Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Digitala genkretsar baserade på CRISPR-Cas-system och anti-CRISPR-proteiner

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64539
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University
* These authors contributed equally

Summary

CRISPR-Cas-system och anti-CRISPR-proteiner integrerades i schemat av booleska grindar i Saccharomyces cerevisiae. De nya små logiska kretsarna visade god prestanda och fördjupade förståelsen för både dCas9/dCas12a-baserade transkriptionsfaktorer och egenskaperna hos anti-CRISPR-proteiner.

Abstract

Syntetiska genbooleska grindar och digitala kretsar har ett brett spektrum av applikationer, från medicinsk diagnostik till miljövård. Upptäckten av CRISPR-Cas-systemen och deras naturliga hämmare - anti-CRISPR-proteinerna (Acrs) - ger ett nytt verktyg för att designa och implementera digitala genkretsar in vivo . Här beskriver vi ett protokoll som följer idén om "Design-Build-Test-Learn" biologisk ingenjörscykel och använder dCas9 / dCas12a tillsammans med deras motsvarande Acrs för att etablera små transkriptionsnätverk, av vilka några beter sig som booleska grindar, i Saccharomyces cerevisiae. Dessa resultat pekar ut egenskaperna hos dCas9/dCas12a som transkriptionsfaktorer. I synnerhet, för att uppnå maximal aktivering av genuttryck, måste dSpCas9 interagera med ett konstruerat ställnings-RNA som samlar in flera kopior av VP64-aktiveringsdomänen (AD). Däremot ska dCas12a smältas samman vid C-änden med den starka VP64-p65-Rta (VPR) AD. Dessutom förstärks inte aktiviteten hos båda Cas-proteinerna genom att öka mängden sgRNA / crRNA i cellen. Den här artikeln förklarar också hur man bygger booleska grindar baserat på CRISPR-dCas-Acr interaktion. Den AcrIIA4-smälta hormonbindande domänen hos den humana östrogenreceptorn är kärnan i en NOT-grind som svarar på β-östradiol, medan AcrVAs syntetiserade av den inducerbara GAL1-promotorn tillåter att efterlikna både JA- och NOT-grindar med galaktos som ingång. I de senare kretsarna visade AcrVA5, tillsammans med dLbCas12a, det bästa logiska beteendet.

Introduction

År 2011 föreslog forskare en beräkningsmetod och utvecklade en motsvarande mjukvara för automatisk design av digitala syntetiska genkretsar1. En användare var tvungen att ange antalet ingångar (tre eller fyra) och fylla i kretsens sanningstabell; Detta gav all nödvändig information för att härleda kretsstrukturen med hjälp av tekniker från elektronik. Sanningstabellen översattes till två booleska formler via Karnaugh-kartmetoden2. Varje boolesk formel består av satser som beskriver logiska operationer (summa eller multiplikation) bland (en del av) kretsingångarna och deras negationer (literalerna). Satser summeras i sin tur antingen (OR) eller multipliceras (AND) för att beräkna kretsutgången. Varje krets kan realiseras enligt någon av dess två motsvarande formler: en skriven i POS-form (produkt av summor) och den andra i SOP-representation (summa av produkter). Den förra består av en multiplikation av satser (dvs. booleska grindar) som innehåller en logisk summa av literalerna. Det senare är däremot en summa av satser där bokstaverna multipliceras.

Elektriska kretsar kan realiseras, på en brödbräda, genom att fysiskt koppla olika grindar tillsammans. Den elektriska strömmen tillåter utbyte av signaler mellan grindar, vilket leder till beräkning av utgången.

I biologi är situationen mer komplex. En boolesk grind kan realiseras som en transkriptionsenhet (TU; dvs sekvensen "promotorkodande regionterminator" inuti eukaryota celler), där transkription eller översättning (eller båda) regleras. Således etablerar åtminstone två typer av molekyler en biologisk ledning: transkriptionsfaktorproteinerna och de icke-kodande, antisens-RNA1.

En gendigital krets är organiserad i två eller tre lager av grindar, nämligen: 1) ingångsskiktet, som är tillverkat av JA (buffert) och INTE grindar och omvandlar ingångskemikalierna till ledningsmolekyler; 2) det inre skiktet, som består av lika många TU som det finns klausuler i motsvarande booleska formel. Om kretsen är utformad enligt SOP-formeln kommer varje klausul i det interna skiktet att producera kretsutgången (t.ex. fluorescens) i en så kallad distribuerad utgångsarkitektur. Om produkten av summa (POS) formel används, krävs ett 3) slutligt lager, vilket kommer att innehålla en enda multiplikativ grind som samlar ledningsmolekylerna från det inre skiktet.

Sammantaget kan i syntetisk biologi många olika system utformas för samma krets. De skiljer sig åt i antal och typ av både TU och ledningsmolekyler. För att välja den enklaste lösningen som ska implementeras i jästceller är varje kretsdesign associerad med en komplexitetspoäng S, definierad som

Equation 1

där A representerar antalet aktivatorer, R representerar antalet repressorer och a är mängden antisens-RNA-molekyler. Om antingen aktivatorer eller repressorer saknas från kretsen är deras bidrag till S noll. Därför är det svårare att realisera ett kretsschema i labbet (högt S) när det kräver ett stort antal ortogonala transkriptionsfaktorer. Detta innebär att nya aktivatorer och repressorer ska konstrueras de novo för att realisera hela ledningarna inuti de digitala kretsarna. I princip kan nya DNA-bindande proteiner monteras genom att använda zinkfingerproteiner3 och TAL-effektorer4 som mallar. Detta alternativ verkar dock för svårt och tidskrävande; därför bör man förlita sig mest på små RNA och translationsreglering för att slutföra komplexa genkretsar.

Ursprungligen utvecklades denna metod för att tillverka digitala kretsar i bakterier. I eukaryota celler, istället för antisens-RNA, är det faktiskt mer lämpligt att tala om mikroRNA (miRNA) eller små störande RNA (siRNA)5. RNAi-vägen är emellertid inte närvarande i jäst S. cerevisiae. Därför bör man välja helt transkriptionella nätverk. Antag att en krets behöver fem aktivatorer och fem repressorer; dess komplexitetspoäng skulle vara S = 32. Kretskomplexiteten kan minskas genom att ersätta de 10 transkriptionsfaktorerna med en enda dCas96 (nukleasbrist Cas9) smält till en aktiveringsdomän (AD). Som visas i7 fungerar dCas9-AD som en repressor i jäst när man binder en promotor mellan TATA-boxen och TSS (transkriptionsstartplatsen) och som en aktivator när den binds väl uppströms TATA-boxen. Således kan man ersätta 10 transkriptionsfaktorer med ett enda dCas9-AD-fusionsprotein och 10 sgRNA (single guide RNA) för en total komplexitetspoäng på S = 11. Det är snabbt och enkelt att syntetisera tio sgRNA, medan, som tidigare kommenterats, montering av 10 proteiner skulle kräva mycket längre och mer komplicerat arbete.

Alternativt kan man använda två ortogonala dCas-proteiner (t.ex. dCas9 och dCas12a): ett för att smälta till en AD, och det andra naket eller i kombination med en repressionsdomän. Komplexitetspoängen skulle öka med endast en enhet (S = 12). Därför är CRISPR-dCas-system nyckeln till konstruktionen av mycket invecklade digitala genkretsar i S. cerevisiae.

Denna artikel karakteriserar djupt effektiviteten hos både dCas9- och dCas12a-baserade repressorer och aktivatorer i jäst. Resultaten visar att de inte kräver en hög mängd sgRNA för att optimera sin aktivitet, så episomala plasmider undviks företrädesvis. Dessutom är dCas9-baserade aktivatorer mycket effektivare när man använder ett ställnings-RNA (scRNA) som rekryterar kopior av VP64 AD. Däremot fungerar dCas12a bra när den smälts direkt till den starka VPR AD. Dessutom kräver en syntetisk aktiverad promotor ett varierande antal målplatser, beroende på aktivatorns konfiguration (t.ex. tre vid användning av dCas12a-VPR, sex för dCas9-VP64 och endast en med dCas9 och ett scRNA). Som en repressor verkar dCas12a mer skarp när den binder kodningsregionen snarare än promotorn.

Som en nackdel interagerar dock CRISPR-dCas9/dCas12a inte direkt med kemikalier. Därför kanske de inte är till någon nytta i inmatningslagret. Av denna anledning har alternativa booleska grindkonstruktioner innehållande anti-CRISPR-proteiner (Acrs) undersökts. Acrs verkar på (d) Cas-proteiner och hämmar deras arbete8. Därför är de ett sätt att modulera aktiviteten hos CRISPR-(d) Cas-system. Denna uppsats analyserar grundligt interaktionerna mellan typ II Acrs och (d) Cas9, liksom typ V Acrs och (d) Cas12a i S. cerevisiae. Eftersom Acrs är mycket mindre än Cas-proteiner, byggdes en INTE grind som svarar på östrogen β-östradiol genom att smälta den hormonbindande domänen hos den humana östrogenreceptorn9-HBD (hER) till AcrIIA4. Dessutom realiserades en handfull JA- och NOT-grindar som uttryckte dCas12a(-AD) konstitutivt och AcrVA vid induktion med galaktos. För närvarande tjänar dessa grindar endast som ett bevis på konceptet. Men de representerar också det första steget mot en djup omprövning av algoritmen för att utföra den beräkningsautomatiska designen av syntetiska gendigitala kretsar i jästceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design och konstruktion av sgRNA/crRNA-uttryckskassetten

OBS: Det finns två typer av sgRNA / crRNA-uttryckskassetter: en-benämnd SNR5210-består av RNA-polymeras III-beroende SNR52-promotor, sgRNA / crRNA-sekvensen och SUP4-terminatorn; en annan-förkortad som RGR 11-består av RNA-polymeras II-beroende ADH1-promotor, RGR-strukturen (ribozym-guide RNA-ribozym) som innehåller två ribozymer (en hammarhuvudribozym-HH och en hepatit delta-virus ribozym-HDV) och sekvensen av sgRNA / crRNA däremellan och ADH1-terminatorn. De sgRNA-styrande Cas9-homologerna är gjorda av en spacersekvens och den karakteristiska direkta upprepningen12, medan crRNA för Cas12a-proteiner innefattar den direkta upprepningen följt av spacersekvensen13,14 (se kompletterande tabell 1 för alla DNA-sekvenser som används i denna studie).

  1. Designa distanssekvensen för Cas9/Cas12a-medierad transkriptionsaktivering.
    1. Utnyttja den bakteriella lex-operatorsekvensen (benämnd lexOp) för att vara målplatsen 15,16 och sätt in den i CYC1-promotorn som driver uttrycket av det jästförstärkta gröna fluorescerande proteinet (yEGFP)17. Därför definieras distanssekvensen av och kompletterar den infogade lexOp.
  2. Kontrollera avståndssekvensens ortogonalitet via CRISPRDIRECT-verktyget18.
    1. Klistra in lexOp-sekvensen flankerad av PAM-sekvensen i textfältet, definiera PAM-sekvensen som NRG för dCas9 och TTTV för dCas12a och ange arten i listrutan som spirande jäst (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genome. Klicka på Design. Se till att det inte finns någon matchande målwebbplats i 20mer + PAM eller i 12mer + PAM-sökning.
  3. Konstruera sgRNA/crRNA-uttryckskassetten.
    1. Använd touchdown PCR för att förstärka DNA-sekvenserna för vanliga biologiska delar, som promotorer, kodande sekvenser och terminatorer.
      1. Bered en reaktionsblandning innehållande: 20–40 ng DNA-mall, 1 μL 10 μM framåtprimer (dvs. ot25, sgRNA/crRNA-expressionsplasmidkonstruktion), 1 μL 10 μM omvänd primer (dvs. ot26, sgRNA/crRNA-expressionsplasmidkonstruktion), 5 μL 2,5 mM dNTP-blandning, 0,5 μL DNA-polymeras, 10 μL 5x DNA-polymerasreaktionsbuffert, och dubbeldestillerat vatten (ddH2O) upp till en total volym på 50 μl.
        OBS: Se kompletterande tabell 2 för en lista över primers som används i denna studie.
      2. Kör touchdown PCR-programmet på en termocykler:
        Steg 1: 98 °C i 30 sekunder.
        Steg 2 med 10 cykler: 98 °C i 10 s, 68 °C i 20 s och 72 °C i 15 s.
        Steg 3 med 25 cykler: 98 °C i 10 s, 59 °C i 20 s och 72 °C i 15 s.
        Steg 4: 72 °C i 2 min.
        Håll slutligen vid 4 °C tills uppföljningsförsöken inleds.
        OBS: 68 °C i steg 2 och 59 °C i steg 3 beror på smälttemperaturen för både framåt- och bakåtprimrar, varierande från olika primrarpar. Tiden vid 72 °C i steg 2 och 3 bestäms av PCR-produktens längd och DNA-polymerasets hastighet.
    2. Isolera PCR-produkterna via gelelektrofores (100 V, 30 min). Eluera DNA-sekvenserna från agarosgelen via ett DNA-gelextraktionskit (se materialförteckning).
      OBS: En 0,8% agarosgel krävs för fragment längre än 500 nt, en 1,5% agarosgel för fragment mellan 100 nt och 500 nt och en 2% agarosgel för fragment kortare än 100 nt.
    3. Sätt in TU som uttrycker sgRNA / crRNA i en pRSII404/424 skyttelvektor19, som innehåller ampicillinresistensgenen och den jästvalbara auxotrofa markörgenen-TRP1.
      1. Smält skyttelvektorn vid 37 °C i 1 timme med de två restriktionsenzymerna SacI och Acc65I. Bered reaktionsblandningen genom att tillsätta 5 μg av skyttelvektorn, rekommenderade mängder enzymer, rötningsbuffert (enligt enzyminstruktionerna) ochddH2Oupp till en total volym på 30 μl.
      2. Kontrollera skyttelvektorns uppslutning med hjälp av gelelektrofores (se delsteg 1.3.2). Inaktivera sedan de två enzymerna vid 65 °C i 20 minuter.
      3. Använd Gibson-monteringsmetod 20 för att sätta in de renade PCR-produkterna i den uppskurna skyttelvektorn genom att släppa in den ekvimolära DNA-blandningen vid50 °C i 1 timme.
      4. Transformera Escherichia coli DH5α kompetenta celler med ovanstående Gibson-reaktionsblandning via värmechocktransformationsmetoden21. Överför de transformerade E. coli-cellerna till Luria-Bertani (LB) agarplattor innehållande ampicillin (0,1 g / L). Sätt plattorna i inkubatorn vid 37 °C och låt cellerna växa över natten.
      5. Plocka fyra kolonier från LB-agarplattan och odla dem separat över natten vid 37 °C i LB-lösning innehållande ampicillin (0,1 g/L). Använd sedan miniberedningsproceduren för att extrahera plasmider från E. coli-cellerna 22.
      6. Använd primrarna ot18 och ot19 (se kompletterande tabell 2 för oligosekvenser) för att sekvensera och bekräfta den infogade transkriptionsenheten via Sanger-metoden23.
        OBS: I senare experiment kommer de konstruerade och bekräftade plasmiderna att införas i jästgenomet via PEG / LiAc-protokollet24.

2. Design och konstruktion av ställningens RNA-uttryckskassett

OBS: Ställningsguide-RNA (scRNA) består av sgRNA-sekvensen och MS2-hårnålstrukturerna25. Två typer av MS2 hårnålsstrukturer används i detta arbete: vildtyp MS2 hårnål-wt och f6 MS2 pälsprotein (MCP) aptamer-f6.

  1. Syntetisera en scRNA-mall som kan rymma olika distanssekvenser (dvs. pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
    OBS: I denna studie syntetiserades scRNA-mallen av ett gensyntesföretag (se materialtabell).
  2. Utforma lämpliga primers (se kompletterande tabell 2) för att köra PCR på nödvändiga distanssekvenser.
  3. Följ procedurerna i steg 1.3 för att konstruera en scRNA-uttryckskassett.

3. dSpCas9 teknik och expressionsplasmidkonstruktion

  1. Hämta plasmiden pTPGI_dSpCas9_VP64 (se Materialförteckning).
  2. Konstruera acceptorvektorn pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, baserat på pRSII406-skyttelvektorn, via touchdown PCR och Gibson-monteringsmetoden (se steg 1.3). Plasmiden ger en stark konstitutiv promotor-pGPD och en terminator-CYC1t.
  3. Smält den pTPGI_dCas9_VP64 plasmiden och den nykonstruerade acceptorvektorn (5 μg för 1 timme eller 10 μg för övernattning - se steg 1.3.3.1 som referens) med XbaI och XhoI vid 37 °C. Separera och rena skärfragmentet och acceptorvektorn enligt steg 1.3.2.
  4. Ligera det renade skärfragmentet och acceptorvektorn med T4 DNA-ligas vid 16 °C i 8 timmar. Bered ligeringslösningen genom att tillsätta 50-100 ng av den renade acceptorvektorn, renade målfragment i ekvimolär mängd med acceptorvektorn, 1,5 μL T4-buffert, 0,5 μL T4-ligas ochddH2Oupp till en total volym på 15 μl.
  5. Följ steg 1.3.3.3 och 1.3.3.4. Kontrollera sedan att den nykonstruerade plasmiden är korrekt genom digestion med XbaI och Xhol (37 °C, 1 timme) och gelelektrofores (se steg 1.3.2).

4. dCas12a teknik och plasmidkonstruktion

  1. Konstruera plasmiderna som uttrycker dCas12a-AD.
    1. Syntetisera två jästkodonoptimerade dCas12a-proteiner (denAsCas12a och dLbCas12a) flankerade av BamHI- och Xhol-restriktionsenzymställen.
      OBS: I denna studie syntetiserades de två jästkodonoptimerade dCas12a-proteinerna av ett gensyntesföretag (se materialtabell).
    2. Konstruera acceptorvektorn pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 via touchdown PCR och Gibson-monteringsmetoden (se steg 1.3), där "promotorn" är antingen pGPD eller pGAL1, "sp" representerar en kort slumpmässig sekvens och "AD" är antingen VPR eller VP64.
    3. För in varje dCas12a-protein i de två nykonstruerade acceptorvektorerna via digestion med BamHI och XhoI och ligering med T4 DNA-ligas (se steg 3.3 och 3.4).
  2. Konstruera plasmiderna som uttrycker en bar dCas12a.
    1. Konstruera en acceptorvektor för galaktosinducerbara expressionskassetter av dCas12a som pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t med touchdown PCR och Gibson-monteringsmetoden (se steg 1.3).
    2. Smält plasmiderna som innehåller dCas12a-proteinerna och ovanstående acceptorvektor med BamHI och Xhol och ligera dem sedan med T4 DNA-ligas för att få plasmiden pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (se steg 3.3 och 3.4).
    3. Smält plasmiden som erhölls i steg 4.2.2 med Acc65I och BamHI, och ersätt sedan pGAL1 med pGPD via touchdown PCR och Gibson-monteringsmetoden för att konstruera pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. Anti-CRISPR-proteinteknik och plasmidkonstruktion

OBS: Tre typer av promotorer har använts för att driva Acrs-uttryck: en inducerbar promotor-pGAL1, fyra jästkonstitutiva promotorer-pGPD, pACT1, pTEF1 och pTEF2 och en syntetisk konstitutiv promotor-genCYC1t_pCYC1noTATA26.

  1. Erhålla plasmiderna som innehåller sekvenserna av typ II Acrs (AcrIIA2, AcrIIA427 och AcrIIA5 28) och typ V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 och AcrVA529) från ett gensyntesföretag.
  2. Konstruera plasmiderna baserat på pRSII403-skyttelvektorn för att uttrycka Acrs.
    1. Konstruera AcrIIA-uttryckskassetter.
      OBS: Använd touchdown PCR för att förstärka fyra olika promotorer (dvs. pGPD, pACT1, pTEF2 och genCYC1t_pCYC1noTATA), de tre typerna av AcrIIA och två terminatorer (ADH1t och CYC1t). Bygg en serie TUs som uttrycker AcrIIAs, under olika promotorer, via Gibson-monteringsmetoden (se steg 1.3).
    2. Konstruera AcrVA-uttryckskassetter.
      1. Syntetisera acceptorsekvensen: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, där "sp" är en slumpmässig sekvens som kommer att ersättas av AcrVA senare.
        OBS: I denna studie syntetiserades acceptorsekvenserna av ett gensyntesföretag (Table of Materials).
      2. Montera acceptorvektorerna pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, där "promotorn" är: pGAL1, pTEF1 och genCYC1t_pCYC1noTATA. Använd Gibson-monteringsmetoden (se steg 1.3).
      3. Sätt in var och en av de tre AcrVAs i acceptorvektorn som beskrivs i steg 5.2.2.2 (via touchdown PCR och Gibson-monteringsmetoden [se steg 1.3]) för att bygga en uppsättning plasmider som producerar AcrVAs.
  3. Ytterligare ingenjör AcrIIA4 genom att utöka dess sekvens med sekvenserna av GS-länkaren och HBD (hER). Detta gör det möjligt att bygga en β-östradiol-responsiv krets.
    1. Använd touchdown PCR för att få GS-HBD- och AcrIIA4-delar separat (se steg 1.3.1).
    2. Sätt AcrIIA4, GS-HBD och skyttelvektorn i Gibson-blandningen och konstruera hela plasmiden via Gibson-metoden (se steg 1.3.3).

6. crRNA-detektering: RT-qPCR och primers design

OBS: crRNA-detektion uppnåddes via RT-qPCR, som är organiserad i tre steg.

  1. Utför RNA-extraktion och rening från jästceller via ett RNA-kit.
    1. Odla jästceller över natten i 2 ml syntetiskt definierat komplett medium (SDC, 1 L volym: 20 g glukos, 2 g AA-blandning, 6,7 g YNB, 396 mg leucin, 79,2 mg tryptofan, 79,2 mg histidin och 79,2 mg uracil) med hjälp av en 24-brunnsplatta (240 rpm, 30 ° C).
    2. På morgonen späd cellkulturen (1:100) till 2 ml färsk SDC och fortsätt att odla jästcellerna vid 30 ° C, 240 rpm, i ytterligare 4 timmar.
    3. Skörda hela 2 ml av celllösningen och centrifugera vid 20,238 x g i 2 minuter. Ta bort supernatanten försiktigt eftersom cellpelleten är liten.
    4. Extrahera RNA från jästceller med hjälp av ett RNA-kit.
    5. Kontrollera RNA-kvaliteten.
      1. Förbered en 1% agarosgel. Blanda 5 μl av varje RNA-prov med 1 μl DNA-laddningsfärgämne. Ladda sedan blandningen på gelén och kör den.
      2. Se till att två klara band vid ~ 4,000 nt och ~ 2,000 nt, motsvarande ribosomalt RNA (25S / 18S), finns på gelén. Ett ytterligare suddigt band kan ses vid ~ 80 nt för tRNA.
    6. Använd RNA-proverna omedelbart för cDNA-syntes eller förvara dem vid -80 °C för framtida bruk.
  2. Omvänd transkription: Använd stam-loop-metoden 30 för att bilda den första strängen av cDNA som motsvarar crRNA (40 nt). För omvänd transkription av sgRNA (nästan 100 nt) är proceduren densamma som för cDNA-syntesen av referensgenen ACT1.
    OBS: Metoden för omvänd transkription av crRNA skiljer sig från den som används med sgRNA och ACT1 mRNA. Eftersom crRNA är mycket kort behandlades det som ett mikroRNA och använde mikroRNA-omvänd transkriptionsmetod (stam-loop-metod) för att erhålla motsvarande cDNA. Två cDNA-syntessatser (ett stam-loop-kit för crRNA och ett vanligt omvänt transkriptionskit för ACT1-genen ) användes vid crRNA-kvantifiering. Samma mängd RNA användes i de två satserna (se materialtabell) för att göra experimentresultaten jämförbara. Primern som användes med stam-loop-satsen utformades enligt stam-loop-sekvensen och de sista sex nukleotiderna vid 3'-änden av crRNA (för stam-loop och primersekvens, se kompletterande tabell 2).
    1. Stam-loop-metod för crRNA omvänd transkription
      1. Ta RNA-mallen, primern och buffertarna ur frysen och låt dem smälta på is.
      2. Genomisk DNA-borttagning: Förbered först 10 μL av reaktionsblandningen enligt satsinstruktionerna. Lägg blandningen i en termisk cykler vid 42 °C i 2 minuter. Slutligen överför den till is.
      3. Syntes av den första cDNA-strängen: Bered 20 μl av reaktionsblandningen genom tillsats av 10 μl av blandningen från steg 6.2.1.2, 1 μl stam-loopprimer (2 μM koncentration), 2 μL 10x RT-reaktionsbuffert, 2 μL enzymblandning med omvänd transkription (innehållande omvänt transkriptas) och 5 μl RNasfrittH2O.
      4. Placera reaktionsblandningen i en termisk cykler och kör följande program: 25 °C i 5 minuter, 50 °C i 15 minuter och 85 °C i 5 minuter. Använd produkten omedelbart för qPCR-reaktionen eller förvara den vid -80 °C.
    2. sgRNA och ACT1 mRNA omvänd transkription
      1. Första reaktionen: Förbered en 13 μL-blandning bestående av primerblandningen, dNTP-blandningen, RNA-mallen (50 pg-5 μg) och RNasfritt vatten (förutom RNA-mallen, allt som tillhandahålls av satsen), enligt satsinstruktionerna. Använd 1 μg RNA-mall. Lägg blandningen i en termisk cykler vid 70 °C i 10 minuter.
      2. Andra reaktionen (cDNA-syntes): Bered reaktionsblandningen genom att tillsätta reagenserna (enligt beskrivningen i satsens anvisningar) till 13 μL av den första reaktionslösningen upp till en slutlig volym på 20 μl. Placera blandningen i en termisk cykler i 15 minuter vid 50 °C och sedan i ytterligare 5 minuter vid 85 °C. Använd produkten omedelbart för qPCR-reaktionen eller förvara den vid -80 °C.
  3. SYBR-kit för qPCR: Detektering av Ct-värde
    OBS: Den omvända primern som används i crRNA: s qPCR är fixerad eftersom den motsvarar det omvända komplementet av stamslingsekvensen (se kompletterande tabell 2). Den främre primern är däremot variabel och beror på sekvensen av crRNA. Framåt- och bakåtprimrarna för sgRNA och ACT1 mRNA qPCR är utformade vid https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Två primrar väljs när skillnaden mellan deras smälttemperaturer inte överstiger 2 °C (se kompletterande tabell 2). Varje prov mäts i tre replikat.
    1. Bered qPCR-reaktionsblandningen enligt tillverkarens anvisningar för SYBR-kitet.
    2. Ställ in följande qPCR-program i en PCR-maskin i realtid.
      Förinkubation: 10 min vid 95 °C.
      PCR-steg: 15 s vid 95 °C, följt av 34 s vid 55 °C. Ställ in cykeln för PCR-steget till 45 gånger. Smältsteg: 10 s vid 95 °C, följt av 60 s vid 65 °C och slutligen 1 s vid 97 °C.
    3. Beräkna de relativa mRNA-uttrycksvärdena via Pfaffl-formeln31.

7. Immunofluorescens för att detektera Cas-proteiner

OBS: CasS-proteiner (CasP) smälts till en His_tag.

  1. Beredning av jästceller
    1. Plocka några jästceller med en steril slinga och odla dem i 5 ml YPD-rikt medium över natten vid 240 rpm vid 30 ° C. På morgonen tillsätts 500 μL av celllösningen till 20 ml färsk YPD och odlas vid 240 rpm vid 30 °C tills OD600 når 0,6.
    2. Ta 5 ml av kulturen och blanda den med 500 μL 37% formaldehyd. Låt blandningen stå i rumstemperatur (RT) i 10 minuter. Skörda cellerna genom centrifugering vid 1 500 x g i 5 minuter.
    3. Ta bort supernatanten och suspendera cellerna igen med 1 ml fixeringsbuffert (0,1 M KH 2 PO4, 0,5 M MgCl2, 3,7% formaldehyd, pH = 6,5). Håll celllösningen vid rumstemperatur i 20 minuter.
    4. Centrifugera celllösningen vid 1 500 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten och suspendera cellerna igen i 1 ml tvättbuffert (0,1 M KH 2 PO 4,1,2M sorbitol, pH = 6,5) kompletterat med 4 μL beta-merkaptoetanol och4 μL lysatlösning (5 mg/ml). Häll celllösningen i en inkubator vid 37 °C i 20 minuter.
    5. Centrifugera celllösningen vid 1 500 x g i 5 minuter och kassera supernatanten. Tvätta cellpelleten två gånger med 1 ml PBS genom centrifugering (1 500 x g i 5 min).
    6. Resuspendera cellerna i 100 μL PBS plus 0,05% Tween 20 och tillsätt 4 μL BSA-lösning (10 mg/ml). Håll celllösningen vid rumstemperatur i 20 minuter.
  2. Inkubation med primär antikropp
    1. Tillsätt Anti-His tag primära antikropp till blandningen i steg 7.1.6 i spädning 1:400. Håll lösningen vid rumstemperatur i 2 timmar.
    2. Centrifugera blandningen i steg 7.2.1 vid 1 500 x g i 5 minuter och avlägsna supernatanten. Tillsätt 1 ml PBST och centrifugera (1 500 x g) i 5 minuter för att tvätta cellpelleten. Upprepa den här åtgärden två gånger. Slutligen kassera supernatanten och suspendera cellerna i 100 μL 1x PBST.
  3. Detektering av mikroskopiceller
    1. Montera cellerna på en bild; Ta 2 μL av celllösningen från steg 7.2.2 och placera den på en glasskiva. Täck den med ett täckglas.
    2. Observera cellerna under ett fluorescensmikroskop. Slå på lysrörskällan, mikroskopet och datorn. Skriv ner numret för lysrörskällan och öppna mikroskopprogrammet på datorn.
    3. Sätt bilden på mikroskopsteget. Välj 40x objektivlinsen och observera cellerna under det gröna ljuset (550 nm). Flytta den grova fokusratten tills jästcellernas kontur visas. Flytta finfokusratten för att fokusera cellerna.
    4. Upptäck cellerna med mikroskopprogramvaran. Stäng mikroskopets synfält och växla till datorskärmen. Klicka på Live, vänta i 3-5 s och klicka på Capture för att ta en bild. Spara bilden.
    5. Stäng av datorn, mikroskopet och lysröret.

8. Datainsamling: FACS

OBS: Grön fluorescens detekteras via flödescytometri (dvs. fluorescensaktiverade cellsorteringsmätningar [FACS]). Jästceller odlas i allmänhet vid 30 ° C och 240 rpm för att köra FACS-experiment. Celler kan dock kräva vissa försiktighetsåtgärder beroende på deras genetiska innehåll. Celler som innehåller genen dCas12a-VPR (kontrollerad av den GPD-konstitutiva promotorn) måste odlas i 24 timmar i SDC-lösningen. Därefter späds cellerna i ett förhållande av 1:100 i färsk SDC och odlas i ytterligare 12 timmar innan fluorescensintensiteten mäts. Celler modifierade med AcrIIA4-HBD (hER) -genen kräver också utspädning. Dessutom måste OD600 kontrolleras. Först får cellerna växa i SDC över natten (över 14 timmar). På morgonen mäts OD600. Därefter späds kulturen i SDC, levereras med en mångsidig koncentration av β-östradiol, ner till OD600 = 0,1. Före FACS-experiment odlas cellerna i ytterligare 7 h så att OD600 når 0,8-1,0. Celler som uttrycker dCas9-VP64 eller dCas12a-VP64 odlas i SDC i 20-24 timmar utan utspädning och ytterligare tillväxt före mätningarna vid FACS-maskinen.

  1. Slå på FACS-maskinen 20 min före mätningarna för att värma upp lasern.
  2. Bered proverna (spädning): blanda 20 μl av cellkulturen med 300 μlddH2O.
  3. Kör FACS-programvaran på datorn som är ansluten till FACS-maskinen och skapa ett nytt experiment. Ställ in mätparametrarna (dvs. FSC (SSC) -A / H / W och histogram).
  4. Välj filter enligt excitations- och emissionsvåglängderna för proverna. Till exempel är målproteinet här yEGFP, vars excitations- och emissionsvåglängder är 488 nm respektive 507 nm. Så välj FITC- eller GFP-filtret (excitationsvåglängd: 488 nm; emissionsvåglängd: 527/32 nm). Ange anskaffningscellnumret till 10 000.
  5. Justera FITC-filterspänningen genom att mäta intensiteten hos fluorescerande pärlor. Se till att den relativa skillnaden i intensiteten hos pärlorna mellan två på varandra följande experiment inte överstiger 5%.
  6. Tvätta maskinen med ddH2O i några sekunder för att ta bort eventuella överflödiga pärlor.
  7. Mät provets fluorescensintensitet. Klicka på Förhandsgranska och vänta i 3-5 s för provinjektionsstabilitet. Klicka slutligen på Anskaffa.
  8. Mät pärlorna igen i slutet av experimentet. Spänningen är den som användes under den första strängmätningen (se steg 8.4, 438-441 V). Kontrollera om den relativa skillnaden mellan de två pärlornas mått överstiger 5%.
  9. Exportera FACS-data som FCS-filer.
  10. Analysera FCS-filerna med R Studio-programvaran.

9. Analys av data

OBS: Använd Flowcore R Bioconductor paket32 i R studio. De FCS filer analyserades med hjälp av ett skript skrivet i R-språk.

  1. Öppna R studio och ladda skriptet Bdverse-analys. R för att analysera FCS-filerna.
  2. Ange experimentnamnet (ename), katalogen (sökvägen) där FCS-filerna finns
    Lagrad (dir_d) och där resultatfilerna skapas (dir_r).
  3. Ställ in fluorescenskanalen. Till exempel select_ch = "GPA-A" om grön fluorescens mättes.
  4. Ange antalet prover som mättes (s_num).
  5. Ställ in måtten för varje punktdiagram (sxlim, sylim). Ange den maximala längden på x- och y-axeln för stapeldiagram och låddiagram (xlimit, ylimit). xlimit måste vara större än eller lika med s_num.
  6. Välj grindmetod genom att ta bort # från motsvarande rader.
    OBS: morphGate är en automatisk grindmetod som utförs av skriptet (dvs. regionen för punktdiagrammen där cellerna är tätare känns igen och väljs av programmet). polygonGate och rectangleGate kräver att man tittar på punktdiagrammen och definierar antingen hörnen på en polygon eller sidan av en rektangel som omfattar zonen där de flesta cellerna ligger.
  7. Välj det flowSet-objekt som är låst, vilket motsvarar den valda grindmetoden. Välj punktdiagrammets upplösning (res; bör vara minst lika med 256).
  8. Avkommentera flt_low <- filter_low (sp) för att ta bort mätningar där fluorescens är negativ. Avkommentera flt_sp <- filter (flt_lw) för att ta bort avvikande värden på grund av andra experiment.
  9. Tryck på Source och kör skriptet. Alla filer som innehåller resultaten från analysen skapas i dir_r.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

sgRNA/crRNA-uttryck av ett RNA-polymeras III-typ promotor
Först behandlade detta arbete konstruktionen av transkriptionsaktiveringskretsen (krets 1) som visas i figur 1A. Den innehöll tre grundläggande komponenter: 1) genen som kodar för yEGFP (reportern), som föregicks av en serie olika syntetiska promotorer som gav målplatser för dCas9/dCas12a-AD; 2) en jästkodonoptimerad version av dCas9 eller dCas12a smält till en aktiveringsdomän (VP64 respektive VPR) och innehållande antingen en eller två nukleära lokaliseringssekvenser (NLS). Båda dCas-proteinerna producerades av en stark konstitutiv promotor-pGPD; och 3) en sgRNA/crRNA-sekvens som styrde dCas9/dCas12a-AD till målplatserna. Aktiveringseffektiviteten hos dCas9/dCas12a-baserade aktivatorer visualiserades och reflekterades av reporterns fluorescensintensitet (mätt via FACS-experiment).

Ett dCas9-protein (dSpCas9) och två dCas12a-proteiner (denAsCas12a och dLbCas12a) testades. En 3,36-faldig aktivering uppnåddes med dSpCas9 förlängd, vid dess C-terminal, med VP64 AD och bindning av en syntetisk promotor-uppströms av yEGFP-innehållande sex kopior av lexOp-målplatsen. SGRNA placerades i en integrativ skyttelvektor och transkriberades av RNA-polymeras III-beroende SNR52-promotorn ( SNR52i-konfiguration , se figur 1B). När det gäller dCas12a returnerade denAsCas12a-VPR den högsta aktiveringen (4,45 gånger) från en syntetisk promotor med tre operatorer när crRNA uttrycktes via SNR52i-konfigurationen (figur 1C). Under samma förhållanden uppnådde dLbCas12a-VPR sin bästa fluorescensförbättring (3,21 gånger) (figur 1D). Det bör noteras att jämförelsetermen i varje experiment var en krets vars sgRNA / crRNA inte kunde binda lexoperatörerna.

Multicopy plasmider är inte nödvändiga
SNR52i sgRNA-uttryckskassetten ersattes med en RGR-struktur uttryckt av en måttligt stark promotor-pADH1. I både dCas9- och dCas12a-fallen föreföll aktivering i närvaro av ett sgRNA/crRNA genererat genom självklyvning av RGR jämförbart med eller till och med lägre än det som uppnåddes med ett sgRNA/crRNA producerat via SNR52i, trots att pSNR52 ansågs vara en svag promotor (se figur 1C,D för de första resultaten erhållna med dCas12a).

För att ytterligare undersöka sambandet mellan sgRNA/crRNA-mängd och aktiveringseffektivitet infördes de två sgRNA/crRNA-uttryckssystemen i en episomal plasmid, som kan tas upp av cellen i 10-40 kopior och generera en större mängd sgRNA/crRNA. Som visas i figur 2A var aktiveringen av crRNA belägen på en integrativ plasmid (antingen SNR52i eller RGRi) 1,4 till 2,4 gånger högre än den som uppnåddes när samma crRNA uttrycktes av en episomal plasmid (antingen SNR52m eller RGRm). Trenden bekräftades av sgRNA. I detta fall garanterade den integrativa plasmiden en 1,1- till 1,5-faldig högre aktivering (figur 2B). För att utesluta att resultaten orsakades av en förlust av episomala plasmider utfördes RT-qPCR för att kvantifiera sgRNA / crRNA relativ överflöd in vivo. Resultaten, i figur 2C,D, verifierade att den episomala vektorn producerade en mycket högre nivå av sgRNA/crRNA än den integrativa vektorn, oavsett expressionssystem (RGR eller SNR52). Dessa resultat visade att SNR52-systemet kunde fungera ännu bättre än RGR-systemet, och en högre mängd sgRNA/crRNA i cellen garanterade inte en högre aktivering av CRISPR-Cas-systemet. Därför bör episomala plasmider inte användas vid konstruktion av digitala genkretsar där dCas9/dCas12a-AD används.

Byggnadsställning RNA-teknik
Ett scRNA konstruerades genom att utvidga sekvensen av ett sgRNA med MS2-hårnålsstrukturer som tillät att rekrytera VP64 AD när det smältes till MS2-pälsproteinet (MCP, se figur 3A). På detta sätt behövdes ingen konstruktion av eller modifieringar av dCas9. Två MS2-varianter provades: wt och f6. ScRNA innehållande den enda MS2-hårnålen-1×MS2(wt) och 1×MS2(f6)-gav en 5,27-faldig respektive en 4,34-faldig aktivering. ScRNA med en kombination av de två hårnålarna-2×MS2(wt+f6)-gav dock den övergripande högsta aktiveringen i denna studie (7,54 gånger, se figur 3B). Dessa resultat visade att konstruktion av ett scRNA var mycket effektivare än att smälta några aktiveringsdomäner till dSpCas9 direkt.

Boolesk grind baserad på Acr-proteiner
För att ytterligare kontrollera och finjustera transkriptionsaktivering av CRISPR-Cas-system modifierades krets 1 med införandet av en fjärde TU för uttryck av anti-CRISPR-proteiner (se figur 4A för AcrIIA och figur 5A för AcrVAs). Efter att ha visat att Acrs var effektiva, i S. cerevisiae, i kontrast till aktiveringen på grund av dCas9 / dCas12a-AD, byggdes en ny krets (se figur 5D) för att testa AcrVA-verkan på dCas12a-baserade repressorer (ett tidigare arbete33 hade redan visat att AcrIIA kunde hämma dCas9-baserad nedreglering av gener). De nya, Acr-innehållande små nätverken fungerade som enkla booleska grindar (JA och INTE), vilket kan leda till en omformning av ingångsskiktet i mer komplexa syntetiska gendigitala kretsar.

AcrIIA4 är en stark hämmare av dSpCas9
Fyra olika promotorer med olika styrkor användes för att driva uttrycket av tre typer av AcrIIs-AcrIIA2, AcrIIA4 och AcrIIA5. Resultaten visade att de tre AcrII fungerade på ett dosberoende sätt i S. cerevisiae. När de uttrycktes av en stark promotor-pGPD-reducerade de fluorescensnivån som uppnåddes av dSpCas9: scRNA_2×MS2 (wt + f6) -MCP-VP64 till 0,21, 0,11 respektive 0,13 av dess värde (figur 4B). Eftersom AcrIIA4 var den enda som orsakade hög hämning av fluorescensuttryck även när det producerades av en svag, syntetisk promotor genCYC1t_pCYC1noTATA kunde vi dra slutsatsen att AcrIIA4 var den starkaste hämmaren bland de tre AcrII. Därefter smältes HBD(ER) samman med C-änden på AcrIIA4 för att bygga en β-östradiolavkänningsanordning (se figur 4C). I närvaro av östrogen β-östradiol kunde AcrIIA4-HBD (ER) translokera in i kärnan och sedan neutralisera funktionen hos den dSpCas9-baserade aktivatorn. Titreringskurvan i figur 4D visar att kretsen beter sig som en NOT-grind med ett ON/OFF-förhållande som närmar sig 2,3.

AcrVA är repressorer av dCas12a-proteiner
En NOT-grind designades och byggdes genom att sätta in pGAL1-drivande AcrVA-uttryckskassetten i krets 1. På detta sätt kan AcrVA-syntes och därmed undertryckande av dCas12a-AD induceras av galaktos (figur 5A). Som visas i figur 5B,C hindrade AcrVA1 både denAsCas12a och dLbCas12a som aktivatorer genom att minska fluorescensuttrycket från 19% till 71%, beroende på kretsschemat. AcrVA4 och AcrVA5 kan inte utöva någon åtgärd på denAsCas12a34. De utförde dock en stark hämning av dLbCas12a-baserade aktivatorer genom att minska fluorescensuttrycket upp till 84% (AcrVA5) och 82% (AcrVA4). Sammantaget visade sig AcrVA5 vara den mest tillförlitliga, bland dessa tre AcrVA, för att hämma dLbCas12a-baserade aktivatorer eftersom det garanterade, i olika kretsar, högre än 70% förtryck.

AcrVA1-verkan är koncentrationsberoende
Sambandet mellan AcrVAs in vivo-koncentration och deras hämmande effekter på både aktivatorer och repressorer baserat på denAs/dLbCas12a studerades också. För detta ändamål uttrycktes varje AcrVA under olika promotorer: den starka pGAL1, den medelstarka pTEF1 och den svaga genCYC1t_pCYC1noTATA. Som illustreras i figur 5E visade AcrVA1 stora fluktuationer i prestanda beroende på promotorn som ledde syntesen. AcrVA1 fungerade ganska bra endast när den producerades av pGAL1. Under pTEF1 och genCYC1t_pCYC1noTATA visade AcrVA1 endast en viss repression på den nakna dLbCas12a. AcrVA4 och AcrVA5 verkade däremot vara mindre känsliga för deras koncentration, särskilt när de interagerar med den nakna dLbCas12a.

Dessa data visade att AcrVA4 och AcrVA5 generellt presterade bättre än AcrVA1 när det gällde att hämma dLbCas12a-baserade transkriptionsfaktorer i S. cerevisiae. Det bör noteras att AcrVA5 har en märklig arbetsmekanism, eftersom den fungerar som ett enzym som modifierar LbCas12a permanent. Men som nämnts ovan kan AcrVA5 (tillsammans med AcrVA4) inte interagera med denAsCas12a.

När AcrVA uttrycktes under pGAL1 blir kretsar antingen JA-grindar (dCas12a smältes till en AD) eller INTE-grindar (nakna dCas12a). Den förstnämnda såg alla högpresterande ut, medan den senare verkade fungera bättre i närvaro av AcrVA4 eller AcrVA5.

Figure 1
Figur 1: Transkriptionell aktivering medierad av dCas9/dCas12a-AD. (A) Krets 1-diagram. De syntetiska promotorerna för yEGFP innehöll sex (6x) och tre (3x) kopior av målplatser för dCas9 respektive dCas12a. Därefter kombinerar dCas9 / dCas12a-AD med sgRNA / crRNA; Den syntetiska promotorn är riktad och aktiverad på grund av närvaron av aktiveringsdomänerna. (B) Den bästa aktiveringseffektiviteten för dSpCas9-VP64 uppnåddes när det fanns sex lexOp-målställen på den syntetiska promotorn och sgRNA transkriberades av SNR52i. (C,D) Den högsta aktiveringseffektiviteten för dCas12a-VPR erhölls när tre kopior av lexOp infördes i den syntetiska promotorn och crRNA genererades av SNR52i. SNR52i betyder att sgRNA/crRNA producerades av pSNR52, och uttryckskassetten placerades inuti en integrativ skyttelvektor. RGRi betyder att en integrativ plasmid som är värd för RGR-kassetten för att uttrycka sgRNA / crRNA användes. Den negativa kontrollen, "-", representerar ett sgRNA/crRNA innehållande en förvrängd distanssekvens som inte matchar lexOp-stället eller med någon sekvens längs jästgenomet. "bA" indikerar att sgRNA / crRNA binder antisenssträngen av mål-DNA, medan "bS" står för bindning av sinnesträngen. Varje fluorescensnivå representerar medelvärdet från minst tre oberoende experiment (dvs. utförda på olika dagar). Felstaplar är standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Jämförelsen av integrativt och episomalt plasmidproducerande sgRNA/crRNA. (A) Aktiveringseffektivitet för dLbCas12a-VPR:crRNA när man riktar in sig på en enda plats på promotorn uppströms yEGFP. (B) dSpCas9-VP64: sgRNA-aktiverad n× syntetisk promotor ("n" står för antalet lexOp-målplatser). (C,D) Normaliserad sgRNA/crRNA-uttrycksnivå15,16. "i" betyder att sgRNA / crRNA-uttryckskassetten placerades i en integrativ skyttelvektor, medan "m" står för multicopy (dvs episomal) plasmid. "bA"/"bS" indikerar att sgRNA/crRNA binder DNA:ts antisens/sinnessträng. "ctrl" är en negativ kontroll, där en krypterad sgRNA / crRNA uttrycktes. Varje fluorescensnivå representerar medelvärdet från minst tre oberoende experiment (dvs. utförda på olika dagar). Felstaplar är standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Aktiveringseffektiviteten för den nakna dSpCas9 i komplex med ett scRNA. (A) Det schematiska diagrammet över interaktionerna mellan scRNA, MCP-VP64 och det nakna dSpCas916. Den lockliknande strukturen i lila representerar MCP (MS2 coat protein). En MS2-hårnål (den lila strukturen i scRNA) kan rekrytera och binda två kopior av MCP. Således möjliggör ett scRNA inte bara DNA-bindning av dSpCas9 utan även aktivering av genuttryck genom rekrytering av MCP-VP64. (B) Aktiveringseffektiviteten för dSpCas9: scRNA-MCP-VP64. Tre typer av scRNA testades: en som bar den vilda typen MS2 hårnål-1×MS2 (wt), en annan konstruerad med f6 MCP aptamer-1×MS2 (f6), och den sista innehållande båda hårnålarna-2×MS2 (wt + f6), som visade sig vara den mest presterande. Varje fluorescensnivå representerar medelvärdet från minst tre oberoende experiment (dvs. utförda på olika dagar). Felstaplar är standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: AcrIIA-relaterade kretsar och resultat . (A) AcrIIA-uttryckskassetten sattes in i krets 1. Denna ytterligare TU inkluderar pGPD som leder uttrycket av AcrIIAs för att motverka dSpCas9: scRNA_2×MS2 (wt + f6) -MCP-VP64. (B) AcrIIAs hämningseffektivitet på den bästa dSpCas9-baserade aktivatorn i figur 3B. Den svarta streckade linjen representerar fluorescensen i närvaro av den dSpCas9-baserade aktivatorn. Figurerna ovanför varje kolumn visar hämningseffektiviteten beräknad som OFF/ON-förhållandet (dvs. fluorescensnivån i närvaro av AcrIIA dividerat med fluorescensen i frånvaro av AcrIIA). I legenden ökar styrkan hos de fyra konstitutiva promotorerna gradvis från upp till ner. (C) Diagram över β-östradiolavkänningsanordningen (INTE grind) som uttrycker AcrIIA4-HBD(hER). (D) Titreringskurva för kretsen i (C)16. Den gröna kurvan avser förändringen i fluorescens i den funktionella kretsen. Den svarta kurvan härleddes från stammen utan uttryck av AcrIIA4-HBD(hER)-den negativa kontrollen. Den streckade linjen i grått markerade fluorescensplatån vid jämvikten. Det beräknades som medelvärdet av fluorescensvärdena vid koncentrationer av β-östradiol som inte understiger 125 nM. Varje fluorescensnivå representerar medelvärdet från minst tre oberoende experiment (dvs. utförda på olika dagar). Felstaplar är standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: AcrVA-relaterade kretsar och resultat. (A) AcrVA-uttryckskassetten sattes in i krets 1. Den nya TU innehåller den inducerbara promotorn pGAL1 uppströms AcrVA-generna som neutraliserar dCas12a-AD. Den nya kretsen är en pas grind som regleras av galaktos. (B,C) Resultat från den galaktosresponsiva NOT-grinden i (A). Här driver pGAL1 syntesen av AcrVAs, som sedan interagerar med dCas12a-AD15. Den relativa fluorescensen motsvarar OFF/ON-förhållandet. d) Galaktos-responsiv JA-grind. Den använder AcrVAs under kontroll av pGAL1 och den nakna dCas12as som undertrycker syntesen av yEGFP. (E) Jämförelse av hämningseffektiviteten hos AcrVA uttryckt av promotorer med olika styrka15. Grupperna "AcrV-effekter på förtryck" och "nakna dLb" avser kretsen i (D). Grupperna "AcrV-effekter på aktivering" och "dLb-VPR" är resultatet av NOT-grinden i (A). Varje fluorescensnivå representerar medelvärdet från minst tre oberoende experiment (dvs. utförda på olika dagar). Felstaplar är standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande tabell 1: En lista över alla DNA-sekvenser som användes i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 2: En lista över primers som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfiler: R-studioskriptet för att analysera FCS-filerna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet visade ett möjligt komplett arbetsflöde för syntetiska gendigitala kretsar, efter "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) biologiska ingenjörscykel och avseende både torrlaboratorie- och våtlaboratorieexperiment. Här fokuserade vi på CRISPR-Cas-systemet, främst dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a och motsvarande anti-CRISPR-proteiner, genom att designa och bygga i S. cerevisiae små transkriptionsnätverk. Några av dem efterliknade booleska grindar, som är de grundläggande komponenterna i digitala kretsar. Alla kretsar som beskrivs här tillät oss att avbilda egenskaper och egenskaper hos CRISPR-associerade och anti-CRISPR-proteiner i S. cerevisiae. Dessa resultat är väsentliga för att inkludera dessa proteiner i schemat för digitala genkretsar.

DBTL-konceptet ger ett ramverk inom syntetisk biologi, medan många optimeringar och förbättringar ska göras efter testning av en ny artefakt. Till exempel fanns det i krets 1 ursprungligen bara en målplats (en kopia av lexOp) för dCas9/dCas12a-AD på den syntetiska promotorn uppströms yEGFP. Efter att ha testat den kretskonfigurationen fann vi att den inte kunde uppnå mer än en tvåfaldig aktivering15,16. Sedan antog vi att genom att öka antalet kopior av lexOp, som i7, kunde vi nå en högre transkriptionsaktivering. Faktum är att en högre fluorescensnivå erhölls genom att använda tre till sex lexOp-platser (figur 1). Dessutom förbättrade vi ytterligare prestandan hos kretsarna som är värd för dSpCas9 genom att konstruera ett scRNA, vilket är lättare än att smälta en eller flera AD till ett stort protein som dSpCas9 (figur 3). Dessutom, genom att använda en promotor av olika styrkor för att producera de tre AcrIIA som vi valde, drog vi slutsatsen att AcrIIA4 var den starkaste hämmaren bland dem. Således byggde vi en ny NOT-grind som svarar på β-östradiol genom att smälta HBD (ER) till AcrIIA4 och utnyttja den starka repressionen av AcrIIA4 på vår bästa dSpCas9-baserade aktivator (figur 4).

På liknande sätt karakteriserade vi djupt både arbetet med denAsCas12a och dLbCas12a i jäst och deras interaktioner med tre AcrVA (figur 5). För varje dCas12a-AcrVA-par byggde vi en NOT (dCas12a var smält till en AD) och en JA (bare dCas12a) grind som svarade på galaktos. Sammantaget resulterade dLbCas12a, tillsammans med AcrVA5, i det bästa systemet för att beräkna enkla logiska funktioner.

Metoden som beskrivs här presenterade några kritiska steg. Alla protein-DNA-sekvenser var jästkodonoptimerade för att säkerställa högre uttryck i S. cerevisiae. För att undvika ospecifika mål för dSpCas9/denAsCas12a/dLbCas12a i S. cerevisiae-genomet valde vi en bakterieoperator som lexOp. Dessutom visade stammar innehållande GAL1-promotorn en signifikant tillväxtfördröjning som kan begränsa tillämpligheten av pGAL1 på syntetiska genkretsar15.

Vissa ändringar kan också föras till vissa steg i den övergripande metoden. För att förbättra effektiviteten i digestion-ligeringsförfarandet är det att föredra att smälta 10 μg (över natten) av både den införda plasmiden och acceptorvektorerna, snarare än endast 5 μg på 1 timme. På detta sätt uppnås en högre DNA-koncentration efter elueringssteget. Tiden för T4-ligering bör förlängas från 1 h (tillverkarprotokoll) till 8 h. Slutligen bör stammar som innehåller fusionsproteinet dCas12a-VPR spädas efter en 24-timmarsodling och odlas i ytterligare 12 timmar innan ett FACS-experiment körs. Under detta tillstånd är variationen mellan fluorescensnivåerna från olika celler inte längre för hög, och en acceptabel standardavvikelse åtföljer medelvärdet av fluorescensintensiteten över en cellpopulation.

Sammanfattningsvis förklarade detta protokoll hur man förenklar utformningen av digitala genkretsar genom att använda dCas-proteiner och eventuellt anti-CRISPR-proteiner. Ännu viktigare visade vi i detalj hur dessa familjer av proteiner fungerar i S. cerevisiae och vilka av dem som är mest lovande för en framtida användning inom digitala nätverk. Ett olöst problem är kopplingen av CRISPR-dCas/anti-CRISPR-system och kemikalier, som representerar kretsingångarna och inte direkt kan binda dCas-proteiner eller anti-CRISPR. Här kringgick vi problemet genom att använda antingen den inducerbara GAL1-promotorn eller HBD(ER) som är ansluten till AcrIIA4. Ett sätt att generalisera arkitekturen för kretsingångsskiktet är dock nödvändigt för att designa syntetiska digitala genkretsar för olika bioteknikområden såsom metabolisk teknik, biosyntes, biosensing, biodiagnostik och bioremediering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inte något konkurrerande ekonomiskt intresse.

Acknowledgments

Vi vill tacka alla studenter i Synthetic Biology lab-SPST, TJU-för deras allmänna hjälp, tillsammans med Zhi Li och Xiangyang Zhang för deras hjälp i FACS-experiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mL PCR 8-strip tubes NEST 403112
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C
1.5 mL Microtubes Axygen MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011150
2 mL Microtubes Axygen MCT-200-C 
50 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011500
Agarose-molecular biology grade Invitrogen 75510-019
Ampicillin sodium salt Solarbio 69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler Thermo Fisher Scientific 4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit Axygen AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads BD 650621 Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer  BD -
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Sorvall ST 16R Thermo Fisher Scientific 75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α) Life Technologies 18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent GE Healthcare RPN2235
Electrophoresis apparatus Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd JY300C
Flat 8-strip caps NEST 406012
Gene synthesis company Azenta Life Sciences https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568 Invitrogen A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit CWBIO CW2569M Kit used in step 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase) zymoresearch E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope Nikon - Fluorescence microscope
Pipet tips—10 μL Axygen T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL Axygen T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL Axygen T-200-Y-R-S
pRSII403 Addgene 35436
pRSII404 Addgene 35438
pRSII405 Addgene 35440
pRSII406 Addgene 35442
pRSII424 Addgene 35466
pTPGI_dSpCas9_VP64  Addgene 49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase New England Biolabs M0491
Restriction enzyme-Acc65I New England Biolabs R0599
Restriction enzyme-BamHI New England Biolabs R0136
Restriction enzyme-SacI-HF New England Biolabs R3156
Restriction enzyme-XhoI New England Biolabs R0146
Roche LightCycler 96  Roche - Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C - - The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289;
MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit SparkJade AG0502 Kit used in step 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler BIO-RAD 186-1096
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
T5 Exonuclease New England Biolabs M0363
Taq DNA ligase New England Biolabs M0208
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) Takara RR820Q
YeaStar RNA kit Zymo Research R1002
β-estradiol Sigma-Aldrich E8875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).
  2. Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).
  3. Mandell, J. G., Barbas, C. F. Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases. Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).
  4. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  5. Drinnenberg, I. A., et al. RNAi in budding yeast. Science. 326 (5952), 544-550 (2009).
  6. Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates. Nature Communications. 8, 15459 (2017).
  7. Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas. ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).
  8. Nakamura, M., et al. Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells. Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).
  9. Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131 (1), 129-134 (1993).
  10. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  11. Gao, Y., Zhao, Y. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  14. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  15. Yu, L., Marchisio, M. A. Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins. ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).
  16. Zhang, Y., Marchisio, M. A. Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).
  17. Sheff, M. A., Thorn, K. S. Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  19. Chee, M. K., Haase, S. B. New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae. G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).
  20. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  21. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. Fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  23. Sanger, F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).
  24. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  25. Zalatan, J. G., et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).
  26. Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits. Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).
  27. Rauch, B. J., et al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).
  28. Hynes, A. P., et al. An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9. Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).
  29. Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science. 362 (6411), 236-239 (2018).
  30. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  31. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  32. Hahne, F., et al. flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry. BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).
  33. Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae. Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).
  34. Dong, L., et al. An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).

Tags

Retraktion utgåva 188 CRISPR-Cas-system dSpCas9 denAsCas12a dLbCas12a typ II-A anti-CRISPR-proteiner typ V-A anti-CRISPR-proteiner digitala genkretsar Saccharomyces cerevisiae syntetisk biologi
Digitala genkretsar baserade på CRISPR-Cas-system och anti-CRISPR-proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A.… More

Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A. Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64539, doi:10.3791/64539 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter