Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3D-celcultuur

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64554
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Departments of Biomedical Engineering, Neurology, and Dermatology, Duke University

Summary

Het minimaliseren van de variabiliteit in de deeltjesfractie binnen korrelige steigers vergemakkelijkt reproduceerbare experimenten. Dit werk beschrijft methoden voor het genereren van granulaire steigers met gecontroleerde deeltjesfracties voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen.

Abstract

Microgels zijn de bouwstenen van microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigers, die dienen als een platform voor zowel in vitro celkweek als in vivo weefselherstel. In deze korrelige steigers maakt de aangeboren porositeit die wordt gegenereerd door de lege ruimte tussen microgels celinfiltratie en migratie mogelijk. Het regelen van de leegtefractie en deeltjesfractie is van cruciaal belang voor het ontwerp van map-steigers, omdat porositeit een bioactieve aanwijzing is voor cellen. Sferische microgels kunnen worden gegenereerd op een microfluïdisch apparaat voor gecontroleerde grootte en vorm en vervolgens gevriesdroogd met behulp van methoden die breuk van het polymeernetwerk voorkomen. Bij rehydratatie leiden de gelyofiliseerde microgels tot gecontroleerde deeltjesfracties in MAP-steigers. De implementatie van deze methoden voor microgellyofilisatie heeft geleid tot reproduceerbare studies die het effect van deeltjesfractie op macromolecuuldiffusie en celverspreiding aantonen. Het volgende protocol zal betrekking hebben op de fabricage, lyofilisatie en rehydratatie van microgels voor het beheersen van deeltjesfracties in MAP-steigers, evenals het gloeien van de microgels door middel van bio-orthogonale crosslinking voor 3D-celkweek in vitro.

Introduction

Microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigers zijn een subklasse van korrelige materialen waarin de microgel (μgel) bouwstenen met elkaar verbonden zijn om een bulk, poreuze steiger te vormen. Met de unieke microarchitectuur van deze korrelige steigers ondersteunt de aangeboren porositeit die wordt gegenereerd door de lege ruimte tussen onderling verbonden bolvormige microgel versnelde celinfiltratie en migratie1. De microgel bouwstenen van MAP steigers kunnen worden vervaardigd uit zowel synthetische als natuurlijke polymeren met chemische modificaties2. De hier beschreven methoden benadrukken specifiek het gebruik van microgels bestaande uit een hyaluronzuur (HA) ruggengraat gemodificeerd met functionele norborneen (NB) handgrepen. De NB functionele handgreep op het HA-polymeer ondersteunt klikchemiereacties voor het vormen van microgels en het aan elkaar koppelen om MAP-steigers 3,4 te genereren. Er zijn talloze schema's gebruikt om de microgels aan elkaar te koppelen (d.w.z. gloeien), zoals enzymatische1, op licht gebaseerde 5,6 en additiefvrije klikchemie 3,7-reacties. Additiefvrije klikchemie wordt in dit werk beschreven, met behulp van de tetrazine-norborneen inverse elektronenvraag Diels-Alder conjugatie voor het onderling verbinden van de HA-NB microgels.

Om MAP-steigers te fabriceren, genereren gebruikers eerst de microgel-bouwstenen met behulp van omgekeerde emulsies in batchsystemen of in microfluïdische apparaten, evenals met elektrohydrodynamisch spuiten, lithografie of mechanische fragmentatie2. De productie van bolvormige HA-NB microgels is goed beschreven en eerder gerapporteerd met behulp van zowel batch-emulsie2 als microfluïdische druppelgeneratietechnieken 8,9,10,11. In dit werk werden bolvormige HA-NB microgels gegenereerd op een flow-focussend microfluïdisch platform voor gecontroleerde grootte en vorm, zoals eerder beschreven 8,9,10. Na zuivering bestaan de microgels in een waterige suspensie en moeten ze worden geconcentreerd om een vastgelopen toestand te induceren. Wanneer ze vastzitten, vertonen microgels afschuifverdunnende eigenschappen, waardoor ze kunnen functioneren als injecteerbare, ruimtevullende materialen1. Een methode om een vastgelopen toestand te induceren, is om de microgels te drogen via lyofilisatie of vriesdrogen en vervolgens het gedroogde product opnieuw te hydrateren in een gecontroleerd volume12. Als alternatief kan overtollige buffer uit de microgel-slurry worden verwijderd via centrifugatie over een zeef of met handmatige verwijdering van de buffer uit de microgelpellet, hetzij door aspiratie of met behulp van een absorberend materiaal. Het gebruik van centrifugatie om de microgels te drogen kan echter een zeer variabel bereik van deeltjesfracties en lege fracties genereren bij het maken van korrelige steigers12. Technieken voor het lyofiliseren van microgels zijn beschreven met behulp van 70% IPA voor polyethyleenglycol (PEG) microgels13, gefluoreerde oliën voor gelatine methacryloyl (GelMa) microgels14 en 70% ethanol voor HA-microgels12. Dit protocol belicht methoden voor het vriesdrogen van bolvormige HA-microgels met behulp van 70% ethanol, een standaard laboratoriumreagens, om de oorspronkelijke microgel-eigenschappen tijdens het droogproces te behouden. De gevriesdroogde HA-microgels kunnen worden gewogen en gerehydrateerd met door de gebruiker gedefinieerde gewichtspercentages om de uiteindelijke deeltjesfracties in MAP-steigerste regelen 12.

De laatste stap in map-steigervorming is afhankelijk van het gloeien van de microgels om een bulk, poreuze steiger te creëren1. Door gebruik te maken van inheemse extracellulaire matrixcomponenten en bio-orthogonale gloeischema's te gebruiken, dienen MAP-steigers als een biocompatibel platform voor zowel in vitro celkweek als in vivo weefselherstel3. Door deze benaderingen kunnen MAP-steigers worden vervaardigd uit HA-NB-bouwstenen met door de gebruiker gedefinieerde deeltjesfracties voor hun gebruik in tissue engineering-toepassingen12. Het volgende protocol beschrijft de microfluïdische productie van HA-NB microgels gevolgd door lyofilisatie en rehydratatie voor het regelen van deeltjesfracties in MAP-steigers. Ten slotte worden stappen voor het gloeien van de microgels beschreven met behulp van bio-orthogonale chemie voor in vitro 3D-celkweekexperimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabricage van microfluïdische apparaten

  1. Zachte lithografie
    OPMERKING: Dit protocol beschrijft de fabricage van een flow-focusing microfluïdisch apparaatontwerp van de Wilson et al.9. Dit protocol kan echter worden gebruikt met elk apparaatontwerp op een SU-8-wafer. De wafer kan op een petrischaal worden geplakt en moet vervolgens worden gesilaniseerd om te voorkomen dat het PDMS zich aan de waferfunctieshecht 15.
    1. Meng de polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeerbasis met het uithardingsmiddel (zie Materiaaltabel) in een verhouding van 10:1. Bereid ongeveer 100 g om de wafer te bedekken met ~5 mm PDMS. Giet het PDMS-mengsel op de wafer en ontgas in een exsiccator gedurende ongeveer 30 minuten. Zodra alle bubbels weg zijn, plaats je ze minstens 2 uur in een oven op 60 °C om het PDMS uit te harden.
    2. Gebruik een mes om voorzichtig rond de parameter van het apparaat te traceren zonder de wafer te kraken; pel vervolgens voorzichtig het PDMS van de wafer. Gebruik een biopsiepunch van 1 mm (zie Materiaaltabel) om de inlaat- en uitlaatkanalen te maken.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het ponsen van het microfluïdische apparaat. Scheuren of scheuren rond de inlaat- of uitlaatkanalen kunnen lekken veroorzaken tijdens de productie van microgel.
    3. Gebruik tape om stof van het apparaat aan de functiezijde te verwijderen. Plaats de apparaten en schone glasglaasjes op een hete plaat bij 135 °C gedurende ten minste 15 minuten om vocht te verwijderen.
    4. Gebruik in een zuurkast een coronaplasmapistool (zie Materiaaltabel) hoog op zowel de glazen dia's als apparaten (aan de zijkant blootgesteld) gedurende ongeveer 30 s, en verlijm ze vervolgens snel aan elkaar. Oefen voorzichtig druk uit om een goede afdichting tussen het apparaat en de glasschuif te garanderen. Plaats de apparaten een nacht in een oven van 60 °C om de hechting vast te zetten.

2. Microfluïdische productie van hyaluronzuur (HA) microgels met norborneen (NB) functionele handgrepen

  1. HA-NB synthese
    OPMERKING: De synthese van HA-norborneen (HA-NB) werd aangepast van Darling et al.3 met behulp van 79 kDa natrium HA met molaire equivalenten van 1:1.5:2.5 van HA-repeat-eenheden tot 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorfolinechloride (DMTMM) tot 5-norborneen-2-methylamine (NMA).
    1. Weeg de reactanten. Los de HA op bij 20 mg/ml in 200 mM MES-buffer (pH ~6) door in een bekerglas of kolf op een roerplaat te roeren. Voeg na opgelost de DMTMM toe aan de HA-oplossing en laat ongeveer 20 minuten reageren bij kamertemperatuur. Zo kan bijvoorbeeld 1 g HA + 1,09 g DMTMM + 845 μL NMA worden gebruikt.
    2. Voeg NMA dropwise toe aan de HA/DMTMM oplossing. Voeg parafilm toe aan de opening van het reactievat om verdamping te minimaliseren en bedek het reactievat met folie. Blijf roeren terwijl u de reactie ongeveer 24 uur laat doorgaan.
    3. Koel na 24 uur 200 proof ethanol (ongeveer 10x het reactievolume). Breng op een roerplaat de reactie druppelsgewijs over op de gekoelde ethanol om de HA-NB neer te slaan en blijf gedurende 20 minuten roeren bij 200-300 tpm.
    4. Breng de oplossing over in 50 ml conische buizen en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 5.000 x g . Giet het overtollige ethanol af om als afval af te voeren. Op dit punt moet het HA-NB-product witte pellets in de conische buizen zijn. Trek vacuüm op de HA-NB in een dessicator om een nacht te drogen.
    5. Zuiver de HA-NB met behulp van 12-14 kDa moleculair gewicht cut-off cellulose dialyse tubing (zie Materiaaltabel). Los HA-NB op in 2 M NaCl-oplossing en breng over in de dialysebuis. Bind de slang vast en bevestig deze indien nodig met klemmen. Breng de gevulde dialyseslang over in een emmer met 5 L ultrapuur water en dialyseer de HA-NB een nacht tegen water.
    6. Verwijder de volgende dag het water en vervang het door 1 M NaCl-oplossing gedurende 30 minuten. Verwijder de NaCl-oplossing en dialyseer vervolgens gedurende 3 dagen tegen ultrapuur water en vervang het water dagelijks.
    7. Filtreer het gedialyseerde product met een vacuümaangedreven filter van 0,2 μm en breng het gefilterde product vervolgens over in conische buizen van 50 ml.
    8. Voeg vloeibare stikstof toe aan een cryogene container en bevries de HA-NB-buizen gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens de conische buizen met een tang en verwijder snel de dop en dek af met een weefsel van laboratoriumkwaliteit (zie materiaaltabel). Bevestig het weefsel met een elastiekje en breng het over in een lyofilisatiecontainer of -kamer (zie Materiaaltafel) en lyofiel. Bewaar het gelyofiliseerde product bij -20 °C.
      LET OP: Vloeibare stikstof is een gevaarlijke stof. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met vloeibare stikstof.
    9. Kwantificeer norborneenmodificatie door de HA-NB op te lossen bij 10 mg/ml in D2O en te analyseren via proton NMR (figuur 1A)16.
      1. Om de hoeveelheid functionalisatie te bepalen, kalibreert u eerst de D2O-oplosmiddelpiek tot 4,8 PPM. Integreer de piek voor de HA-methylprotonen (δ2,05) en kalibreer de integratie naar 3.0. Integreer vervolgens de pieken voor de pendant norborneengroepen op δ6,33 en δ6,02 (vinylprotonen, endo). Normaliseer de integratie van deze pieken naar het overeenkomstige aantal protonen om de gemiddelde mate van modificatie te bepalen3.
  2. Bereiding van HA-NB microgel precursor
    1. Bereid 50 mM HEPES-buffer (pH 7,5) en steriel filter de buffer met behulp van een vacuümaangedreven filter van 0,2 μm. Bereid met behulp van de HEPES-buffer respectievelijk 50 mM-voorraden lithiumfenyl (2,4,6,-trimethylbenzoyl) fosfinaat (LAP) foto-initiator en tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) reductiemiddel. Houd de LAP-oplossing uit de buurt van licht.
    2. Bereid de andere microgelprecursorcomponenten door de respectieve 50 mM-voorraden di-thiol linker en RGD-peptide in steriel gedestilleerd water te bereiden. Weeg HA-NB af en los op in HEPES-buffer om een voorraad van 10 mg / ml te bereiden.
      OPMERKING: Verschillende di-thiol linkers kunnen worden gebruikt voor de interne crosslinking van de microgels op basis van de voorkeur van de gebruiker. Zowel een afbreekbare (d.w.z. MMP-splijtbare) als een niet-afbreekbare (dithiothreitol of DTT) linker zijn opgenomen in de materiaaltabel. Het RGD-peptide is opgenomen in de microgelformulering om celadhesie in MAP-steigers te bevorderen, maar deze component kan worden verwijderd en vervangen door een gelijk volume HEPES-buffer.
    3. Combineer de precursorcomponenten met eindconcentraties van 9,9 mM LAP, 0,9375 mM TCEP (4 thiol/TCEP), 2,8 mM di-thiol linker, 1 mM RGD peptide en 3,5 wt% (w/v) HA-NB door extra HEPES-buffer toe te voegen om het gewenste eindvolume te bereiken. Meng de precursor goed met een positieve verplaatsingspipet.
    4. Trek met een P1000-pipet langzaam het hele mengsel op. Plaats de punt op het uiteinde van een spuit van 1 ml en werp de punt uit de pipet. Trek aan de zuiger van de spuit om het mengsel in de spuit te laden en voeg vervolgens een filter van 0,2 μm toe aan het uiteinde van de spuit en filter in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer de gefilterde precursoroplossing om de bubbels te verwijderen die tijdens het filteren worden geproduceerd.
    5. Nogmaals, trek met behulp van een P1000-pipet langzaam de gefilterde voorloper omhoog en pas op dat je geen bubbels creëert. Als er bubbels zijn, tik dan zachtjes op de punt om ze los te maken en naar boven te drijven.
    6. Plaats de punt op het uiteinde van een spuit van 1 ml en werp de punt uit de pipet. Houd de spuit verticaal en trek de zuiger van de spuit langzaam totdat de volledige voorloperoplossing in de spuit zit. Voeg een stompe puntnaald toe aan de spuit en duw de voorloper door de punt van de naald. Wikkel de spuit in folie om uit het licht te blijven.
  3. Bereiding van microgel knijpoplossing
    1. Bereid 5% v/v Span-80 in zware witte minerale olie en meng goed. Droog uit om bubbels te verwijderen. Bewaar het oppervlakteactieve stof/oliemengsel op kamertemperatuur gewikkeld in folie. Meng goed en droog uit voor elk gebruik.
    2. Gebruik een spuit van 5 ml om het olie/oppervlakteactieve stofmengsel op te zuigen (belletjes minimaliseren) totdat de afstand tussen de zuiger en de vingergreep ongeveer gelijk is aan de afstand van de voorloperspuit. Voeg een stompe naald toe aan de spuit en duw de olie door de punt van de naald.
  4. Microfluïdische apparaat instellen
    1. Voeg een stompe naald toe aan een spuit van 1 ml en vul met een synthetische hydrofobe behandelingsoplossing (zie materiaaltabel). Laat de oplossing voorzichtig door het microfluïdische apparaat stromen totdat deze zich bij elke inlaat/uitlaat verzamelt. Laat de oplossing ongeveer 30 minuten drogen in het apparaat op de benchtop en trek vervolgens vacuüm op de uitlaat om overtollige oplossing te verwijderen. Beveilig het apparaat met klemmen op een tafelmicroscoop.
    2. Wikkel een conische buis van 15 ml met folie en plaats deze in een buizenrek om te dienen als de microgel-verzamelcontainer. Gebruik een ringstandaard met een klem om de UV-lichtsonde in de opening van de opvangbuis te plaatsen. Gebruik een UV-detector (zie Materiaaltabel) om de UV-intensiteit te meten, waarbij de sonde wordt verplaatst tot 20 mW/cm2 is bereikt. Doe het UV-licht uit tot later.
    3. Snijd buizen op een lengte die reikt van het microfluïdische apparaat tot de verzamelcontainer. Snijd aan het ene uiteinde van de buis een hoek van 45°. Steek het schuine uiteinde van de buis voorzichtig in het uitlaatkanaal.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het inbrengen van de buis in het microfluïdische apparaat. Scheuren of scheuren rond de inlaat- of uitlaatkanalen kunnen lekken veroorzaken tijdens de productie van microgel.
    4. Bevestig zowel de voorloper- als de oliefasespuiten op een pomp met dubbele spuit (zie materiaaltabel). Snijd nog twee stukken slang op een lengte die reikt van spuitpunten tot het microfluïdische apparaat. Snijd aan het ene uiteinde van elke buis een hoek van 45°. Zet de slang (stomp uiteinde) voorzichtig vast aan beide spuitpunten.
    5. Wijzig de instellingen op de pomp voor de spuit van 1 ml en neem het geschatte precursorvolume op. Duw de pomp langzaam naar voren totdat er voldoende druk op de zuigers van de spuit wordt uitgeoefend om zowel de olie als de voorloper naar de uiteinden van de slang te duwen en lucht uit het systeem te verwijderen. Laat de druk 5-10 minuten gelijk worden voordat u doorgaat naar stap 2.4.6.
    6. Steek het schuine uiteinde van de buis voorzichtig in de inlaatkanalen van het microfluïdische apparaat met de microgel-precursoroplossing in de voorinlaat en de knijpolie in de achterinlaat. Beweeg de pomp in kleine stappen naar voren totdat de stroom in het apparaat begint en bolvormige microgels zich beginnen te vormen in het stroomfocusgebied. Start de pomp met een debiet van 0,4 μL/min en laat het apparaat draaien totdat het stabiliseert. Stel indien nodig het debiet in kleine stappen in ±0,1 μL/min om de productie van microgel te stabiliseren.
    7. Zodra de productie van microgel stabiliseert zoals weergegeven in figuur 1B, vervangt u de opvangbuis door een nieuwe buis en schakelt u het UV-licht in. Controleer de run regelmatig om ervoor te zorgen dat de microgelproductie stabiel is gedurende de duur van de run.

Figure 1
Figuur 1: Microfluïdische productie van hyaluronzuur (HA) microgels met norborneen (NB) functionele handgrepen. (A) Ongeveer 31% van de HA-herhalingseenheden werd met succes gemodificeerd met NB, zoals bepaald door proton NMR-analyse uitgevoerd in deuteriumoxide. 1 H NMR verschuivingen van hangende norbornenen bij δ6,33 en δ6,02 (vinyl protonen, endo), en δ6,26 en δ6,23 ppm (vinyl protonen, exo) werden vergeleken met de HA-methylgroep δ2,05 ppm om functionalisatie te bepalen. Overgenomen uit Anderson et al.12 met toestemming van Elsevier. (B) Schema van het flow-focusing microfluïdische apparaat dat wordt gebruikt om HA-NB-μgels te genereren. (C) Maximale intensiteitsprojecties van confocale microscopie werden gebruikt om fluorescerend gelabelde μgels te visualiseren (schaalbalk = 500 μm). (D) Frequentieverdelingen van microgeldiameter van onafhankelijke runs op de microfluïdische opstelling tonen controle over microgelgrootte ~ 50 μm of ~ 100 μm, afhankelijk van het gebruikte apparaat. (E) De diameter van de microgel wordt gerapporteerd als de gemiddelde en standaardafwijking voor elke onafhankelijke run. Overgenomen uit Wilson et al.9 met toestemming van Wiley. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Zuiverende en drogende microgels

  1. Zuivering van microgels
    1. Bereid de microgelwasbuffer (300 mM HEPES, 50 mM NaCl, 50 mM CaCl2) en 2% (w/v) Pluronic F-127 oppervlakteactieve oplossing in wasbuffer. Steriliseer de oplossingen met een vacuümaangedreven filter van 0,2 μm.
    2. Centrifugeer de microgel opvangbuis (5.000 x g) gedurende 5 min. In een steriele kap, zuig de supernatant oliefase zorgvuldig aan. Combineer de μgels 1:1 met 2% Pluronic F-127 oppervlakteactieve oplossing en vortex om goed te mengen. Centrifugeer (5.000 x g) gedurende 5 minuten en zuig de supernatant wasoplossing aan.
    3. Voeg wasbuffer toe op 4x microgel volume en vortex om goed te mengen. Centrifugeer (5.000 x g) het mengsel gedurende 5 minuten en zuig de wasoplossing aan. Voltooi 4-8 wasbeurten met de wasbuffer totdat de oppervlakteactieve stof uit het systeem is verwijderd (d.w.z. er blijven geen bubbels achter).
  2. Fluorescerende etikettering van HA-NB microgels
    OPMERKING:De interne synthese van een fluorescerend gelabeld tetrazine is gebaseerd op twee base-gekatalyseerde thiol-Michael-additiereacties in reeksen die goed zijn beschreven en eerder zijn gerapporteerd3. Voor dit werk werd Alexa Fluor-488 geconjugeerd met tetrazine voor de etikettering van norborneen-gemodificeerde μgels. Het gelyofiliseerde product (Alexa Flour 488-Tet) werd opgelost in dimethylformamide bij 1 mg / ml en bewaard bij -20 ° C.
    1. Om de μgels fluorescerend te labelen, bereidt u eerst een werkoplossing van Alexa Fluor 488-Tet door de 1 mg / ml-voorraad 1: 14 in steriele 1x PBS te verdunnen. Combineer in een steriele kap de μgels met de werkoplossing (2:1 per volume).
    2. Gebruik een verplaatsingspipet en meng goed. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
    3. Centrifugeer (5.000 x g) en zuig de kleuringsoplossing aan. Was de μgels twee keer met 1x PBS (1:1 per volume) om de niet-gereageerde Alexa Fluor 488-Tet te verwijderen.
      OPMERKING: Op dit punt kunnen de fluorescerend gelabelde μgels worden afgebeeld op een confocale microscoop om de microgelgrootte te kwantificeren (figuur 1C-E)9. Methoden voor het meten van de grootte van microgel zijn grondig beschreven door Roosa et al.17.
  3. Ha-NB microgels drogen
    1. Breng gezuiverde μgels (figuur 2A) over naar een cryoveilige schroefdopbuis met behulp van een pipet met positieve verplaatsing. Voeg 70% ethanol toe aan de gezuiverde μgels 50% (v/v) en meng goed met een verplaatsingspipet. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 5.000 x g.
      LET OP: Ethanol is een licht ontvlambare stof.
      OPMERKING: De cryoveilige schroefdopbuis kan worden gewogen voordat μgels worden toegevoegd en vervolgens opnieuw worden gewogen na lyofilisatie om de massa van μgels te bepalen. Dit wordt aanbevolen om fouten te minimaliseren bij het gebruik van hoeveelheden van minder dan 1 mg. Zorg ervoor dat de weegschaal voorafgaand aan gebruik intern is afgesteld of gekalibreerd.
    2. Zuig de supernatantvloeistof aan en vervang deze door 70% ethanol (50% v/v) (figuur 2B). Meng goed met een verdringingspipet. Incubeer een nacht bij 4 °C.
      OPMERKING: Microgels kunnen worden bewaard in 70% ethanol bij 4 °C voorafgaand aan lyofilisatie voor langdurige opslag, indien nodig. Gelyofiliseerde microgels zijn weergegeven in figuur 2C. Andere lyofilisatiemedia kunnen in deze stap worden gebruikt als cryogelvorming gewenst is (figuur 2D).
    3. Centrifugeer kort om ervoor te zorgen dat de μgels zich aan de onderkant van de schroefdopbuis bevinden. Voeg vloeibare stikstof toe aan een cryogene container en voeg vervolgens de tube μgels toe om te flash-freezeen.
    4. Verwijder na 5-10 minuten de tube μgels met een tang. Verwijder snel de dop en dek af met een weefsel van laboratoriumkwaliteit. Bevestig het weefsel met een elastiekje en breng het over naar een lyofilisatiecontainer of -kamer.
    5. Laad het monster op de lyofilisator volgens de instructies van de fabrikant. Lyofieliseren bij 0,066 Torr en -63 °C. Bewaar de gelyofiliseerde μgels (lyo-μgels) goed afgesloten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Lyofilisatie is voltooid wanneer alle vloeistof uit de buis wordt verwijderd en een gedroogd product overblijft. Organische oplosmiddelen kunnen de levensduur van de rubberen armaturen op gangbare lyofilisatiesystemen verkorten.

Figure 2
Figuur 2: Ha-NB microgels drogen. (A) Maximale intensiteitsprojectie van μgels in waterige oplossing (schaalbalk = 100 μm). (B) Gezuiverde μgels kunnen 1:1 per volume worden geïncubeerd in het lyofilisatiemedium van keuze en gelyofiliseerd. (C) Maximale intensiteitsprojectie van gedroogde lyo-μgels (schaalbalk = 100 μm). (D) Microgels worden geresuspendeerd na lyofilisatie. EtOH (70%) wordt aanbevolen voor het behoud van de oorspronkelijke eigenschappen van de μgels gedurende het hele lyofilisatieproces; andere media zoals isopropylalcohol (IPA), water en acetonitril (MeCN) kunnen echter door elkaar worden gebruikt om cryogelvorming te vergemakkelijken (schaalbalk = 100 of 50 μm zoals vermeld). (E) Meting van de HA-NB microgel diameter voor (grijs) en na lyofilisatie (groen) in 70% EtOH weergegeven als frequentieverdelingen voor drie microgel populaties. Overgenomen uit Anderson et al.12 met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. MAP steiger fabricage

  1. Tetrazine linker synthese
    OPMERKING: Tetrazine linkers kunnen worden gebruikt om μgels met vrije norborneengroepen met elkaar te verbinden (figuur 3A). De syntheseprocedure van HA-tetrazine (HA-Tet) werd aangepast van Zhang et al.18 met behulp van 79 kDa natrium HA met molaire equivalenten van 1:1:0,25 van HA-repeateenheden tot DMTMM tot tetrazine-amine (figuur 3B)12.
    1. Weeg de reactanten. Los de HA op bij 20 mg/ml in 200 mM MES-buffer (pH ~6) door in een bekerglas of kolf op een roerplaat te roeren. Voeg na opgelost de DMTMM toe aan de HA-oplossing en laat ongeveer 20 minuten reageren bij kamertemperatuur. Bijvoorbeeld, 100 mg HA + 72,8 mg DMTMM + 14,14 mg tetrazine-amine kan worden gebruikt.
    2. Los het tetrazine-amine op met 15 mg/ml in 200 mM MES-buffer en voeg druppelsgewijs toe aan de HA/DMTMM-oplossing. Raadpleeg figuur 3C voor de HA-Tet-reactie-instelling.
    3. Voeg parafilm toe aan de opening van het reactievat om verdamping te minimaliseren en bedek het reactievat met folie. Blijf roeren terwijl u de reactie ongeveer 24 uur laat doorgaan.
    4. Koel na 24 uur 200 proof ethanol (ongeveer 10x het reactievolume). Breng op een roerplaat de reactie druppelsgewijs over op de gekoelde ethanol om de HA-Tet neer te slaan (figuur 3D) en blijf gedurende 20 minuten roeren.
    5. Breng de oplossing over in 50 ml conische buizen en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 5.000 x g . Giet het overtollige ethanol af om als afval af te voeren. Trek vacuüm op de HA-Tet in een dessicator om een nacht te drogen. Een voorbeeld van het gedroogde product in deze stap in het protocol is te vinden in figuur 3E.
    6. Zuiver de HA-Tet met behulp van dialyse. Los HA-Tet op in 2 M NaCl-oplossing en breng over in cellulosedialysebuizen met een afsnijding van het molecuulgewicht van 12-14 kDa. Breng de gevulde dialyseslang over in een emmer met 5 L ultrapuur water en breng de HA-Tet een nacht dialyseren tegen water.
    7. Verwijder de volgende dag het water en vervang het door 1 M NaCl-oplossing gedurende 30 minuten. Verwijder de NaCl-oplossing en dialyseer vervolgens gedurende 3 dagen tegen ultrapuur water en vervang het water dagelijks.
    8. Filtreer het gedialyseerde product met een vacuümaangedreven filter van 0,2 μm en breng het gefilterde HA-Tet-product vervolgens over in conische buizen van 50 ml.
    9. Bevries de conische buizen gedurende 10 minuten in vloeibare stikstof en verwijder vervolgens de conische buizen met een tang. Verwijder snel de dop en dek af met een weefsel van laboratoriumkwaliteit. Beveilig het weefsel met een elastiekje en breng het over naar een lyofilisatiecontainer of -kamer en lyofiel. Bewaar het gelyofiliseerde product (figuur 3F) bij -20 °C.
    10. Kwantificeer tetrazinemodificatie door de HA-Tet op te lossen bij 10 mg/ml in D2O en te analyseren via proton NMR (figuur 3G)16.
      1. Om de hoeveelheid functionalisatie te bepalen, kalibreert u eerst de D2O-oplosmiddelpiek tot 4,8 PPM. Integreer de piek voor de HA-methylprotonen (δ2,05) en kalibreer de integratie naar 3.0. Integreer vervolgens de pieken voor de hangende tetrazinegroepen bij δ8,5 (2H) en δ7,7 (2H) (aromatische protonen). Normaliseer de integratie van deze pieken naar het overeenkomstige aantal protonen om de gemiddelde mate van modificatie te bepalen12.
  2. Lyo-μgels onderling koppelen om MAP-steigers te vormen voor karakterisering
    1. Bereid de MAP-steigercomponenten voor (d.w.z. μgels, HA-Tet, rehydratatievolume). Weeg de lyo-μgels (figuur 4A) en reconstitueer in 84% van het uiteindelijke MAP-volume van 1x PBS. Laat de microgels ongeveer 20 minuten opzwellen (figuur 4B,C). De wt% MAP die voor rehydratatie wordt gebruikt, kan worden gekozen op basis van de voorkeur van de gebruiker voor de uiteindelijke deeltjesfractie (zie figuur 4D, E).
    2. Los de HA-Tet op in 1x PBS in de gekozen concentratie (zie OPMERKING hieronder).
      OPMERKING: Het veranderen van zowel de verpakkingsfractie (via wt% MAP) als de concentratie van HA-Tet zal de mechanische eigenschappen van bulksteigers veranderen. Een 3,4 wt% MAP-steiger met 0,02 mg/ml HA-Tet (gloeiverhouding van 2,6 mol Tet:mol HA-NB) genereert bijvoorbeeld MAP-steigers met ongeveer 700 Pa shear opslagmodulus12.
    3. Gebruik een verplaatsingspipet om de HA-Tet en lyo-μgels te combineren en goed te mengen. Op dit punt kan het mengsel via een verplaatsingspipet worden overgebracht op glazen dia's, putplaten of een container naar keuze van de gebruiker. Laat μgels gedurende 25 minuten gloeien bij 37 °C en gebruik vervolgens een spatel om de MAP-steigers over te brengen naar putplaten gevuld met 1x PBS. Houd MAP-steigers in 1x PBS totdat ze klaar zijn voor karakterisering.
  3. MAP-scaffolddeeltjesfractie berekenen
    1. Voor een betere beeldkwaliteit brengt u de MAP-steiger over op een glazen afdekplaat met behulp van een spatel. Image MAP-steigers op een confocale microscoop met behulp van de laser voor FITC-excitatie en -emissie. Afbeelding MAP steigers op een 20x objectief en verkrijg een Z-stack die 250-300 μm doorkruist in de Z-richting met een stapgrootte van 2,5 μm. Noteer de μm/pixel kalibratie van de afbeelding.
    2. Importeer de Z-stack-afbeelding in de analysesoftware (zie Materiaaltabel). Selecteer de knop Nieuwe oppervlakken toevoegen . Schakel het selectievakje Alleen een interessegebied segmenteren in en selecteer vervolgens de blauwe pijlknop Volgende: Interessegebied.
    3. Definieer een interessegebied en houd de X-, Y- en Z-dimensies bij van het volume dat wordt geanalyseerd. Selecteer de blauwe pijlknop Volgende: Bronkanaal.
      OPMERKING: X- en Y-dimensies zijn in eenheden van pixels, terwijl de Z-dimensie het aantal stappen is. Een aanbevolen Z-hoogte voor het gebied van belang moet minimaal twee μgels bevatten.
    4. Gebruik de vervolgkeuzelijst Bronkanaal om het FITC-kanaal te selecteren. Vink het vakje naast Glad aan en voer een oppervlaktedetail van 2,50 μm in. Selecteer onder Drempels de optie Absolute intensiteit en selecteer vervolgens de blauwe pijlknop Volgende: Drempel.
    5. Gebruik de voorgestelde drempelwaarde voor het FITC-kanaal. Draai de 3D-projectie om de weergavekwaliteit te beoordelen en indien nodig aan te passen. Selecteer Volgende: Oppervlakken classificeren.
      OPMERKING: De knop Vorige kan worden gebruikt om eerdere stappen in het proces, zoals Z-dimensie, indien nodig te bewerken.
    6. Controleer of Aantal Voxels 10.0 is en selecteer vervolgens de groene dubbele pijlknop Voltooien: Voer alle aanmaakstappen uit en beëindig de wizard.
      OPMERKING: Volumerenderingsparameters kunnen worden opgeslagen voor batchanalyse, zodat dezelfde instellingen worden toegepast om alle steigers te analyseren.
    7. Als u de gegevens wilt exporteren, selecteert u het tabblad Statistieken en vervolgens het tabblad Gedetailleerd . Gebruik de tweede vervolgkeuzelijst om de variabele Volume te selecteren. Selecteer de disketteknop Statistieken exporteren op tabbladweergave naar bestand en sla op als spreadsheetbestand (.xls) wanneer daarom wordt gevraagd.
    8. Open het bestand en gebruik de functie SOM op kolom A-volume om het totale volume (μm3) van de μgels in het interessegebied te bepalen.
    9. Converteer de afmetingen van het interessegebied dat is geanalyseerd van pixels naar μm. Gebruik de μm/pixel kalibratie van de afbeelding uit stap 4.3.1 om de X- en Y-dimensies om te zetten. Vermenigvuldig de Z-dimensie (aantal stappen) met de stapgrootte voor de afbeelding om de Z-dimensie om te zetten in μm. Bereken het volume van het interessegebied (μm3) door de X-, Y- en Z-dimensies te vermenigvuldigen.
    10. Om de deeltjesfractie van de steiger te bepalen, deelt u het totale volume van de μgels in het interessegebied (gevonden in stap 4.3.8) door het volume van het interessegebied (gevonden in stap 4.3.9).

Figure 3
Figuur 3: Synthese van tetrazine linker voor de fabricage van microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) scaffolds. (A) Schematische weergave van HA-NB-μgels die worden gekoppeld aan een tetrazine-linker om MAP-steigers te vormen. (B) Reactieschema voor HA-Tet synthese. (C) De HA-Tet-reactie werd ingesteld en mocht 's nachts reageren, gevolgd door (D) neerslag van HA-Tet in ethanol. (E) Eenmaal gezuiverd en gedroogd, werd de HA-Tet gerehydrateerd en gelyofiliseerd om (F) een gedroogd, lichtroze product te produceren. (G) Proton NMR-analyse toont succesvolle modificatie van 11% van de HA-herhalingseenheden. Overgenomen uit Anderson et al.12 met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Rehydratatie van gelyofiliseerde microgels voor map-steigerfabricage. (A) Maximale intensiteitsprojectie van gedroogde lyo-μgels (schaalbalk = 100 μm). (B) Na vriesdrogen blijkt de rehydratatie van lyo-μgels ongeveer 20 minuten te duren (schaalbalk = 100 μm). (C) Lyo-μgels kunnen worden gerehydrateerd met variërend wt% MAP om vastgelopen μgels te produceren (schaalbalk = 100 μm). (D) Het verhogen van de wt% MAP bij het rehydrateren van lyo-μgels verandert de deeltjesfractie in MAP-steigers, zoals blijkt uit enkele Z-plakjes map-steigers en volumeprojecties (schaalbalk = 100 μm). (E) Met behulp van deze door de gebruiker gedefinieerde wt% MAP-steigers kunnen unieke deeltjesfracties worden bereikt (NL = niet-gelyofiliseerde μgels). Een eenrichtings-ANOVA met Tukey HSD werd uitgevoerd op de monsters (n = 3), met significantie gerapporteerd op p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,005 (***) en p < 0,001 (****). Overgenomen uit Anderson et al.12 met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5.3D celkweek in kaartsteigers

  1. Celkweekapparaten voorbereiden
    1. Als u een aangepast celkweekapparaat voor deze experimenten wilt maken (figuur 5A-C), gebruikt u een 3D-printer om een negatieve mal af te drukken met behulp van het CAD-bestand in Supplemental Coding File 1.
      OPMERKING: De afmetingen van het celkweekapparaat zijn als volgt: 94,9 mm x 94,9 mm x 4,8 mm met een totale puthoogte van 2,6 mm. De diameter van de binnenste putten en buitenste putten is respectievelijk 4 mm en 6 mm.
    2. Meng polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeerbasis met het uithardingsmiddel in een massaverhouding van 10:1. Giet het PDMS-mengsel in een grote plastic petrischaal en ontgas in een exsiccator gedurende ongeveer 30 minuten of totdat alle belletjes zijn verdwenen.
    3. Zodra alle bubbels zijn verdwenen, plaatst u de 3D-geprinte mal voorzichtig in het PDMS om de vorming van nieuwe bellen te minimaliseren. Zet in de oven op 60 °C gedurende ten minste 2 uur om het PDMS uit te harden.
    4. Gebruik een mes of scheermesje om voorzichtig rond de parameter van het kweekapparaat te traceren en verwijder vervolgens voorzichtig de mal. Gebruik een biopsiepunch van 4 mm om PDMS van de bodem van de putten te verwijderen. Knip de apparaten zodat ze op een glazen afdekplaat passen.
      OPMERKING: Celkweekapparaten kunnen ook worden verlijmd met glazen dia's, maar glazen afdekplaten verbeteren de beeldvorming van monsters.
    5. Gebruik tape om stof van de onderkant van de kweekapparaten te verwijderen. Plaats de schone glazen afdekplaten en kweekinrichtingen (onderkant naar boven) gedurende ten minste 15 minuten op een hete plaat bij 135 °C om vocht te verwijderen.
    6. Gebruik in een zuurkast een coronaplasmapistool hoog op zowel de glazen afdekplaat als de onderkant van het apparaat gedurende 30 s en verlijm vervolgens snel de behandelde oppervlakken aan elkaar. Oefen voorzichtig druk uit om te zorgen voor een goede afdichting tussen het kweekapparaat en de glazen afdekplaat.
    7. Herhaal stap 5.1.6 voor alle apparaten en plaats deze vervolgens een nacht in een oven van 60 °C om de verbinding vast te zetten. Autoclaaf de apparaten om te steriliseren voor gebruik in vitro.
  2. Celkweek in MAP-steigers
    1. Bereid de MAP-steigercomponenten (d.w.z. μgels, HA-Tet, mediavolume) voor op basis van de gewenste deeltjesfractie (zie figuur 4D-E). Weeg de lyo-μgels in een steriele kap en reconstitueer in 84% van het uiteindelijke MAP-volume van celmedia op basis van de gekozen wt% MAP. Laat de μgels ongeveer 20 min opzwellen.
      OPMERKING: Deze methoden vereisen dat de gebruiker het lyo-microgelproduct weegt voor rehydratatie. Voor kleine massa's (1 mg of minder) wordt voorgesteld om eerst de cryobuis te wegen voordat μgels worden toegevoegd en gelyofiliseerd, en vervolgens de buis na lyofilisatie opnieuw te wegen om de massa van het product te bepalen om fouten te minimaliseren.
    2. Los de HA-Tet op in celmedia in 16% van het uiteindelijke MAP-volume.
      OPMERKING: De volgende stappen voor het voorbereiden van cellen voor het zaaien in MAP-steigers kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van het celtype dat wordt gebruikt. In dit protocol werden D1-muis mesenchymale cellen gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 1% penicilline-streptomycine (pen-streptop) en 10% foetaal runderserum (FBS) (zie Materiaaltabel). Voor deze cellen moeten standaard adherente celkweekprotocollen worden gevolgd, waarbij de culturen op 37 °C en 5% CO2 worden gehouden in met weefselkweek behandelde kweekvaten.
    3. Zodra de mesenchymale cellen van de D1-muis 70% -80% samenvloeiing hebben bereikt, ademt u de media op en wast u de cellen met 1x PBS. Til de cellen op door voldoende volume van 1% trypsine-EDTA toe te voegen om het oppervlak van het weefselkweekvat te bedekken. Incubeer bij 37 °C gedurende 1-3 min en doof vervolgens de trypsinisatie door DMEM-media toe te voegen aangevuld met 1% pen-strep en 10% FBS bij 2x het volume trypsine-EDTA.
    4. Centrifugeer de celsuspensie bij 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. Aspirateer de supernatant media en resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM media aangevuld met 1% pen-strep en 10% FBS.
    5. Zorg ervoor dat de celsuspensie goed gemengd is en breng vervolgens 20 μL over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg 20 μL trypan blue oplossing toe en meng goed. Gebruik 20 μL van dit mengsel om de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller met dia's van de celtelkamer.
    6. Breng het aantal cellen dat nodig is voor het zaaien van 10.000 cellen/μL MAP over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. Aspirateer voorzichtig de supernatant media uit de celkorrel zonder de cellen aan te zuigen.
    7. Voeg de μgels en crosslinker toe aan de celpellet met een verplaatsingspipet. Meng goed met een verplaatsingspipet en zaai vervolgens 10 μL van het mengsel per putje. Pipet bij het plateren in een cirkelvormige beweging om het mengsel gelijkmatig in de put te verdelen.
    8. Laat de μgels gedurende 25 minuten gloeien bij 37 °C in de celincubator voordat u celmedia toevoegt om de putjes te vullen (~ 50 μL media per putje). Houd de 3D-culturen op 37 °C en verander de media indien nodig. Om te voorkomen dat de steiger wordt opgezogen bij het wisselen van media, stabiliseert u de pipetpunt langs de rand van de bovenste put.
      OPMERKING: Wanneer u vloeistof uit de kweekputten toevoegt of verwijdert, plaatst u het uiteinde van de pipetpunt op de richel boven de MAP-steiger om de kans op verstoring of aanzuigen van de steiger uit de put te minimaliseren.
    9. Fixeer monsters op de gewenste tijdstippen door de media te verwijderen en 50 μL 4% paraformaldehyde per put toe te voegen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de monsters 3x met 50 μL 1x PBS of voorkeursbuffer. Op dit punt in het protocol kunnen standaardmethoden voor immunofluorescentie of fluorescentiekleuring worden gevolgd, met behulp van 50 μL per werkvolume.
      OPMERKING: Deze methoden voor fixatie en celkleuring beschrijven specifiek het gebruik van fluorescerende vlekken; immunostaining met primaire en/of secundaire antilichaamconjugaties kan echter ook in deze scaffolds worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant met 50 μL als werkvolume per put.
    10. Beeld cellen in MAP-steigers op een confocale microscoop met behulp van een 20x objectief en verkrijg een Z-stack die 200-250 μm in de Z-richting doorkruist met een stapgrootte van 2,5 μm. Een voorbeeld van fluorescentiekleuring met DAPI (nucleaire kleuring verdund 1:1000 in 0,15% Triton-X in 1x PBS) en falloidine-647 (F-actinekleuring verdund 1:40 in 0,15% Triton-X in 1x PBS) wordt weergegeven in figuur 5E, F met vaste D1-cellen gekweekt in MAP-steigers gedurende 3 dagen.
      OPMERKING: Plasmabehandeling van glasoppervlakken resulteert in verhoogde hydrofielheid, waarvan is aangetoond dat het de celadhesie verbetert. Cellen zullen waarschijnlijk worden waargenomen die zich verspreiden langs de bodem van de celkweekputten, maar mogen niet worden opgenomen in celtellingen of celvolumekwantificering voor het beoordelen van de celrespons in MAP-scaffolds.

Figure 5
Figuur 5: Celkweek in MAP-steigers. (A) De mal voor het maken van celkweekputten kan 3D-geprint en gegoten worden met PDMS. De hele mal is 95 mm in diameter, de grote putten hebben een diameter van 6 mm en de kleine binnenste putten hebben een diameter van 4 mm. (B) Eenmaal gegoten met PDMS, worden de celkweekapparaten plasmagebonden aan coverslips voor verbeterde microscopiemogelijkheden. (C) De doorsnede van een celkweek toont het reservoir voor celmedia (~ 50 μL) en een kleiner reservoir voor het zaaien van MAP-steigers met cellen (~ 10 μL). (D) Het proces van het zaaien van cellen in MAP-scaffolds is eerst afhankelijk van de rehydratatie van lyo-μgels op de gewenste wt% van de gebruiker, gevolgd door het mengen met cellen en de crosslinker voor het onderling verbinden van de μgels. (E) Cellen kunnen worden ingekapseld in MAP-steigers (groen) met gevarieerde wt% MAP. Representatieve beelden zijn van dag 5 van D1 celkweek in MAP-steigers (schaalbalk = 100 μm). (F) Enkelvoudige Z-slices vertonen verschillen in celgroei in steigers bestaande uit verschillende wt% MAP (schaalbalk = 50 μm). Overgenomen uit Anderson et al.12 met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel van dit protocol is om de bereiding van microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigers met een bio-orthogonaal crosslinking schema en gecontroleerde deeltjesfracties voor 3D-celkweek te demonstreren. Ten eerste werd HA gemodificeerd met norborneen hangergroepen om te worden gebruikt in zowel microgelvorming als interlinking om MAP-steigers te vormen. Met behulp van deze methoden werd ongeveer 31% van de HA-herhalingseenheden met succes aangepast met een norborneen functionele handgreep (figuur 1A). Microfluïdische apparaten met een stroomfocusgebied (figuur 1B) bleken HA-NB-μgels te produceren met een diameter van ~ 50 μm of ~ 100 μm (figuur 1C, D). De μgels die in de rest van dit werk werden gebruikt, hadden een gemiddelde diameter van 92 μm (Q1 = 79 μm, Q3 = 103 μm) (figuur 1E).

Om de deeltjesfractie te beheersen, werden μgels gedroogd via lyofilisatie (figuur 2A-C) om een product te produceren dat door de gebruiker kon worden gewogen en gerehydrateerd om gezwollen μgels te bereiken. Het medium voor het lyofiliseren van de μgels werd geoptimaliseerd om cryogelvorming (d.w.z. interne defecten) te voorkomen door 70% ethanol te gebruiken, maar het is ook aangetoond dat cryogels werden bereikt met behulp van andere media voor lyofilisatie als cryogels door de gebruiker worden gewenst (figuur 2D). Een uitgebreide studie van verschillende lyofilisatiemedia voor microgel cryogelvorming is te vinden in het werk van Anderson et al.12. Met behulp van confocale microscopie werd de diameter van de HA-NB-microgel zowel voor als na lyofilisatie gekwantificeerd met 70% ethanol (figuur 2E), wat aangaf dat er geen significante verandering in microgelgrootte was met dit droogproces.

Om bio-orthogonale interlinking van HA-NB μgels te vergemakkelijken, werd een lineaire HA-Tet crosslinker gesynthetiseerd (figuur 3). Proton NMR-spectroscopie toonde een succesvolle modificatie van 11% van de HA-herhalingseenheden met een tetrazine-hangergroep met behulp van de stappen die in dit werk worden beschreven (figuur 3G), en de reactieopbrengst was 95%. Met behulp van de HA-Tet linker werd het gedroogde lyo-microgelproduct (figuur 4A) gerehydrateerd met gespecificeerde volumes om verschillende wt% (w/v) formuleringen van μgels (figuur 4B,C) te bereiken in MAP-steigers variërend van 10 μL (4 mm diameter) tot 50 μL (8 mm diameter) in grootte voor respectievelijk celkweekexperimenten en materiaalkarakterisering. Deze door de gebruiker gedefinieerde wt% van de μgels in MAP-steigers kwam overeen met unieke deeltjesfracties in de steigers (figuur 4D, E).

Dit protocol beschrijft ook het proces voor het zaaien van cellen in MAP-steigers voor 3D-cultuur (figuur 5D) met behulp van bio-orthogonale gloeischema's. De lyo-μgels werden gerehydrateerd met de gewenste wt% in de celmedia en vervolgens gemengd met de celpellet en HA-Tet voor het onderling verbinden van de μgels. Dit mengsel werd vervolgens verguld in celkweekapparaten (figuur 5A-C) om cellen te verkrijgen die waren ingekapseld in de lege ruimte tussen μgels in MAP-steigers. Cellen in 3D-cultuur in MAP-steigers werden op dag 5 gefixeerd, gekleurd en afgebeeld op een confocale microscoop zoals weergegeven in figuur 5E. Een voorbeeld van de cellen in de lege ruimte van de MAP-steigers voor verschillende wt%-formuleringen is weergegeven in figuur 5F.

Aanvullend coderingsbestand 1: CAD-bestand dat wordt gebruikt om de mal voor celkweekapparaten in 3D te printen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Van microfluïdische productie van HA-NB-microgels is aangetoond dat microgels worden gegenereerd met een smallere grootteverdeling dan emulsiebatchproductie 3,9. De microgels die in dit protocol worden beschreven, zijn geformuleerd met behulp van een MMP-splitsbare crosslinker (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) om materiaaldegradatie te ondersteunen. HA-NB microgels kunnen echter ook worden verknoopt met behulp van een alternatieve di-thiol linker zoals dithiothreitol (DTT), die niet afbreekbaar is. Evenzo kunnen andere foto-initiators, zoals Irgacure 2959 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon, worden gebruikt in de HA-NB-precursor in plaats van LAP om thiol-ene crosslinking10 te vergemakkelijken. Deze microgels waren samengesteld uit 3,5 wt% HA op basis van een eerder werk dat aantoonde dat de viscositeit van een 3,5 wt% precursoroplossing vatbaar was voor knijpen in druppels op een microfluïdisch platform6. Anderen hebben ha-nb microgel fabricage beschreven op flow-focussen microfluïdische apparaten met behulp van lagere wt% formuleringen (3 wt% HA-NB) en 8,10,11. Hoewel deze methode gunstig is voor het produceren van microgelpopulaties met een lage polydispersiteit, is het meer tijd- en arbeidsintensief dan batch-emulsietechnieken die ook kunnen worden gebruikt voor HA-NB-microgelproductie3.

Het microgellyofilisatieproces is afhankelijk van het bevriezen van crosslinked polymeernetwerken. Defecten kunnen optreden tijdens het bevriezen wanneer kristalstructuren in het lyofilisatiemedium zich vormen en fungeren als porogenen, en de resulterende cryogels vertonen een verbeterde porositeit en verschillende mechanische eigenschappen in vergelijking met het oorspronkelijke materiaal19,20. Tot op heden zijn er methoden beschreven voor vriesdrogende microgels die cryogelvorming voor polyethyleenglycol (PEG) 13, GelMa14 en HA-formuleringen12 voorkomen met behulp van verschillende media voor lyofilisatie. Voor dit protocol kan de gebruiker 70% ethanol uitwisselen met een ander lyofilisatiemedium naar keuze als cryogels gewenst zijn. Hoewel cryogels voor sommige toepassingen voordelig kunnen zijn, werd 70% ethanol in dit protocol benadrukt als het lyofilisatiemedium omdat het een veel voorkomend laboratoriumreagens is, het het voordeel van sterilisatie in het proces van MAP-fabricage bevat, en het stelt de HA-microgels in staat om hun oorspronkelijke grootte, vorm en stijfheid te behouden, terwijl ook interne defecten worden geminimaliseerd zodra ze zijn gerehydrateerd12 . Naast deze beoordelingen van microgel-kenmerken, zou omgevingscanning elektronenmicroscopie (SEM) kunnen worden geïmplementeerd als een potentieel hulpmiddel om microgelmorfologie voor en na lyofilisatie te beoordelen.

De methoden die in dit werk worden beschreven voor het drogen van HA-NB-microgels werden geïntroduceerd om de variabiliteit in deeltjesfractie te omzeilen en consistente MAP-steigers te produceren met door de gebruiker gedefinieerde wt% -formuleringen. De studie van gecontroleerde deeltjesfractie bij verschillende wt% rehydratatie was beperkt tot de studie van bolvormige microgels. Andere microgelvormen, zoalsstaafjes 8,21 of onregelmatige vormen10,22, zijn niet onderzocht om de relatie tussen wt% MAP en deeltjesfractie te beoordelen. Deeltjesfractie is beoordeeld in MAP-steigers met behulp van consistente verhoudingen van gerehydrateerde lyo-microgels (84%) en HA-Tet crosslinker (16%) op basis van een eerdere studie2; deze fracties kunnen echter naar goeddunken van de gebruiker worden gewijzigd, zolang het HA-Tet-volume voldoende is om HA-Tet op te lossen met de gewenste crosslinking-verhouding. De norborneen-tetrazine klikchemiereactie is effectief geweest bij het gloeien van microgels om MAP-steigers te vormen met behulp van bi-functionele23, multi-arm3, evenals de lineaire12 tetrazine linker beschreven in deze methoden. Indien gewenst kan de molaire verhouding van Tet:HA-NB worden gevarieerd om verschillende stijfheiden van de bulk MAP-steigers te bereiken12. Deze technieken voor gerehydrateerde lyo-microgels moeten nog worden beoordeeld voor andere gloeiende chemicaliën naast tetrazine-norborneen.

3D-celkweek in MAP-scaffolds is eerder beschreven met tal van celtypen, zoals endotheelcellen8, fibroblasten 1,3,4,24, neurale voorlopercellen 9 en mesenchymale stamcellen 25,26. Residuele ethanol werd waargenomen via proton NMR nadat HA-NB microgels waren gelyofiliseerd in 70% ethanol; er werd echter ook bevestigd dat de sporenhoeveelheden ethanol geen invloed hadden op de levensvatbaarheid van de cel12. Kweek in MAP-steigers bestaande uit lyo-microgels is tot nu toe alleen aangetoond met mesenchymale stamcellen van muizen12; dit protocol voor het zaaien van cellen in MAP-scaffolds met lyo-microgels kan echter worden uitgewisseld met andere celtypen en hun bijbehorende celmedia. Voor D1-celkweek is aangetoond dat de intensiteit van F-actine en het totale celvolume afnemen naarmate de wt% MAP toeneemt12. Het is ook aangetoond dat het verhogen van de wt% MAP overeenkomt met een toename van de stijfheid van bulksteigers (niet de lokale microgelstijfheid) naarmate de holteruimte tussen microgels kleiner wordt, wat leidt tot minder celproliferatie in hoge wt% MAP-steigers12.

Dit werk beschreef methoden voor het produceren van HA-NB-microgels op een microfluïdisch platform, gevolgd door het vriesdrogen van de microgels om de oorspronkelijke microgel-eigenschappen te behouden of cryogels te produceren. Dit protocol schetste de synthese van een tetrazine-linker die wordt gebruikt om de lyo-microgels met elkaar te verbinden zodra ze zijn gerehydrateerd met door de gebruiker gedefinieerde gewichtspercentages om MAP-scaffolds te maken met gecontroleerde deeltjesfracties. Ten slotte beschrijft dit werk de stappen voor het kweken van cellen binnen deze MAP-steigers met door de gebruiker gedefinieerde microarchitecturen. Het creëren van granulaire scaffolds met consistente deeltjesfracties verbetert de reproduceerbaarheid van experimentele resultaten voor MAP-gebruikers, die verder gaan dan celresponsen tot massatransport en mechanische eigenschappen, evenals 12. MAP-steigers die met behulp van deze technieken worden gegenereerd, kunnen in de toekomst worden gebruikt voor in vivo toepassingen. Het gebruik van een gelyofiliseerd product voor de fabricage van korrelige steigers is gunstig voor het verbeteren van de houdbaarheid van het materiaal en zal ook voordelig zijn voor toekomstige vertaling van MAP-steigers naar een klinische omgeving.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ARA en TS hebben een voorlopig patent aangevraagd op deze technologie.

Acknowledgments

De auteurs willen de National Institutes of Health, de National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) en het National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568) bedanken. Dit werk werd gedeeltelijk uitgevoerd in de Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), een lid van het North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), dat wordt ondersteund door de National Science Foundation (awardnummer ECCS-2025064) als onderdeel van de National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). De auteurs willen de voormalige postdoc van het lab, Dr. Lucas Schirmer, evenals Ethan Nicklow bedanken voor hun hulp bij het genereren van het 3D-geprinte apparaat voor celkweekexperimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide Invitrogen A10254 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 For staining cell culture samples
Aluminum foil VWR 89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm Integra Miltex 69031-01
Biopsy punch, 4 mm Integra Miltex 33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped SAI Infusion Technologies B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm Corning CLS430521
Calcium chloride VWR 1B1110 For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume Rainin 17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume Rainin 17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume Rainin 17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL CELLTREAT 667015B
Centrifuge tube, 50 mL CELLTREAT 229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle Stellar Scientific CP-C7304 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator ETP 11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap Nunc 368632
D1 mouse mesenchymal cells ATCC CRL-12424 Example cell line for culture in MAP gels
DAPI Sigma-Aldrich D9542 For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D Sigma-Aldrich 151882 For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off Spectra/Por 132703 For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether VWR BDH1121-4LPC For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide Sigma-Aldrich 277056 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)  TCI-Chemicals D2919 For modifying HA
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861 Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich D6429-500ML For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof) KOPTEC 89234-850
Fetal bovine serum (FBS) ATCC 30-2020 For D1 cell culture
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
Hemacytometer with coverglass Daigger Scientific EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg Contipro N/A 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package Oxford Instruments N/A Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe Chemyx N/A
Kimwipe Kimberly-Clark 34120
Laboratory stand with support lab clamp Geyer 212100
Liquid nitrogen Airgas NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate TCI-Chemicals L0290
Lyophilizer Labconco N/A Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide Kerafast FCC210 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) Fisher Scientific BP300-100 For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 VWR 48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer FlowJem Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy Sigma-Aldrich 330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) GenScript N/A
5-Norbornene-2-methylamine TCI-Chemicals 95-10-3 For HA-NB synthesis
Packing tape Scotch 3M 1426
Parafilm Bemis PM996
PEG(thiol)2 JenKem Technology USA A4001-1 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL Thermo Fisher Scientific 15140122 For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm Corning 351058
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010023
RainX water repellent glass treatment Grainger 465D20 Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) GenScript N/A
Rubber bands Staples 112417
Sodium chloride Chem-Impex 30070 For dialysis
Span 80 for synthesis Sigma-Aldrich 1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer Electron Microscopy Science 4019862 polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter Cytvia 09-928-066
Tetraview LCD digital microscope Celestron 44347
Tetrazine-amine HCl salt Chem-Impex 35098 For HA-Tet synthesis
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Millipore Sigma 51805-45-9
Triton X-100 VWR 97063-864
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red Fisher Scientific 25-200-056 For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in Thomas Scientific 1204G82
UV curing system controller, LX500 LED  OmniCure 010-00369R
UV curing head, LED spot UV OmniCure N/A
UV light meter, Traceable VWR 61161-386
Vacuum dessicator Bel-Art 08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife Elmer's XZ3601W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
  4. Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
  5. Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
  6. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  7. Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
  8. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
  9. Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
  10. Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  11. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
  12. Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
  13. Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
  14. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  15. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  16. JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).
  17. Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
  18. Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
  19. Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
  20. Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
  21. Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
  22. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  23. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  24. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  25. Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
  26. Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).

Tags

Bio-engineering Nummer 188
Deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3D-celcultuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, A. R., Segura, T.… More

Anderson, A. R., Segura, T. Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (188), e64554, doi:10.3791/64554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter