التحكم في جزء الجسيمات في سقالات الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها لثقافة الخلية 3D
Summary
إن تقليل التباين في جزء الجسيمات داخل السقالات الحبيبية يسهل التجريب القابل للتكرار. يصف هذا العمل طرق توليد سقالات حبيبية مع كسور الجسيمات الخاضعة للرقابة لتطبيقات هندسة الأنسجة في المختبر .
Abstract
الكبسولات الهلامية الدقيقة هي اللبنات الأساسية لسقالات الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها (MAP) ، والتي تعمل كمنصة لكل من زراعة الخلايا في المختبر وإصلاح الأنسجة الحية . في هذه السقالات الحبيبية ، تتيح المسامية الفطرية الناتجة عن الفراغ الفراغي بين الكبسولات الهلامية الدقيقة تسلل الخلايا والهجرة. يعد التحكم في جزء الفراغ وجزء الجسيمات أمرا بالغ الأهمية لتصميم سقالة MAP ، حيث أن المسامية هي إشارة نشطة بيولوجيا للخلايا. يمكن إنشاء الهلاميات الدقيقة الكروية على جهاز الموائع الدقيقة للتحكم في الحجم والشكل ثم تجفيفها بالتجميد باستخدام طرق تمنع تكسير شبكة البوليمر. عند إعادة الإماهة ، تؤدي الهلاميات الدقيقة المجففة بالتجميد إلى كسور جسيمات خاضعة للرقابة في سقالات MAP. أدى تنفيذ هذه الطرق لتجفيف الميكروجيل إلى دراسات قابلة للتكرار تظهر تأثير جزء الجسيمات على انتشار الجزيئات الكبيرة وانتشار الخلايا. سيغطي البروتوكول التالي تصنيع الكبسولات الهلامية الدقيقة وتجفيفها وإعادة إماهتها للتحكم في جزء الجسيمات في سقالات MAP ، بالإضافة إلى تلدين الهلاميات الدقيقة من خلال الربط الحيوي المتعامد لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد في المختبر.
Introduction
سقالات الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها (MAP) هي فئة فرعية من المواد الحبيبية التي ترتبط فيها كتل البناء microgel (μgel) لتشكيل سقالة مسامية سائبة. مع البنية الدقيقة الفريدة لهذه السقالات الحبيبية ، فإن المسامية الفطرية الناتجة عن مساحة الفراغ بين الميكروجيل الكروي المترابط تدعم تسلل الخلايا المتسارعة والهجرة1. يمكن تصنيع اللبنات الأساسية للميكروجيل لسقالات MAP من كل من البوليمرات الاصطناعية والطبيعية مع تعديلات كيميائية2. تسلط الطرق الموضحة هنا الضوء على وجه التحديد على استخدام المواد الهلامية الدقيقة المكونة من العمود الفقري لحمض الهيالورونيك (HA) المعدل بمقابض نوربورنين الوظيفية (NB). يدعم المقبض الوظيفي NB على بوليمر HA تفاعلات كيمياء النقر لتشكيل الهلاميات الدقيقة وربطها معا لتوليد سقالات MAP 3,4. تم استخدام العديد من المخططات لربط الهلاميات الدقيقة معا (أي التلدين) ، مثل تفاعلات الأنزيمية1 ، 5,6 القائمة على الضوء ، وكيمياء النقر الخالية من المواد المضافة 3,7. تم وصف كيمياء النقر الخالية من المواد المضافة في هذا العمل ، باستخدام اقتران ديلز-ألدر للطلب العكسي للإلكترون رباعي-نوربورنين لربط الهلاميات الدقيقة HA-NB.
لتصنيع سقالات MAP ، يقوم المستخدمون أولا بإنشاء كتل بناء microgel باستخدام مستحلبات عكسية إما في أنظمة الدفعات أو داخل أجهزة الموائع الدقيقة ، وكذلك مع الرش الكهروهيدروديناميكي أو الطباعة الحجرية أو التجزئة الميكانيكية2. تم وصف إنتاج الهلاميات الدقيقة الكروية HA-NB بشكل جيد وتم الإبلاغ عنها سابقا باستخدام كل من مستحلب الدفعات2 وتقنيات توليد قطرات الموائع الدقيقة8،9،10،11. في هذا العمل ، تم إنشاء كبسولات هلامية كروية HA-NB على منصة موائع دقيقة تركز على التدفق للتحكم في الحجم والشكل ، كما هو موضح سابقا8،9،10. بعد التنقية ، توجد الهلاميات الدقيقة في تعليق مائي ويجب أن تتركز للحث على حالة انحشار. عند التشويش ، تظهر الهلاميات الدقيقة خصائص ترقق القص ، مما يسمح لها بالعمل كمواد قابلة للحقن وملء الفراغ1. تتمثل إحدى طرق إحداث حالة انحشار في تجفيف الكبسولات الهلامية الدقيقة عن طريق التجفيد ، أو التجفيف بالتجميد ، ثم إعادة ترطيب المنتج المجفف لاحقا في حجم متحكم فيه12. بدلا من ذلك ، يمكن إزالة المخزن المؤقت الزائد من ملاط microgel عن طريق الطرد المركزي فوق مصفاة أو مع الإزالة اليدوية للمخزن المؤقت من حبيبات microgel إما عن طريق الشفط أو باستخدام مادة ماصة. ومع ذلك ، فإن استخدام الطرد المركزي لتجفيف الهلاميات الدقيقة يمكن أن يولد نطاقا متغيرا للغاية من كسور الجسيمات والكسور الفارغة عند صنع السقالات الحبيبية12. تم وصف تقنيات تجفيف الكبسولات الهلامية الدقيقة باستخدام 70٪ IPA للكبسولات الهلامية الدقيقة13 من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، والزيوت المفلورة للجيل الجيلاتيني ميثاكريلويل (GelMa)14 ، و 70٪ من الإيثانول للهلاميات الدقيقةHA 12. يسلط هذا البروتوكول الضوء على طرق تجفيف الهلاميات الدقيقة HA الكروية بالتجميد باستخدام 70٪ من الإيثانول ، وهو كاشف مختبري قياسي ، للاحتفاظ بخصائص microgel الأصلية أثناء عملية التجفيف. يمكن وزن المواد الهلامية الدقيقة HA المجففة بالتجميد وإعادة ترطيبها بنسب وزن يحددها المستخدم للتحكم في كسور الجسيمات النهائية في سقالات MAP12.
تعتمد الخطوة الأخيرة في تشكيل سقالة MAP على تلدين الكبسولات الهلامية الدقيقة لإنشاء سقالة كبيرة ومسامية1. من خلال استخدام مكونات المصفوفة خارج الخلية الأصلية واستخدام مخططات التلدين المتعامد الحيوي ، تعمل سقالات MAP كمنصة متوافقة حيويا لكل من زراعة الخلايا في المختبر وإصلاح الأنسجة الحية 3. من خلال هذه الأساليب ، يمكن تصنيع سقالات MAP من كتل بناء HA-NB مع كسور الجسيمات المحددة من قبل المستخدم لاستخدامها في تطبيقات هندسة الأنسجة12. يصف البروتوكول التالي إنتاج الموائع الدقيقة للكبسولات الهلامية الدقيقة HA-NB متبوعا بالتجفيف بالتجميد والإماهة للتحكم في جزء الجسيمات في سقالات MAP. أخيرا ، يتم وصف خطوات تلدين الهلاميات الدقيقة باستخدام الكيمياء الحيوية المتعامدة لتجارب زراعة الخلايا 3D في المختبر .
Protocol
Representative Results
Discussion
ثبت أن إنتاج الموائع الدقيقة للكبسولات الهلامية الدقيقة HA-NB يولد هلاميات دقيقة ذات نطاق أضيق لتوزيع الحجم من إنتاج دفعة المستحلب 3,9. تمت صياغة الكبسولات الهلامية الدقيقة الموصوفة في هذا البروتوكول باستخدام رابط متقاطع قابل للانقسام MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا المعاهد الوطنية للصحة ، والمعاهد الوطنية للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (1R01NS112940 ، 1R01NS079691 ، R01NS094599) ، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (1R01AI152568). تم تنفيذ هذا العمل جزئيا في مرفق أجهزة المواد المشتركة بجامعة ديوك (SMIF) ، وهو عضو في شبكة تكنولوجيا النانو مثلث أبحاث نورث كارولينا (RTNN) ، والتي تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم (رقم الجائزة ECCS-2025064) كجزء من البنية التحتية الوطنية المنسقة لتكنولوجيا النانو (NNCI). يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور لوكاس شيرمر ، ما بعد الدكتوراه السابق في المختبر ، وكذلك إيثان نيكلو على مساعدتهم في توليد الجهاز المطبوع 3D لتجارب زراعة الخلايا.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
- Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
- Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
- JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , (2022).
- Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
- Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
- Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
- Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).
