दानेदार मचानों के भीतर कण अंश में परिवर्तनशीलता को कम करने से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोग की सुविधा मिलती है। यह काम इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रित कण अंशों के साथ दानेदार मचानों को उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है।
माइक्रोगेल माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल (एमएपी) मचानों के निर्माण खंड हैं, जो इन विट्रो सेल कल्चर और विवो ऊतक मरम्मत दोनों के लिए एक मंच के रूप में काम करते हैं। इन दानेदार मचानों में, माइक्रोगेल के बीच शून्य स्थान द्वारा उत्पन्न जन्मजात सरंध्रता सेल घुसपैठ और प्रवास को सक्षम बनाती है। एमएपी पाड़ डिजाइन के लिए शून्य अंश और कण अंश को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि छिद्र कोशिकाओं के लिए एक बायोएक्टिव क्यू है। गोलाकार माइक्रोगेल को नियंत्रित आकार और आकार के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस पर उत्पन्न किया जा सकता है और बाद में उन तरीकों का उपयोग करके फ्रीज-सुखाया जा सकता है जो बहुलक नेटवर्क के फ्रैक्चरिंग को रोकते हैं। पुनर्जलीकरण पर, लियोफिलाइज्ड माइक्रोगेल एमएपी मचानों में नियंत्रित कण अंशों का नेतृत्व करते हैं। माइक्रोगेल लियोफिलाइजेशन के लिए इन विधियों के कार्यान्वयन ने मैक्रोमोलेक्यूल प्रसार और सेल प्रसार पर कण अंश के प्रभाव को दिखाने वाले प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अध्ययनों को जन्म दिया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एमएपी मचानों में कण अंश को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोगेल के निर्माण, लियोफिलाइजेशन और पुनर्जलीकरण को कवर करेगा, साथ ही विट्रो में 3 डी सेल संस्कृति के लिए बायो-ऑर्थोगोनल क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से माइक्रोगेल को एनीलिंग करेगा।
माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल (एमएपी) मचान दानेदार सामग्री का एक उपवर्ग है जिसमें माइक्रोगेल (गेल) बिल्डिंग ब्लॉक एक थोक, छिद्रपूर्ण मचान बनाने के लिए आपस में जुड़े होते हैं। इन दानेदार मचानों के अद्वितीय माइक्रोआर्किटेक्चर के साथ, इंटरलिंक गोलाकार माइक्रोगेल के बीच शून्य स्थान द्वारा उत्पन्न जन्मजात सरंध्रता त्वरित सेल घुसपैठ और प्रवासन1 का समर्थन करती है। एमएपी मचानों के माइक्रोजेल बिल्डिंग ब्लॉक को रासायनिक संशोधनों के साथ सिंथेटिक और प्राकृतिक पॉलिमर दोनों से बनाया जा सकताहै। यहां वर्णित विधियां विशेष रूप से कार्यात्मक नॉरबोर्निन (एनबी) हैंडल के साथ संशोधित हाइलूरोनिक एसिड (एचए) रीढ़ से युक्त माइक्रोगेल के उपयोग को उजागर करती हैं। एचए बहुलक पर एनबी कार्यात्मक हैंडल माइक्रोगेल बनाने के लिए क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रियाओं का समर्थन करता है और एमएपीमचान 3,4 उत्पन्न करने के लिए उन्हें एक साथ जोड़ता है। माइक्रोगेल को एक साथ जोड़ने के लिए कई योजनाओं को नियोजित किया गया है (यानी, एनीलिंग), जैसे कि एंजाइमेटिक1, प्रकाश-आधारित 5,6, और योजक-मुक्त क्लिक रसायन विज्ञान 3,7 प्रतिक्रियाएं। एचए-एनबी माइक्रोगेल को इंटरलिंक करने के लिए टेट्राज़िन-नॉरबोर्निन व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन मांग डाइल्स-एल्डर संयुग्मन का उपयोग करके इस काम में एडिटिव-फ्री क्लिक रसायन विज्ञान का वर्णन किया गया है।
एमएपी मचानों को बनाने के लिए, उपयोगकर्ता पहले रिवर्स इमल्शन का उपयोग करके या तो बैच सिस्टम में या माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के साथ-साथ इलेक्ट्रोहाइड्रोडायनामिक छिड़काव, लिथोग्राफी या यांत्रिक विखंडन2 के साथ माइक्रोजेल बिल्डिंग ब्लॉक उत्पन्न करते हैं। गोलाकार एचए-एनबी माइक्रोगेल के उत्पादन को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है और पहले बैच इमल्शन2 और माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट जनरेशन तकनीक 8,9,10,11 दोनों का उपयोग करके रिपोर्ट किया गया था। इस काम में, गोलाकार एचए-एनबी माइक्रोगेल को नियंत्रित आकार और आकार के लिए प्रवाह-केंद्रित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर उत्पन्न किया गया था, जैसा कि पहलेवर्णित 8,9,10 था। शुद्धिकरण के बाद, माइक्रोगेल एक जलीय निलंबन में मौजूद होते हैं और जाम अवस्था को प्रेरित करने के लिए केंद्रित होना चाहिए। जाम होने पर, माइक्रोगेल कतरनी-पतला गुण प्रदर्शित करते हैं, जो उन्हें इंजेक्शन योग्य, अंतरिक्ष भरने वाली सामग्री के रूप में कार्य करने की अनुमतिदेते हैं। जाम अवस्था को प्रेरित करने की एक विधि लियोफिलाइजेशन, या फ्रीज-सुखाने के माध्यम से माइक्रोगेल को सुखाना है, फिर बाद में सूखे उत्पाद को नियंत्रित मात्रा12 में पुनर्जलीकृत करना है। वैकल्पिक रूप से, अतिरिक्त बफर को माइक्रोजेल घोल से एक छन्नी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से या माइक्रोगेल गोली से बफर को मैन्युअल रूप से हटाने के साथ या तो आकांक्षा द्वारा या शोषक सामग्री का उपयोग करके हटाया जा सकता है। हालांकि, माइक्रोगेल को सुखाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करते समय कण अंशों और शून्य अंशों की एक अत्यधिक परिवर्तनशील श्रेणी उत्पन्न कर सकतेहैं। लियोफिलाइज़िंग माइक्रोगेल के लिए तकनीकों को पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) माइक्रोगेल13 के लिए 70% आईपीए, जिलेटिन मेथाक्राइलोयल (गेलमा) माइक्रोगेल14 के लिए फ्लोराइडयुक्त तेलों और एचए माइक्रोगेल12 के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करके वर्णित किया गया है। यह प्रोटोकॉल सुखाने की प्रक्रिया के दौरान मूल माइक्रोजेल गुणों को बनाए रखने के लिए 70% इथेनॉल, एक मानक प्रयोगशाला अभिकर्मक का उपयोग करके गोलाकार एचए माइक्रोगेल को फ्रीज-सुखाने के तरीकों पर प्रकाश डालता है। एमएपी मचानों12 में अंतिम कण अंशों को नियंत्रित करने के लिए फ्रीज-सूखे एचए माइक्रोगेल को उपयोगकर्ता-परिभाषित वजन प्रतिशत पर तौला और पुनर्जलीकृत किया जा सकता है।
एमएपी पाड़ गठन में अंतिम चरण एक थोक, छिद्रपूर्ण पाड़1 बनाने के लिए माइक्रोगेल को एनीलिंग पर निर्भर करता है। देशी बाह्य मैट्रिक्स घटकों का उपयोग करके और बायो-ऑर्थोगोनल एनीलिंग योजनाओं को नियोजित करके, एमएपी स्काफोल्ड्स इन विट्रो सेल कल्चर और विवो ऊतक मरम्मतदोनों के लिए एक जैव संगत मंच के रूप में काम करते हैं। इन दृष्टिकोणों के माध्यम से, एमएपी मचानों को ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में उनके रोजगार के लिए उपयोगकर्ता-परिभाषित कण अंशों के साथ एचए-एनबी बिल्डिंग ब्लॉक से बनाया जा सकताहै। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एमएपी मचानों में कण अंश को नियंत्रित करने के लिए लियोफिलाइजेशन और पुनर्जलीकरण के बाद एचए-एनबी माइक्रोगेल के माइक्रोफ्लुइडिक उत्पादन का वर्णन करता है। अंत में, माइक्रोगेल को एनीलिंग के चरणों को इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर प्रयोगों के लिए बायो-ऑर्थोगोनल रसायन विज्ञान का उपयोग करके वर्णित किया गया है।
एचए-एनबी माइक्रोगेल के माइक्रोफ्लुइडिक उत्पादन को इमल्शन बैच उत्पादन 3,9 की तुलना में आकार वितरण की संकीर्ण सीमा के साथ माइक्रोगेल उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रोटोकॉ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (1आर01एनएस112940, 1आर01एनएस079691, आर01एनएस094599), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इंफेक्शियस डिजीज (1आर01एआई152568) को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम ड्यूक यूनिवर्सिटी शेयर्ड मैटेरियल्स इंस्ट्रूमेंटेशन फैसिलिटी (एसएमआईएफ) में किया गया था, जो उत्तरी कैरोलिना रिसर्च ट्रायंगल नैनो टेक्नोलॉजी नेटवर्क (आरटीएनएन) का एक सदस्य है, जिसे राष्ट्रीय नैनो टेक्नोलॉजी समन्वित बुनियादी ढांचे (एनएनसीआई) के हिस्से के रूप में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (पुरस्कार संख्या ईसीसीएस -2025064) द्वारा समर्थित किया गया है। लुकास शिमर के साथ-साथ एथन निकलो को सेल कल्चर प्रयोगों के लिए 3 डी मुद्रित डिवाइस बनाने में उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
Rubber bands | Staples | 112417 | |
Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |