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Biology

व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशियों से क्विसेंट स्टेम सेल आबादी का अलगाव

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों में व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशियों से मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं और फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों के अलगाव का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल में एकल मांसपेशी विच्छेदन, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा स्टेम सेल अलगाव, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा शुद्धता मूल्यांकन, और 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन निगमन परख द्वारा एस-चरण प्रविष्टि का मात्रात्मक माप शामिल है।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी वयस्क स्टेम कोशिकाओं की अलग-अलग आबादी को आश्रय देती है जो होमियोस्टैसिस और ऊतक की मरम्मत में योगदान करती है। कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) में नई मांसपेशियों को बनाने की क्षमता होती है, जबकि फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज (एफएपी) स्ट्रोमल सहायक ऊतकों में योगदान करते हैं और फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट्स बनाने की क्षमता रखते हैं। एमयूएससी और एफएपी दोनों लंबे समय तक प्रतिवर्ती सेल चक्र निकास की स्थिति में रहते हैं, जिसे क्विसेंस कहा जाता है। क्वीसेंट स्थिति उनके कार्य की कुंजी है। क्विसेंट स्टेम कोशिकाओं को आमतौर पर एक ही नमूने में एक साथ पूल किए गए कई मांसपेशियों के ऊतकों से शुद्ध किया जाता है। हालांकि, हाल के अध्ययनों ने विभिन्न मांसपेशियों से अलग किए गए एमयूएससी के आणविक प्रोफाइल और क्वीसेंस गहराई में अलग-अलग अंतर का खुलासा किया है। वर्तमान प्रोटोकॉल व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशियों से एमयूएससी और एफएपी के अलगाव और अध्ययन का वर्णन करता है और स्टेम सेल सक्रियण के आणविक विश्लेषण करने के लिए रणनीतियों को प्रस्तुत करता है। यह विभिन्न विकास मूल, मोटाई और कार्यों की मांसपेशियों को अलग करने और पचाने का विवरण देता है, जैसे कि डायाफ्राम, ट्राइसेप्स, ग्रैसिलिस, टिबियल एंटीरियर (टीए), गैस्ट्रोकेनेमस (जीए), सोलस, एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल), और मासेटर मांसपेशियां। एमयूएससी और एफएपी को प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा शुद्ध किया जाता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग और 5-एथिनाइल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) निगमन परख द्वारा विश्लेषण किया जाता है।

Introduction

मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) की उपस्थिति के कारण कंकाल की मांसपेशियों में पुनर्जनन की उच्च क्षमता होती है। एमयूएससी बेसल लैमिना के नीचे, मायोफाइबर पर स्थित होते हैं, और लंबे समय तक, प्रतिवर्ती सेल चक्र निकास 1,2,3,4 की एक स्थिर अवस्था में रहते हैं। चोट लगने पर, एमयूएससी सक्रिय हो जाते हैं और कोशिका चक्र में प्रवेश करते हैं ताकि पूर्वजों को बढ़ाया जा सके जो अंतर कर सकते हैं और नए मायोफाइबर 2,5 बनाने के लिए फ्यूज कर सकते हैं। पिछले काम से पता चला है कि मांसपेशियों के पुनर्जनन 6,7,8 के लिए एमयूएससी बिल्कुल आवश्यक हैं। इसके अलावा, एक एकल एमयूएससी नई स्टेम कोशिकाओं और नए मायोफाइबरदोनों को एनग्राफ्ट और उत्पन्न कर सकता है। कंकाल की मांसपेशी भी फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों (एफएपी) नामक मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं की एक आबादी को आश्रय देती है, जो मांसपेशी पुनर्जनन 6,10,11,12 के दौरान एमयूएससी समारोह का समर्थन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।

मांसपेशियों के पुनर्जनन को समन्वित करने की उनकी क्षमता के कारण, यह समझने में जबरदस्त रुचि रही है कि एमयूएससी और एफएपी कैसे काम करते हैं। क्यूसेंट एमयूएससी को प्रतिलेखन कारकपैक्स 7 और स्प्राउटी 1, और सेल सतह प्रोटीन कैल्सीटोनिन रिसेप्टर की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित किया जाता है, जबकि क्विसेंट एफएपी को सेल सतह प्रोटीन प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर अल्फा (पीडीजीएफआरए) 10,12,13,14,15 द्वारा चिह्नित किया जाता है।. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि सेल सतह मार्करों और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 9,15,16,17,18,19,20,21 का उपयोग करके कंकाल की मांसपेशियों से एमयूएससी और एफएपी को शुद्ध किया जा सकता है। हालांकि इन प्रोटोकॉल ने एमयूएससी और एफएपी का अध्ययन करने की क्षमता को बहुत उन्नत किया है, एक दोष यह है कि इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल को विभिन्न मांसपेशियों के ऊतकों के पूल से एमयूएससी के अलगाव की आवश्यकता होती है। हमारे और अन्य लोगों के हालिया काम ने विभिन्न ऊतकों से अलग एमयूएससी के बीच सेल फेनोटाइप और जीन अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर का खुलासा कियाहै। डायाफ्राम, ट्राइसेप्स और ग्रेसिलिस से एमयूएससी निचले हिंदलिम्ब मांसपेशियों से एमयूएससी की तुलना में तेजी से सक्रियण दिखाते हैं, जबकि एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशी से एमयूएससी डायाफ्राम और निचले हिंदलिम्बमांसपेशियों से एमयूएससी की तुलना में तेजीसे भेदभाव दिखाते हैं।

यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशियों से एमयूएससी और एफएपी के अलगाव का वर्णन करता है (चित्रा 1)। इसमें डायाफ्राम, ट्राइसेप्स, ग्रैसिलिस, टिबियल एंटीरियर (टीए), सोलस, एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल), गैस्ट्रोकेनेमस (जीए), और मासेटर मांसपेशियों का विच्छेदन शामिल है। विच्छेदित मांसपेशियों को बाद में कोलेजनेस II (एक प्रोटीज जो विशेष रूप से कोलेजन में प्रो-एक्स-ग्लाइ-प्रो अमीनो अनुक्रम को लक्षित करता है, संयोजी ऊतक और ऊतक पृथक्करण24 के क्षरण को सक्षम करता है) और डिस्पेस (एक प्रोटीज जो फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन IV को रोकता है, आगे सेल पृथक्करणको सक्षम करता है) का उपयोग करके एंजाइमेटिक पाचन द्वारा अलग किया जाता है।). एमयूएससी और एफएपी को एफएसीएस द्वारा एकल-सेल निलंबन से अलग किया जाता है। सेल विश्लेषण के लिए डाउनस्ट्रीम परख के उदाहरण के रूप में, स्टेम सेल सक्रियण 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) निगमन द्वारा निर्धारित किया जाता है, जबकि सेल शुद्धता सेल-प्रकार विशिष्ट मार्कर पैक्स 7 और पीडीजीएफआरए के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा निर्धारित की जाती है।

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Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल आरहस विश्वविद्यालय में पशु देखभाल दिशानिर्देशों और स्थानीय नैतिकता नियमों के अनुसार किया गया था।

नोट: पशु प्रयोग और पोस्टमार्टम कृंतक नमूनों की हैंडलिंग के लिए स्थानीय नैतिक समिति के नियमों का पालन करना सुनिश्चित करें। चूहे एलर्जी का एक संभावित स्रोत हैं; यदि उपलब्ध हो, तो निकास वेंटिलेशन चालू करें और एलर्जी के अत्यधिक जोखिम से बचने के लिए इसे कार्यक्षेत्र पर रखें। वैकल्पिक रूप से, यदि प्रयोग नियमित रूप से किया जाता है तो फेस मास्क पहनें। इस प्रोटोकॉल में शार्प्स के साथ काम करना शामिल है, और शोधकर्ताओं को कटौती के मामले में प्राथमिक चिकित्सा लागू करने के लिए प्रक्रियाओं और रसद से खुद को परिचित करने की सिफारिश की जाती है।

1. तैयारी (1-2 घंटे; विच्छेदन से एक दिन पहले)

नोट: समाधान, प्लेट, और मीडिया बाँझ परिस्थितियों में तैयार किए जाते हैं और उपयोग से पहले फ़िल्टर (0.45 μm) होते हैं जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया गया हो। डिस्पेस (पीबीएस में 11 यू / एमएल) और कोलेजनेस II (पीबीएस में 1.000 यू / एमएल) के स्टॉक समाधान तैयार करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस (तालिका 1) पर स्टोर करें। स्टॉक को पिघलाया जाता है और चरण 4.2.6 में द्वितीयक पाचन के लिए उपयोग किया जाता है।

  1. 96-अच्छी तरह से आधे क्षेत्र की प्लेट की कोलेजन कोटिंग
    1. अम्लीय पानी तैयार करें। 2 लीटर बीकर में 895 एमएल आटोक्लेव पानी में 5.15 एमएल ग्लेशियल एसिटिक एसिड जोड़ें।
    2. 0.45 μm, 500 mL फ़िल्टर इकाई का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर करें। फ़िल्टर किए गए अम्लीय पानी के 800 मिलीलीटर को 1 एल की बोतल में स्थानांतरित करें।
    3. बोतल में बाँझ कोलेजन स्टॉक समाधान के 40 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे घोल को घुमाकर मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, उपयोग तक प्रकाश से सुरक्षित।
    4. कोलेजन के साथ एक या अधिक 96-अच्छी तरह से आधे क्षेत्र की प्लेटों को कोट करें। प्रत्येक कुएं में कोलेजन कोटिंग समाधान के 50 μL जोड़ें और प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (ON) कोट करें।
    5. अगले दिन वैक्यूम-आधारित एस्पिरेटर का उपयोग करके कोलेजन समाधान को एस्पिरेट करें और 100 μL आटोक्लेव पानी और एस्पिरेटिंग जोड़कर प्लेट 2x को धो लें।
    6. प्लेट के ढक्कन को झुकाएं और प्लेट को 20-30 मिनट के लिए हुड में सूखने दें।
    7. जब प्लेट पूरी तरह से सूख जाए, तो इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें, और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लेपित प्लेटों को 4 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: कोलेजन कोटिंग सेल आसंजन को सक्षम बनाता है। मुक्त कोलेजन को धोना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सेल फ़ंक्शन और सिग्नलिंग में हस्तक्षेप कर सकता है (उदाहरण के लिए, एमयूएससी पर कैल्सीटोनिन रिसेप्टर्स के लिए कोलेजन वी का बंधन)26।

2. तैयारी (0.5 घंटे; विच्छेदन का दिन):

  1. अतिरिक्त समाधान और कार्यक्षेत्र की तैयारी
    1. एचएएम के एफ 10 माध्यम के 445 एमएल में 50 मिलीलीटर घोड़े के सीरम और 5 मिलीलीटर पेन / स्ट्रेप को जोड़कर बाँझ धोने का माध्यम तैयार करें। संदूषण को रोकने के लिए एक लामिनर प्रवाह हुड में काम करें।
    2. पृथक्करण बफर तैयार करने के लिए आवश्यक कोलेजनेस II की उचित मात्रा की गणना और वजन करें। (प्रत्येक माउस के लिए, कोलेजनेस II की 26,000 इकाइयों का उपयोग 650 यू / एमएल कोलेजनेस II पर 40 एमएल पृथक्करण बफर बनाने के लिए किया जाता है)। तौले हुए पाउडर को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें और इसे बर्फ पर स्टोर करें।
    3. मांसपेशियों के अलगाव के लिए दो 10 सेमी व्यंजन तैयार करें। प्रत्येक पेट्री डिश में 3 एमएल वॉश मीडियम (तालिका 1) डालें। बाद में उपयोग के लिए लामिनर प्रवाह हुड के बाहर 10 सेमी व्यंजन लाएं।
    4. मांसपेशियों के पाचन के लिए सामग्री तैयार करें। नमूनों की संख्या के आधार पर, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों (आठ प्रति माउस, प्रत्येक मांसपेशी के लिए एक) की उपयुक्त संख्या को लेबल करें और उन्हें बेंच पर छोड़ दें। सुइयों, 10 एमएल सिरिंज, और 40 μm सेल स्ट्रेनर्स को 70% इथेनॉल (प्रत्येक माउस के आठ, प्रत्येक मांसपेशी के लिए एक) के साथ स्प्रे करें और उन्हें लैमिनर फ्लो हुड के अंदर लाएं। सिरिंज में सुइयों को संलग्न करें।
    5. छंटाई के लिए सामग्री तैयार करें। नमूनों की संख्या के आधार पर सेल छन्नी कैप के साथ 5 एमएल गोल नीचे ट्यूबों को लेबल करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें और उन्हें लामिनर प्रवाह हुड में छोड़ दें।
    6. सॉर्ट किए जा रहे नमूनों और आबादी की संख्या के अनुरूप, सेल संग्रह के लिए 500 μL वॉश माध्यम के साथ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें (16 प्रति माउस, प्रत्येक सेल आबादी प्रति मांसपेशी ऊतक के लिए एक ट्यूब)। इन ट्यूबों को बर्फ पर स्टोर करें।

3. मांसपेशी विच्छेदन (20-30 मिनट)

नोट: प्रोटोकॉल का यह खंड एक गैर-बाँझ वातावरण में किया जाता है। प्रक्रिया एक या कई चूहों का उपयोग करके की जा सकती है। हालांकि, एक माउस दोनों नमूनों को सॉर्टिंग के लिए तैयार करने और मुआवजे और एफएसीएस गेट स्थापित करने के लिए नियंत्रण के लिए पर्याप्त है।

  1. मांसपेशियों के अलगाव की शुरुआत
    1. विच्छेदन और मांसपेशियों के अलगाव के लिए गैर-बाँझ कार्यक्षेत्र तैयार करें। 70% इथेनॉल के साथ वर्कस्टेशन कीटाणुरहित करें। वर्कस्टेशन पर एक बाँझ सुरक्षात्मक डिस्पोजेबल अंडरपैड रखें।
    2. एक स्थायी मार्कर का उपयोग करके, पेट्री डिश ढक्कन के शीर्ष पर प्रत्येक मांसपेशी के लिए एक बॉक्स खींचें ताकि बाद में पृथक मांसपेशियों को रखा जा सके।
    3. सर्जिकल उपकरणों को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
    4. सीओ2 इनहेलेशन और / या ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें।
    5. व्यक्तिगत मांसपेशियों को अलग करें (एक समय में एक माउस से यदि कई चूहों का उपयोग किया जाता है)। फर को गीला करने और त्वचा को कीटाणुरहित करने के लिए माउस को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। माउस को पेट के सामने अंडरपैड पर रखें। सभी आठ मांसपेशियों और उनके संबंधित शारीरिक स्थान का अवलोकन चित्रा 2 ए में दिखाया गया है।
  2. ग्रेसिलिस मांसपेशियों को अलग करना
    1. पेट की त्वचा में 0.5 सेमी क्षैतिज चीरा लगाने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें।
    2. त्वचा को हटाएं: दोनों हाथों का उपयोग करके, चीरे के ऊपरी और निचले हिस्से पर पकड़ने के लिए अंगूठे और तर्जनी उंगली का उपयोग करें। धड़ और निचले छोरों की त्वचा को फाड़ने और भाग लेने के लिए चीरे के प्रत्येक तरफ खींचें। दोनों हिंदअंगों (कूल्हे से पैर की उंगलियों तक नीचे की ओर) को उजागर करने के लिए निचले छोर की त्वचा को नीचे खींचें। इसी तरह, धड़ को उजागर करने के लिए ऊपर की ओर खींचें।
    3. ग्रेसिलिस मांसपेशी (आंतरिक जांघ) का पता लगाएं। घुमावदार बल का उपयोग करके, ग्रैसिलिस पर पकड़ें और मांसपेशियों को थोड़ा ऊपर उठाएं (चित्रा 2 बी)। कैंची के साथ, 0.5 सेमी चीरा (चित्रा 2 सी) बनाएं, जिसमें से ग्रैसिलिस को काट दिया जाता है और पूरी तरह से अलग कर दिया जाता है (चित्रा 2 डी)। दूसरे ग्रेसिलिस मांसपेशी को अलग करने के लिए दूसरे पैर के लिए इसे दोहराएं।
  3. टीए और ईडीएल मांसपेशियों को अलग करना (निचला हिंदलिंब, वेंट्रल साइड)।
    1. एक स्केलपेल का उपयोग करके, टिबिया के पार्श्व पक्ष (सबसे मोटी निचली हिंदलिम्ब हड्डी) के साथ 0.5 सेमी चीरा लगाकर प्रावरणी को काट लें। प्रावरणी को पकड़ने के लिए घुमावदार बल का उपयोग करें और इसे हटाने के लिए खींचें।
      नोट: जब प्रावरणी को पूरी तरह से हटा दिया गया है, तो पिछले पैर के बाहर के छोर पर टेंडन दिखाई देते हैं और उन्हें अलग किया जा सकता है।
    2. टीए (टिबिया के पार्श्व पक्ष) और ईडीएल (टीए के नीचे) के डिस्टल टेंडन (चित्रा 2 ई-जी) के बीच जाने के लिए सुपरफाइन युक्तियों के साथ सीधे बल का उपयोग करें।
      नोट: अनुभव के साथ, सीधे बल के बजाय स्केलपेल ब्लेड के कुंद छोर का उपयोग किया जा सकता है।
    3. मांसपेशियों को अलग करने के लिए मांसपेशियों के समीपस्थ छोर की ओर बल को स्लाइड करें।
    4. सीधे बल को बाहर के छोर पर वापस लाएं। डिस्टल टेंडन को काट लें।
    5. धीरे से घुमावदार बल के साथ मांसपेशियों के डिस्टल टेंडन को पकड़ें। मांसपेशियों को उसके समीपस्थ लगाव के ऊपर और ऊपर उठाएं और समीपस्थ कण्डरा को यथासंभव अपने लगाव बिंदु के करीब सावधानी पूर्वक काटें। दूसरे छोर को काटें और टीए को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    6. ईडीएल के डिस्टल टेंडन के नीचे जाने के लिए सुपरफाइन टिप्स के साथ सीधे बल का उपयोग करें।
    7. मांसपेशियों को अलग करने के लिए मांसपेशियों के समीपस्थ छोर की ओर बल को स्लाइड करें।
    8. सीधे बल को बाहर के छोर पर वापस लाएं। मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाए बिना डिस्टल टेंडन को काटें।
    9. धीरे से घुमावदार बल के साथ ईडीएल के डिस्टल टेंडन को पकड़ें। मांसपेशियों को उसके समीपस्थ लगाव के ऊपर और ऊपर उठाएं और समीपस्थ कण्डरा को यथासंभव अपने लगाव बिंदु के करीब सावधानी पूर्वक काटें। दूसरे छोर को काटें और ईडीएल को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। दूसरे टीए और ईडीएल मांसपेशियों को अलग करने के लिए दूसरे हिंदलिम्ब के लिए दोहराएं।
  4. जीए और तलवों की मांसपेशियों को अलग करना (निचला हिंदलिम्ब, पृष्ठीय पक्ष)।
    1. अकिलिस कण्डरा और निचले हिंदलिम्ब हड्डियों के बीच जाने के लिए सुपरफाइन युक्तियों के साथ सीधे बल का उपयोग करें।
    2. मांसपेशियों को अलग करने के लिए मांसपेशियों के समीपस्थ छोर की ओर बल को स्लाइड करें।
    3. सीधे बल को बाहर के छोर पर वापस लाएं। डिस्टल टेंडन को काट लें।
      नोट: जीए के नीचे स्थित तलवों की मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए, जितना संभव हो सके अपने डिस्टल अकिलिस टेंडन अटैचमेंट के करीब काटें, जीए से जुड़े कण्डरा का एक हिस्सा छोड़ दें (चित्रा 2 एच)।
    4. तलवों की मांसपेशियों को प्रकट करने और अलग करने के लिए, जीए को ऊपर और फिबुला (निचले हिंदलिम्ब में दो हड्डियों की सबसे पतली हड्डी) पर खींचें।
      नोट: सोलस मांसपेशी जीए (चित्रा 2 आई) के सापेक्ष इसकी विशेषता गहरे लाल रंग से प्रतिष्ठित है।
    5. समीपस्थ तलवे कण्डरा का पता लगाएं। सीधे बल के साथ, तलवों और जीए के बीच में जाएं।
    6. जीए से तलवों को अलग करने के लिए मांसपेशियों के बाहर के छोर की ओर बल को स्थानांतरित करें।
    7. पहले तलवों को अलग करें। इसके समीपस्थ कण्डरा को काटें, घुमावदार बल के साथ कण्डरा को पकड़ें, और इसके डिस्टल टेंडन तक पहुंचने के लिए तलवों को सावधानीपूर्वक उठाएं। जीए से तलवों को अलग करने के लिए डिस्टल टेंडन को काट लें। तलवों को धोने के माध्यम से पेट्री डिश में रखें (चित्रा 2 जे)।
    8. जीए को काटें और इसे पेट्री डिश में रखें। दूसरे तलवे और जीए मांसपेशियों को अलग करने के लिए दूसरे पैर के लिए इसे दोहराएं।
  5. ट्राइसेप्स मांसपेशियों को अलग करना (ऊपरी अग्रभाग, पृष्ठीय पक्ष)।
    1. ट्राइसेप्स मांसपेशी और ह्यूमरस हड्डी (ऊपरी अग्रभाग की मुख्य हड्डी) के बीच जाने के लिए सुपरफाइन युक्तियों के साथ सीधे बल का उपयोग करें (चित्रा 2के-एम)।
    2. मांसपेशियों को अलग करने के लिए मांसपेशियों के समीपस्थ छोर की ओर बल को स्लाइड करें। मांसपेशियों के समीपस्थ छोर को काटें।
    3. घुमावदार बल के साथ ट्राइसेप्स के समीपस्थ छोर को पकड़ें और डिस्टल टेंडन तक पहुंचने के लिए इसे कोहनी के ऊपर और ऊपर खींचें। ट्राइसेप्स के डिस्टल टेंडन को काटें, मांसपेशियों को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और दूसरे फोरलिम्ब के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
  6. मालिश करने वाली मांसपेशियों को अलग करना
    1. जबड़े से फर और त्वचा को हटा दें। कैंची से 0.5 सेमी का क्षैतिज चीरा लगाएं। दोनों हाथों का उपयोग करके, अंगूठे और इंडेक्स उंगलियों का उपयोग करके चीरे के प्रत्येक तरफ चुटकी लें। ऊपर और नीचे की ओर खींचकर त्वचा को हटा दें।
    2. मालिश के प्रमुख कण्डरा (पुच्छल, आंख के नीचे) का पता लगाएं। हड्डी और मांसपेशियों के बीच में फ्लैट स्केलपेल ब्लेड डालें (चित्रा 2 एन)। कण्डरा काट लें।
    3. घुमावदार बल के साथ प्रमुख मालिश कण्डरा को पकड़ें। जबड़े की हड्डी से मालिश की मांसपेशियों को अलग करने के लिए इसे रोस्ट्रल दिशा में एक स्केलपेल ब्लेड या कैंची से काटें (चित्रा 2 ओ, पी)। पेट्री डिश में पृथक मालिश मांसपेशी रखें। दूसरे मालिश मांसपेशी के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
  7. डायाफ्राम मांसपेशी को अलग करना
    नोट: डायाफ्राम मांसपेशियों को अलग करते समय, आंतरिक अंगों और आंत में काटने से बचने के लिए सावधानी से कटौती करना सुनिश्चित करें, क्योंकि यह संदूषण का एक स्रोत है।
    1. कैंची का उपयोग करके, उरोस्थि के बीच में एक थोराकोटॉमी (पसलियों के बीच में एक कट) बनाएं (छाती के बीच में स्थित एक लंबी सपाट हड्डी, जो पसलियों को जोड़ती है) और उरोस्थि के माध्यम से काट दें (चित्रा 2 क्यू)।
    2. रिबकेज के माध्यम से 360 ° काटकर डायाफ्राम को उजागर करें।
    3. ऊपरी शरीर को निचले हिस्से/पेट से अलग करें। कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके, श्वासनली, अन्नप्रणाली, वेना कावा और पेट की महाधमनी को काट लें।
    4. डायाफ्राम को निचले शरीर से अलग करें। कैंची का उपयोग करके, उरोस्थि के 1 सेमी नीचे एक लैप्रोटॉमी (पेट की गुहा में एक सर्जिकल चीरा) बनाएं और 360 डिग्री कट (चित्रा 2 आर) बनाएं।
    5. बंद कैंची को रिबकेज और पेट के अंगों के बीच रखें और नीचे दबाएं। पेट के अंगों से इसे अलग करने के लिए रिबकेज पर धीरे से खींचें (चित्रा 2 एस)।
    6. डायाफ्राम को पसली के पिंजरे से अलग करें। ढीले ढंग से डायाफ्राम को दो उंगलियों के बीच पकड़ें और कैंची के साथ रिबकेज के माध्यम से काट लें। डायाफ्राम को 360 डिग्री कट में जितना संभव हो सके पसलियों के करीब काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। पृथक डायाफ्राम को पेट्री डिश में रखें।
      नोट: गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के दौरान, डायाफ्राम टूट सकता है और रिबकेज के खिलाफ गिर सकता है, जिससे इसका पता लगाना मुश्किल हो जाता है। मांसपेशियों को अभी भी अलग किया जा सकता है। ध्वस्त मांसपेशियों की पहचान करें, इसे दो उंगलियों के बीच पकड़ें, और रिबकेज के बाद 360 डिग्री काटें।

4. एकल-कोशिका निलंबन के लिए मांसपेशी पाचन (~ 1 घंटे 35 मिनट)

नोट: निम्नलिखित चरणों में गैर-बाँझ (चरण 4.1-4.2) और बाँझ कार्य वातावरण (चरण 4.3) शामिल हैं।

  1. यांत्रिक पाचन
    1. पृथक मांसपेशियों को 10 सेमी पेट्री डिश के ढक्कन में रखें।
    2. घुमावदार बल का उपयोग करके, एक-एक करके पृथक मांसपेशियों पर पकड़ें। सोलस और जीए के लिए, अकिलिस टेंडन के शेष हिस्सों को हटा दें।
    3. कैंची का उपयोग करके, पृथक मांसपेशियों को एक-एक करके लगभग 1 मिमी3 टुकड़ों में काट लें।
  2. एंजाइमेटिक पाचन
    1. वजन किए गए कोलेजनेस II पाउडर (कोलेजनेस II: 650 यू / एमएल वॉश मीडिया में) में 40 मिलीलीटर कोल्ड वॉश माध्यम जोड़कर मांसपेशियों के पृथक्करण बफर तैयार करें।
      नोट: इष्टतम एंजाइमेटिक गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए ताजा तैयार मांसपेशी पृथक्करण बफर का उपयोग करें।
    2. कीमा वाली मांसपेशियों को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल पृथक्करण बफर होता है।
    3. 60 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस हिलाने वाले पानी के स्नान में 35 मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    4. इनक्यूबेशन के बाद, 15 एमएल की कुल मात्रा में वॉश मीडियम जोड़ें। ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,600 x g पर स्पिन करें।
    5. वैक्यूम-आधारित एस्पिरेटर का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाले को 4 मिलीलीटर की मात्रा तक ले जाएं। गोली को परेशान करने से बचने के लिए, धीरे-धीरे ऊपर से एस्पिरेट करें, और किसी भी फ्लोटिंग वसा को हटा दें।
    6. डिस्पेस और कोलेजनेस II के स्टॉक एलिकोट को पिघलाना। शेष 4 एमएल नमूने में कोलेजनेस II समाधान (1,000 यू / एमएल स्टॉक, -20 डिग्री सेल्सियस) के 500 μL जोड़ें। इसके बाद, डिस्पेस समाधान के 500 μL जोड़ें (11 U / mL स्टॉक, -20 °C)।
      नोट: डिस्पेस एक अवक्षेप उत्पन्न कर सकता है। यदि ऐसा होता है, तो उपयोग से पहले 1 मिनट पहले 10,000 x g पर डिस्पेस स्टॉक समाधान को स्पिन करें। गोली को परेशान किए बिना अब स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला को सेल निलंबन में स्थानांतरित करें।
    7. गोली को भंग करने के लिए नमूने को संक्षेप में भंवर करें।
    8. 60 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस हिलने वाले पानी के स्नान में 20 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
      नोट: बड़ी संख्या में मांसपेशियों के नमूनों को पचाने में समय लगता है। चरण 4.3.1-4.3.6 के लिए, प्रति नमूना 2-5 मिनट लेने का अनुमान लगाएं। यह कदम तेजी से चलता है जब दो या दो से अधिक शोधकर्ताओं द्वारा समानांतर में प्रदर्शन किया जाता है।
  3. नमूनों का समरूपीकरण।
    1. सेल निलंबन को समरूप करें। निलंबन को 15 एमएल ट्यूब से 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुई 5x के माध्यम से नमूने को ऊपर और नीचे खींचकर नमूने को फिर से निलंबित करने के लिए 20 जी सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
      नोट: यदि बिना पचे हुए मांसपेशियों के टुकड़े सुई को रोकते हैं, तो उन्हें कागज के ऊतक पर पोंछ दें।
    2. एक नई 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर 40 μm सेल छन्नी रखें।
    3. सिरिंज में पूर्ण सेल निलंबन लें और नमूने को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में छान लें, जिसमें शीर्ष पर एक सेल छन्नी हो। फिल्टर पर सीधे कुल मात्रा वितरित करके नमूने को छान लें।
    4. सभी मोनोन्यूक्लियेटेड कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने के लिए, खाली शंक्वाकार ट्यूब में 20 एमएल वॉश माध्यम जोड़ें और इसे सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डालें जिसमें तनावपूर्ण नमूना होता है। पी 1000 पिपेट के साथ सेल छन्नी के नीचे शेष मात्रा पुनः प्राप्त करें।
    5. सेल छन्नी को छोड़ दें और नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,600 x g पर स्पिन करें।
    6. पी 1000 पिपेट के साथ पाइपिंगकरके, गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें।
    7. पी 1000 पिपेट के साथ पाइपिंग करके, धोने के माध्यम के 500 μL में डायाफ्राम गोली को फिर से निलंबित करें और धोने के माध्यम के 300 μL में अन्य मांसपेशियों के नमूनों को फिर से निलंबित करें।
      नोट: डायाफ्राम उच्चतम स्टेम सेल सामग्री वाली मांसपेशियों में सबसे बड़ा है और इसलिए इसका उपयोग नियंत्रण धुंधला करने के लिए किया जा सकता है।

5. धुंधला और छंटाई (~ 40 मिनट + 30 मिनट प्रकार / नमूना)

नोट: निम्नलिखित चरणों के लिए बर्फ पर एक बाँझ वातावरण में काम करें।

  1. डायाफ्राम सेल निलंबन के 50 μL एलिकोट को नियंत्रण दाग (50 μL प्रत्येक) के लिए चार नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। प्रत्येक नियंत्रण ट्यूब में 300 μL की अंतिम मात्रा में वॉश माध्यम के 250 μL जोड़ें।
  2. तीन नियंत्रण धुंधला ट्यूबों में प्रतिदीप्ति माइनस-वन एंटीबॉडी (एफएमओ-नियंत्रण) के 3 μL (1:100) जोड़ें और एंटीबॉडी (बिना दाग नियंत्रण) के बिना एक ट्यूब छोड़ दें ( तालिका 2 देखें)।
  3. शेष मांसपेशी एकल सेल निलंबन में एंटीबॉडी (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC, और SCA1-PacificBlue) के 3 μL (1:100) जोड़ें, जिसमें शेष डायाफ्राम नमूना भी शामिल है।
  4. सेल सस्पेंशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए हेड-ओवर-हेड शेकर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर निर्धारित करने और फ्लो साइटोमेट्री के लिए द्वार सेट करने के लिए नियंत्रण धुंधला होना आवश्यक है। विभिन्न एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक में एक विशिष्ट कार्य एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय होगा जिसे परीक्षण करने की आवश्यकता है। यदि विभिन्न विक्रेताओं से एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, तो एकाग्रता, और इस प्रकार कमजोर पड़ना, भिन्न हो सकता है। प्रकार के दौरान किसी भी मृत या मरने वाली कोशिकाओं को खत्म करने के लिए धुंधला मिश्रण में एक सेल व्यवहार्यता डाई जोड़ा जा सकता है।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,600 x g पर नमूने स्पिन करें। पाइपिंग द्वारा गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को फेंक दें।
  6. पी 1000 पिपेट के साथ पाइप िंग करके, धोने के माध्यम के 800 μL में प्रत्येक नमूने को पुन: निलंबित करें।
  7. किसी भी शेष सेल क्लंप (या समुच्चय) को हटाने के लिए सेल स्ट्रेनर कैप (40 μm) के साथ FACS ट्यूब का उपयोग करके नमूने फ़िल्टर करें।
  8. वॉश माध्यम के अतिरिक्त 800 μL जोड़कर सेल छन्नी धो लें।
  9. विश्लेषण तक नमूने को बर्फ पर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर रखें।
    नोट: यदि इस बिंदु पर सेल निलंबन कोशिकाओं की उच्च सांद्रता के कारण बादल / घना दिखाई देता है, तो सेल घनत्व को कम करने के लिए वॉश माध्यम का अतिरिक्त 800 μL जोड़ें।
  10. 70 μm नोजल के साथ FACS शुरू करें।
  11. गेटिंग रणनीति सेट करने के लिए बिना दाग वाले और एफएमओ नियंत्रणों का उपयोग करें: एमयूएससी सीडी 45-एफआईटीसी, सीडी 31-एफआईटीसी और एससीए 1-पैकब्लू के लिए नकारात्मक हैं, और वीसीएएम 1-पीईसी 7 के लिए सकारात्मक हैं; FAPs CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 के लिए नकारात्मक हैं, और SCA1-PACblue के लिए सकारात्मक हैं।
  12. दाग वाले एकल-सेल निलंबन को दो-तरफा सॉर्ट का उपयोग करके क्रमबद्ध करें और एमयूएससी और एफएपी को अलग-अलग संग्रह ट्यूबों में इकट्ठा करें जिसमें वॉश माध्यम के 500 μL शामिल हैं।
    नोट: चार लेजर (कॉन्फ़िगरेशन: 70 μm nojal, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm) के साथ FACS का उपयोग करते हुए, फ्लोरोफोर के चुने हुए संयोजन को प्रतिदीप्ति संकेत के मुआवजे की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, यदि एक अलग प्रवाह साइटोमीटर या फ्लोरोफोर के एक अलग संयोजन का उपयोग कर रहे हैं, तो मुआवजे के लिए अतिरिक्त एकल-दाग नियंत्रण नमूने की सिफारिश की जाती है। छोटी मांसपेशियों (ईडीएल, सोलस, टीए) से, 3,000 एमयूएससी और 5,000 एफएपी की पैदावार की उम्मीद की जाती है। अन्य बड़ी मांसपेशियों के लिए, 20,000 एमयूएससी और एफएपी की पैदावार की उम्मीद की जानी चाहिए। FACS सॉफ़्टवेयर द्वारा सूचीबद्ध इवेंट गणना संग्रह ट्यूब में व्यवहार्य कोशिकाओं की वास्तविक संख्या से विचलित हो सकती है। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल गिनती द्वारा सेल संख्या की पुष्टि की जा सकती है।
  13. क्रमबद्ध कोशिकाओं को 1,600 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। पाइपिंग द्वारा, सेल गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें।
  14. प्रत्येक नमूने में वॉश माध्यम के 100 μL जोड़ें और हवा के बुलबुले बनाने के बिना कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें। पुन: निलंबित नमूने के 100 μL को कोलेजन-लेपित आधे क्षेत्र 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। प्लेट 1,000-3,000 कोशिकाएं प्रति कुआं।
    नोट: यदि कोशिकाओं को ठीक से पुन: निलंबित नहीं किया जाता है, तो कोशिकाएं झुरमुट में एक साथ चिपक सकती हैं, जो बाद में माइक्रोस्कोपी विश्लेषण को भ्रमित करती हैं।
  15. माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और उनके वितरण, आकार और आकार को नोट करें।
  16. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाएं 2 घंटे के भीतर पालन करेंगी।
    नोट: एकत्र की गई सेल आबादी की शुद्धता की पुष्टि करने की सिफारिश की जाती है, या तो फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण (सॉर्टर पर क्रमबद्ध नमूने का एलिकोट लोड करके और घटनाओं की एक छोटी संख्या को रिकॉर्ड करके) या माइक्रोस्कोपी के बाद प्लेटेड कोशिकाओं के एंटीबॉडी धुंधला करके (पैक्स 7 माउस एमयूएससी के लिए एक परिभाषित मार्कर है, पीडीजीएफआरए माउस एफएपी के लिए एक परिभाषित मार्कर है)। नीचे अनुभाग 7 से शुरू होने पर पैक्स 7 और पीडीजीएफआरए प्रोटीन स्तरों के लिए कोशिकाओं के धुंधला होने के लिए एक प्रोटोकॉल है।

6. ईडीयू निगमन परख

नोट: बाँझ परिस्थितियों में काम करें और निम्नलिखित चरणों के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) को संभालते समय रासायनिक फ्यूम हुड का उपयोग करें। ईडीयू डीएनए में शामिल एक न्यूक्लियोटाइड एनालॉग है क्योंकि कोशिकाएं सेल चक्र के एस-चरण से गुजरती हैं। यह उच्च सांद्रता पर म्यूटाजेनिक है। ईडीयू को संभालते समय हमेशा दस्ताने पहनें। ईडीयू कचरे से निपटने के लिए स्थानीय दिशानिर्देशों की जांच करें।

  1. ईडीयू पल्स (दिन 1)
    1. एक ताजा धोने के माध्यम में 2x EdU का एक कार्यशील समाधान तैयार करें।
    2. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ 96-वेल प्लेट को बाहर निकालें। संगम की निगरानी के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। लामिनर प्रवाह हुड में जाएं।
    3. पाइपिंग द्वारा प्लेट से 50 μL मध्यम निकालें। 2x EdU कार्यशील समाधान के 50 μL जोड़ें ताकि कुएं में अंतिम मात्रा 100 μL हो।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इच्छित अवधि के लिए ईडीयू की उपस्थिति में कोशिकाओं को कल्चर करें।
      नोट: ईडीयू पल्स का समय और अवधि अलग-अलग हो सकती है। औसतन, क्विसेंट एमयूएससी को अपने पहले सेल डिवीजन19 को पूरी तरह से सक्रिय करने और पूरा करने में 2 दिन लगते हैं। चढ़ाना के तुरंत बाद ईडीयू को क्रमबद्ध कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है।
  2. निर्धारण (दिन 2)
    नोट: पीएफए एक कार्सिनोजेन है। पीएफए को हमेशा सावधानी से संभालें। पीएफए को संभालने और कचरे के निपटान के लिए स्थानीय नियमों से परिचित हों।
    1. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ 96-वेल प्लेट को बाहर निकालें। माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और प्लेट को फ्यूम हुड में ले जाएं।
    2. पाइपिंग करके, माध्यम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 4% पीएफए के 50 μL जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। एक रासायनिक फ्यूम हुड में कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    3. पीएफए को एक पिपेट के साथ निकालें और इसे एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में फेंक दें।
    4. सभी कुओं में पीबीएस के 100 μL जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। पाइपिंग करके, पीबीएस को एस्पिरेट करें और धोने को दोहराएं। कोशिकाओं को पीबीएस के 100 μL में रखें।
      नोट: किसी भी कोशिका को धोने से बचने के लिए, पीबीएस को धीरे-धीरे पाइप करके कुएं के किनारे पर वितरित करें।
  3. EdU लेबलिंग
    1. पीबीएस को हटाकर और पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के 100 μL जोड़कर ईडीयू का पता लगाने से पहले कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: ट्राइटन एक्स -100 एक सर्फेक्टेंट है और त्वचा में जलन पैदा कर सकता है। सावधानी के साथ संभालें और हमेशा दस्ताने का उपयोग करें।
    2. 5 मिनट के बाद, ट्राइटन एक्स -100 को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 100 μL जोड़ें।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक ईडीयू क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
    4. पीबीएस को एस्पिरेट करें और ईडीयू क्लिक-केमिस्ट्री प्रतिक्रिया मिश्रण के 33 μL जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    5. एडीयू क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया मिश्रण को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 100 μL के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    6. पीबीएस को एस्पिरेट करें, होचस्ट (1: 2,000) के साथ पीबीएस के 100 μL जोड़ें, और आरटी पर 10 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित इनक्यूबेट करें।
    7. होचस्ट को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 100 μL जोड़कर दो बार धो लें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के 100 μL में कोशिकाओं को स्टोर करें।
    8. एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर कोशिकाओं की छवि। कोशिकाओं को महीनों तक अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि कुएं सूख न जाएं।
      नोट: एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सह-दाग देना संभव है। इस मामले में, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद एक अवरुद्ध चरण के साथ आगे बढ़ें। संयुग्मित फ्लोरोफोरे के साथ एक द्वितीयक एंटीबॉडी का चयन करें जिसका उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ईडीयू का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरे के साथ ओवरलैप नहीं होता है। सुनिश्चित करें कि होचस्ट की वर्णक्रमीय सीमा के साथ ओवरलैपिंग फ्लोरोफोरेस के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग न करें।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा धारा 6 से स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है। अनुभाग 6 को छोड़ते समय, कृपया नीचे दिए गए चरण 7.2 के साथ जारी रखने से पहले सेल परमेबिलाइजेशन को सक्षम करने के लिए चरण 6.3.1 और 6.3.2 निष्पादित करें।

  1. ईडीयू-लेबल कोशिकाओं वाली प्लेट को बाहर निकालें।
  2. 18 एमएल पीबीएस में 2 एमएल गधे सीरम जोड़कर 20 एमएल ब्लॉकिंग बफर तैयार करें।
  3. निरर्थक एंटीबॉडी बाइंडिंग को रोकने के लिए, प्रत्येक कुएं से पीबीएस के 100 μL निकालें और p200 पिपेट के साथ ब्लॉकिंग बफर के 50 μL जोड़ें। प्लेट को आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित और एल्यूमीनियम पन्नी में कवर किया जाए ताकि फ्लोरोफोर-लेबल ईडीयू के फोटोब्लीचिंग को रोका जा सके।
    नोट: कोशिकाओं को कुएं के तल पर तय किया जाता है, लेकिन पाइपिंग करते समय बहुत अधिक बल लागू होने पर अलग हो सकते हैं।
  4. नमूनों को अवरुद्ध करते समय, प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। माउस एंटी-पैक्स 7 और खरगोश एंटी-पीडीजीएफआरए के 8.0 μL (1:100) को 16 कुओं (आठ ऊतकों, दो सेल प्रकार) को दागने के लिए 800 μL ब्लॉकिंग बफर में जोड़ें।
  5. अवरुद्ध करने के बाद, गधे के सीरम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 50 μL जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में कवर किए गए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें और प्रत्येक कुएं में ट्राइटन के 50 μL (पीबीएस में 0.5%) जोड़ें। अनबाउंड एंटीबॉडी को धोने के लिए, प्रकाश से संरक्षित आरटी पर 5 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। धोने को तीन बार दोहराएं।
  7. द्वितीयक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण को गधे एंटी-माउस-एलेक्सा 647 और गधे एंटी-खरगोश-एलेक्सा 555 के 1.0 μL (1:1,000) को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़कर तैयार करें, जिसमें ब्लॉकिंग बफर के 1,000 μL होते हैं।
  8. प्रत्येक कुएं में द्वितीयक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण के 33 μL जोड़ें। प्रकाश से संरक्षित आरटी पर 60 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  9. पाइपिंग द्वारा अतिरिक्त द्वितीयक एंटीबॉडी को हटा दें, ट्राइटन के 50 μL (पीबीएस में 0.1%) जोड़ें, और प्रकाश से संरक्षित आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। धोने को तीन बार दोहराएं।
  10. अंत में, पीबीएस के 100 μL जोड़ें। तय करें कि क्या एक ठंडा सीसीडी कैमरे के साथ उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्लेट को तुरंत छवि बनाना है, या प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करना है जब तक कि प्लेट के किनारों को पैराफिल्म के साथ सील करके और एल्यूमीनियम पन्नी में सील प्लेट को लपेटकर बाद में विश्लेषण न किया जाए।

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Representative Results

व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशी अलगाव (चित्रा 2) के लिए प्रोटोकॉल के बाद, ग्रैसिलिस, टीए, ईडीएल, जीए, सोलस, ट्राइसेप्स, मैसेटर और डायाफ्राम मांसपेशियों को तीन स्विस नर आउटब्रेड चूहों से अलग किया गया था जिन्हें स्थानीय प्रजनन कार्यक्रम से बंद कर दिया गया था (चित्रा 2)। ऊतक पृथक्करण और एंटीबॉडी धुंधला होने के बाद, व्यक्तिगत मांसपेशियों से एमयूएससी और एफएपी को एफएसीएस (चित्रा 3) द्वारा शुद्ध किया गया था। कोशिकाओं की पहचान करने और सिंगल्स को डबल्स से अलग करने के लिए एक बिना दाग वाले नमूने के साथ प्रारंभिक गेटिंग प्राप्त की गई थी (चित्रा 3 ए)। धुंधला थ्रेसहोल्ड (चित्रा 3 बी) की पहचान करने के लिए एफएमओ नियंत्रण का उपयोग करके बाद के गेट सेट किए गए थे। दाग वाले नमूने को तब सीडी 31/सीडी 45-एफआईटीसी और एससीए 1-पैकब्लू के लिए गेट किया गया था। एससीए1+/सीडी31-/सीडी45-जनसंख्या (एफएपी) को एक अलग संग्रह ट्यूब में क्रमबद्ध किया गया था, जबकि दोहरी नकारात्मक आबादी को वीसीएएम 1-पीईसी7 और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) के लिए गेट और प्लॉट किया गया था। VCAM1+ जनसंख्या (MUSCs) को एक अलग संग्रह ट्यूब में क्रमबद्ध किया गया था। एमयूएससी और एफएपी को सिंगल्स के प्रतिशत के रूप में निर्धारित किया गया था (तालिका 3) और वॉश माध्यम के 500 μL वाले अलग-अलग संग्रह ट्यूबों में क्रमबद्ध किया गया था। डायाफ्राम और ट्राइसेप्स मांसपेशी एकल-कोशिका निलंबन में एफएपी की तुलना में एमयूएससी की अधिक सापेक्ष बहुतायत होती है, जबकि अन्य एकल-सेल निलंबन में एमयूएससी की तुलना में एफएपी की अधिक सापेक्ष बहुतायत होती है (तालिका 3)।

क्रमबद्ध कोशिकाओं में से, 1,000-3,000 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए बीज और इनक्यूबेट किया गया था। 24 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को हटा दिया गया और ईडीयू युक्त एक ताजा माध्यम के साथ बदल दिया गया। कोशिकाओं को 48 घंटे पर तय किया गया था, ईडीयू के लिए दाग दिया गया था, और बाद में पैक्स 7 प्रोटीन या पीडीजीएफआरए प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ, और एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इमेजजे में फिजी प्लगइन का उपयोग करके छवियों को परिमाणित किया गया था। मजबूत ईडीयू धुंधलापन देखा गया था, हालांकि दो स्टेम सेल प्रकारों और विभिन्न मांसपेशियों के लिए ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं का अंश अलग था (चित्रा 4 ए-सी)। ईडीएल या जीए से अलग किए गए एमयूएससी ने टीए, डायाफ्राम, ग्रैसिलिस, या ट्राइसेप्स से अलग किए गए एमयूएससी की तुलना में काफी कम ईडीयू निगमन दिखाया, जबकि मासेटर और सोलस से अलग किए गए एमयूएससी बीच में आते हैं और किसी भी समूह से काफी अलग नहीं होते हैं (चित्रा 4 ए, बी)। यह हमारे पिछले परिणामों22 के अनुरूप है। इसके अलावा, जिन ऊतकों से एमयूएससी उच्च ईडीयू निगमन स्तर दिखाते हैं, वे वही ऊतक हैं जिनसे एमयूएससी को पहले पैक्स 3 प्रोटीन22 के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए दिखाया गया था। ईडीएल से अलग किए गए एफएपी ने जीए और सोलस से अलग एफएपी की तुलना में काफी कम ईडीयू निगमन दिखाया, जबकि टीए से अलग एफएपी ने सोलस से अलग एफएपी की तुलना में काफी कम ईडीयू निगमन दिखाया (चित्रा 4 ए, सी)। यह अलगाव के लिए विभिन्न ऊतकों से मांसपेशियों को पूल करने के बजाय व्यक्तिगत ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं का विश्लेषण करने के महत्व को रेखांकित करता है। सभी ऊतकों के लिए, ईडीयू पॉजिटिव एमयूएससी का औसत अंश ईडीयू-पॉजिटिव एफएपी के औसत अंश की तुलना में अधिक था, यह सुझाव देते हुए कि एमयूएससी दी गई स्थितियों में तेजी से सक्रिय होते हैं।

अंत में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग (चित्रा 4 डी) के साथ सेल शुद्धता की पुष्टि की गई थी। औसतन, 97.71% (± 1.38%) एमयूएससी ने पैक्स 7 प्रोटीन के लिए सकारात्मक दाग लगाया, और 88.16% (±6.35%) एफएपी ने पीडीजीएफआरए प्रोटीन के लिए सकारात्मक दाग दिया, जो हमारे स्टेम सेल अलगाव प्रक्रिया की विशिष्टता की पुष्टि करता है (चित्रा 4 डी)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध सार। प्रोटोकॉल के दो मुख्य खंडों को दर्शाने वाला योजनाबद्ध, एमयूएससी अलगाव (ऊपरी पैनल), क्विसेंस परख (निचला पैनल), और उनमें से प्रत्येक में उपयोग की जाने वाली पद्धति के प्रमुख चरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मांसपेशियों का स्थान और अलगाव। (ए) प्रत्येक मांसपेशी के स्थान को दर्शाने वाली एक योजना। (B-S) (बी-डी) ग्रैसिलिस, (ई-जी) टीए / ईडीएल, (एच-जे) ट्राइसेप्स, (के-एम) जीए / सोलस, (एन-पी) मासेटर, और (क्यू-एस) डायाफ्राम मांसपेशियों के लिए मांसपेशियों के अलगाव का प्रदर्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डायाफ्राम मांसपेशी नमूने में एमयूएससी और एफएपी को पहचानने और सॉर्ट करने के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति। कोशिकाओं की पहचान सेल आकार (फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी)) और ग्रैन्यूलैरिटी (साइड स्कैटर (एसएससी)) के आधार पर की जाती है। सिंगल्स का चयन एफएससी-ए और एफएससी-डब्ल्यू के आधार पर किया जाता है। वंश-कोशिकाओं को एमयूएससी (वंशावली-/वीसीएएम1+) की बाद में पहचान के लिए गेट किया जाता है, और एफएपी (वंशावली-/एससीए1+) कोशिकाओं को एफएपी की पहचान करने के लिए गेट किया जाता है। एक ही गेटिंग रणनीति (ए) एक बिना दाग वाले नियंत्रण, (बी) एफएमओ नियंत्रण (एफएमओ-एससीए 1पैकब्लू, एफएमओ-सीडी 31/45-एफआईटीसी, और एफएमओ-वीसीएएम 1-पीईसी 7), और (सी) एक दाग वाले नमूने पर लागू की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईडीयू धुंधला होने से सेल सक्रियण का परिमाणीकरण। (ए) डायाफ्राम नमूने से एमयूएससी (शीर्ष पैनल) और एफएपी (नीचे पैनल) के ईडीयू धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां। दिखाए गए ईडीयू और होचस्ट (बाएं पैनलों) की मर्ज की गई छवियां, और हरे रंग (ईडीयू, मध्य पैनल) और नीले (होचस्ट, दाएं पैनल) में एकल चैनल हैं। (बी, सी) संकेतित मांसपेशियों के लिए ईडीयू पॉजिटिव (बी) एमयूएससी या (सी) एफएपी के प्रतिशत को दर्शाने वाला बार ग्राफ। प्लॉटेड एसईएम ± माध्य है। प्रत्येक बिंदु एक माउस का प्रतिनिधित्व करता है। दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके ग्राफपैड में सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था, जिसका महत्व * पी < 0.05 और ** पी < 0.01 पर सेट किया गया था। (डी) एमयूएससी मार्कर पैक्स 7 (बाईं ओर) और एफएपी मार्कर पीडीजीएफआरए (दाईं ओर) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ एमयूएससी (शीर्ष पैनल) और एफएपी (नीचे पैनल) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलाहोना। दिखाए गए चित्रों में होचस्ट के साथ पैक्स 7 की एकीकृत छवियां हैं, इसके बाद एकल चैनल, और पीडीजीएफआरए की छवियों को होचस्ट के साथ विलय किया गया है, इसके बाद एकल चैनल हैं। N = 3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समाधान अभिकर्मकों राशि 
धोने का माध्यम एफ -10 पोषक तत्व मिश्रण (हैम) (1x), + एल-ग्लूटामाइन 445 एमएल
घोड़े का सीरम 50 एमएल
पेन/स्ट्रेप 5 एमएल
पृथक्करण बफर (पहला पाचन) कोलेजनेस टाइप II 650 U/mL
धोने का माध्यम 100 एमएल
डिस्पेस स्टॉक (दूसरा पाचन) पीबीएस में डिस्पेस। 11 U/mL
कोलेजनेस स्टॉक (दूसरा पाचन) पीबीएस में कोलेजनेस टाइप द्वितीय। 1000 U/mL
पीबीएस 1x पीबीएस 10 एक्स पाउडर केंद्रित 9.89 g/L
आटोक्लेव/बाँझ पानी 1 L
अम्लीय पानी विश्लेषण के लिए ग्लेशियल एसिटिक एसिड (100%) निर्जल। 5.15 एमएल
आटोक्लेव/बाँझ पानी 895 एमएल
कोलेजन समाधान (0.002%) बछड़े की त्वचा से कोलेजन 20 एमएल
अम्लीय पानी 800 एमएल
ट्राइटन एक्स -100 ट्राइटन एक्स -100 0.5% (v/v)
पीबीएस 1x 99.5%
बफर ब्लॉक करना पीबीएस 1x 18 एमएल
गधे का सीरम 2 मिलीलीटर

तालिका 1: व्यंजनों की तालिका।

नमूना संख्या. नाम 
1 बिना दाग वाला।
2 प्रतिदीप्ति माइनस VCAM1-PeCy7
3 फ्लोरेसेंस माइनस एससीए 1-पैसिफिकब्लू
4 फ्लोरेसेंस माइनस CD31/45-FITC
5 प्रायोगिक दाग (सभी चार एंटीबॉडी)

तालिका 2: छंटाई से पहले प्रत्येक ऊतक के लिए तैयार किए गए धुंधलापन, नियंत्रण और नमूने का अवलोकन।

ऊतक एंटीबॉडी मिश्रण कोशिकाएँ सिंगलेट्स Lin neg अक्सर पूछे जाने वाले एमयूएससी
मध्यपट बिना दाग के। 100% 82% 55% 0.5% 0.0%
FMO Sca1-PacBlue 100% 83% 19% 0.3% 4.3%
FMO CD31/45-488 100% 84% 40% 9.4% 5.6%
FMO Vcam1-PeCy7 100% 78% 20% 5.6% 0.0%
दाग 100% 77% 19% 2.4% 3.8%
ग्रेसिलिस दाग 100% 96% 11% 2.6% 1.4%
शुक्रिया दाग 100% 88% 16% 2.8% 2.2%
EDL दाग 100% 86% 26% 19.2% 0.8%
सोलस दाग 100% 91% 41% 13.3% 1.1%
जीए दाग 100% 94% 51% 6.1% 1.5%
Triceps दाग 100% 92% 30% 2.6% 4.5%
मालिश करने वाला दाग 100% 85% 27% 19.3% 2.6%

तालिका 3: एफएसीएस डेटा में सापेक्ष सेल प्रकार बहुतायत का अवलोकन।

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Discussion

अच्छी पैदावार प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल के निष्पादन में कई कदम महत्वपूर्ण हैं। थोक अलगाव प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली मांसपेशियों की मात्रा की तुलना में व्यक्तिगत मांसपेशियों में एक छोटी मात्रा होती है। इससे विच्छेदन के दौरान मांसपेशियों के सूखने का खतरा होता है, जिससे उपज कम हो जाती है। इसे रोकने के लिए, विच्छेदन के तुरंत बाद मांसपेशियों में माध्यम जोड़ना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यदि विच्छेदन में अधिक समय लग रहा है, तो मांसपेशियों के हवा के संपर्क में आने के समय को कम करने के लिए एक समय में त्वचा को एक अंग से हटाया जा सकता है। छोटी मात्रा के परिणामस्वरूप अति-पाचन का खतरा भी बढ़ जाता है। इसका मुकाबला करने के लिए, वर्तमान विधि में कोलेजनेस II एंजाइम की कम मात्रा और थोक मांसपेशी प्रोटोकॉल 9,16 की तुलना में कम पाचन समय की आवश्यकता होती है। एंजाइमेटिक पाचन भी एंजाइमों की शुद्धता पर निर्भर करता है, और कम शुद्धता उपज को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। इसके अलावा, यांत्रिक पाचन महत्वपूर्ण है। अपर्याप्त कटाई के मामले में, घटी हुई सतह क्षेत्र एंजाइमेटिक पाचन में बाधा डालेगा और स्टेम सेल उपज को कम करेगा। बहुत अधिक काटने के मामले में, बढ़ी हुई सतह क्षेत्र अति-पाचन का कारण बनेगा और स्टेम सेल उपज को कम करेगा। हिलाने वाला पानी स्नान पची हुई मांसपेशियों की वर्षा को रोकता है, एंजाइम के वितरण में सुधार करता है, और एक सजातीय तापमान बनाने में सहायता करता है, पूरी तरह से कम इनक्यूबेशन समय को सक्षम करता है। इसलिए, वर्तमान विधि अन्य तरीकों की तुलना में इनक्यूबेशन समय की महत्वपूर्ण कमी की अनुमति देती है।

यह प्रोटोकॉल सेल पृथक्करण और शुद्धिकरण पर निर्भर करता है। ये प्रक्रियाएं ऊतक की चोट की नकल करती हैं, जो स्टेम कोशिकाओं को सक्रिय करती हैं। लगातार, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एमयूएससी अलगाव प्रक्रिया27,28,29,30 के दौरान अपने जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों को बदलते हैं। नतीजतन, शुद्ध स्टेम सेल जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के मामले में विवो में कोशिकाओं से अलग हैं। प्रोटोकॉल में एक दूसरा सीमित कारक एफएसीएस पर इसकी निर्भरता है, जिसके लिए महंगे उपकरणों तक पहुंच की आवश्यकता होती है। एफएसीएस उच्च शुद्धता20 के साथ एक साथ कई सेल आबादी को अलग करने के लिए स्वर्ण मानक है। चुंबकीय मोतियों और माइक्रोबबल का उपयोग करके हालिया प्रगति लागत31,32 में कमी की पेशकश करती है, लेकिन क्या वे एकल मांसपेशियों पर काम करने के लिए तुलनीय पैदावार प्रदान करते हैं, यह निर्धारित करने की आवश्यकता है। अंत में, मांसपेशियों के छोटे आकार के कारण प्रोटोकॉल की उपज सीमित है, इस प्रकार संभावित डाउनस्ट्रीम परख पर प्रतिबंध है।

पिछले अध्ययनों ने सेल उपज को अधिकतम करने के लिए एमयूएससी और / या एफएपी को अलग करते समय विभिन्न मांसपेशियों को इकट्ठा करने पर भरोसा किया है। हालांकि, यह विभिन्न मांसपेशियों के बीच स्टेम सेल व्यवहार और कार्य में किसी भी ऊतक-विशिष्ट अंतर का औसत है। वर्तमान प्रोटोकॉल स्टेम सेल फ़ंक्शन के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत मांसपेशियों से एमयूएससी और एफएपी के अलगाव को सक्षम बनाता है। डाउनस्ट्रीम परख के एक उदाहरण के रूप में, स्टेम सेल सक्रियण को ईडीयू निगमन द्वारा परख लिया गया था, जिससे पता चला कि विभिन्न ऊतकों से स्टेम सेल अलग-अलग सक्रियण कैनेटीक्स प्रदर्शित करते हैं। पिछले कार्यों में, अन्य डाउनस्ट्रीम परखों का उपयोग करने की व्यवहार्यता दिखाई गई है; इन परखों के लिए छोटी सेल संख्याओं की आवश्यकता होती है, जैसे कि स्मार्टसेक 2 सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण, सेल प्रत्यारोपण, माइक्रोफ्लुइडिक पीसीआर, और क्लोनल विस्तार परख 22,33,34,35।

निष्कर्ष में, यह प्रोटोकॉल एमयूएससी और एफएपी को अलग करने और अध्ययन करने के लिए व्यक्तिगत मांसपेशियों के विच्छेदन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यह रणनीति प्रयोगों को स्वास्थ्य और बीमारी में विभिन्न मांसपेशियों में स्टेम सेल फ़ंक्शन की बेहतर समझ हासिल करने में सक्षम करेगी।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं और हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

सेल सॉर्टिंग एफएसीएस कोर सुविधा, आरहुस विश्वविद्यालय, डेनमार्क में की गई थी। Biorender.com का उपयोग करके आंकड़े बनाए गए थे। हम खरगोश एंटी-पीडीजीएफआरए एंटीबॉडी साझा करने के लिए डॉ जे फारुप को धन्यवाद देते हैं। इस काम को ईपी के लिए एयूएफएफ शुरुआती अनुदान और नोवोनॉर्डिस्क फोन्डेन से ईपी (0071113) और एडीएम (0071116) को स्टार्ट पैकेज अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 72.706.700 1.5 mL tube
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.554.502 15 mL tube
5 mL polystyrene round-bottom tube Falcon, Fisher Scientific  352054 FACS tube without strainer cap
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap Falcon, Fisher Scientific   352235 FACS tube with strainer cap
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) VWR collection 525.0946 5 mL tube
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.547.254 50 mL tube
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387458 (Cat # A31572)
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2420713 (Cat#A31571)
ARIA 3 BD FACS, Core facility Aarhus University
Centrifuge 5810 eppendorf EP022628188 Centrifuge
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387287 (Cat# C10337) Cell Proliferation Kit
Collagen from calf-skin  Bioreagent, Sigma Aldrich  Source: SLCK6209 (Cat# C8919)
Collagenase type II Worthington, Fisher Scientific  Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) Collagenase
Dispase Gibco, Fisher Scientific  Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) Dispase
Donkey serum (non-sterile) Sigma Aldrich, Merck Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)
Dumont nr. 5, 110 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.327 Straight forceps with fine tips
Dumont nr. 7, 115 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.335 Curved forceps
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2453614 (cat# 31550-023)
FITC anti-mouse CD31 BioLegend, NordicBioSite MEC13.3 (Cat # 102506)
FITC Anti-mouse CD45 BioLegend, NordicBioSite 30-F11 (Cat# 103108)
Glacial acetic acid (100%) EMSURE, Merck   K44104563 9Cat # 1000631000)
Head over head mini-tube rotator  Fisher Scientific  15534080 (Model no. 88861052) Head over head mini-tube rotator
Horse serum Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2482639 (cat# 10368902 )
Isotemp SWB 15 FisherBrand, Fisher Scientific 15325887 Shaking water bath
MS2 mini-shaker  IKA  Vortex unit
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) BD microlance, Fisher Scientific  304827 20G needle 
Neutral formalin buffer 10% CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3945.040 Cell strainer 
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend, NordicBioSite D7 (Cat# 108120)
Pax7 primary antibody DSHB Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)
PBS 10x powder concentrate Fisher BioReagents, Fisher Scientific BP665-1
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) BioLegend, NordicBioSite 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)
Pen/strep Gibco, Fisher Scientific  Lot. 163589 (cat# 11548876 )
Pipette tips p10 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2140-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p1000 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2279-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p20 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2149P-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p200 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2069-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Protective underpad Abena  ACTC-7712  60 x 40cm, 8 layers
Rainin, pipet-lite XLS Mettler Toledo, Thermo Scientific  2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 Pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Recombinant anti-PDGFR-alpha RabMAb, abcam AB134123
Scalpel (shaft no. 3) Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.502 Scalpel
Scalpel blade no. 11 Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.0911 Scalpel
Scanlaf mars Labogene class 2 cabinet: Mars Flow bench
ScanR Olympus Microscope, Core facility Aarhus University
Scissors FST 14568-09
Series 8000 DH Thermo Scientific 3540-MAR Incubator
Serological pipette 10 mL VWR 612-3700 Sterile, non-pyrogenic
Serological pipette 5 mL VWR, Avantor delivered by VWR 612-3702 Sterile, non-pyrogenic
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile  BD Emerald, Fisher Scientific 307731 Syringe
TC Dish 100, standard Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3902 Petri dish 
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 Corning, Sigma Aldrich 3764 96-well Half bottom plate
Triton X-100 Sigma Aldrich, Merck Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)

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References

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व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशियों से क्विसेंट स्टेम सेल आबादी का अलगाव
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