dLbCas12a-VPR zijn beste fluorescentieverbetering (3,21-voudig) (figuur 1D). Opgemerkt moet worden dat de vergelijkingsterm in elk experiment een circuit was waarvan het sgRNA / crRNA de lex-operatoren niet kon binden.
Multicopy plasmiden zijn niet nodig
De SNR52i sgRNA-expressiecassette werd vervangen door een RGR-structuur die tot expressie kwam door een matig sterke promotor-pADH1. In zowel dCas9- als dCas12a-gevallen leek activering in aanwezigheid van een sgRNA/crRNA gegenereerd door de zelfsplitsing van RGR echter vergelijkbaar met of zelfs lager dan die bereikt met een sgRNA/crRNA geproduceerd via SNR52i, ondanks het feit dat pSNR52 werd beschouwd als een zwakke promotor (zie figuur 1C,D voor de eerste resultaten verkregen met dCas12a).
Om het verband tussen de hoeveelheid sgRNA/crRNA en de activeringsefficiëntie verder te onderzoeken, werden de twee sgRNA/crRNA-expressiesystemen ingebracht in een episomaal plasmide, dat in 10-40 kopieën door de cel kan worden opgenomen en een grotere hoeveelheid sgRNA/crRNA kan genereren. Zoals te zien is in figuur 2A, was de activering door crRNA op een integratief plasmide (SNR52i of RGRi) 1,4- tot 2,4-voudig hoger dan wanneer hetzelfde crRNA werd uitgedrukt door een episomaal plasmide (SNR52m of RGRm). De trend werd bevestigd door het sgRNA. In dit geval garandeerde het integratieve plasmide een 1,1- tot 1,5-voudig hogere activering (figuur 2B). Om uit te sluiten dat de resultaten werden veroorzaakt door een verlies van de episomale plasmiden, werd RT-qPCR uitgevoerd om de relatieve abundantie van sgRNA / crRNA in vivo te kwantificeren. De resultaten, in figuur 2C,D, bevestigden dat de episomale vector een veel hoger niveau van sgRNA / crRNA produceerde dan de integratieve vector, ongeacht het expressiesysteem (RGR of SNR52). Deze resultaten toonden aan dat het SNR52-systeem nog beter kon werken dan het RGR-systeem, en een hogere hoeveelheid sgRNA / crRNA in de cel garandeerde geen hogere activering door het CRISPR-Cas-systeem. Daarom mogen episomale plasmiden niet worden gebruikt bij de constructie van gendigitale circuits waar dCas9/dCas12a-AD worden gebruikt.
Scaffold RNA-engineering
Een scRNA werd gemanipuleerd door de sequentie van een sgRNA uit te breiden met MS2-haarspeldstructuren die het mogelijk maakten VP64 AD te rekruteren wanneer het werd gefuseerd met het MS2-vachteiwit (MCP, zie figuur 3A). Op deze manier waren er geen engineering van, noch aanpassingen aan dCas9 nodig. Er werden twee MS2-varianten uitgeprobeerd: wt en f6. Het scRNA met de enkele MS2 haarspeldbocht 1×MS2(wt) en 1×MS2(f6)-gaf respectievelijk een 5,27-voudige en een 4,34-voudige activering. Het scRNA met een combinatie van de twee haarspelden-2×MS2(wt+f6)-retourneerde echter de algehele hoogste activatie in deze studie (7,54-voudig, zie figuur 3B). Deze resultaten toonden aan dat het engineeren van een scRNA veel effectiever was dan het rechtstreeks fuseren van activeringsdomeinen met dSpCas9.
Booleaanse poort op basis van Acr-eiwitten
Om transcriptionele activering door CRISPR-Cas-systemen verder te regelen en af te stemmen, werd circuit 1 aangepast met de insertie van een vierde TU voor de expressie van anti-CRISPR-eiwitten (zie figuur 4A voor AcrIIAs en figuur 5A voor AcrVA's). Na aan te tonen dat Acrs effectief waren, in S. cerevisiae, in tegenstelling tot de activering als gevolg van dCas9/dCas12a-AD, werd een nieuw circuit gebouwd (zie figuur 5D) om de AcrVA-werking op dCas12a-gebaseerde repressoren te testen (een eerder werk33 had al aangetoond dat AcrIIAs dCas9-gebaseerde gen-downregulatie konden remmen). De nieuwe, Acr-bevattende kleine netwerken werkten als eenvoudige Booleaanse poorten (JA en NIET), wat zou kunnen leiden tot een restyling van de invoerlaag van complexere synthetische gendigitale circuits.
AcrIIA4 is een sterke remmer van dSpCas9
Vier verschillende promotors met verschillende sterke punten werden gebruikt om de expressie van drie soorten AcrIIs-AcrIIA2, AcrIIA4 en AcrIIA5 aan te sturen. De resultaten toonden aan dat de drie AcrIIs op een dosisafhankelijke manier werkten in S. cerevisiae. Wanneer uitgedrukt door een sterke promotor-pGPD-ze verlaagden het fluorescentieniveau bereikt door dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64 tot respectievelijk 0,21, 0,11 en 0,13 van de waarde (figuur 4B). Aangezien AcrIIA4 de enige was die een hoge remming van fluorescentie-expressie veroorzaakte, zelfs wanneer geproduceerd door een zwakke, synthetische promotor-genCYC1t_pCYC1noTATA - konden we concluderen dat AcrIIA4 de sterkste remmer was van de drie AcrIIs. Vervolgens werd de HBD(ER) gefuseerd met het C-eindpunt van AcrIIA4 om een β-oestradioldetectieapparaat te bouwen (zie figuur 4C). In aanwezigheid van het oestrogeen β-oestradiol kon AcrIIA4-HBD (ER) transloceren in de kern en vervolgens de functie van de op dSpCas9 gebaseerde activator neutraliseren. De titratiecurve in figuur 4D laat zien dat het circuit zich gedraagt als een NOT-poort met een AAN/UIT-verhouding van bijna 2,3.
AcrVA's zijn onderdrukkers van dCas12a-eiwitten
Een NOT-poort werd ontworpen en gebouwd door de pGAL1-aangedreven AcrVA-expressiecassette in circuit 1 te plaatsen. Op deze manier zou de AcrVA-synthese, en de daaruit voortvloeiende onderdrukking van dCas12a-AD, kunnen worden geïnduceerd door galactose (figuur 5A). Zoals te zien is in figuur 5B,C, belemmerde AcrVA1 zowel denAsCas12a als dLbCas12a als activatoren door de fluorescentie-expressie te verminderen van 19% tot 71%, afhankelijk van het circuitschema. AcrVA4 en AcrVA5 kunnen geen actie ondernemen op denAsCas12a34. Ze voerden echter een sterke remming uit van op dLbCas12a gebaseerde activatoren door fluorescentie-expressie te verminderen tot 84% (AcrVA5) en 82% (AcrVA4). Over het algemeen bleek AcrVA5 de meest betrouwbare te zijn, van deze drie AcrVA's, in het remmen van dLbCas12a-gebaseerde activatoren omdat het in verschillende circuits meer dan 70% repressie garandeerde.
AcrVA1-werking is concentratieafhankelijk
De relatie tussen de in vivo concentratie van AcrVA's en hun remmende effecten op zowel activatoren als repressoren op basis van denAs/dLbCas12a werd ook bestudeerd. Daartoe werd elke AcrVA uitgedrukt onder verschillende promotors: de sterke pGAL1, de middelsterke pTEF1 en de zwakke genCYC1t_pCYC1noTATA. Zoals geïllustreerd in figuur 5E, vertoonde AcrVA1 grote fluctuaties in zijn prestaties, afhankelijk van de promotor die de synthese leidde. AcrVA1 werkte alleen redelijk goed wanneer geproduceerd door pGAL1. Onder pTEF1 en genCYC1t_pCYC1noTATA vertoonde AcrVA1 enige repressie op de kale dLbCas12a. AcrVA4 en AcrVA5 bleken daarentegen minder gevoelig te zijn voor hun concentratie, vooral bij interactie met de kale dLbCas12a.
Deze gegevens toonden aan dat AcrVA4 en AcrVA5 over het algemeen beter presteerden dan AcrVA1 bij het remmen van op dLbCas12a gebaseerde transcriptiefactoren in S. cerevisiae. Opgemerkt moet worden dat AcrVA5 een eigenaardig werkingsmechanisme heeft, omdat het fungeert als een enzym dat LbCas12a permanent wijzigt. Zoals hierboven vermeld, kan AcrVA5 (samen met AcrVA4) echter niet interageren met denAsCas12a.
Wanneer AcrVA's werden uitgedrukt onder pGAL1, worden circuits ofwel YES-poorten (dCas12a was gefuseerd met een AD) of NOT-poorten (kale dCas12a). De eerste zag er allemaal zeer performant uit, terwijl de laatste beter leek te werken in de aanwezigheid van AcrVA4 of AcrVA5.
Figuur 1: Transcriptionele activering gemedieerd door dCas9/dCas12a-AD. (A) Schakel 1-diagram. De synthetische promotors van yEGFP bevatten zes (6x) en drie (3x) kopieën van doellocaties voor respectievelijk dCas9 of dCas12a. Daarna combineert dCas9/dCas12a-AD met sgRNA/crRNA; De synthetische promotor wordt getarget en geactiveerd vanwege de aanwezigheid van de activeringsdomeinen. (B) De beste activeringsefficiëntie van dSpCas9-VP64 werd bereikt wanneer er zes lexOp-doellocaties op de synthetische promotor waren en het sgRNA werd getranscribeerd door SNR52i. (C,D) De hoogste activeringsefficiëntie van dCas12a-VPR werd verkregen wanneer drie exemplaren van lexOp in de synthetische promotor werden ingebracht en het crRNA werd gegenereerd door SNR52i. SNR52i betekent dat het sgRNA/crRNA werd geproduceerd door pSNR52 en dat de expressiecassette in een integratieve shuttlevector werd geplaatst. RGRi betekent dat een integratief plasmide dat de RGR-cassette host om sgRNA / crRNA uit te drukken, werd gebruikt. De negatieve controle, "-", vertegenwoordigt een sgRNA/crRNA dat een gecodeerde spacersequentie bevat die niet overeenkomt met de lexOp-site of met een sequentie langs het gistgenoom. "bA" geeft aan dat het sgRNA/crRNA de antisense-streng van doel-DNA bindt, terwijl "bS" staat voor het binden van de zintuigstreng. Elk fluorescentieniveau vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van ten minste drie onafhankelijke experimenten (d.w.z. uitgevoerd op verschillende dagen). Foutbalken zijn de standaarddeviatie van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De vergelijking van integratieve en episomale plasmide-producerende sgRNA/crRNA. (A) Activeringsefficiëntie van dLbCas12a-VPR:crRNA bij het richten op een enkele locatie op de promotor stroomopwaarts van yEGFP. (B) dSpCas9-VP64:sgRNA geactiveerd n× synthetische promotor ("n" staat voor het aantal lexOp-doellocaties). (C,D) Genormaliseerd sgRNA/crRNA expressieniveau15,16. "i" betekent dat de sgRNA/crRNA-expressiecassette in een integratieve shuttlevector werd geplaatst, terwijl "m" staat voor multicopy (d.w.z. episomaal) plasmide. "bA"/"bS" geeft aan dat het sgRNA/crRNA de antisense/sense streng van het DNA bindt. "ctrl" is een negatieve controle, waarbij een vervormd sgRNA/crRNA werd uitgedrukt. Elk fluorescentieniveau vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van ten minste drie onafhankelijke experimenten (d.w.z. uitgevoerd op verschillende dagen). Foutbalken zijn de standaarddeviatie van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De activeringsefficiëntie van de kale dSpCas9 in complex met een scRNA. (A) Het schematische diagram van de interacties tussen scRNA, MCP-VP64 en de kale dSpCas9 16. De kapachtige structuur in paars staat voor MCP (MS2 coat protein). Eén MS2-haarspeld (de paarse structuur in het scRNA) kan twee kopieën van MCP rekruteren en binden. Een scRNA maakt dus niet alleen DNA-binding door dSpCas9 mogelijk, maar ook activering van genexpressie door de rekrutering van MCP-VP64. (B) De activeringsefficiëntie van dSpCas9:scRNA-MCP-VP64. Er werden drie soorten scRNA getest: een met de wild-type MS2 haarspeld×MS2 (wt), een andere ontworpen met de f6 MCP aptamer-1×MS2 (f6), en de laatste met beide haarspelden-2×MS2 (wt + f6), die het meest performant bleek te zijn. Elk fluorescentieniveau vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van ten minste drie onafhankelijke experimenten (d.w.z. uitgevoerd op verschillende dagen). Foutbalken zijn de standaarddeviatie van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: AcrIIA-gerelateerde circuits en resultaten . (A) De AcrIIA-expressiecassette is in circuit 1 geplaatst. Deze extra TU bevat pGPD die de expressie van AcrIIAs leidt om dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64 tegen te gaan. (B) De remmingsefficiëntie van AcrIIAs op de beste op dSpCas9 gebaseerde activator in figuur 3B. De zwarte stippellijn vertegenwoordigt de fluorescentie in aanwezigheid van de op dSpCas9 gebaseerde activator. De figuren boven elke kolom tonen de remmingsefficiëntie berekend als de UIT/AAN-verhouding (d.w.z. het fluorescentieniveau in aanwezigheid van het AcrIIA gedeeld door de fluorescentie bij afwezigheid van AcrIIA). In de legende neemt de kracht van de vier constitutieve promotors geleidelijk toe van boven naar beneden. (C) Diagram van de β-oestradioldetectie (NOT gate) die AcrIIA4-HBD(hER) uitdrukt. (D) Titratiecurve van het circuit in (C)16. De groene curve verwijst naar de verandering in fluorescentie in het functionele circuit. De zwarte curve werd afgeleid van de stam zonder de expressie van AcrIIA4-HBD(hER)-de negatieve controle. De stippellijn in grijs markeerde het fluorescentieplateau bij het evenwicht. Het werd berekend als het gemiddelde van de fluorescentiewaarden bij concentraties van β-oestradiol niet lager dan 125 nM. Elk fluorescentieniveau vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van ten minste drie onafhankelijke experimenten (d.w.z. uitgevoerd op verschillende dagen). Foutbalken zijn de standaarddeviatie van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: AcrVA-gerelateerde circuits en resultaten. (A) De AcrVA-expressiecassette is in circuit 1 geplaatst. De nieuwe TU bevat de induceerbare promotor pGAL1 stroomopwaarts van de AcrVA-genen die de werking van dCas12a-AD neutraliseren. Het nieuwe circuit is een NOT-poort gereguleerd door galactose. (B,C) Resultaten van de galactose-responsieve NOT gate in (A). Hier stuurt pGAL1 de synthese van AcrVA's aan, die vervolgens interageren met dCas12a-AD15. De relatieve fluorescentie komt overeen met de UIT/AAN-verhouding. (D) Galactose-responsieve JA-poort. Het maakt gebruik van AcrVA's onder de controle van pGAL1 en de kale dCas12as die de synthese van yEGFP onderdrukt. (E) Vergelijking van de remmingsefficiënties van AcrVA's uitgedrukt door promotors van verschillende sterkte15. De groepen "AcrV-effecten op repressie" en "kale dLb" verwijzen naar het circuit in (D). De groepen "AcrV-effecten op activering" en "dLb-VPR" zijn de resultaten van de NOT-gate in (A). Elk fluorescentieniveau vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van ten minste drie onafhankelijke experimenten (d.w.z. uitgevoerd op verschillende dagen). Foutbalken zijn de standaarddeviatie van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Een lijst van alle DNA-sequenties die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Een lijst van primers die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende coderingsbestanden: Het R-studioscript om de FCS-bestanden te analyseren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol toonde een mogelijke complete workflow voor synthetische gen-digitale circuits, volgens de "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) biologische engineeringcyclus en met betrekking tot zowel dry-lab als wet-lab experimenten. Hier hebben we ons gericht op het CRISPR-Cas-systeem, voornamelijk dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a en de bijbehorende anti-CRISPR-eiwitten, door kleine transcriptionele netwerken van S. cerevisiae te ontwerpen en in te bouwen. Sommigen van hen bootsten Booleaanse poorten na, die de basiscomponenten van digitale circuits zijn. Alle hier beschreven circuits stelden ons in staat om de eigenschappen en kenmerken van CRISPR-geassocieerde en anti-CRISPR-eiwitten in S. cerevisiae weer te geven. Deze resultaten zijn essentieel om deze eiwitten op te nemen in het schema van gendigitale circuits.
Het DBTL-concept biedt een kader in de synthetische biologie, terwijl veel optimalisaties en verbeteringen zullen worden aangebracht na het testen van een nieuw artefact. In circuit 1 was er bijvoorbeeld aanvankelijk slechts één doellocatie (één exemplaar van lexOp) voor dCas9/dCas12a-AD op de synthetische promotor stroomopwaarts van yEGFP. Na het testen van die circuitconfiguratie ontdekten we dat het niet meer dan een tweevoudige activering15,16 kon bereiken. Vervolgens gingen we ervan uit dat door het aantal exemplaren van lexOp te verhogen, zoals in7, we een hogere transcriptionele activering konden bereiken. Inderdaad, een hoger fluorescentieniveau werd verkregen door drie tot zes lexOp-sites te gebruiken (figuur 1). Bovendien hebben we de prestaties van de circuits die dSpCas9 hosten verder verbeterd door een scRNA te ontwikkelen, wat gemakkelijker is dan het fuseren van een of meer AD's met een groot eiwit zoals dSpCas9 (figuur 3). Bovendien, door een promotor van verschillende sterktes te gebruiken om de drie AcrIIAs te produceren die we kozen, concludeerden we dat AcrIIA4 de sterkste remmer onder hen was. Daarom hebben we een nieuwe NOT-poort gebouwd die reageert op β-estradiol door de HBD (ER) te fuseren met AcrIIA4 en de sterke onderdrukking van AcrIIA4 uit te buiten op onze beste dSpCas9-gebaseerde activator (figuur 4).
Evenzo hebben we zowel de werking van denAsCas12a als dLbCas12a in gist en hun interacties met drie AcrVA's diep gekarakteriseerd (figuur 5). Voor elk dCas12a-AcrVA-paar bouwden we een NOT (dCas12a was gefuseerd met een AD) en een YES (kale dCas12a) gate die reageert op galactose. Over het algemeen resulteerde dLbCas12a, samen met AcrVA5, in het beste systeem om eenvoudige logische functies te berekenen.
De hier beschreven methode bevatte enkele kritieke stappen. Alle eiwit-DNA-sequenties waren gistcodon-geoptimaliseerd om een hogere expressie in S. cerevisiae te garanderen. Om niet-specifieke doelwitten van dSpCas9/denAsCas12a/dLbCas12a in het genoom van S. cerevisiae te vermijden, selecteerden we een bacteriële operator zoals lexOp. Bovendien vertoonden stammen die de GAL1-promotor bevatten een significante groeivertraging die de toepasbaarheid van pGAL1 op synthetische gencircuits15 zou kunnen beperken.
Sommige wijzigingen kunnen ook worden aangebracht in enkele stappen in de algemene methode. Om de efficiëntie van de verteringsligatieprocedure te verbeteren, verdient het de voorkeur om 10 μg ('s nachts) van zowel het insert-bevattende plasmide als de acceptorvectoren te verteren, in plaats van slechts 5 μg in 1 uur. Op deze manier wordt een hogere DNA-concentratie bereikt na de elutiestap. De tijd voor T4-ligatie moet worden verlengd van 1 uur (protocol van de fabrikant) tot 8 uur. Ten slotte moeten stammen die het dCas12a-VPR-fusie-eiwit bevatten, na een cultuur van 24 uur worden verdund en nog eens 12 uur worden gekweekt voordat een FACS-experiment wordt uitgevoerd. Onder deze voorwaarde is de variabiliteit tussen de fluorescentieniveaus van verschillende cellen niet langer te hoog en gaat een aanvaardbare standaarddeviatie gepaard met de gemiddelde waarde van de fluorescentie-intensiteit over een celpopulatie.
Samenvattend legde dit protocol uit hoe het ontwerp van digitale gencircuits kan worden vereenvoudigd door gebruik te maken van dCas-eiwitten en mogelijk anti-CRISPR-eiwitten. Wat nog belangrijker is, we hebben in detail laten zien hoe deze families van eiwitten werken in S. cerevisiae en welke van hen het meest veelbelovend zijn voor een toekomstig gebruik binnen digitale netwerken. Een onopgelost probleem is de koppeling van CRISPR-dCas/anti-CRISPR-systemen en chemicaliën, die de circuitingangen vertegenwoordigen en dCas-eiwitten of anti-CRISPR's niet direct kunnen binden. Hier hebben we het probleem omzeild door de induceerbare GAL1-promotor of de HBD (ER) te gebruiken die aan AcrIIA4 is gekoppeld. Een manier om de architectuur van de circuitinvoerlaag te generaliseren is echter noodzakelijk om synthetische gendigitale circuits te ontwerpen voor verschillende bio-engineeringgebieden zoals metabole engineering, biosynthese, biosensing, biodiagnostiek en bioremediatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.
Acknowledgments
We willen alle studenten van het Synthetic Biology lab-SPST, TJU-bedanken voor hun algemene hulp, samen met Zhi Li en Xiangyang Zhang voor hun hulp bij FACS-experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mL PCR 8-strip tubes | NEST | 403112 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 15 mL Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | |
| 50 mL Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| Agarose-molecular biology grade | Invitrogen | 75510-019 | |
| Ampicillin sodium salt | Solarbio | 69-52-3 | |
| Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375786 | |
| AxyPrep DNA gel extraction kit | Axygen | AP-GX-250 | |
| BD FACSuite CS&T research beads | BD | 650621 | Fluorescent beads |
| BD FACSVerse flow cytometer | BD | - | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge Sorvall ST 16R | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | |
| E. coli competent cells (Strain DH5α) | Life Technologies | 18263-012 | |
| ECL select Western Blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2235 | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd | JY300C | |
| Flat 8-strip caps | NEST | 406012 | |
| Gene synthesis company | Azenta Life Sciences | https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | |
| HiFiScript cDNA synthesis kit | CWBIO | CW2569M | Kit used in step 6.2.2.1 |
| Lysate solution (Zymolyase) | zymoresearch | E1004-A | |
| Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope | Nikon | - | Fluorescence microscope |
| Pipet tips—10 μL | Axygen | T-300-R-S | |
| Pipet tips—1000 μL | Axygen | T-1000-B-R-S | |
| Pipet tips—200 μL | Axygen | T-200-Y-R-S | |
| pRSII403 | Addgene | 35436 | |
| pRSII404 | Addgene | 35438 | |
| pRSII405 | Addgene | 35440 | |
| pRSII406 | Addgene | 35442 | |
| pRSII424 | Addgene | 35466 | |
| pTPGI_dSpCas9_VP64 | Addgene | 49013 | |
| Q5 High-fidelity DNApolymerase | New England Biolabs | M0491 | |
| Restriction enzyme-Acc65I | New England Biolabs | R0599 | |
| Restriction enzyme-BamHI | New England Biolabs | R0136 | |
| Restriction enzyme-SacI-HF | New England Biolabs | R3156 | |
| Restriction enzyme-XhoI | New England Biolabs | R0146 | |
| Roche LightCycler 96 | Roche | - | Real-Time PCR Instrument |
| S. cerevisiae CEN.PK2-1C | - | - | The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2 |
| Stem-Loop Kit | SparkJade | AG0502 | Kit used in step 6.2.1.3 |
| T100 Thermal Cycler | BIO-RAD | 186-1096 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| T5 Exonuclease | New England Biolabs | M0363 | |
| Taq DNA ligase | New England Biolabs | M0208 | |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0495 | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) | Takara | RR820Q | |
| YeaStar RNA kit | Zymo Research | R1002 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E8875 |
References
- Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).
- Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).
- Mandell, J. G., Barbas, C. F. Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases. Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Drinnenberg, I. A., et al.
- Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates. Nature Communications. 8, 15459 (2017).
- Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas. ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).
- Nakamura, M., et al. Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells. Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).
- Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131 (1), 129-134 (1993).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Gao, Y., Zhao, Y. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
- Yu, L., Marchisio, M. A. Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins. ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).
- Zhang, Y., Marchisio, M. A. Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).
- Sheff, M. A., Thorn, K. S. Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Chee, M. K., Haase, S. B. New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae. G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. Fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Sanger, F.
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Zalatan, J. G., et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).
- Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits. Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).
- Rauch, B. J., et al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).
- Hynes, A. P., et al. An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9. Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).
- Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science. 362 (6411), 236-239 (2018).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Hahne, F., et al. flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry. BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).
- Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae. Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).
- Dong, L., et al. An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).
