Control de la fracción de partículas en andamios microporosos de partículas recocidas para cultivo celular 3D
Summary
Minimizar la variabilidad en la fracción de partículas dentro de andamios granulares facilita la experimentación reproducible. Este trabajo describe métodos para generar andamios granulares con fracciones de partículas controladas para aplicaciones de ingeniería de tejidos in vitro .
Abstract
Los microgeles son los bloques de construcción de los andamios de partículas recocidas microporosas (MAP), que sirven como plataforma tanto para el cultivo celular in vitro como para la reparación de tejidos in vivo . En estos andamios granulares, la porosidad innata generada por el espacio vacío entre los microgeles permite la infiltración y migración celular. El control de la fracción vacía y la fracción de partículas es fundamental para el diseño de andamios MAP, ya que la porosidad es una señal bioactiva para las células. Los microgeles esféricos se pueden generar en un dispositivo microfluídico para controlar el tamaño y la forma y, posteriormente, liofilizar utilizando métodos que evitan la fracturación de la red de polímeros. Tras la rehidratación, los microgeles liofilizados conducen a fracciones de partículas controladas en andamios MAP. La implementación de estos métodos para la liofilización de microgel ha llevado a estudios reproducibles que muestran el efecto de la fracción de partículas en la difusión de macromoléculas y la propagación celular. El siguiente protocolo cubrirá la fabricación, liofilización y rehidratación de microgeles para controlar la fracción de partículas en andamios MAP, así como el recocido de los microgeles a través de reticulación bio-ortogonal para cultivo celular 3D in vitro.
Introduction
Los andamios de partículas recocidas microporosas (MAP) son una subclase de materiales granulares en los que los bloques de construcción de microgel (μgel) están interconectados para formar un andamio poroso a granel. Con la microarquitectura única de estos andamios granulares, la porosidad innata generada por el espacio vacío entre el microgel esférico interconectado admite la infiltración celular acelerada y la migración1. Los bloques de construcción de microgel de los andamios MAP se pueden fabricar a partir de polímeros sintéticos y naturales con modificaciones químicas2. Los métodos descritos aquí destacan específicamente el uso de microgeles compuestos por una columna vertebral de ácido hialurónico (AH) modificada con mangos funcionales de norborneno (NB). El mango funcional NB en el polímero HA admite reacciones químicas de clic para formar microgeles y unirlos para generar andamios MAP 3,4. Se han empleado numerosos esquemas para unir los microgeles (es decir, recocido), como las reacciones enzimáticas1, 5,6 basadas en luz y química de clic sin aditivos 3,7. La química de clic sin aditivos se describe en este trabajo, utilizando la conjugación de demanda inversa de electrones de tetrazina-norborneno Diels-Alder para interconectar los microgeles HA-NB.
Para fabricar andamios MAP, los usuarios primero generan los bloques de construcción de microgel utilizando emulsiones inversas, ya sea en sistemas por lotes o dentro de dispositivos microfluídicos, así como con pulverización electrohidrodinámica, litografía o fragmentación mecánica2. La producción de microgeles esféricos HA-NB ha sido bien descrita y previamente reportada utilizando tanto la emulsión por lotes2 como las técnicas de generación de gotas microfluídicas 8,9,10,11. En este trabajo, se generaron microgeles esféricos HA-NB en una plataforma microfluídica de enfoque de flujo para un tamaño y forma controlados, como se describió anteriormente 8,9,10. Después de la purificación, los microgeles existen en una suspensión acuosa y deben concentrarse para inducir un estado de atascamiento. Cuando se atascan, los microgeles exhiben propiedades de adelgazamiento por cizallamiento, que les permiten funcionar como materiales inyectables que llenan el espacio1. Un método para inducir un estado atascado es secar los microgeles mediante liofilización, o liofilización, y luego rehidratar el producto seco en un volumen controlado12. Alternativamente, el exceso de tampón se puede eliminar de la suspensión de microgel mediante centrifugación sobre un colador o con la extracción manual del tampón del gránulo de microgel, ya sea por aspiración o utilizando un material absorbente. Sin embargo, el uso de la centrifugación para secar los microgeles puede generar un rango muy variable de fracciones de partículas y fracciones vacías al hacer andamios granulares12. Se han descrito técnicas para liofilizar microgeles utilizando 70% IPA para microgeles de polietilenglicol (PEG)13, aceites fluorados para microgeles de gelatina metacriloyl (GelMa) 14 y etanol al 70% para microgeles HA12. Este protocolo destaca los métodos para liofilizar microgeles esféricos de HA utilizando etanol al 70%, un reactivo de laboratorio estándar, para conservar las propiedades originales del microgel durante el proceso de secado. Los microgeles HA liofilizados se pueden pesar y rehidratar en porcentajes de peso definidos por el usuario para controlar las fracciones de partículas finales en andamios MAP12.
El paso final en la formación de andamios MAP se basa en el recocido de los microgeles para crear un andamio voluminoso y poroso1. Al utilizar componentes nativos de la matriz extracelular y emplear esquemas de recocido bioortogonal, los andamios MAP sirven como una plataforma biocompatible tanto para el cultivo celular in vitro como para la reparación de tejidos in vivo 3. A través de estos enfoques, los andamios MAP pueden fabricarse a partir de bloques de construcción HA-NB con fracciones de partículas definidas por el usuario para su empleo en aplicaciones de ingeniería de tejidos12. El siguiente protocolo describe la producción microfluídica de microgeles HA-NB seguida de liofilización y rehidratación para controlar la fracción de partículas en andamios MAP. Por último, los pasos para el recocido de los microgeles se describen utilizando química bio-ortogonal para experimentos de cultivo celular 3D in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha demostrado que la producción microfluídica de microgeles HA-NB genera microgeles con un rango de distribución de tamaño más estrecho que la producción por lotes de emulsiones 3,9. Los microgeles descritos en este protocolo se formularon utilizando un reticulante MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) para apoyar la degradación del material. Sin embargo, los microgeles HA-NB también pueden ser reticulados utilizando un enlazador de di-tiol alterna…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los Institutos Nacionales de Salud, los Institutos Nacionales de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (1R01AI152568). Este trabajo se realizó en parte en la Instalación de Instrumentación de Materiales Compartidos de la Universidad de Duke (SMIF), miembro de la Red de Nanotecnología del Triángulo de Investigación de Carolina del Norte (RTNN), que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (número de premio ECCS-2025064) como parte de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología (NNCI). Los autores desean agradecer al ex postdoctorado del laboratorio, el Dr. Lucas Schirmer, así como a Ethan Nicklow por su ayuda en la generación del dispositivo impreso en 3D para experimentos de cultivo celular.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
References
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