Summary
Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule staminali muscolari e dei progenitori fibro-adipogeni dai singoli muscoli scheletrici nei topi. Il protocollo prevede la dissezione di un singolo muscolo, l'isolamento delle cellule staminali mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza, la valutazione della purezza mediante colorazione con immunofluorescenza e la misurazione quantitativa dell'ingresso in fase S mediante saggio di incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina.
Abstract
Il muscolo scheletrico ospita popolazioni distinte di cellule staminali adulte che contribuiscono all'omeostasi e alla riparazione del tessuto. Le cellule staminali muscolari scheletriche (MuSC) hanno la capacità di creare nuovi muscoli, mentre i progenitori fibro-adipogeni (FAP) contribuiscono ai tessuti di supporto stromale e hanno la capacità di produrre fibroblasti e adipociti. Sia i MuSC che i FAP risiedono in uno stato di uscita prolungata del ciclo cellulare reversibile, chiamato quiescenza. Lo stato quiescente è la chiave della loro funzione. Le cellule staminali quiescenti sono comunemente purificate da più tessuti muscolari riuniti in un singolo campione. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato differenze distinte nei profili molecolari e nella profondità di quiescenza delle MuSC isolate da diversi muscoli. Il presente protocollo descrive l'isolamento e lo studio di MuSCs e FAPs da singoli muscoli scheletrici e presenta strategie per eseguire analisi molecolari dell'attivazione delle cellule staminali. Descrive in dettaglio come isolare e digerire muscoli di diversa origine dello sviluppo, spessori e funzioni, come il diaframma, tricipiti, gracili, tibiale anteriore (TA), gastrocnemio (GA), soleo, estensore digitorum longus (EDL) e muscoli masseteri. MuSCs e FAPs sono purificati mediante selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) e analizzati mediante colorazione a immunofluorescenza e saggio di incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU).
Introduction
Il muscolo scheletrico ha un'elevata capacità di rigenerazione grazie alla presenza di cellule staminali muscolari (MuSC). I MuSC si trovano sulle miofibre, sotto la lamina basale, e risiedono in uno stato quiescente di uscita prolungata e reversibile del ciclo cellulare 1,2,3,4. Dopo la lesione, i MuSC si attivano ed entrano nel ciclo cellulare per dare origine a progenitori amplificatori che possono differenziarsi e fondersi per formare nuove miofibre 2,5. Lavori precedenti hanno dimostrato che i MuSC sono assolutamente essenziali per la rigenerazione muscolare 6,7,8. Inoltre, un singolo MuSC può attecchire e generare sia nuove cellule staminali che nuove miofibre9. Il muscolo scheletrico ospita anche una popolazione di cellule stromali mesenchimali chiamate progenitori fibro-adipogeni (FAP), che svolgono un ruolo cruciale nel sostenere la funzione MuSC durante la rigenerazione muscolare 6,10,11,12.
Grazie al loro potenziale di coordinare la rigenerazione muscolare, c'è stato un enorme interesse nella comprensione di come funzionano MuSC e FAP. Le MuSC quiescenti sono caratterizzate dall'espressione dei fattori di trascrizione Pax7 e Sprouty1 e del recettore della calcitonina della proteina di superficie cellulare, mentre le FAP quiescenti sono marcate dal recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine della proteina di superficie cellulare (PDGFRa)10,12,13,14,15 . Studi precedenti hanno dimostrato che MuSC e FAP potrebbero essere purificati dai muscoli scheletrici utilizzando marcatori di superficie cellulare e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Mentre questi protocolli hanno notevolmente migliorato la capacità di studiare MuSC e FAP, uno svantaggio è che la maggior parte di questi protocolli richiede l'isolamento dei MuSC da un pool di diversi tessuti muscolari. Recenti lavori da noi e da altri hanno rivelato differenze nel fenotipo cellulare e nei livelli di espressione genica tra MuSC isolati da diversi tessuti22,23. I MuSC dal diaframma, tricipiti e gracili mostrano un'attivazione più rapida rispetto ai MuSC dai muscoli degli arti posteriori inferiori22, mentre i MuSC dal muscolo extraoculare mostrano una differenziazione più rapida rispetto ai MuSC dal diaframma e dai muscoli degli arti posteriori inferiori23.
Questo protocollo descrive l'isolamento di MuSC e FAP dai singoli muscoli scheletrici (Figura 1). Ciò include la dissezione del diaframma, tricipiti, gracili, tibiale anteriore (TA), soleo, estensore digitorum longus (EDL), gastrocnemio (GA) e muscoli masseteri. I muscoli sezionati vengono successivamente dissociati dalla digestione enzimatica utilizzando la collagenasi II (una proteasi che colpisce specificamente la sequenza aminoica Pro-X-Gly-Pro nel collagene, consentendo la degradazione del tessuto connettivo e la dissociazione dei tessuti24) e la dispasi (una proteasi che fende la fibronectina e il collagene IV, consentendo un'ulteriore dissociazione cellulare25). MuSC e FAP sono isolati dalle sospensioni a cella singola mediante FACS. Come esempi di saggi a valle per l'analisi cellulare, l'attivazione delle cellule staminali è determinata analizzando l'incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), mentre la purezza cellulare è determinata dalla colorazione a immunofluorescenza per i marcatori specifici del tipo cellulare Pax7 e PDGFRa.
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Protocol
Il presente protocollo è stato eseguito in conformità con le linee guida sulla cura degli animali presso l'Università di Aarhus e le normative etiche locali.
NOTA: Assicurarsi di rispettare le normative del comitato etico locale per la sperimentazione animale e la gestione di campioni di roditori post-mortem. I topi sono una potenziale fonte di allergeni; Se disponibile, attivare la ventilazione di scarico e posizionarla sopra lo spazio di lavoro per evitare un'eccessiva esposizione agli allergeni. In alternativa, indossare una maschera facciale se l'esperimento viene eseguito regolarmente. Questo protocollo prevede di lavorare con oggetti taglienti e si raccomanda ai ricercatori di familiarizzare con le procedure e la logistica per applicare il primo soccorso in caso di taglio.
1. Preparazione (1-2 ore; il giorno prima della dissezione)
NOTA: Le soluzioni, le piastre e i mezzi sono preparati in condizioni sterili e filtrati (0,45 μm) prima dell'uso, salvo diversa indicazione. Preparare soluzioni madre di dispasi (11 U/mL in PBS) e collagenasi II (1.000 U/mL in PBS) e conservarle a -20 °C (Tabella 1). Le scorte sono scongelate e utilizzate per la digestione secondaria nella fase 4.2.6.
- Rivestimento di collagene di una piastra semi-area a 96 pozzetti
- Preparare acqua acida. Aggiungere 5,15 ml di acido acetico glaciale a 895 ml di acqua autoclavata in un becher da 2 litri.
- Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante da 0,45 μm, 500 mL. Trasferire 800 ml di acqua acida filtrata in una bottiglia da 1 L.
- Aggiungere 40 ml di soluzione madre di collagene sterile al flacone. Mescolare delicatamente la soluzione agitando e conservare a 4 °C, al riparo dalla luce, fino all'uso.
- Rivestire una o più piastre di mezza area a 96 pozzetti con collagene. Aggiungere 50 μL di soluzione di rivestimento di collagene in ciascun pozzetto e rivestire la piastra per una notte (ON) a 4 °C.
- Aspirare la soluzione di collagene il giorno seguente utilizzando un aspiratore sottovuoto e lavare la piastra 2x aggiungendo 100 μL di acqua autoclavata e aspirando.
- Inclinare il coperchio del piatto e lasciare asciugare il piatto nel cappuccio per 20-30 minuti.
- Quando la piastra è completamente asciutta, avvolgerla in un foglio di alluminio e conservare a 4 °C fino all'uso. Le piastre rivestite possono essere conservate fino a 4 settimane.
NOTA: Il rivestimento di collagene consente l'adesione cellulare. È importante lavare via il collagene libero in quanto potrebbe interferire con la funzione cellulare e la segnalazione (ad esempio, il legame del collagene V ai recettori della calcitonina sui MuSC)26.
2. Preparazione (0,5 ore; il giorno della dissezione):
- Preparazione di soluzioni aggiuntive e spazio di lavoro
- Preparare il mezzo di lavaggio sterile aggiungendo 50 ml di siero per cavalli e 5 ml di penna/streptococco a 445 ml di terreno F10 di HAM. Lavorare in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni.
- Calcolare e pesare la quantità appropriata di collagenasi II necessaria per preparare il tampone di dissociazione. (Per ogni topo, 26.000 unità di collagenasi II vengono utilizzate per produrre 40 ml di tampone di dissociazione a 650 U / mL collagenasi II). Aggiungere la polvere pesata in un tubo conico da 50 ml e conservarla su ghiaccio.
- Preparare due piatti da 10 cm per l'isolamento muscolare. Versare 3 ml di mezzo di lavaggio (Tabella 1) in ciascuna capsula di Petri. Portare i piatti da 10 cm fuori dalla cappa a flusso laminare per un uso successivo.
- Preparare i materiali per la digestione muscolare. In base al numero di campioni, etichettare il numero appropriato di tubi conici da 50 ml (otto per topo, uno per ogni muscolo) e lasciarli sul banco. Spruzzare gli aghi, le siringhe da 10 ml e i filtri cellulari da 40 μm con etanolo al 70% (otto di ciascuno per topo, uno per ogni muscolo) e portarli all'interno del cappuccio a flusso laminare. Attaccare gli aghi alle siringhe.
- Preparare i materiali per lo smistamento. Etichettare tubi inferiori rotondi da 5 mL con tappi filtranti cellulari in base al numero di campioni. Coprire i tubi con un foglio di alluminio e lasciarli nella cappa a flusso laminare.
- In corrispondenza del numero di campioni e popolazioni da selezionare, preparare provette da microcentrifuga da 1,5 ml con 500 μL di terreno di lavaggio per la raccolta delle cellule (16 per topo, una provetta per ogni popolazione cellulare per tessuto muscolare). Conservare questi tubi sul ghiaccio.
3. Dissezione muscolare (20-30 min)
NOTA: Questa sezione del protocollo viene eseguita in un ambiente non sterile. La procedura può essere eseguita utilizzando uno o più topi. Tuttavia, un mouse è sufficiente per preparare sia i campioni per lo smistamento che i controlli per l'impostazione dei cancelli di compensazione e FACS.
- Iniziare l'isolamento muscolare
- Preparare lo spazio di lavoro non sterile per la dissezione e l'isolamento muscolare. Disinfettare la postazione di lavoro con etanolo al 70%. Posizionare un sottocuscinetto protettivo monouso sterile sulla postazione di lavoro.
- Usando un pennarello permanente, disegna una scatola per ogni muscolo sopra un coperchio della piastra di Petri per posizionare successivamente il muscolo isolato.
- Spruzzare gli strumenti chirurgici con etanolo al 70%.
- Eutanasia del topo per inalazione di CO2 e/o lussazione cervicale.
- Isolare i singoli muscoli (da un topo alla volta se si utilizzano più topi). Spruzzare il topo con etanolo al 70% per bagnare il pelo e disinfettare la pelle. Posizionare il mouse sul sottopad con l'addome rivolto verso l'alto. Una panoramica di tutti e otto i muscoli e della loro rispettiva posizione anatomica è mostrata nella Figura 2A.
- Isolare i muscoli gracili
- Utilizzare un paio di forbici per fare un'incisione orizzontale di 0,5 cm nella pelle addominale.
- Rimuovere la pelle: usando entrambe le mani, usa il pollice e l'indice per afferrare la parte superiore e inferiore dell'incisione. Tirare su ciascun lato dell'incisione per strappare e separare la pelle del tronco e degli arti inferiori. Tirare giù la pelle degli arti inferiori per esporre entrambi gli arti posteriori (verso il basso dall'anca alle dita dei piedi). Allo stesso modo, tirare verso l'alto per esporre il busto.
- Individuare il muscolo gracile (interno coscia). Usando una pinza curva, afferrare il gracile e sollevare leggermente il muscolo (Figura 2B). Con le forbici, praticare un'incisione di 0,5 cm (Figura 2C), da cui il gracile viene ritagliato e completamente isolato (Figura 2D). Ripeti questo per l'altra gamba per isolare il secondo muscolo gracilis.
- Isolare i muscoli TA e EDL (arto posteriore inferiore, lato ventrale)
- Usando un bisturi, tagliare la fascia facendo un'incisione di 0,5 cm lungo il lato laterale della tibia (l'osso posteriore inferiore più spesso). Usa una pinza curva per afferrare la fascia e tirare per rimuoverla.
NOTA: Quando la fascia è stata completamente rimossa, i tendini all'estremità distale della zampa posteriore sono visibili e possono essere separati. - Utilizzare una pinza dritta con punte superfini per andare tra il tendine distale del TA (lato laterale della tibia) e l'EDL (sotto il TA) (Figura 2E-G).
NOTA: Con l'esperienza, l'estremità smussata di una lama di bisturi può essere utilizzata al posto della pinza dritta. - Far scorrere la pinza verso l'estremità prossimale del muscolo per separare i muscoli.
- Riportare la pinza dritta all'estremità distale. Tagliare il tendine distale.
- Afferrare delicatamente il tendine distale del muscolo con una pinza curva. Sollevare il muscolo verso l'alto e sopra il suo attacco prossimale e tagliare con cura il tendine prossimale il più vicino possibile al suo punto di attacco. Tagliare l'altra estremità e trasferire il TA in una capsula di Petri.
- Utilizzare una pinza dritta con punte superfini per andare sotto il tendine distale dell'EDL.
- Far scorrere la pinza verso l'estremità prossimale del muscolo per separare i muscoli.
- Riportare la pinza dritta all'estremità distale. Tagliare il tendine distale senza danneggiare il muscolo.
- Afferrare delicatamente il tendine distale dell'EDL con una pinza curva. Sollevare il muscolo verso l'alto e sopra il suo attacco prossimale e tagliare con cura il tendine prossimale il più vicino possibile al suo punto di attacco. Tagliare l'altra estremità e trasferire l'EDL in una capsula di Petri. Ripetere l'operazione per l'altro arto posteriore per isolare i secondi muscoli TA e EDL.
- Usando un bisturi, tagliare la fascia facendo un'incisione di 0,5 cm lungo il lato laterale della tibia (l'osso posteriore inferiore più spesso). Usa una pinza curva per afferrare la fascia e tirare per rimuoverla.
- Isolare l'AG e i muscoli solei (arto posteriore inferiore, lato dorsale)
- Usa una pinza dritta con punte superfini per andare tra il tendine di Achille e le ossa degli arti posteriori inferiori.
- Far scorrere la pinza verso l'estremità prossimale del muscolo per separare il muscolo.
- Riportare la pinza dritta all'estremità distale. Tagliare il tendine distale.
NOTA: Per evitare di danneggiare il muscolo soleo, che si trova sotto la GA, tagliare il più vicino possibile al suo attacco distale del tendine di Achille, lasciando un pezzo del tendine attaccato all'AG (Figura 2H). - Per rivelare e isolare il muscolo soleo, tirare il GA su e sopra il perone (l'osso più sottile delle due ossa nell'arto posteriore inferiore).
NOTA: Il muscolo soleo si distingue per il suo caratteristico colore rosso scuro rispetto al GA (Figura 2I). - Individuare il tendine soleo prossimale. Con una pinza dritta, andare tra il soleo e GA.
- Spostare la pinza verso l'estremità distale del muscolo per separare il soleo dal GA.
- Isolare prima il soleo. Taglia il suo tendine prossimale, afferra il tendine con una pinza curva e solleva con attenzione il soleo per accedere al suo tendine distale. Tagliare il tendine distale per isolare il soleo dal GA. Posizionare il soleo nella capsula di Petri con mezzo di lavaggio (Figura 2J)
- Tagliare il GA e metterlo nella capsula di Petri. Ripeti questa operazione per l'altra gamba per isolare il secondo soleo e i muscoli GA.
- Isolare i muscoli tricipiti (arto anteriore superiore, lato dorsale)
- Utilizzare una pinza dritta con punte superfini per andare tra il muscolo tricipite e l'omero (l'osso principale della zampa anteriore superiore) (Figura 2K-M).
- Far scorrere la pinza verso l'estremità prossimale del muscolo per separare il muscolo. Tagliare l'estremità prossimale del muscolo.
- Afferrare l'estremità prossimale del tricipite con una pinza curva e tirarla su e sopra il gomito per accedere al tendine distale. Tagliare il tendine distale del tricipite, trasferire il muscolo in una capsula di Petri e ripetere la procedura per l'altro arto anteriore.
- Isolare i muscoli masseteri
- Rimuovere la pelliccia e la pelle dalla mascella. Fai un'incisione orizzontale di 0,5 cm con le forbici. Usando entrambe le mani, pizzicare su ciascun lato dell'incisione usando il pollice e l'indice. Rimuovere la pelle tirando verso l'alto e verso il basso.
- Individuare il tendine maggiore del massetere (caudale, sotto l'occhio). Inserire la lama piatta del bisturi tra l'osso e il muscolo (Figura 2N). Tagliare il tendine.
- Afferrare il tendine massetere maggiore con una pinza curva. Tagliarlo con una lama di bisturi o forbici nella direzione rostrale per separare il muscolo massetere dall'osso mascellare (Figura 2O, P). Posizionare il muscolo massetere isolato nella capsula di Petri. Ripetere la procedura per il secondo muscolo massetere.
- Isolare il muscolo del diaframma
NOTA: Quando si isola il muscolo del diaframma, assicurarsi di tagliare con cura per evitare di tagliare gli organi interni e l'intestino, poiché questa è una fonte di contaminazione.- Usando le forbici, eseguire una toracotomia (un taglio tra le costole) nel mezzo dello sterno (un lungo osso piatto, situato nel mezzo del torace, che collega le costole) e tagliare lo sterno (Figura 2Q).
- Esporre il diaframma tagliando a 360° attraverso la gabbia toracica.
- Separare la parte superiore del corpo dalla parte inferiore / addome. Usando un paio di forbici, tagliare la trachea, l'esofago, la vena cava e l'aorta addominale.
- Separare il diaframma dalla parte inferiore del corpo. Usando le forbici, fare una laparotomia (un'incisione chirurgica nella cavità addominale) 1 cm sotto lo sterno e fare un taglio a 360 ° (Figura 2R).
- Posizionare le forbici chiuse tra la gabbia toracica e gli organi addominali e premere verso il basso. Tirare delicatamente la gabbia toracica per separarla dagli organi addominali (Figura 2S).
- Separare il diaframma dalla gabbia toracica. Tenere liberamente il diaframma tra due dita e tagliare la gabbia toracica con le forbici. Utilizzare le forbici per tagliare il diaframma il più vicino possibile alle costole in un taglio a 360°. Posizionare il diaframma isolato in una capsula di Petri.
NOTA: Durante la dislocazione cervicale, il diaframma potrebbe rompersi e collassare contro la gabbia toracica, rendendolo difficile da localizzare. Il muscolo può ancora essere isolato. Identifica il muscolo collassato, tienilo tra due dita e taglia a 360 ° seguendo la gabbia toracica.
4. Digestione muscolare a sospensione unicellulare (~1 h 35 min)
NOTA: i seguenti passaggi includono ambienti di lavoro non sterili (passaggi 4.1-4.2) e sterili (passaggio 4.3).
- Digestione meccanica
- Posizionare i muscoli isolati nel coperchio di una capsula di Petri di 10 cm.
- Usando una pinza curva, afferra i muscoli isolati uno per uno. Per il soleo e GA, rimuovere le parti rimanenti del tendine di Achille.
- Usando le forbici, tritare i muscoli isolati uno per uno tagliandoli in circa 1 mm3 pezzi.
- Digestione enzimatica
- Preparare il tampone di dissociazione muscolare aggiungendo 40 ml di terreno di lavaggio a freddo alla polvere di collagenasi II pesata (collagenasi II: 650 U/mL in mezzo di lavaggio).
NOTA: Utilizzare tampone di dissociazione muscolare appena preparato per garantire un'attività enzimatica ottimale. - Trasferire i muscoli tritati in un tubo conico da 15 mL contenente 5 mL di tampone di dissociazione.
- Incubare il tubo per 35 minuti a bagnomaria a 37 °C a 60 giri/min.
- Dopo l'incubazione, aggiungere il mezzo di lavaggio a un volume totale di 15 ml. Ruotare il tubo a 1.600 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante fino a un volume di 4 ml utilizzando un aspiratore a vuoto. Per evitare di disturbare il pellet, aspirare lentamente dall'alto e rimuovere il grasso galleggiante.
- Aliquote di stock di dismalgelo di dispasi e collagenasi II. Aggiungere 500 μL della soluzione di collagenasi II (1.000 U/mL di stock, -20 °C) ai restanti 4 mL di campione. Quindi, aggiungere 500 μL della soluzione di dispase (11 U/mL di stock, -20 °C).
NOTA: Dispase può generare un precipitato. In tal caso, ruotare la soluzione madre di dispase a 10.000 x g, 1 minuto prima dell'uso. Trasferire il surnatante ormai chiaro alla sospensione cellulare senza disturbare il pellet. - Vortice brevemente i campioni per sciogliere il pellet.
- Incubare i campioni per 20 minuti a bagnomaria a 37 °C a 60 giri/min.
NOTA: Digerire un gran numero di campioni muscolari richiede molto tempo. Per le fasi 4.3.1-4.3.6, stimare di prendere 2-5 minuti per campione. Questo passaggio va più veloce se eseguito in parallelo da due o più ricercatori.
- Preparare il tampone di dissociazione muscolare aggiungendo 40 ml di terreno di lavaggio a freddo alla polvere di collagenasi II pesata (collagenasi II: 650 U/mL in mezzo di lavaggio).
- Omogeneizzazione dei campioni
- Omogeneizzare la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione dal tubo da 15 mL a un tubo da 50 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml con un ago da 20 G per risospendere il campione tirando il campione su e giù attraverso l'ago 5 volte.
NOTA: Se pezzi di muscolo non digerito ostruiscono l'ago, pulirli su un fazzoletto di carta. - Posizionare un filtro cellulare da 40 μm su un nuovo tubo conico da 50 ml.
- Prelevare l'intera sospensione cellulare nella siringa e filtrare il campione in un nuovo tubo conico da 50 mL con un filtro cellulare sulla parte superiore. Filtrare il campione erogando il volume totale direttamente sul filtro.
- Per recuperare tutte le celle mononucleate, aggiungere 20 mL del mezzo di lavaggio al tubo conico vuoto e versarli attraverso il filtro cellulare nel tubo conico da 50 mL contenente il campione filtrato. Recuperare il volume rimanente sotto il filtro cellulare con una pipetta p1000.
- Eliminare il filtro cellulare e ruotare il campione a 1.600 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Mediante pipettaggio con una pipetta p1000, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.
- Mediante pipettaggio con una pipetta p1000, risospendere il pellet del diaframma in 500 μL del mezzo di lavaggio e risospendere gli altri campioni muscolari in 300 μL del mezzo di lavaggio ciascuno.
NOTA: Il diaframma è il più grande dei muscoli con il più alto contenuto di cellule staminali e può quindi essere utilizzato per le colorazioni di controllo.
- Omogeneizzare la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione dal tubo da 15 mL a un tubo da 50 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml con un ago da 20 G per risospendere il campione tirando il campione su e giù attraverso l'ago 5 volte.
5. Colorazione e selezione (~40 min + 30 min sort/sample)
NOTA: Lavorare in un ambiente sterile su ghiaccio per i seguenti passaggi.
- Trasferire un'aliquota di 50 μL della sospensione della cella del diaframma in quattro nuove provette da microcentrifuga da 2 mL per le colorazioni di controllo (50 μL ciascuna). Aggiungere 250 μL del mezzo di lavaggio a ciascun tubo di controllo fino a un volume finale di 300 μL.
- Aggiungere 3 μL (1:100) degli anticorpi di fluorescenza meno uno (controllo FMO) ai tre tubi di colorazione di controllo e lasciare una provetta senza anticorpi (controllo non colorato) (vedere Tabella 2).
- Aggiungere 3 μL (1:100) degli anticorpi (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC e SCA1-PacificBlue) alle restanti sospensioni muscolari a singola cellula, incluso il campione di diaframma rimanente.
- Incubare le sospensioni cellulari per 15 minuti a 4 °C in uno shaker testa a testa.
NOTA: Le colorazioni di controllo sono necessarie per determinare i livelli di fluorescenza di fondo e impostare le porte per la citometria a flusso. Possono essere utilizzati diversi anticorpi, ma ognuno avrà una concentrazione di lavoro specifica e un tempo di incubazione che deve essere testato. Se vengono utilizzati anticorpi di fornitori diversi, la concentrazione, e quindi la diluizione, può variare. Un colorante di vitalità cellulare può essere aggiunto alla miscela colorante per eliminare eventuali cellule morte o morenti durante l'ordinamento. - Centrifugare i campioni a 1.600 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet mediante pipettaggio.
- Mediante pipettaggio con una pipetta p1000, risospendere ciascun campione in 800 μL del mezzo di lavaggio.
- Filtrare i campioni utilizzando una provetta FACS con un cappuccio filtrante cellulare (40 μm) per rimuovere eventuali grumi di cellule rimanenti (o aggregati).
- Lavare il filtro cellulare aggiungendo altri 800 μL del mezzo di lavaggio.
- Conservare i campioni coperti con un foglio di alluminio sul ghiaccio fino all'analisi.
NOTA: Se a questo punto la sospensione cellulare appare torbida/densa a causa dell'elevata concentrazione di cellule, aggiungere altri 800 μL del mezzo di lavaggio per diminuire la densità cellulare. - Avviare il FACS con un ugello da 70 μm.
- Utilizzare i controlli unstained e FMO per impostare la strategia di gating: i MuSC sono negativi per CD45-FITC, CD31-FITC e SCA1-PacBlue e sono positivi per VCAM1-PECy7; I FAP sono negativi per CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 e positivi per SCA1-PacBlue.
- Smistare le sospensioni monocellulari colorate utilizzando la selezione bidirezionale e raccogliere i MuSC e i FAP in provette di raccolta differenziata contenenti 500 μL del mezzo di lavaggio.
NOTA: Utilizzando FACS con quattro laser (configurazione: ugello da 70 μm, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm), la combinazione scelta di fluorofori non richiede la compensazione del segnale di fluorescenza. Tuttavia, se si utilizza un citometro a flusso diverso o una diversa combinazione di fluorofori, si raccomandano ulteriori campioni di controllo a colorazione singola per la compensazione. Dai muscoli più piccoli (EDL, soleo, TA), ci si possono aspettare rendimenti di 3.000 MuSC e 5.000 FAP. Per gli altri muscoli più grandi, sono prevedibili rendimenti di 20.000 MuSC e FAP. I conteggi degli eventi elencati dal software FACS possono differire dal numero effettivo di celle vitali nella provetta di raccolta. Il numero di cellule può essere confermato dal conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. - Ruotare le celle ordinate a 1.600 x g per 5 minuti a 4 °C. Con il pipettaggio, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Aggiungere 100 μL del mezzo di lavaggio a ciascun campione e risospendere accuratamente le celle senza creare bolle d'aria. Trasferire i 100 μL del campione risospeso in una piastra a metà area da 96 pozzetti rivestita di collagene. Piastra 1.000-3.000 celle per pozzetto.
NOTA: Se le cellule non sono correttamente risospese, le cellule possono aderire insieme in grumi, confondendo le successive analisi al microscopio. - Ispezionare le cellule al microscopio e notare la loro distribuzione, forma e dimensione.
- Incubare la piastra a 37 °C, 5% CO2. Le cellule aderiranno entro 2 ore.
NOTA: Si raccomanda di confermare la purezza delle popolazioni cellulari raccolte, sia mediante analisi citometrica a flusso (caricando un'aliquota del campione selezionato sul selezionatore e registrando un piccolo numero di eventi) o mediante colorazione anticorpale delle cellule placcate seguita da microscopia (Pax7 è un marcatore di definizione per i MuSC di topo, PDGFRa è un marcatore di definizione per i FAP di topo). A partire dalla sezione 7 di seguito è riportato un protocollo per la colorazione delle cellule per i livelli di proteine Pax7 e PDGFRa.
6. Saggio di incorporazione EdU
NOTA: Lavorare in condizioni sterili e utilizzare la cappa aspirante chimica durante la manipolazione della paraformaldeide (PFA) per le seguenti fasi. EdU è un analogo nucleotidico incorporato nel DNA mentre le cellule attraversano la fase S del ciclo cellulare. È mutageno ad alte concentrazioni. Indossare sempre i guanti quando si maneggia EdU. Consulta le linee guida locali per la gestione dei rifiuti EDU.
- Impulso EdU (giorno 1)
- Preparare una soluzione di lavoro di 2x EdU in un mezzo di lavaggio fresco.
- Prendi la piastra a 96 pozzetti con le cellule fuori dall'incubatore. Ispezionare le cellule al microscopio per monitorare la confluenza. Spostarsi nella cappa a flusso laminare.
- Rimuovere 50 μL di terreno dalla piastra mediante pipettaggio. Aggiungere 50 μL di soluzione di lavoro 2x EdU in modo che il volume finale nel pozzetto sia di 100 μL.
- Coltura delle cellule in presenza di EdU per il periodo di tempo previsto a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: la tempistica e la durata dell'impulso EdU possono variare. In media, i MuSC quiescenti impiegano 2 giorni per attivare completamente e completare la loro prima divisione cellulare19. EdU può essere aggiunto alle celle ordinate immediatamente dopo la placcatura.
- Fissazione (giorno 2)
NOTA: PFA è cancerogeno. Maneggiare sempre PFA con cura. Familiarizzare con le normative locali per la gestione del PFA e lo smaltimento dei rifiuti.- Prendi la piastra a 96 pozzetti con le cellule fuori dall'incubatore. Ispezionare le cellule al microscopio e spostare la piastra nella cappa aspirante.
- Con il pipettaggio, rimuovere il mezzo e fissare le celle aggiungendo 50 μL di PFA al 4% a ciascun pozzetto. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) in una cappa aspirante chimica.
- Rimuovere il PFA con una pipetta e gettarlo in un contenitore per rifiuti appropriato.
- Lavare le celle aggiungendo 100 μL di PBS a tutti i pozzetti. Con il pipettaggio, aspirare il PBS e ripetere il lavaggio. Mantenere le cellule in 100 μL di PBS.
NOTA: per evitare di lavare le celle, erogare il PBS sul lato del pozzetto pipettando lentamente.
- Etichettatura EdU
- Permeabilizzare le cellule prima del rilevamento dell'EdU rimuovendo il PBS e aggiungendo 100 μL di Triton X-100 allo 0,5% in PBS. Incubare la piastra per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: Triton X-100 è un tensioattivo e può causare irritazione cutanea. Maneggiare con cura e usare sempre i guanti. - Dopo 5 minuti, aspirare Triton X-100 e aggiungere 100 μL di PBS.
- Preparare una miscela di reazione chimica a scatto EdU secondo il protocollo del produttore.
- Aspirare il PBS e aggiungere 33 μL della miscela di reazione chimica a scatto EdU. Incubare la piastra per 30 minuti a RT.
- Aspirare la miscela di reazione click-chimica EdU e lavare le cellule con 100 μL di PBS.
- Aspirare il PBS, aggiungere 100 μL di PBS con Hoechst (1:2.000) e incubare protetto dalla luce per 10 minuti a RT.
- Aspirare l'Hoechst e lavare due volte aggiungendo 100 μL di PBS. Conservare le cellule in 100 μL di PBS a 4 °C al buio.
- Immagina le cellule su un microscopio invertito. Le cellule possono essere conservate al buio per mesi finché i pozzetti non si asciugano.
NOTA: È possibile co-colorare le cellule con anticorpi. In questo caso, procedere con una fase di blocco seguita dall'incubazione con l'anticorpo primario. Selezionare un anticorpo secondario con un fluoroforo coniugato il cui spettro di emissione non si sovrapponga a quello del fluoroforo utilizzato per rilevare EdU. Assicurarsi di non utilizzare anticorpi secondari con fluorofori sovrapposti alla gamma spettrale di Hoechst.
- Permeabilizzare le cellule prima del rilevamento dell'EdU rimuovendo il PBS e aggiungendo 100 μL di Triton X-100 allo 0,5% in PBS. Incubare la piastra per 5 minuti a 4 °C.
7. Colorazione con immunofluorescenza
NOTA: questa parte del protocollo può essere eseguita indipendentemente dalla sezione 6. Quando si salta la sezione 6, eseguire i passaggi 6.3.1 e 6.3.2 per abilitare la permeabilizzazione cellulare prima di continuare con il punto 7.2 riportato di seguito.
- Estrarre la piastra contenente le celle marcate con EdU.
- Preparare 20 ml di tampone bloccante aggiungendo 2 ml di siero d'asino a 18 ml di PBS.
- Per evitare il legame anticorpale non specifico, rimuovere 100 μL di PBS da ciascun pozzetto e aggiungere 50 μL del tampone bloccante con una pipetta p200. Incubare la piastra per 30 minuti a RT, protetta dalla luce e ricoperta di foglio di alluminio per prevenire il fotosbiancamento dell'EdU marcato con fluoroforo.
NOTA: le celle sono fissate sul fondo del pozzetto, ma possono staccarsi se viene applicata troppa forza durante il pipettaggio. - Mentre si bloccano i campioni, preparare la miscela di anticorpi primari. Aggiungere 8,0 μL (1:100) di topo anti-Pax7 e coniglio anti-PDGFRa a 800 μL di tampone bloccante per colorare 16 pozzetti (otto tessuti, due tipi di cellule).
- Dopo il blocco, rimuovere il siero dell'asino e aggiungere 50 μL della miscela di anticorpi primari a ciascun pozzetto. Incubare la piastra per una notte a 4 °C, ricoperta di foglio di alluminio.
- Dopo l'incubazione, rimuovere l'anticorpo primario e aggiungere 50 μL di Triton (0,5% in PBS) a ciascuno dei pozzetti. Incubare la piastra per 5 minuti a RT al riparo dalla luce, per lavare via l'anticorpo non legato. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Preparare la miscela principale di anticorpi secondari aggiungendo 1,0 μL (1:1.000) di asino anti-topo-Alexa647 e asino anti-coniglio-Alexa555 a una provetta di microcentrifuga contenente 1.000 μL del tampone bloccante.
- Aggiungere 33 μL della miscela principale di anticorpi secondari a ciascuno dei pozzetti. Incubare la piastra per 60 minuti a RT al riparo dalla luce.
- Rimuovere l'anticorpo secondario in eccesso mediante pipettaggio, aggiungere 50 μL di Triton (0,1% in PBS) e incubare per 5 minuti a RT al riparo dalla luce. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Infine, aggiungere 100 μL di PBS. Decidere se visualizzare immediatamente la lastra utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita con una camera CCD raffreddata o conservare la lastra a 4 °C fino a un'analisi successiva sigillando i bordi della lastra con parafilm e avvolgendo la piastra sigillata in un foglio di alluminio.
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Representative Results
Seguendo il protocollo per l'isolamento individuale del muscolo scheletrico (Figura 2), i muscoli gracili, TA, EDL, GA, soleo, tricipiti, massetere e diaframma sono stati isolati da tre topi maschi svizzeri di razza che erano stati interrotti da un programma di allevamento locale (Figura 2). Dopo la dissociazione tissutale e la colorazione degli anticorpi, i MuSC e i FAP dei singoli muscoli sono stati purificati mediante FACS (Figura 3). Il gating iniziale è stato ottenuto con un campione non colorato per identificare le cellule e separare i singoletti dai doppietti (Figura 3A). I cancelli successivi sono stati impostati utilizzando i controlli FMO per identificare le soglie di colorazione (Figura 3B). Il campione colorato è stato quindi controllato per CD31 / CD45-FITC e Sca1-PacBlue. La popolazione SCA1+/CD31-/CD45- (FAP) è stata smistata in una provetta di raccolta differenziata, mentre la popolazione doppia negativa è stata controllata e tracciata per VCAM1-PECy7 e forward scatter (FSC). La popolazione VCAM1+ (MuSC) è stata smistata in una provetta di raccolta differenziata. MuSC e FAP sono stati quantificati come percentuale di singoletti (Tabella 3) e ordinati in provette di raccolta differenziata contenenti 500 μL del mezzo di lavaggio. Le sospensioni monocellulari del muscolo diaframma e tricipite hanno una maggiore abbondanza relativa di MuSC rispetto alle FAP, mentre le altre sospensioni monocellulari hanno una maggiore abbondanza relativa di FAP rispetto alle MuSC (Tabella 3).
Delle cellule selezionate, 1.000-3.000 cellule sono state seminate e incubate per 24 ore. Dopo 24 ore di incubazione, il terreno è stato rimosso e sostituito con un terreno fresco contenente EdU. Le cellule sono state fissate a 48 ore, colorate per EdU, e successivamente con anticorpi contro la proteina Pax7 o la proteina PDGFRa, e ripresi utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertita. Le immagini sono state quantificate utilizzando il plugin Fiji in ImageJ. È stata osservata una robusta colorazione EdU, sebbene la frazione di cellule EdU-positive fosse diversa per i due tipi di cellule staminali e i diversi muscoli (Figura 4A-C). I MuSC isolati dall'EDL o dal GA hanno mostrato un'incorporazione di EdU significativamente inferiore rispetto ai MuSC isolati da TA, diaframma, gracilis o tricipite, mentre i MuSC isolati dal massetere e dal soleo cadono nel mezzo e non sono significativamente diversi da entrambi i gruppi (Figura 4A, B). Ciò è coerente con i nostri precedenti risultati22. Inoltre, i tessuti da cui i MuSC mostrano alti livelli di incorporazione di EdU sono gli stessi tessuti da cui i MuSC hanno precedentemente dimostrato di esprimere alti livelli di proteina Pax322. I FAP isolati dall'EDL hanno mostrato un'incorporazione di EdU significativamente inferiore rispetto ai FAP isolati dal GA e dal soleo, mentre i FAP isolati dall'AT hanno mostrato un'incorporazione di EdU significativamente inferiore rispetto ai FAP isolati dal soleo (Figura 4A,C). Ciò sottolinea l'importanza di analizzare le cellule staminali dai singoli tessuti piuttosto che raggruppare i muscoli di tessuti diversi per l'isolamento. Per tutti i tessuti, la frazione media di MuSC EdU-positivi era più alta rispetto alla frazione media di FAP EdU-positivi, suggerendo che i MuSC si attivano più velocemente nelle condizioni date.
Infine, la purezza cellulare è stata confermata con la colorazione con immunofluorescenza (Figura 4D). In media, il 97,71% (± 1,38%) dei MuSC è risultato positivo per la proteina Pax7 e l'88,16% (±6,35%) dei FAP è risultato positivo per la proteina PDGFRa, confermando la specificità della nostra procedura di isolamento delle cellule staminali (Figura 4D).
Figura 1: Schema astratto del protocollo. Schema che mostra i due segmenti principali del protocollo, isolamento MuSC (pannello superiore), saggio di quiescenza (pannello inferiore) e i passaggi chiave della metodologia utilizzata in ciascuno di essi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Posizione e isolamento muscolare. (A) Uno schema che mostra la posizione di ciascun muscolo. (B-S) Dimostrazione dell'isolamento muscolare per (B-D) gracilis, (E-G) TA / EDL, (H-J) tricipiti, (K-M) GA/soleo, (N-P) massetere e (Q-S) muscoli del diaframma. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Strategia di gating utilizzata per identificare e ordinare MuSC e FAP in un campione di muscolo del diaframma. Le celle sono identificate in base alla dimensione della cella (Forward Scatter (FSC)) e alla granularità (Side Scatter (SSC)). Le canottiere sono selezionate in base a FSC-A e FSC-W. Le cellule di lignaggio sono controllate per la successiva identificazione di MuSC (Lineage-/VCAM1+) e le cellule FAP (Lineage-/SCA1+) sono gate per identificare i FAP. La stessa strategia di gating è stata applicata a (A) un controllo non colorato, (B) controlli FMO (FMO-SCA1PacBlue, FMO-CD31/45-FITC e FMO-VCAM1-PECy7) e (C) un campione colorato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Quantificazione dell'attivazione cellulare mediante colorazione EdU. (A) Immagini rappresentative della colorazione EdU di MuSC (pannelli superiori) e FAP (pannelli inferiori) da un campione di diaframma. Vengono mostrate le immagini unite di EdU e Hoechst (pannelli di sinistra) e i singoli canali in verde (EdU, pannelli centrali) e blu (Hoechst, pannelli di destra). (B,C) Grafico a barre che mostra la percentuale di MuSC EdU-positivi (B) o FAP (C) per i muscoli indicati. Tracciato è la media ± SEM. Ogni punto rappresenta un mouse. L'analisi statistica è stata eseguita in GraphPad utilizzando test t di Student a due code, con significatività impostata su *p < 0,05 e **p < 0,01. (D) Colorazione a immunofluorescenza di MuSCs (pannelli superiori) e FAPs (pannelli inferiori) con anticorpi contro il marcatore MuSC Pax7 (lato sinistro) e il marcatore FAP PDGFRa (lato destro). Vengono mostrate le immagini unite di Pax7 con Hoechst, seguite dai singoli canali, e le immagini unite di PDGFRa con Hoechst, seguite dai singoli canali. N = 3. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Soluzioni | Reagenti | Importo |
| Mezzo di lavaggio | F-10 Miscela di nutrienti (prosciutto) (1x), +L-glutammina | 445 ml |
| Siero di cavallo | 50 ml | |
| Penna/streptococco | 5 ml | |
| Tampone di dissociazione (1a digestione) | Collagenasi di tipo II | 650 U/mL |
| Mezzo di lavaggio | 100 ml | |
| Dispase stock (2a digestione) | Dispase in PBS | 11 U/mL |
| Brodo di collagenasi (2a digestione) | Collagenasi di tipo II nella PBS | 1000 U/mL |
| PBS 1x | PBS 10x concentrato di polvere | 9,89 g/L |
| Acqua sterilizzata/sterilizzata | 1 L | |
| Acqua acida | Acido acetico glaciale (100%) Anidra per analisi | 5,15 ml |
| Acqua sterilizzata/sterilizzata | 895 ml | |
| Soluzione di collagene (0,002%) | Collagene dalla pelle di vitello | 20 ml |
| Acqua acida | 800 ml | |
| Triton X-100 | Triton X-100 | 0,5% (v/v) |
| PBS 1x | 99.5% | |
| Blocco del buffer | PBS 1x | 18 ml |
| Siero d'asino | 2 ml |
Tabella 1: Tabella delle ricette.
| Campione n. | Nome |
| 1 | Innocente |
| 2 | Fluorescenza meno VCAM1-PeCy7 |
| 3 | Fluorescenza meno SCA1-PacificBlue |
| 4 | Fluorescenza meno CD31/45-FITC |
| 5 | Colorazione sperimentale (tutti e quattro gli anticorpi) |
Tabella 2: Panoramica della colorazione, dei controlli e dei campioni preparati per ciascun tessuto prima della cernita.
| Fazzoletto | Miscela di anticorpi | Cellule | Canottiere | Lin neg | FAP | MuSC |
| Diaframma | Innocente | 100% | 82% | 55% | 0.5% | 0.0% |
| FMO Sca1-PacBlue | 100% | 83% | 19% | 0.3% | 4.3% | |
| FMO CD31/45-488 | 100% | 84% | 40% | 9.4% | 5.6% | |
| FMO Vcam1-PeCy7 | 100% | 78% | 20% | 5.6% | 0.0% | |
| macchiato | 100% | 77% | 19% | 2.4% | 3.8% | |
| Gracilis | macchiato | 100% | 96% | 11% | 2.6% | 1.4% |
| GRAZIE | macchiato | 100% | 88% | 16% | 2.8% | 2.2% |
| EDL | macchiato | 100% | 86% | 26% | 19.2% | 0.8% |
| Soleo | macchiato | 100% | 91% | 41% | 13.3% | 1.1% |
| GA | macchiato | 100% | 94% | 51% | 6.1% | 1.5% |
| Tricipite | macchiato | 100% | 92% | 30% | 2.6% | 4.5% |
| Massetere | macchiato | 100% | 85% | 27% | 19.3% | 2.6% |
Tabella 3: Panoramica dell'abbondanza relativa del tipo di cella nei dati FACS.
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Discussion
Diversi passaggi sono fondamentali nell'esecuzione di questo protocollo per ottenere buoni rendimenti. I singoli muscoli hanno un volume ridotto rispetto alla quantità di muscolo utilizzata nei protocolli di isolamento di massa. Ciò si traduce in un rischio di secchezza del muscolo durante la dissezione, che riduce la resa. Per evitare ciò, è importante aggiungere mezzo ai muscoli immediatamente dopo la dissezione. Inoltre, se la dissezione richiede più tempo, la pelle può essere rimossa da un arto alla volta per ridurre il tempo di esposizione dei muscoli all'aria. Il volume più piccolo si traduce anche in un aumento del rischio di sovra-digestione. Per contrastare questo, il presente metodo richiede quantità inferiori di enzima collagenasi II e tempi di digestione ridotti rispetto ai protocolli muscolari di massa 9,16. La digestione enzimatica dipende anche dalla purezza degli enzimi e una purezza inferiore può influire negativamente sulla resa. Inoltre, la digestione meccanica è fondamentale. In caso di taglio insufficiente, la superficie ridotta ostacolerà la digestione enzimatica e ridurrà la resa delle cellule staminali. In caso di taglio eccessivo, l'aumento della superficie causerà un'eccessiva digestione e ridurrà la resa delle cellule staminali. Il bagno d'acqua agitato impedisce la precipitazione del muscolo digerito, migliora la distribuzione dell'enzima e aiuta a creare una temperatura omogenea, consentendo tempi di incubazione più brevi. Pertanto, il presente metodo consente una significativa riduzione del tempo di incubazione rispetto ad altri metodi.
Questo protocollo dipende dalla dissociazione e purificazione cellulare. Queste procedure imitano la lesione tissutale, che attiva le cellule staminali. Coerentemente, studi recenti hanno rivelato che i MuSC cambiano i loro programmi di espressione genica durante la procedura di isolamento27,28,29,30. Di conseguenza, le cellule staminali purificate sono diverse dalle cellule in vivo in termini di modelli di espressione genica. Un secondo fattore limitante nel protocollo è la sua dipendenza da FACS, che richiede l'accesso ad apparecchiature costose. FACS è il gold standard per isolare più popolazioni cellulari contemporaneamente con elevata purezza20. I recenti progressi che utilizzano perline magnetiche e microbolle offrono riduzioni dei costi31,32, ma è necessario determinare se offrono rendimenti comparabili per lavorare su singoli muscoli. Infine, la resa del protocollo è limitata a causa delle piccole dimensioni dei muscoli, ponendo così restrizioni su potenziali test a valle.
Studi precedenti si sono basati sul raggruppamento di diversi muscoli durante l'isolamento di MuSC e / o FAP per massimizzare la resa cellulare. Tuttavia, questo media di eventuali differenze tessuto-specifiche nel comportamento e nella funzione delle cellule staminali tra i diversi muscoli. L'attuale protocollo consente l'isolamento di MuSC e FAP dai singoli muscoli per le analisi a valle della funzione delle cellule staminali. Come esempio di un test a valle, l'attivazione delle cellule staminali è stata analizzata mediante incorporazione EdU, rivelando che le cellule staminali di tessuti diversi mostrano cinetiche di attivazione diverse. In lavori precedenti è stata dimostrata la fattibilità dell'utilizzo di altri saggi a valle; questi test richiedono numeri cellulari più piccoli, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula SmartSeq2, il trapianto di cellule, la PCR microfluidica e i saggi di espansione clonale 22,33,34,35.
In conclusione, questo protocollo descrive un metodo per la dissezione dei singoli muscoli per isolare e studiare MuSC e FAP. Questa strategia consentirà agli esperimenti di ottenere una migliore comprensione della funzione delle cellule staminali tra i diversi muscoli in salute e malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti e non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
La selezione delle cellule è stata eseguita presso la FACS Core Facility, Università di Aarhus, Danimarca. Le figure sono state create utilizzando Biorender.com. Ringraziamo il Dr. J. Farup per aver condiviso l'anticorpo anti-PDGFRa del coniglio. Questo lavoro è stato sostenuto da un AUFF Starting Grant a E.P. e Start Package grants da NovoNordiskFonden a E.P. (0071113) e ad A.D.M. (0071116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
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