Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64539
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University
* These authors contributed equally

Summary

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

Abstract

גנים סינתטיים לשערים בוליאניים ולמעגלים דיגיטליים יש מגוון רחב של יישומים, החל מאבחון רפואי ועד לטיפול סביבתי. גילוי מערכות CRISPR-Cas והמעכבים הטבעיים שלהן - חלבוני האנטי-קריספר (Acrs) - מספק כלי חדש לתכנון ויישום מעגלים דיגיטליים של גנים in vivo . כאן, אנו מתארים פרוטוקול העוקב אחר הרעיון של מחזור ההנדסה הביולוגית "תכנון-בנייה-בדיקה-למידה" ועושה שימוש ב- dCas9/dCas12a יחד עם ה- Acrs המתאימים שלהם כדי ליצור רשתות שעתוק קטנות, שחלקן מתנהגות כמו שערים בוליאניים, ב - Saccharomyces cerevisiae. תוצאות אלה מציינות את המאפיינים של dCas9/dCas12a כגורמי שעתוק. בפרט, כדי להשיג הפעלה מקסימלית של ביטוי גנים, dSpCas9 צריך לקיים אינטראקציה עם RNA פיגום מהונדס שאוסף עותקים מרובים של תחום ההפעלה VP64 (AD). לעומת זאת, dCas12a יאוחה, במסוף C, עם VP64-p65-Rta (VPR) AD חזק. יתר על כן, הפעילות של שני חלבוני Cas אינה משופרת על ידי הגדלת כמות sgRNA/crRNA בתא. מאמר זה גם מסביר כיצד לבנות שערים בוליאניים בהתבסס על אינטראקציית CRISPR-dCas-Acr. תחום קשירת ההורמונים המאוחה AcrIIA4 של קולטן האסטרוגן האנושי הוא הליבה של שער NOT המגיב ל-β-אסטרדיול, בעוד ש-AcrVAs המסונתזים על ידי מקדם GAL1 המושרה מאפשרים לחקות שערי כן ו-NOT עם גלקטוז כקלט. במעגלים האחרונים, AcrVA5, יחד עם dLbCas12a, הראו את ההתנהגות הלוגית הטובה ביותר.

Introduction

בשנת 2011, חוקרים הציעו שיטה חישובית ופיתחו תוכנה מתאימה לתכנון אוטומטי של מעגלי גנים סינתטיים דיגיטליים1. המשתמש היה צריך לציין את מספר הקלטים (שלוש או ארבע) ולמלא את טבלת האמת המעגלית; זה סיפק את כל המידע הדרוש כדי לגזור את מבנה המעגל באמצעות טכניקות מאלקטרוניקה. טבלת האמת תורגמה לשתי נוסחאות בוליאניות בשיטת מפת קרנאו2. כל נוסחה בוליאנית מורכבת ממשפטים המתארים פעולות לוגיות (סכום או כפל) בין (חלק) קלטי המעגל ושלילותיהם (הליטרלים). סעיפים, בתורם, מסוכמים (OR) או מוכפלים (AND) כדי לחשב את פלט המעגל. כל מעגל יכול להתממש על פי כל אחת משתי הנוסחאות המתאימות: האחת כתובה בצורת קופה (מכפלה של סכומים) והשנייה בצורת SOP (סכום מוצרים). הראשון מורכב מכפל של סעיפים (כלומר, שערים בוליאניים) המכילים סכום לוגי של הליטרלים. האחרון, לעומת זאת, הוא סכום של סעיפים שבהם מכפילים את המילוליים.

מעגלים חשמליים יכולים להתממש, על קרש לחם, על ידי חיווט פיזי של שערים שונים יחד. הזרם החשמלי מאפשר חילופי אותות בין השערים, מה שמוביל לחישוב הפלט.

בביולוגיה המצב מורכב יותר. שער בוליאני יכול להתממש כיחידת שעתוק (TU; כלומר, הרצף "מקדם-קידוד אזור-מסיים" בתוך תאים איקריוטים), שבו שעתוק או תרגום (או שניהם) מוסדרים. לפיכך, לפחות שני סוגים של מולקולות יוצרים חיווט ביולוגי: חלבוני גורם השעתוק והרנ"א האנטיסנס שאינו מקודד1.

מעגל דיגיטלי גנטי מאורגן בשתיים או שלוש שכבות של שערים, כלומר: 1) שכבת הקלט, העשויה משערי כן (חיץ) ולא וממירה את כימיקלי הקלט למולקולות חיווט; 2) השכבה הפנימית, המורכבת מכמה TUs שיש סעיפים בנוסחה הבוליאנית המתאימה. אם המעגל מתוכנן על פי נוסחת SOP, כל סעיף בשכבה הפנימית יפיק את פלט המעגל (למשל, פלואורסצנציה) במה שנקרא ארכיטקטורת פלט מבוזר. אם משתמשים בנוסחת המכפלה של סכום (POS), נדרשת שכבה סופית 3), שתכיל שער כפל יחיד האוסף את מולקולות החיווט מהשכבה הפנימית.

בסך הכל, בביולוגיה סינתטית, ניתן לתכנן סכמות רבות ושונות עבור אותו מעגל. הם נבדלים במספר ובסוג של TUs ומולקולות חיווט. על מנת לבחור את הפתרון הקל ביותר ליישום בתאי שמרים, כל תכנון מעגל משויך לציון סיבוכיות S, המוגדר כ

Equation 1

כאשר A מייצג את מספר המפעילים, R מייצג את מספר המדכאים, ו-A הוא כמות מולקולות האנטיסנס RNA. אם מפעילים או מדכאים נעדרים מהמעגל, תרומתם ל-S היא אפס. לכן, קשה יותר לממש סכמת מעגלים במעבדה (S גבוהה) כאשר היא דורשת מספר גבוה של גורמי שעתוק אורתוגונליים. משמעות הדבר היא כי מפעילים ומדכאים חדשים יונדסו דה נובו על מנת לממש את החיווט המלא בתוך המעגלים הדיגיטליים. באופן עקרוני, ניתן להרכיב חלבונים קושרי דנ"א חדשים באמצעות חלבוני אצבע אבץ3 ואפקטי TAL4 כתבניות. עם זאת, אפשרות זו נראית מפרכת מדי וגוזלת זמן; לכן, יש להסתמך בעיקר על רנ"א קטן ובקרת תרגום כדי לסיים מעגלי גנים מורכבים.

במקור, שיטה זו פותחה כדי לייצר מעגלים דיגיטליים בחיידקים. ואכן, בתאים איקריוטים, במקום רנ"א אנטיסנס, מתאים יותר לדבר על מיקרו-רנ"א (miRNAs) או על רנ"א מפריע קטן (siRNAs)5. עם זאת, מסלול RNAi אינו קיים שמרים S. cerevisiae. לפיכך, יש לבחור ברשתות תמלול מלאות. נניח שמעגל חשמלי זקוק לחמישה מפעילים וחמישה מדכאים; ציון הסיבוכיות שלו יהיה S = 32. ניתן להפחית את מורכבות המעגל על ידי החלפת 10 גורמי השעתוק ב- dCas96 יחיד (Cas9 חסר נוקלאז) המאוחה לתחום הפעלה (AD). כפי שמוצגב-7, dCas9-AD פועל כמדכא בשמרים בעת קשירת מקדם בין תיבת TATA ל-TSS (אתר התחלת שעתוק) וכמפעיל בעת קשירה טובה במעלה הזרם של תיבת TATA. לפיכך, ניתן להחליף 10 גורמי שעתוק בחלבון היתוך dCas9-AD יחיד ו-10 sgRNA (RNA מנחה יחיד) לקבלת ציון סיבוכיות כולל של S = 11. זה מהיר וקל לסנתז עשרה sgRNAs, בעוד שכפי שצוין קודם לכן, הרכבה של 10 חלבונים תדרוש עבודה ארוכה ומסובכת הרבה יותר.

לחלופין, ניתן להשתמש בשני חלבוני dCas אורתוגונליים (למשל, dCas9 ו-dCas12a): אחד כדי להתיך לאלצהיימר, והשני חשוף או בשילוב עם תחום דיכוי. ציון הסיבוכיות יגדל ביחידה אחת בלבד (S = 12). לפיכך, מערכות CRISPR-dCas הן המפתח לבניית מעגלים ספרתיים מורכבים מאוד של גנים בשמרי אפייה (S. cerevisiae).

מאמר זה מאפיין באופן עמוק את היעילות של מדכאים ומפעילים מבוססי dCas9 ו-dCas12a בשמרים. התוצאות מראות כי הם אינם דורשים כמות גבוהה של sgRNA כדי לייעל את פעילותם, ולכן פלסמידים אפיזומליים הם העדיפו להימנע. יתר על כן, מפעילים מבוססי dCas9 יעילים הרבה יותר בעת שימוש ב-RNA פיגום (scRNA) המגייס עותקים של VP64 AD. לעומת זאת, dCas12a עובד היטב כאשר הוא מאוחה ישירות ל-VPR AD החזק. יתר על כן, מקדם מופעל סינתטי דורש מספר משתנה של אתרי מטרה, בהתאם לתצורה של מפעיל (למשל, שלושה בעת שימוש dCas12a-VPR, שישה עבור dCas9-VP64, ורק אחד עם dCas9 ו scRNA). כמדחיק, dCas12a נראה נוקב יותר בעת קשירת אזור הקידוד ולא המקדם.

כחיסרון, עם זאת, CRISPR-dCas9/dCas12a אינם מתקשרים ישירות עם כימיקלים. לכן, ייתכן שלא יועיל להם בשכבת הקלט. מסיבה זו נחקרו עיצובי שערים בוליאניים חלופיים המכילים חלבונים אנטי-קריספר (Acrs). Acrs לפעול על (d)Cas חלבונים ולעכב את פעולתם8. לפיכך, הם אמצעי לווסת את הפעילות של מערכות CRISPR-(d)Cas. מאמר זה מנתח ביסודיות את האינטראקציות בין סוג II Acrs ו- (d)Cas9, כמו גם סוג V Acrs ו- (d)Cas12a ב- S. cerevisiae. מכיוון ש-Acrs קטנים בהרבה מחלבוני Cas, שער NOT המגיב לאסטרוגן β-אסטרדיול נבנה על ידי איחוי תחום קשירת ההורמונים של קולטן האסטרוגן האנושי 9-HBD(hER)-ל-AcrIIA4. חוץ מזה, קומץ שערים של כן ו-NOT שביטאו dCas12a(-AD) באופן מכונן ו-AcrVAs עם אינדוקציה עם גלקטוז מומשו. כיום, שערים אלה משמשים רק כהוכחת היתכנות. עם זאת, הם גם מייצגים את הצעד הראשון לקראת חשיבה מחודשת עמוקה על האלגוריתם לביצוע התכנון האוטומטי החישובי של מעגלים דיגיטליים של גנים סינתטיים בתאי שמרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכנון ובנייה של קלטת ביטוי sgRNA/crRNA

הערה: ישנם שני סוגים של קלטות ביטוי sgRNA/crRNA: SNR5210 המורכב ממקדם SNR52 תלוי RNA פולימראז III, רצף sgRNA/crRNA ומסיים SUP4; מבנה נוסף, המקוצר כ-RGR11, מורכב ממקדם ADH1 תלוי RNA פולימראז II, מבנה RGR (ribozyme-guide RNA-ribozyme) המכיל שני ריבוזימים (ריבוזימי ראש פטיש-HH, וריבוזים-HDV של נגיף הפטיטיס דלתא) ואת רצף ה-sgRNA/crRNA שביניהם, ואת ה-ADH1 terminator. ההומולוגים המנחים את ה-sgRNA Cas9 מורכבים מרצף ספייסר ומהחזרה הישירה האופיינית12, בעוד שה-crRNA עבור חלבוני Cas12a מורכב מהחזרה הישירה ואחריה מרצף הספייסר13,14 (ראו טבלה משלימה 1 לכל רצפי הדנ"א ששימשו במחקר זה).

  1. תכנן את רצף הספייסר עבור הפעלת שעתוק בתיווך Cas9/Cas12a.
    1. רתום את רצף אופרטורי הלקס החיידקי (הנקרא lexOp) לאתר היעד 15,16 והכנס אותו למקדם CYC1 המניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר שמרים (yEGFP)17. לפיכך, רצף הספייסר מוגדר על ידי ומשלים את הלקסופ שהוכנס.
  2. בדוק את האורתוגונליות של רצף הספייסר באמצעות הכלי CRISPRDIRECT18.
    1. הדבק את רצף lexOp שמשני צדדיו רצף PAM בשדה הטקסט, הגדר את רצף PAM כ- NRG עבור dCas9 ו- TTTV עבור dCas12a, וציין את המינים מהרשימה הנפתחת כ - Budding Yeast (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genome. לחץ על עיצוב. ודא שאין אתר יעד תואם בחיפוש 20mer+PAM וגם לא בחיפוש 12mer+PAM.
  3. בנה את קסטת הביטוי sgRNA/crRNA.
    1. השתמש ב- touchdown PCR כדי להגביר את רצפי ה- DNA של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים, כמו מקדמים, רצפי קידוד וטרמינטורים.
      1. הכינו תערובת תגובה המכילה: 20-40 ננוגרם של תבנית DNA, 1 μL של פריימר קדמי 10 מיקרומטר (כלומר, ot25, בניית פלסמיד ביטוי sgRNA/crRNA), 1 μL של פריימר הפוך 10 μM (כלומר, ot26, בניית פלסמיד ביטוי sgRNA/crRNA), 5 μL של תערובת dNTP 2.5 mM, 0.5 μL של DNA פולימראז, 10 μL של 5x DNA פולימראז חיץ תגובה, ומים מזוקקים פעמיים (ddH2O) עד לנפח כולל של 50 μL.
        הערה: עיין בטבלה משלימה 2 לקבלת רשימה של פריימרים ששימשו במחקר זה.
      2. הפעל את תוכנית ה- PCR למגעים על thermocycler:
        שלב 1: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
        שלב 2 עם 10 מחזורים: 98 ° C עבור 10 שניות, 68 ° C עבור 20 שניות, ו 72 ° C עבור 15 שניות.
        שלב 3 עם 25 מחזורים: 98 ° C עבור 10 שניות, 59 ° C עבור 20 שניות, ו 72 ° C עבור 15 שניות.
        שלב 4: 72°C למשך 2 דקות.
        לבסוף, החזק בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לתחילת ניסויי ההמשך.
        הערה: 68°C בשלב 2 ו- 59°C בשלב 3 תלויים בטמפרטורות ההתכה של פריימרים קדמיים והפוכים, המשתנות מזוגות שונים של פריימרים. הזמן ב 72 ° C בשלבים 2 ו -3 נקבע על ידי אורך מוצר PCR ומהירות ה- DNA פולימראז.
    2. בודדו את מוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל (100 וולט, 30 דקות). יש להקפיד על רצפי הדנ"א מג'ל האגרוז באמצעות ערכת מיצוי ג'ל DNA (ראו טבלת חומרים).
      הערה: ג'ל אגרוז 0.8% נדרש עבור מקטעים ארוכים מ- 500 nt, ג'ל אגרוז 1.5% עבור מקטעים בין 100 nt ל- 500 nt, וג'ל אגרוז 2% עבור מקטעים קצרים מ- 100 nt.
    3. הכנס את TU המבטא sgRNA/crRNA לווקטור מעבורת pRSII404/42419, המכיל את הגן לעמידות לאמפיצילין ואת גן הסמן האוקסוטרופי הניתן לבחירת שמרים - TRP1.
      1. עכל את וקטור המעבורת ב 37 ° C במשך 1 שעה עם שני אנזימי הגבלה SacI ו Acc65I. הכינו את תערובת התגובה על ידי הוספת 5 מיקרוגרם של וקטור המעבורת, כמויות האנזימים המומלצות, חיץ העיכול (בהתאם להוראות האנזים) ו- ddH2O עד לנפח כולל של 30 מיקרוליטר.
      2. ודא את העיכול הווקטורי של המעבורת באמצעות אלקטרופורזה בג'ל (ראה שלב משנה 1.3.2). לאחר מכן, נטרלו את שני האנזימים בטמפרטורה של 65°C למשך 20 דקות.
      3. השתמש בשיטת ההרכבה20 של גיבסון כדי להחדיר את מוצרי ה-PCR המטוהרים לווקטור המעבורת החתוך-פתוח על ידי הכנסת תערובת ה-DNA השווה ב-50°C למשך שעה אחת.
      4. התמירו תאים מוכשרים Escherichia coli DH5α עם תערובת תגובת גיבסון לעיל באמצעות שיטת טרנספורמציית הלם חום21. העבירו את תאי E. coli שעברו טרנספורמציה על לוחות אגר Luria-Bertani (LB) המכילים אמפיצילין ( 0.1 גרם / ליטר). הכניסו את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ותנו לתאים לגדול בן לילה.
      5. בחרו ארבע מושבות מצלחת האגר LB ותרבו אותן בנפרד למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C בתמיסת LB המכילה אמפיצילין (0.1 גרם לליטר). לאחר מכן, השתמש בהליך הכנה מיני כדי לחלץ פלסמידים מתאי E. coli 22.
      6. השתמש בפריימרים ot18 ו- ot19 (ראה טבלה משלימה 2 עבור רצפי אוליגו) כדי לרצף ולאשר את יחידת השעתוק שהוכנסה באמצעות שיטת Sanger23.
        הערה: בניסויים מאוחרים יותר, הפלסמידים הבנויים והמאושרים יוכנסו לגנום השמרים באמצעות פרוטוקול PEG/LiAc24.

2. תכנון ובניית קלטת ביטוי RNA פיגום

הערה: הרנ"א מדריך הפיגום (scRNA) מורכב מרצף sgRNA וממבני סיכות הראש MS225. שני סוגים של מבני סיכות ראש MS2 משמשים בעבודה זו: סיכת שיער MS2 מסוג פראי, וחלבון מעיל f6 MS2 (MCP) aptamer-f6.

  1. סנתז תבנית scRNA המסוגלת להכיל רצפי ספייסר שונים (כלומר, pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
    הערה: במחקר זה, תבנית scRNA סונתזה על ידי חברת סינתזת גנים (ראה טבלת חומרים).
  2. תכנן פריימרים מתאימים (ראה טבלה משלימה 2) כדי להריץ PCR על רצפי הספייסר הדרושים.
  3. בצע את ההליכים בשלב 1.3 כדי לבנות קלטת ביטוי scRNA.

3. dSpCas9 הנדסת ובניית פלסמיד ביטוי

  1. השג את pTPGI_dSpCas9_VP64 הפלסמיד (ראה טבלת חומרים).
  2. בנה את וקטור הקבלה pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, בהתבסס על וקטור המעבורת pRSII406, באמצעות touchdown PCR ושיטת ההרכבה של Gibson (עיין בשלב 1.3). הפלסמיד מספק מקדם מכונן חזק-pGPD, וטרמינטור-CYC1t.
  3. עכל את הפלסמיד pTPGI_dCas9_VP64 ואת וקטור המקבל החדש שנבנה (5 מיקרוגרם עבור 1 שעות או 10 מיקרוגרם עבור לילה - ראה שלב 1.3.3.1 כהפניה) עם XbaI ו- XhoI ב 37 ° C. הפרד וטהרה את קטע ההוספה ואת וקטור המקבל כמו בשלב 1.3.2.
  4. קשרו את מקטע ההוספה המטוהר ואת וקטור הקבלה עם ליגאז T4 DNA ב 16 °C במשך 8 שעות. הכן את תמיסת הקשירה על ידי הוספת 50-100 ננוגרם של וקטור המקבל המטוהר, מקטעי מטרה מטוהרים בכמות שווה ערך עם וקטור המקבל, 1.5 מיקרוליטר של חיץ T4, 0.5 מיקרוליטר של ליגאז T4 ו- ddH2O עד לנפח כולל של 15 מיקרוליטר.
  5. בצע את שלבים 1.3.3.3 ו- 1.3.3.4. לאחר מכן, ודא כי פלסמיד שנבנה לאחרונה נכון על ידי עיכול עם XbaI ו Xhol (37 ° C, 1 שעות) אלקטרופורזה ג'ל (ראה שלב 1.3.2).

4. dCas12a הנדסה ובניית פלסמיד

  1. בנו את הפלסמידים המבטאים dCas12a-AD.
    1. סנתז שני חלבוני dCas12a ממוטבים לקודון שמרים (denAs12a ו-dLbCas12a) שמשני צדיהם אתרי אנזימי הגבלה BamHI ו-Xhol.
      הערה: במחקר זה, שני חלבוני dCas12a המותאמים לקודון שמרים סונתזו על ידי חברת סינתזת גנים (ראה טבלת חומרים).
    2. בנה את וקטור הקבלה pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 באמצעות touchdown PCR ושיטת ההרכבה של גיבסון (ראה שלב 1.3), כאשר "מקדם" הוא pGPD או pGAL1, "sp" מייצג רצף אקראי קצר, ו- "AD" הוא VPR או VP64.
    3. הכנס כל חלבון dCas12a לשני וקטורי הקבלה החדשים שנבנו באמצעות עיכול עם BamHI ו- XhoI וקשירה עם ליגאז DNA T4 (עיין בשלבים 3.3 ו- 3.4).
  2. בנו את הפלסמידים המבטאים dCas12a חשוף.
    1. בנה וקטור מקבל עבור קלטות הביטוי המושרות בגלקטוז של dCas12a כ- pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t באמצעות touchdown PCR ושיטת ההרכבה של גיבסון (ראה שלב 1.3).
    2. עכל את הפלסמידים המכילים את חלבוני dCas12a ואת וקטור הקבלה לעיל עם BamHI ו- Xhol, ולאחר מכן קשר אותם עם ליגאז DNA T4 כדי לקבל את פלסמיד pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (עיין בשלבים 3.3 ו- 3.4).
    3. עכל את הפלסמיד שהתקבל בשלב 4.2.2 עם Acc65I ו- BamHI, ולאחר מכן החלף את pGAL1 ב- pGPD באמצעות PCR טאצ'דאון ושיטת ההרכבה של גיבסון לבניית pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. הנדסת חלבונים אנטי-קריספר ובניית פלסמיד

הערה: שלושה סוגים של מקדמים שימשו כדי להניע ביטוי Acrs: מקדם אינדוקטיבי-pGAL1, ארבעה מקדמי שמרים-pGPD, pACT1, pTEF1 ו-pTEF2, ומקדם מכונן סינתטי-genCYC1t_pCYC1noTATA26.

  1. השג את הפלסמידים המכילים את הרצפים של Acrs מסוג II (AcrIIA2, AcrIIA427 ו- AcrIIA5 28) ו- V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 ו- AcrVA529) מחברת סינתזת גנים.
  2. בנה את הפלסמידים בהתבסס על וקטור המעבורת pRSII403 כדי לבטא Acrs.
    1. בניית קלטות ביטוי AcrIIA.
      הערה: השתמש ב-touchdown PCR כדי להגביר ארבעה מקדמים שונים (כלומר, pGPD, pACT1, pTEF2 ו-genCYC1t_pCYC1noTATA), שלושת סוגי AcrIIA ושני טרמינטורים (ADH1t ו-CYC1t). בנה סדרה של TUs המבטאים AcrIIAs, תחת מקדמים שונים, באמצעות שיטת ההרכבה של גיבסון (עיין בשלב 1.3).
    2. בניית קלטות ביטוי AcrVA.
      1. סנתז את רצף המקבלים: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, כאשר "sp" הוא רצף אקראי שיוחלף על ידי AcrVAs מאוחר יותר.
        הערה: במחקר זה, רצפי הקבלה סונתזו על ידי חברת סינתזת גנים (Table of Materials).
      2. הרכיבו את וקטורי הקבלה pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, כאשר ה"מקדם" הוא: pGAL1, pTEF1 ו- genCYC1t_pCYC1noTATA. השתמש בשיטת ההרכבה של Gibson (עיין בשלב 1.3).
      3. הכנס כל אחד משלושת ה- AcrVAs לווקטור הקבלה המתואר בשלב 5.2.2.2 (באמצעות touchdown PCR ושיטת ההרכבה של Gibson [ראה שלב 1.3]) כדי לבנות קבוצה של פלסמידים המייצרים AcrVAs.
  3. מהנדס נוסף AcrIIA4 על ידי הרחבת הרצף שלו עם הרצפים של מקשר GS ו- HBD (hER). זה מאפשר בניית מעגל מגיב β אסטרדיול.
    1. השתמש ב-touchdown PCR כדי להשיג חלקי GS-HBD ו-AcrIIA4 בנפרד (ראה שלב 1.3.1).
    2. הכניסו את AcrIIA4, GS-HBD ואת וקטור המעבורת לתוך תערובת גיבסון ובנו את הפלסמיד המלא בשיטת גיבסון (ראו שלב 1.3.3).

6. זיהוי crRNA: RT-qPCR ועיצוב פריימרים

הערה: זיהוי crRNA הושג באמצעות RT-qPCR, אשר מאורגן בשלושה שלבים.

  1. בצעו את מיצוי וטיהור ה-RNA מתאי שמרים באמצעות ערכת RNA.
    1. תאי שמרים בתרבית לילה ב-2 מ"ל של מדיום שלם סינתטי מוגדר (SDC, נפח 1 ליטר: 20 גרם גלוקוז, 2 גרם תערובת AA, 6.7 גרם YNB, 396 מ"ג לאוצין, 79.2 מ"ג טריפטופן, 79.2 מ"ג היסטידין ו-79.2 מ"ג אורציל) באמצעות צלחת 24 בארות (240 סל"ד, 30 מעלות צלזיוס).
    2. בבוקר, לדלל את תרבית התאים (1:100) לתוך 2 מ"ל של SDC טרי ולהמשיך לגדל את תאי השמרים ב 30 ° C, 240 סל"ד, במשך 4 שעות נוספות.
    3. קצרו את כל 2 מ"ל של תמיסת התא והצנטריפוגה במהירות של 20,238 x גרם למשך 2 דקות. הסר את הסופרנאטנט בזהירות מכיוון שכדורית התא קטנה.
    4. חלצו את הרנ"א מתאי שמרים באמצעות ערכת RNA.
    5. בדוק את איכות ה- RNA.
      1. הכינו ג'ל אגרוז 1%. ערבבו 5 μL מכל דגימת RNA עם 1 μL של צבע טעינת DNA. לאחר מכן לטעון את התערובת על ג'ל ולהפעיל אותו.
      2. ודא ששני פסים שקופים ב~4,000 nt ו- ~2,000 nt, המתאימים ל- RNA ריבוזומלי (25S/18S), נמצאים על הג'ל. ניתן לראות פס מטושטש נוסף ב~80 nt עבור tRNA.
    6. השתמש בדגימות RNA באופן מיידי לסינתזה cDNA או אחסן אותן ב -80 ° C לשימוש עתידי.
  2. שעתוק הפוך: השתמש בשיטת לולאת גזע30 כדי ליצור את הגדיל הראשון של cDNA המתאים ל- crRNA (40 nt). עבור שעתוק לאחור של sgRNA (כמעט 100 nt), ההליך זהה לזה של סינתזת cDNA של גן הייחוס ACT1.
    הערה: השיטה לשעתוק לאחור של crRNA שונה מזו המשמשת עם sgRNA ו- ACT1 mRNA. מכיוון שה-crRNA קצר מאוד, התייחסו אליו כאל מיקרו-רנ"א והשתמשו בשיטת השעתוק ההפוך של המיקרו-רנ"א (גישת לולאת גזע) כדי להשיג את ה-cDNA המתאים. שתי ערכות סינתזת cDNA (ערכת לולאת גזע עבור crRNA וערכת שעתוק לאחור רגילה עבור הגן ACT1 ) שימשו לכימות crRNA. אותה כמות של רנ"א שימשה בשתי הערכות (ראו טבלת חומרים) כדי להפוך את תוצאות הניסוי לדומות. הפריימר ששימש עם ערכת לולאת הגזע תוכנן על פי רצף לולאת הגזע וששת הנוקלאוטידים האחרונים בקצה 3' של crRNA (עבור רצף לולאת גזע ופריימר, ראה טבלה משלימה 2).
    1. שיטת לולאת גזע לשעתוק לאחור crRNA
      1. הוציאו את תבנית הרנ"א, הפריימר והמאגרים מהמקפיא ותנו להם להימס על קרח.
      2. הסרת DNA גנומי: ראשית, הכינו 10 μL של תערובת התגובה בהתאם להוראות הערכה. שים את התערובת במחזור תרמי ב 42 ° C למשך 2 דקות. לבסוף, העבירו אותו על קרח.
      3. סינתזה של גדיל cDNA הראשון: הכינו 20 μL של תערובת התגובה על ידי הוספת 10 μL של התערובת משלב 6.2.1.2, 1 μL של פריימר לולאת גזע (ריכוז 2 μM), 2 μL של 10x RT reaction buffer, 2 μL של תערובת אנזימי שעתוק לאחור (המכיל את השעתוק ההפוך), ו-5 μL של H2O נטול RNase.
      4. הניחו את תערובת התגובה במחזור תרמי והפעילו את התוכנית הבאה: 25°C למשך 5 דקות, 50°C למשך 15 דקות ו-85°C למשך 5 דקות. השתמש במוצר לתגובת qPCR באופן מיידי או אחסן אותו ב -80 ° C.
    2. sgRNA ו - ACT1 mRNA שעתוק לאחור
      1. תגובה ראשונה: הכינו תערובת של 13 μL המורכבת מתערובת פריימר, תערובת dNTP, תבנית RNA (50 pg-5 μg) ומים נטולי RNase (מלבד תבנית RNA, כולם מסופקים על ידי הערכה), בהתאם להוראות הערכה. השתמש 1 מיקרוגרם של תבנית RNA. הכניסו את התערובת למחזור תרמי בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות.
      2. תגובה שנייה (סינתזת cDNA): הכינו את תערובת התגובה על ידי הוספת הריאגנטים (כמתואר בהוראות הערכה) ל-13 μL של תמיסת התגובה הראשונה עד לנפח סופי של 20 μL. הניחו את התערובת במחזור תרמי למשך 15 דקות ב-50°C ולאחר מכן למשך 5 דקות נוספות ב-85°C. השתמש במוצר לתגובת qPCR באופן מיידי או אחסן אותו ב -80 ° C.
  3. ערכת SYBR עבור qPCR: זיהוי ערך Ct
    הערה: הפריימר ההפוך המשמש ב- qPCR של crRNA קבוע מכיוון שהוא מתאים להשלמה ההפוכה של רצף לולאת הגזע (ראה טבלה משלימה 2). הפריימר הקדמי, לעומת זאת, משתנה ותלוי ברצף של crRNA. הפריימרים קדימה ואחורה עבור sgRNA ו - ACT1 mRNA qPCR מתוכננים https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. שני פריימרים נבחרים כאשר ההפרש בין טמפרטורות ההתכה שלהם אינו גדול מ- 2 מעלות צלזיוס (ראה טבלה משלימה 2). כל דגימה נמדדת בשלושה עותקים משוכפלים.
    1. הכן את תערובת התגובה qPCR בהתאם להוראות היצרן עבור ערכת SYBR.
    2. הגדר את תוכנית qPCR הבאה במכשיר PCR בזמן אמת.
      דגירה: 10 דקות ב 95 ° C.
      שלב PCR: 15 שניות ב 95 ° C, ואחריו 34 s ב 55 ° C. הגדר את מחזור שלב ה- PCR ל- 45 פעמים. שלב ההתכה: 10 שניות ב 95 ° C, ואחריו 60 s ב 65 ° C, ולבסוף 1 s ב 97 ° C.
    3. חשב את ערכי ביטוי ה- mRNA היחסיים באמצעות נוסחת Pfaffl31.

7. Immunofluorescence כדי לזהות חלבונים Cas

הערה: חלבוני Cas (CasP) מאוחים His_tag.

  1. הכנת תאי שמרים
    1. בחרו כמה תאי שמרים באמצעות לולאה סטרילית ותרבו אותם ב-5 מ"ל של מדיום עשיר ב-YPD למשך הלילה ב-240 סל"ד ב-30°C. בבוקר, להוסיף 500 μL של תמיסת התא ל 20 מ"ל של YPD טרי ולגדל אותם ב 240 סל"ד ב 30 ° C עד OD600 מגיע 0.6.
    2. קח 5 מ"ל של התרבית ולערבב אותו עם 500 μL של 37% פורמלדהיד. הניחו לתערובת להישאר בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות. קצרו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1,500 x גרם למשך 5 דקות.
    3. הסר את supernatant ו resuspend את התאים עם 1 מ"ל של חיץ קיבוע (0.1 M KH 2 PO4, 0.5 M MgCl2, 3.7% פורמלדהיד, pH = 6.5). שמור את תמיסת התא ב- RT למשך 20 דקות.
    4. צנטריפוגה את תמיסת התא ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את התאים ב-1 מ"ל של חיץ כביסה (0.1 M KH 2 PO 4,1.2M סורביטול, pH = 6.5) בתוספת 4 μL של בטא-מרקפטואתנולו-4 μL של תמיסת ליזט (5 מ"ג/מ"ל). הכנס את תמיסת התא לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    5. צנטריפוגה את תמיסת התא ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. שטפו את גלולת התא פעמיים עם 1 מ"ל PBS באמצעות צנטריפוגה (1,500 x גרם למשך 5 דקות).
    6. להשהות מחדש את התאים ב 100 μL של PBS בתוספת 0.05% Tween 20 ולהוסיף 4 μL של תמיסת BSA (10 מ"ג / מ"ל). שמור את תמיסת התא ב- RT למשך 20 דקות.
  2. דגירה עם נוגדן ראשוני
    1. הוסף את הנוגדן העיקרי Anti-His tag לתערובת בשלב 7.1.6 בדילול של 1:400. שמור את הפתרון ב- RT למשך שעתיים.
    2. צנטריפוגו את התערובת בשלב 7.2.1 במהירות של 1,500 x גרם למשך 5 דקות והסירו את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל PBST וצנטריפוגה (1,500 x גרם) למשך 5 דקות כדי לשטוף את גלולת התא. חזור על פעולה זו פעמיים. לבסוף, להשליך את supernatant ולהשעות את התאים ב 100 μL של 1x PBST.
  3. זיהוי תאי מיקרוסקופיה
    1. הר את התאים בשקופית; קח 2 μL של תמיסת התא משלב 7.2.2 והנח אותו על מגלשת זכוכית. כסו אותו בכיסוי.
    2. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי, המיקרוסקופ והמחשב. רשום את מספר מקור האור הפלואורסצנטי ופתח את תוכנת המיקרוסקופ במחשב.
    3. שים את השקופית על במת המיקרוסקופ. בחר עדשה אובייקטיבית 40x והתבונן בתאים תחת האור הירוק (550 ננומטר). הזיזו את ידית המיקוד הגסה עד להופעת קווי המתאר של תאי השמרים. הזז את ידית המיקוד העדינה כדי למקד את התאים.
    4. זהה את התאים באמצעות תוכנת המיקרוסקופ. סגור את שדה הראייה של המיקרוסקופ ועבור למסך המחשב. לחץ על שידור חי, המתן 3-5 שניות ולחץ על צלם כדי לצלם תמונה. שמור את התמונה.
    5. כבה את המחשב, המיקרוסקופ ומקור האור הפלואורסצנטי.

8. רכישת נתונים: FACS

הערה: פלואורסצנטיות ירוקה מזוהה באמצעות ציטומטריית זרימה (כלומר, מדידות מיון תאים המופעלות על ידי פלואורסצנטיות [FACS]). תאי שמרים מתורבתים, באופן כללי, ב 30 ° C ו 240 סל"ד כדי להפעיל ניסויים FACS. עם זאת, תאים עשויים לדרוש כמה אמצעי זהירות בהתאם לתוכן הגנטי שלהם. תאים המכילים את הגן dCas12a-VPR (הנשלט על ידי מקדם המכונן GPD ) חייבים להיות מגודלים במשך 24 שעות בתמיסת SDC. לאחר מכן, התאים מדוללים ביחס של 1:100 ב-SDC טרי ומגודלים במשך 12 שעות נוספות לפני מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות. תאים שעברו שינוי עם הגן AcrIIA4-HBD(hER) דורשים דילול גם כן. יתר על כן, OD600 צריך להיות נשלט. ראשית, התאים מורשים לגדול SDC בן לילה (מעל 14 שעות). בבוקר, OD600 נמדד. לאחר מכן התרבות מדוללת ב- SDC, המסופקת עם ריכוז מגוון של β-אסטרדיול, עד OD600 = 0.1. לפני ניסויי FACS, התאים גדלים במשך 7 שעות נוספות, כך OD600 מגיע 0.8-1.0. תאים המבטאים dCas9-VP64 או dCas12a-VP64 גדלים ב-SDC למשך 20-24 שעות ללא דילול וצמיחה נוספת לפני המדידות במכונת FACS.

  1. הפעל את מכשיר FACS 20 דקות לפני המדידות כדי לחמם את הלייזר.
  2. הכן את הדגימות (דילול): מערבבים 20 μL של תרבית התא עם 300 μL של ddH2O.
  3. הפעל את תוכנת FACS במחשב המחובר למחשב FACS וצור ניסוי חדש. הגדר את פרמטרי המדידה (כלומר, FSC(SSC)-A/H/W והיסטוגרמה).
  4. בחר את המסנן בהתאם לאורכי גל העירור והפליטה של הדגימות. לדוגמה, חלבון המטרה כאן הוא yEGFP, שאורכי גל העירור והפליטה שלו הם 488 ננומטר ו-507 ננומטר, בהתאמה. לכן, בחר את מסנן FITC או GFP (אורך גל עירור: 488 ננומטר; אורך גל פליטה: 527/32 ננומטר). הגדר את מספר תא הרכישה ל- 10,000.
  5. כוונן את מתח מסנן FITC על ידי מדידת עוצמת החרוזים הפלואורסצנטיים. ודא שההבדל היחסי בעוצמת החרוזים בין שני ניסויים עוקבים אינו עולה על 5%.
  6. שטפו את המכונה עם ddH2O למשך מספר שניות כדי להסיר חרוזים עודפים אפשריים.
  7. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של הדגימה. לחץ על תצוגה מקדימה והמתן 3-5 שניות ליציבות הזרקת הדגימה. לבסוף, לחץ על Acquire.
  8. מדדו שוב את החרוזים בסוף הניסוי. המתח הוא זה ששימש במהלך מדידת החרוזים הראשונית (ראה שלב 8.4, 438-441 V). בדקו האם ההפרש היחסי בין המידות של שני החרוזים עולה על 5%.
  9. יצא את נתוני FACS כקבצי FCS.
  10. נתח את קבצי FCS באמצעות תוכנת R Studio.

9. ניתוח נתונים

הערה: השתמש בחבילת Flowcore R Bioconductor 32 בתוך סטודיו R. קבצי FCS נותחו באמצעות סקריפט שנכתב בשפת R.

  1. פתח את סטודיו R וטען את ניתוח הסקריפט Bdverse. R כדי לנתח את קבצי FCS.
  2. הגדר את שם הניסוי (ename), את הספרייה (נתיב) שבה נמצאים קובצי FCS
    מאוחסן (dir_d), והיכן ייווצרו קבצי התוצאה (dir_r).
  3. הגדר את תעלת הפלואורסצנטיות. לדוגמה, select_ch = "GPA-A" אם נמדדה פלואורסצנטיות ירוקה.
  4. הגדר את מספר הדגימות שנמדדו (s_num).
  5. הגדר את המידות של כל תרשים נקודה (sxlim, sylim). הגדר את האורך המרבי של ציר x ו- y עבור תרשימי עמודות ותרשימי תיבות (xlimit, ylimit). xlimit חייב להיות גדול או שווה ל- s_num.
  6. בחר בשיטת gating על-ידי הסרת # מהשורות המתאימות.
    הערה: morphGate היא שיטת gating אוטומטית המבוצעת על ידי הסקריפט (כלומר, האזור של חלקות הנקודות שבו התאים צפופים יותר מזוהה ונבחר על ידי התוכנית). מצולע ו-rectangleGate דורשים להסתכל על חלקות הנקודות ולהגדיר את קודקודי המצולע או את הצד של מלבן החובק את האזור שבו נמצאים רוב התאים.
  7. בחר באובייקט flowSet עם גייט, המתאים לשיטת gating שנבחרה. בחר ברזולוציית התוויית הנקודות (res; צריכה להיות שווה לפחות ל- 256).
  8. בטל את ההערה flt_low <- filter_low(sp) כדי להסיר מדידות שבהן הפלואורסצנטיות שלילית. בטל תגובה flt_sp <- filter(flt_lw) כדי להסיר חריגים עקב ניסויים אחרים.
  9. הקש מקור והפעל את קובץ ה-script. כל הקבצים המכילים את תוצאות הניתוח נוצרים ב - dir_r.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביטוי sgRNA/crRNA על ידי מקדם RNA פולימראז מסוג III
ראשית, עבודה זו התייחסה להנדסה של מעגל הפעלת השעתוק (מעגל 1) המוצג באיור 1A. הוא הכיל שלושה מרכיבים בסיסיים: 1) הגן המקודד ל-yEGFP (המדווח), שקדמו לו סדרה של מקדמים סינתטיים שונים שסיפקו אתרי מטרה עבור dCas9/dCas12a-AD; 2) גרסה ממוטבת קודון שמרים של dCas9 או dCas12a המאוחה לתחום הפעלה (VP64 ו-VPR, בהתאמה) ומכילה רצף לוקליזציה גרעיני אחד או שניים (NLS). שני חלבוני dCas הופקו על ידי מקדם מכונן חזק - pGPD; ו-3) רצף sgRNA/crRNA שהנחה את dCas9/dCas12a-AD לאתרי המטרה. יעילות ההפעלה של מפעילים מבוססי dCas9/dCas12a הודגמה והשקפה על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות של המדווח (נמדדה באמצעות ניסויי FACS).

חלבון dCas9 אחד (dSpCas9) ושני חלבוני dCas12a (denAsCas12a ו-dLbCas12a) נבדקו. הפעלה של פי 3.36 הושגה עם dSpCas9 מורחב, בסיום C שלו, עם VP64 AD ומחייב מקדם סינתטי במעלה הזרם של yEGFP המכיל שישה עותקים של אתר היעד lexOp. ה-sgRNA הוכנס לווקטור מעבורת אינטגרטיבי ושעתק על-ידי מקדם SNR52 תלוי RNA פולימראז III (תצורת SNR52i , ראו איור 1B). במקרה של dCas12a, denAs12a-VPR החזיר את ההפעלה הגבוהה ביותר (פי 4.45) ממקדם סינתטי עם שלושה אופרטורים כאשר crRNA בא לידי ביטוי באמצעות תצורת SNR52i (איור 1C). באותם תנאים, dLbCas12a-VPR השיג את שיפור הפלואורסצנטיות הטוב ביותר שלו (פי 3.21) (איור 1D). יש לציין כי מונח ההשוואה, בכל ניסוי, היה מעגל שה-sgRNA/crRNA שלו לא הצליח לקשור את אופרטורי הלקס.

פלסמידים מרובי עותקים אינם נחוצים
קלטת הביטוי SNR52i sgRNA הוחלפה במבנה RGR מבוטא על ידי מקדם pADH1 חזק במידה בינונית. עם זאת, הן במקרים של dCas9 והן במקרים של dCas12a, הפעלה בנוכחות sgRNA/crRNA שנוצר על-ידי הפיצול העצמי של RGR נראתה דומה או אפילו נמוכה יותר מזו שהושגה עם sgRNA/crRNA שהופק באמצעות SNR52i, למרות העובדה ש-pSNR52 נחשב למקדם חלש (ראו איור 1C,D לתוצאות הראשונות שהתקבלו עם dCas12a).

כדי להמשיך ולחקור את הקשר בין כמות sgRNA/crRNA לבין יעילות ההפעלה, שתי מערכות הביטוי sgRNA/crRNA הוכנסו לפלסמיד אפיזומלי, אשר יכול להיקלט על ידי התא ב-10-40 עותקים ולייצר כמות גדולה יותר של sgRNA/crRNA. כפי שניתן לראות באיור 2A, ההפעלה על-ידי crRNA הממוקם על פלסמיד אינטגרטיבי (SNR52i או RGRi) הייתה גבוהה פי 1.4 עד פי 2.4 מזו שהושגה כאשר אותו crRNA בוטא על-ידי פלסמיד אפיזומלי (SNR52m או RGRm). המגמה אושרה על ידי sgRNA. במקרה זה, הפלסמיד האינטגרטיבי הבטיח הפעלה גבוהה פי 1.1 עד פי 1.5 (איור 2B). כדי לשלול כי התוצאות נגרמו על ידי אובדן של פלסמידים אפיזומליים, RT-qPCR בוצע כדי לכמת את השפע היחסי sgRNA/crRNA in vivo. התוצאות, באיור 2C,D, אימתו שהווקטור האפיזומלי מייצר רמה גבוהה בהרבה של sgRNA/crRNA מאשר הווקטור האינטגרטיבי, ללא קשר למערכת הביטוי (RGR או SNR52). תוצאות אלה הראו כי מערכת SNR52 יכולה לעבוד אפילו טוב יותר מאשר מערכת RGR, וכמות גבוהה יותר של sgRNA/crRNA בתא לא הבטיחה הפעלה גבוהה יותר על ידי מערכת CRISPR-Cas. לכן, אין להשתמש בפלסמידים אפיזומליים בבניית מעגלים ספרתיים גנטיים שבהם נעשה שימוש ב- dCas9/dCas12a-AD.

הנדסת RNA פיגומים
scRNA הונדס על-ידי הרחבת הרצף של sgRNA עם מבני סיכות ראש MS2 שאפשרו לגייס VP64 AD כאשר הוא מאוחה לחלבון הפרווה MS2 (MCP, ראו איור 3A). בדרך זו, לא היה צורך בהנדסה של dCas9 או בשינויים בו. שתי גרסאות MS2 נוסו: wt ו- f6. ה- scRNA המכיל את סיכת השיער MS2 היחידה - 1×MS2(wt) ו- 1×MS2(f6) - נתן הפעלה של פי 5.27 ופי 4.34, בהתאמה. עם זאת, scRNA עם שילוב של שתי סיכות שיער -2×MS2(wt+f6) - החזיר את ההפעלה הכוללת הגבוהה ביותר במחקר זה (פי 7.54, ראה איור 3B). תוצאות אלה הראו כי הנדסת scRNA הייתה יעילה הרבה יותר מאשר התכה של תחומי הפעלה כלשהם ל- dSpCas9 ישירות.

שער בוליאני המבוסס על חלבוני Acr
כדי להמשיך לשלוט ולכוונן את הפעלת השעתוק על-ידי מערכות CRISPR-Cas, מעגל 1 שונה עם החדרת TU רביעי לביטוי חלבונים אנטי-קריספר (ראו איור 4A עבור AcrIIA ואיור 5A עבור AcrVAs). לאחר שהראה כי Acrs היו יעילים, ב- S. cerevisiae, בניגוד להפעלה עקב dCas9/dCas12a-AD, נבנה מעגל חדש (ראה איור 5D) כדי לבדוק את פעולת AcrVA על מדכאים מבוססי dCas12a (עבודה קודמת33 כבר הראתה כי AcrIIAs יכולים לעכב ויסות מטה של גנים מבוססי dCas9). הרשתות הקטנות החדשות, המכילות Acr, פעלו כשערים בוליאניים פשוטים (כן ולא), מה שעשוי להוביל לעיצוב מחדש של שכבת הקלט של מעגלים דיגיטליים מורכבים יותר של גנים סינתטיים.

AcrIIA4 הוא מעכב חזק של dSpCas9
ארבעה מקדמים שונים עם עוצמות מגוונות שימשו כדי להניע את הביטוי של שלושה סוגים של AcrIIs-AcrIIA2, AcrIIA4 ו- AcrIIA5. התוצאות הראו כי שלושת AcrII עבדו באופן תלוי מינון ב - S. cerevisiae. כאשר הם מבוטא על-ידי מקדם חזק - pGPD - הם הפחיתו את רמת הפלואורסצנטיות שאליה הגיע dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64 ל- 0.21, 0.11 ו- 0.13 מערכו, בהתאמה (איור 4B). מכיוון ש-AcrIIA4 היה היחיד שגרם לעיכוב גבוה של ביטוי פלואורסצנטי גם כאשר הופק על ידי מקדם סינתטי חלש genCYC1t_pCYC1noTATA – יכולנו להסיק ש-AcrIIA4 היה המעכב החזק ביותר מבין שלושת ה-AcrIIs. לאחר מכן, HBD(ER) אוחה למסוף C של AcrIIA4 כדי לבנות התקן חישה β-אסטרדיול (ראו איור 4C). בנוכחות האסטרוגן β-אסטרדיול, AcrIIA4-HBD(ER) יכול לעבור טרנסלוקציה לתוך הגרעין ולאחר מכן לנטרל את הפונקציה של מפעיל מבוסס dSpCas9. עקומת הטיטרציה באיור 4D מראה שהמעגל מתנהג כמו שער NOT עם יחס הפעלה/כיבוי שמתקרב ל-2.3.

AcrVAs הם מדכאים של חלבוני dCas12a
שער NOT תוכנן ונבנה על ידי הכנסת קלטת הביטוי AcrVA המונעת pGAL1 לתוך מעגל 1. בדרך זו, סינתזת AcrVA, וכתוצאה מכך הדיכוי של dCas12a-AD, יכולים להיגרם על-ידי גלקטוז (איור 5A). כפי שניתן לראות באיור 5B,C, AcrVA1 הפריע הן ל-denAsCas12a והן ל-dLbCas12a כמפעילים על-ידי הפחתת ביטוי הפלואורסצנטיות מ-19% ל-71%, בהתאם לסכימת המעגלים. AcrVA4 ו- AcrVA5 אינם יכולים להפעיל כל פעולה על denAsCas12a34. עם זאת, הם ביצעו עיכוב חזק של מפעילים מבוססי dLbCas12a על ידי הפחתת ביטוי פלואורסצנטי עד 84% (AcrVA5) ו 82% (AcrVA4). בסך הכל, AcrVA5 התברר להיות האמין ביותר, מבין שלושת AcrVAs אלה, בעיכוב activators מבוססי dLbCas12a כי זה הבטיח, במעגלים שונים, גבוה מ 70% דיכוי.

פעולת AcrVA1 תלויה בריכוז
כמו כן נחקר הקשר בין ריכוז in vivo של AcrVAs לבין ההשפעות המעכבות שלהם הן על מפעילים והן על מדכאים המבוססים על denAs/dLbCas12a. למטרה זו, כל AcrVA בא לידי ביטוי תחת מקדמים שונים: pGAL1 חזק, pTEF1 חזק בינוני, ואת genCYC1t_pCYC1noTATA חלש. כפי שמודגם באיור 5E, AcrVA1 הציג תנודות גדולות בביצועים שלו בהתאם למקדם שהוביל את הסינתזה שלו. AcrVA1 עבד בצורה סבירה רק כאשר הופק על ידי pGAL1. תחת pTEF1 ו-genCYC1t_pCYC1noTATA, AcrVA1 הראה דיכוי מסוים ב-dLbCas12a החשוף בלבד. AcrVA4 ו-AcrVA5, לעומת זאת, נראו פחות רגישים לריכוז שלהם, במיוחד כאשר הם מתקשרים עם dLbCas12a החשוף.

נתונים אלה הראו כי AcrVA4 ו- AcrVA5 בדרך כלל הפגינו ביצועים טובים יותר מאשר AcrVA1 בעיכוב גורמי שעתוק מבוססי dLbCas12a ב- S. cerevisiae. יש לציין כי AcrVA5 יש מנגנון עבודה מוזר, שכן הוא פועל כאנזים המשנה LbCas12a לצמיתות. עם זאת, כפי שהוזכר לעיל, AcrVA5 (יחד עם AcrVA4) אינו יכול לקיים אינטראקציה עם denAsCas12a.

כאשר AcrVAs בוטאו תחת pGAL1, המעגלים הפכו לשערי כן (dCas12a אוחה ל-AD) או לשערי NOT (dCas12a חשופים). הראשון נראה בעל ביצועים גבוהים, בעוד האחרון נראה עובד טוב יותר בנוכחות AcrVA4 או AcrVA5.

Figure 1
איור 1: הפעלת תמלול בתיווך dCas9/dCas12a-AD. (A) דיאגרמת מעגל 1. המקדמים הסינתטיים של yEGFP הכילו שישה (6x) ושלושה (3x) עותקים של אתרי יעד עבור dCas9 או dCas12a, בהתאמה. לאחר מכן, dCas9/dCas12a-AD משתלב עם sgRNA/crRNA; המקדם הסינתטי ממוקד ומופעל בשל נוכחותם של תחומי ההפעלה. (B) יעילות ההפעלה הטובה ביותר של dSpCas9-VP64 הושגה כאשר היו שישה אתרי מטרה של lexOp על המקדם הסינתטי, וה-sgRNA תומלל על ידי SNR52i. (ג,ד) יעילות ההפעלה הגבוהה ביותר של dCas12a-VPR הושגה כאשר שלושה עותקים של lexOp הוכנסו למקדם הסינתטי, וה- crRNA נוצר על ידי SNR52i. SNR52i פירושו שה-sgRNA/crRNA הופק על ידי pSNR52, וקלטת הביטוי הונחה בתוך וקטור מעבורת אינטגרטיבי. RGRi פירושו פלסמיד אינטגרטיבי המארח את קלטת RGR כדי לבטא sgRNA/crRNA היה בשימוש. הבקרה השלילית, "-", מייצגת sgRNA/crRNA המכיל רצף ספייסר מקושקש שאינו תואם לאתר הלקסופ או לרצף כלשהו לאורך גנום השמרים. "bA" מציין כי sgRNA/crRNA קושר את גדיל האנטיסנס של דנ"א המטרה, בעוד "bS" מייצג קשירת גדיל החוש. כל רמת פלואורסצנטיות מייצגת את הערך הממוצע של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים (כלומר, שבוצעו בימים שונים). קווי שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השוואה בין sgRNA/crRNA המייצר פלסמיד אינטגרטיבי ואפיזומלי. (A) יעילות ההפעלה של dLbCas12a-VPR:crRNA בעת מיקוד לאתר יחיד במעלה הזרם של yEGFP. (B) dSpCas9-VP64:sgRNA מופעל n× מקדם סינתטי ("n" מייצג את מספר אתרי היעד של lexOp). (ג,ד) רמת ביטוי sgRNA/crRNA מנורמלת15,16. "i" פירושו שקלטת הביטוי sgRNA/crRNA הונחה בתוך וקטור מעבורת אינטגרטיבי, בעוד "m" מייצג פלסמיד מרובה עותקים (כלומר, אפיזומלי). "bA"/"bS" מציין שה-sgRNA/crRNA קושר את גדיל האנטיסנס/החישה של הדנ"א. "ctrl" הוא בקרה שלילית, שבה sgRNA מקושקש / crRNA בא לידי ביטוי. כל רמת פלואורסצנטיות מייצגת את הערך הממוצע של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים (כלומר, שבוצעו בימים שונים). קווי שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יעילות ההפעלה של dSpCas9 החשוף בקומפלקס עם scRNA. (A) התרשים הסכמטי של האינטראקציות בין scRNA, MCP-VP64 ו-dSpCas9 החשוף 16. המבנה דמוי הכובע בסגול מייצג MCP (חלבון ציפוי MS2). סיכת ראש MS2 אחת (המבנה הסגול ב-scRNA) יכולה לגייס ולקשור שני עותקים של MCP. לפיכך, scRNA מאפשר לא רק קשירת DNA על ידי dSpCas9 אלא גם הפעלה של ביטוי גנים באמצעות גיוס MCP-VP64. (B) יעילות ההפעלה של dSpCas9:scRNA-MCP-VP64. שלושה סוגים של scRNA נבדקו: אחד נושא את סיכת הראש MS2 מסוג פראי-1×MS2(wt), אחר שהונדס עם f6 MCP aptamer-1×MS2(f6), והאחרון שהכיל את שתי סיכות השיער-2×MS2(wt+f6), שהתברר כבעל הביצועים הטובים ביותר. כל רמת פלואורסצנטיות מייצגת את הערך הממוצע של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים (כלומר, שבוצעו בימים שונים). קווי שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מעגלים ותוצאות הקשורים ל-AcrIIA . (A) קלטת הביטוי AcrIIA הוכנסה למעגל 1. TU נוסף זה כולל pGPD המוביל את הביטוי של AcrIIAs כדי לנטרל dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64. (B) יעילות העיכוב של AcrIIAs במפעיל מבוסס dSpCas9 הטוב ביותר באיור 3B. הקו המקווקו השחור מייצג את הפלואורסצנטיות בנוכחות מפעיל מבוסס dSpCas9. האיורים מעל כל עמודה מראים את יעילות העיכוב המחושבת כיחס OFF/ON (כלומר, רמת הפלואורסצנטיות בנוכחות AcrIIA חלקי הפלואורסצנטיות בהיעדר AcrIIA). באגדה, כוחם של ארבעת המקדמים המכוננים עולה בהדרגה מלמעלה למטה. (C) דיאגרמה של התקן החישה β-אסטרדיול (NOT gate) המבטא AcrIIA4-HBD(hER). (D) עקומת הטיטרציה של המעגל ב-(C)16. העקומה הירוקה מתייחסת לשינוי הפלואורסצנטי במעגל הפונקציונלי. העקומה השחורה נגזרת מהזן ללא ביטוי של AcrIIA4-HBD(hER) - הבקרה השלילית. הקו המקווקו באפור סימן את רמת הפלואורסצנטיות בשיווי המשקל. הוא חושב כממוצע של ערכי הפלואורסצנטיות בריכוזים של β-אסטרדיול שאינם נמוכים מ-125 ננומטר. כל רמת פלואורסצנטיות מייצגת את הערך הממוצע של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים (כלומר, שבוצעו בימים שונים). קווי שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מעגלים ותוצאות הקשורים ל-AcrVA. (A) קלטת הביטוי AcrVA הוכנסה למעגל 1. TU החדש מכיל את מקדם המושרה pGAL1 במעלה הזרם של הגנים AcrVA המנטרלים את העבודה של dCas12a-AD. המעגל החדש הוא שער NOT המוסדר על ידי גלקטוז. (ב,ג) תוצאות משער NOT המגיב לגלקטוז ב-(A). כאן, pGAL1 מניע את הסינתזה של AcrVAs, אשר לאחר מכן אינטראקציה עם dCas12a-AD15. הפלואורסצנטיות היחסית מתאימה ליחס OFF/ON. (D) שער כן מגיב לגלקטוז. היא מעסיקה AcrVAs תחת שליטת pGAL1 ואת dCas12as החשוף המדכא את הסינתזה של yEGFP. (ה) השוואת יעילות העיכוב של AcrVAs המבוטאת על ידי מקדמים בעלי חוזק שונה15. הקבוצות "השפעות AcrV על דיכוי" ו-"dLb חשוף" מתייחסות למעגל ב-(D). הקבוצות "השפעות AcrV על ההפעלה" ו- "dLb-VPR" הן התוצאות של שער NOT ב- (A). כל רמת פלואורסצנטיות מייצגת את הערך הממוצע של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים (כלומר, שבוצעו בימים שונים). קווי שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: רשימה של כל רצפי הדנ"א ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: רשימת פריימרים ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קבצי קידוד משלימים: סקריפט אולפן R לניתוח קבצי FCS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול הראה זרימת עבודה מלאה אפשרית עבור מעגלים דיגיטליים של גנים סינתטיים, לאחר מחזור ההנדסה הביולוגית "תכנון-בנייה-בדיקה-למידה" (DBTL) ובנוגע לניסויי מעבדה יבשה ומעבדה רטובה. כאן, התמקדנו במערכת CRISPR-Cas, בעיקר dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a וחלבוני האנטי-קריספר המתאימים, על ידי תכנון ובנייה ברשתות שעתוק קטנות של S. cerevisiae. חלקם חיקו שערים בוליאניים, שהם המרכיבים הבסיסיים של מעגלים דיגיטליים. כל המעגלים המתוארים כאן אפשרו לנו לתאר את התכונות והתכונות של חלבונים הקשורים לקריספר ואנטי-קריספר בשמרי אפייה (S. cerevisiae). תוצאות אלה חיוניות כדי לכלול חלבונים אלה בתכנית המעגלים הדיגיטליים של הגנים.

תפיסת DBTL מספקת מסגרת בביולוגיה סינתטית, בעוד אופטימיזציות ושיפורים רבים יבוצעו לאחר בדיקת חפץ חדש. לדוגמה, במעגל 1, היה בתחילה רק אתר מטרה אחד (עותק אחד של lexOp) עבור dCas9/dCas12a-AD על המקדם הסינתטי במעלה הזרם של yEGFP. לאחר שבדקנו את תצורת המעגל, מצאנו שהוא יכול להשיג לא יותר מהפעלה כפולה15,16. לאחר מכן, הנחנו שעל ידי הגדלת מספר העותקים של lexOp, כמוב-7, נוכל להגיע להפעלת תמלול גבוהה יותר. ואכן, רמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר התקבלה על-ידי שימוש בשלושה עד שישה אתרי לקסופ (איור 1). יתר על כן, שיפרנו עוד יותר את הביצועים של המעגלים המארחים את dSpCas9 על-ידי הנדסת scRNA, שהיא קלה יותר מאשר היתוך ADs אחד או יותר לחלבון גדול כמו dSpCas9 (איור 3). בנוסף, על ידי שימוש במקדם של עוצמות שונות כדי לייצר את שלושת AcrIIAs שבחרנו, הגענו למסקנה כי AcrIIA4 היה המעכב החזק ביותר ביניהם. לכן, בנינו שער NOT חדש המגיב ל-β-אסטרדיול על-ידי מיזוג HBD(ER) ל-AcrIIA4 וניצול הדיכוי החזק של AcrIIA4 במפעיל הטוב ביותר שלנו מבוסס dSpCas9 (איור 4).

באופן דומה, אפיינו באופן עמוק הן את העבודה של denAsCas12a והן את dLbCas12a בשמרים ואת האינטראקציות שלהם עם שלושה AcrVAs (איור 5). עבור כל זוג dCas12a-AcrVA, בנינו שער NOT (dCas12a אוחה ל-AD) ושער כן (dCas12a חשוף) המגיב לגלקטוז. באופן כללי, dLbCas12a, יחד עם AcrVA5, הביאו למערכת הטובה ביותר לחישוב פונקציות לוגיות פשוטות.

השיטה המתוארת כאן הציגה כמה צעדים קריטיים. כל רצפי הדנ"א החלבוני עברו אופטימיזציה לקודון שמרים כדי להבטיח ביטוי גבוה יותר בשמרי אפייה (S. cerevisiae). כדי להימנע ממטרות לא ספציפיות של dSpCas9/denAsCas12a/dLbCas12a בגנום S. cerevisiae , בחרנו אופרטור חיידקי כגון lexOp. יתר על כן, זנים המכילים את מקדם GAL1 הראו עיכוב גדילה משמעותי שיכול להגביל את התחולה של pGAL1 על מעגלי גנים סינתטיים15.

כמה שינויים יכולים גם להיות מובאים כמה שלבים בשיטה הכוללת. על מנת לשפר את יעילות הליך קשירת העיכול, עדיף לעכל 10 מיקרוגרם (בן לילה) הן של הפלסמיד המכיל אינסרט והן של וקטורי המקבל, ולא רק 5 מיקרוגרם בשעה אחת. בדרך זו, ריכוז DNA גבוה יותר מושג לאחר שלב elution. יש להאריך את הזמן לקשירת T4 מ-1 שעות (פרוטוקול יצרן) ל-8 שעות. לבסוף, זנים המכילים את חלבון ההיתוך dCas12a-VPR צריכים להיות מדוללים לאחר תרבית של 24 שעות ולגדל במשך 12 שעות נוספות לפני ביצוע ניסוי FACS. במצב זה, השונות בין רמות הפלואורסצנטיות מתאים שונים כבר אינה גבוהה מדי, וסטיית תקן מקובלת מלווה את הערך הממוצע של עוצמת הפלואורסצנטיות על אוכלוסיית תאים.

לסיכום, פרוטוקול זה הסביר כיצד לפשט את התכנון של מעגלים דיגיטליים גנטיים על ידי שימוש בחלבוני dCas, ואולי גם חלבונים אנטי-קריספר. חשוב מכך, הראינו בפירוט כיצד משפחות החלבונים האלה פועלות ב-S. cerevisiae ואילו מהן הן המבטיחות ביותר לשימוש עתידי ברשתות דיגיטליות. בעיה בלתי פתורה היא הצימוד של מערכות וכימיקלים מסוג CRISPR-dCas/anti-CRISPR, המייצגים את קלטי המעגלים ואינם יכולים לקשור ישירות חלבוני dCas או אנטי-קריספר. כאן, עקפנו את הבעיה על ידי שימוש במקדם GAL1 המושרה או HBD(ER) המחובר ל- AcrIIA4. עם זאת, יש צורך להכליל את הארכיטקטורה של שכבת הקלט של המעגל כדי לתכנן מעגלים דיגיטליים של גנים סינתטיים עבור תחומים שונים של ביו-הנדסה כגון הנדסה מטבולית, ביוסינתזה, ביו-חישה, ביודיאגנוסטיקה וטיפול ביולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

Acknowledgments

אנו רוצים להודות לכל הסטודנטים במעבדה לביולוגיה סינתטית - SPST, TJU - על עזרתם הכללית, יחד עם ג'י לי ושיאנגיאנג ז'אנג על עזרתם בניסויי FACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mL PCR 8-strip tubes NEST 403112
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C
1.5 mL Microtubes Axygen MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011150
2 mL Microtubes Axygen MCT-200-C 
50 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011500
Agarose-molecular biology grade Invitrogen 75510-019
Ampicillin sodium salt Solarbio 69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler Thermo Fisher Scientific 4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit Axygen AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads BD 650621 Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer  BD -
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Sorvall ST 16R Thermo Fisher Scientific 75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α) Life Technologies 18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent GE Healthcare RPN2235
Electrophoresis apparatus Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd JY300C
Flat 8-strip caps NEST 406012
Gene synthesis company Azenta Life Sciences https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568 Invitrogen A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit CWBIO CW2569M Kit used in step 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase) zymoresearch E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope Nikon - Fluorescence microscope
Pipet tips—10 μL Axygen T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL Axygen T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL Axygen T-200-Y-R-S
pRSII403 Addgene 35436
pRSII404 Addgene 35438
pRSII405 Addgene 35440
pRSII406 Addgene 35442
pRSII424 Addgene 35466
pTPGI_dSpCas9_VP64  Addgene 49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase New England Biolabs M0491
Restriction enzyme-Acc65I New England Biolabs R0599
Restriction enzyme-BamHI New England Biolabs R0136
Restriction enzyme-SacI-HF New England Biolabs R3156
Restriction enzyme-XhoI New England Biolabs R0146
Roche LightCycler 96  Roche - Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C - - The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289;
MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit SparkJade AG0502 Kit used in step 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler BIO-RAD 186-1096
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
T5 Exonuclease New England Biolabs M0363
Taq DNA ligase New England Biolabs M0208
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) Takara RR820Q
YeaStar RNA kit Zymo Research R1002
β-estradiol Sigma-Aldrich E8875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).
  2. Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).
  3. Mandell, J. G., Barbas, C. F. Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases. Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).
  4. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  5. Drinnenberg, I. A., et al. RNAi in budding yeast. Science. 326 (5952), 544-550 (2009).
  6. Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates. Nature Communications. 8, 15459 (2017).
  7. Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas. ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).
  8. Nakamura, M., et al. Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells. Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).
  9. Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131 (1), 129-134 (1993).
  10. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  11. Gao, Y., Zhao, Y. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  14. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  15. Yu, L., Marchisio, M. A. Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins. ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).
  16. Zhang, Y., Marchisio, M. A. Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).
  17. Sheff, M. A., Thorn, K. S. Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  19. Chee, M. K., Haase, S. B. New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae. G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).
  20. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  21. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. Fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  23. Sanger, F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).
  24. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  25. Zalatan, J. G., et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).
  26. Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits. Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).
  27. Rauch, B. J., et al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).
  28. Hynes, A. P., et al. An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9. Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).
  29. Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science. 362 (6411), 236-239 (2018).
  30. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  31. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  32. Hahne, F., et al. flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry. BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).
  33. Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae. Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).
  34. Dong, L., et al. An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).

Tags

Retraction גיליון 188 מערכת CRISPR-Cas dSpCas9 denAsCas12a dLbCas12a חלבונים אנטי-קריספר מסוג II-A חלבונים אנטי-קריספר מסוג V-A מעגלים ספרתיים של גנים שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) ביולוגיה סינתטית
מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A.… More

Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A. Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64539, doi:10.3791/64539 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter