Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av vilande stamcellspopulationer från enskilda skelettmuskler

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver isoleringen av muskelstamceller och fibro-adipogenic progenitorer från enskilda skelettmuskler hos möss. Protokollet innefattar dissektion av enstaka muskler, stamcellsisolering genom fluorescensaktiverad cellsortering, renhetsbedömning genom immunofluorescensfärgning och kvantitativ mätning av S-fasinträde med 5-etynyl-2'-deoxiuridininkorporeringsanalys.

Abstract

Skelettmuskulaturen har distinkta populationer av vuxna stamceller som bidrar till homeostas och reparation av vävnaden. Skelettmuskelstamceller (MuSC) har förmågan att skapa nya muskler, medan fibro-adipogenic progenitorer (FAPs) bidrar till stromala stödvävnader och har förmågan att göra fibroblaster och adipocyter. Både MuSC och FAP ligger i ett tillstånd av långvarig reversibel cellcykelutgång, kallad quiescence. Det vilande tillståndet är nyckeln till deras funktion. Vilande stamceller renas vanligen från flera muskelvävnader som slås samman i ett enda prov. Nya studier har dock avslöjat tydliga skillnader i molekylära profiler och vilodjup hos MuSCs isolerade från olika muskler. Detta protokoll beskriver isolering och studier av MuSC och FAP från enskilda skelettmuskler och presenterar strategier för att utföra molekylär analys av stamcellsaktivering. Den beskriver hur man isolerar och smälter muskler av olika utvecklingsursprung, tjocklekar och funktioner, såsom membranet, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) och massetermusklerna. MuSC och FAP renas genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och analyseras genom immunofluorescensfärgning och 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) inkorporeringsanalys.

Introduction

Skelettmuskulaturen har en hög kapacitet för regenerering på grund av närvaron av muskelstamceller (MuSC). MuSCs är belägna på myofibrerna, under basallamina, och ligger i ett vilande tillstånd av långvarig, reversibel cellcykelutgång 1,2,3,4. Vid skada aktiveras MuSCs och går in i cellcykeln för att ge upphov till förstärkande föregångare som kan differentiera och smälta samman för att bilda nya myofibrer 2,5. Tidigare arbete har visat att MuSCs är absolut nödvändiga för muskelregenerering 6,7,8. Dessutom kan en enda MuSC transplantera och generera både nya stamceller och nya myofibrer9. Skelettmuskulaturen har också en population av mesenkymala stromaceller som kallas fibro-adipogenic progenitors (FAPs), som spelar en avgörande roll för att stödja MuSC-funktionen under muskelregenerering 6,10,11,12.

På grund av deras potential att samordna muskelregenerering har det varit ett enormt intresse för att förstå hur MuSC och FAP fungerar. Vilande MuSCs markeras genom uttryck av transkriptionsfaktorerna Pax7 och Sprouty1 och cellyteproteinkalcitoninreceptorn, medan vilande FAP markeras av cellytans proteintrombocythärledda tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Tidigare studier har visat att MuSC och FAP kunde renas från skelettmuskulaturen med hjälp av cellytemarkörer och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Även om dessa protokoll har avancerat förmågan att studera MuSC och FAP, är en nackdel att de flesta av dessa protokoll kräver isolering av MuSC från en pool av olika muskelvävnader. Nyligen arbete från oss och andra har avslöjat skillnader i cellfenotyp och genuttrycksnivåer mellan MuSCs isolerade från olika vävnader22,23. MuSCs från membranet, triceps och gracilis visar snabbare aktivering än MuSCs från nedre bakbensmusklerna22, medan MuSCs från extraokulär muskel visar snabbare differentiering än MuSCs från membranet och nedre bakbensmusklerna23.

Detta protokoll beskriver isoleringen av MuSC och FAP från enskilda skelettmuskler (figur 1). Detta inkluderar dissektion av membranet, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) och massetermuskler. Dissekerade muskler dissocieras därefter genom enzymatisk nedbrytning med användning av kollagenas II (ett proteas som specifikt riktar sig mot Pro-X-Gly-Pro-aminosekvensen i kollagen, vilket möjliggör nedbrytning av bindväv och vävnadsdissociation24) och dispas (ett proteas som klyver fibronektin och kollagen IV, vilket möjliggör ytterligare celldissociation25). MuSC och FAP isoleras från encellssuspensioner av FACS. Som exempel på nedströmsanalyser för cellanalys bestäms stamcellsaktivering genom analys av 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) inkorporering, medan cellrenhet bestäms genom immunofluorescensfärgning för celltypspecifika markörer Pax7 och PDGFRa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll utfördes i enlighet med riktlinjer för djurvård vid Århus universitet och lokala etiska föreskrifter.

OBS: Se till att följa föreskrifterna från den lokala etiska kommittén för djurförsök och hantering av prover från gnagare efter slakt. Möss är en potentiell källa till allergener; Om tillgängligt, slå på frånluftsventilation och placera den över arbetsytan för att undvika överdriven exponering för allergener. Alternativt, bära ansiktsmask om experimentet utförs regelbundet. Detta protokoll innebär att man arbetar med vassa föremål, och forskare rekommenderas att bekanta sig med förfarandena och logistiken för att applicera första hjälpen vid ett snitt.

1. Förberedelse (1-2 timmar; dagen före dissektion)

OBS: Lösningarna, plattorna och medierna bereds under sterila förhållanden och filtreras (0,45 μm) före användning om inget annat anges. Bered stamlösningar av dispase (11 E/ml i PBS) och kollagenas II (1,000 E/ml i PBS) och förvara dem vid -20 °C (tabell 1). Bestånden tinas och används för sekundär uppslutning i steg 4.2.6.

  1. Kollagenbeläggning av en 96-brunns halvareaplatta
    1. Förbered surt vatten. Tillsätt 5,15 ml isättika till 895 ml autoklaverat vatten i en 2 L bägare.
    2. Filtrera lösningen med en 0,45 μm, 500 ml filterenhet. Överför 800 ml av det filtrerade sura vattnet till en 1 L flaska.
    3. Tillsätt 40 ml steril kollagenlösning till flaskan. Blanda försiktigt lösningen genom att snurra runt och förvara vid 4 °C, skyddad från ljus, tills den används.
    4. Belägg en eller flera 96-brunns halvareaplattor med kollagen. Tillsätt 50 μL kollagenbeläggningslösning till varje brunn och täck plattan över natten (ON) vid 4 °C.
    5. Aspirera kollagenlösningen följande dag med en vakuumbaserad sug och tvätta plattan 2x genom att tillsätta 100 μL autoklaverat vatten och aspirera.
    6. Luta locket på plattan och låt plattan torka i huven i 20-30 min.
    7. När plattan är helt torr, linda in den i aluminiumfolie och förvara den vid 4 °C tills den används. Belagda plattor kan förvaras i upp till 4 veckor.
      OBS: Kollagenbeläggning möjliggör celladhesion. Det är viktigt att tvätta bort fritt kollagen eftersom det kan störa cellfunktion och signalering (t.ex. bindning av kollagen V till kalcitoninreceptorerna på MuSCs)26.

2. Förberedelse (0,5 timmar; dissektionsdagen):

  1. Förberedelse av ytterligare lösningar och arbetsyta
    1. Bered sterilt tvättmedium genom att tillsätta 50 ml hästserum och 5 ml penna/strep till 445 ml HAM:s F10-medium. Arbeta i en laminär flödeshuv för att förhindra kontaminering.
    2. Beräkna och väg den mängd kollagenas II som behövs för att bereda dissociationsbufferten. (För varje mus används 26 000 enheter kollagenas II för att göra 40 ml dissociationsbuffert vid 650 U / ml kollagenas II). Tillsätt det vägda pulvret till ett 50 ml koniskt rör och förvara det på is.
    3. Förbered två 10 cm rätter för muskelisolering. Häll 3 ml tvättmedium (tabell 1) i varje petriskål. Ta 10 cm skålarna utanför den laminära flödeshuven för senare användning.
    4. Förbered materialen för muskelförtunning. Baserat på antalet prover, märk lämpligt antal 50 ml koniska rör (åtta per mus, en för varje muskel) och lämna dem på bänken. Spraya ner nålarna, 10 ml sprutor och 40 μm cellsilar med 70% etanol (åtta av varje per mus, en för varje muskel) och ta in dem i den laminära flödeshuven. Fäst nålar på sprutorna.
    5. Förbered materialen för sortering. Märk 5 ml runda bottenrör med cellsillock baserat på antalet prover. Täck rören med aluminiumfolie och lämna dem i den laminära flödeshuven.
    6. Motsvarande antalet prover och populationer som sorteras, förbered 1,5 ml mikrocentrifugrör med 500 μL tvättmedium för celluppsamling (16 per mus, ett rör för varje cellpopulation per muskelvävnad). Förvara dessa rör på is.

3. Muskeldissektion (20-30 min)

OBS: Detta avsnitt av protokollet utförs i en icke-steril miljö. Förfarandet kan utföras med hjälp av en eller flera möss. En mus är dock tillräcklig för att förbereda både prover för sortering och kontroller för att ställa in kompensations- och FACS-grindar.

  1. Initiera muskelisolering
    1. Förbered den icke-sterila arbetsytan för dissektion och muskelisolering. Desinficera arbetsstationen med 70% etanol. Placera en steril skyddande engångsunderplatta på arbetsstationen.
    2. Använd en permanent markör och rita en låda för varje muskel ovanpå ett petriskållock för att senare placera den isolerade muskeln.
    3. Spraya de kirurgiska instrumenten med 70% etanol.
    4. Avliva musen genom CO2-inandning och/eller cervikal dislokation.
    5. Isolera de enskilda musklerna (från en mus i taget om du använder flera möss). Spraya musen med 70% etanol för att blöta pälsen och desinficera huden. Placera musen på underplattan med buken uppåt. En översikt över alla åtta musklerna och deras respektive anatomiska placering visas i figur 2A.
  2. Isolera gracilismusklerna
    1. Använd en sax för att göra ett 0,5 cm horisontellt snitt i bukhuden.
    2. Ta bort huden: Använd båda händerna och använd tummen och pekfingret för att ta tag i den övre och nedre delen av snittet. Dra i varje sida av snittet för att riva och dela huden på torso och nedre extremiteter. Dra ner huden på nedre extremiteten för att exponera båda bakbenen (nedåt från höft till tår). Dra också uppåt för att exponera överkroppen.
    3. Leta reda på gracilismuskeln (inre låret). Använd böjda pincett, ta tag i gracilierna och lyft muskeln något (figur 2B). Gör med sax ett snitt på 0,5 cm (figur 2C), från vilket gracilierna skärs ut och isoleras helt (figur 2D). Upprepa detta för det andra benet för att isolera den andra gracilismuskeln.
  3. Isolera TA- och EDL-musklerna (nedre bakbenet, ventrala sidan)
    1. Använd en skalpell, skär fascia genom att göra ett 0,5 cm snitt längs sidosidan av skenbenet (det tjockaste nedre bakbensbenet). Använd böjda pincett för att ta tag i fascian och dra för att ta bort den.
      OBS: När fascian har tagits bort helt är senorna i bakbenets distala ände synliga och kan separeras.
    2. Använd raka pincett med superfina spetsar för att gå in mellan den distala senan i TA (sidosidan av skenbenet) och EDL (under TA) (figur 2E-G).
      OBS: Med erfarenhet kan den trubbiga änden av ett skalpellblad användas istället för de raka pincetterna.
    3. Skjut pincetten mot den proximala änden av muskeln för att separera musklerna.
    4. För tillbaka de raka pincetterna till den distala änden. Skär den distala senan.
    5. Ta försiktigt tag i muskelns distala sena med böjda pincett. Lyft muskeln upp och över dess proximala fäste och skär försiktigt den proximala senan så nära dess fästpunkt som möjligt. Skär den andra änden och överför TA till en petriskål.
    6. Använd raka pincett med superfina spetsar för att gå under EDL: s distala sena.
    7. Skjut pincetten mot den proximala änden av muskeln för att separera musklerna.
    8. För tillbaka de raka pincetterna till den distala änden. Skär den distala senan utan att skada muskeln.
    9. Ta försiktigt tag i EDL: s distala sena med böjda pincett. Lyft muskeln upp och över dess proximala fäste och skär försiktigt den proximala senan så nära dess fästpunkt som möjligt. Skär den andra änden och överför EDL till en petriskål. Upprepa för den andra bakbenet för att isolera den andra TA- och EDL-muskeln.
  4. Isolera GA- och soleusmusklerna (nedre bakbenet, dorsala sidan)
    1. Använd raka pincett med superfina spetsar för att gå in mellan hälsenan och de nedre bakbenen.
    2. Skjut pincetten mot den proximala änden av muskeln för att separera muskeln.
    3. För tillbaka de raka pincetterna till den distala änden. Skär den distala senan.
      OBS: För att undvika att skada soleusmuskeln, som ligger under GA, skär så nära dess distala akillessenfäste som möjligt och lämna en bit av senan fäst vid GA (figur 2H).
    4. För att avslöja och isolera soleusmuskeln, dra GA upp och över fibula (det tunnaste benet i de två benen i nedre bakbenet).
      OBS: Soleusmuskeln kännetecknas av sin karakteristiska mörkröda färg i förhållande till GA (figur 2I).
    5. Leta reda på den proximala soleussenan. Med raka pincett, gå in mellan soleus och GA.
    6. Flytta pincetten mot den distala änden av muskeln för att separera soleus från GA.
    7. Isolera soleus först. Skär dess proximala sena, ta tag i senan med böjda pincett och lyft försiktigt soleus för att komma åt dess distala sena. Skär av den distala senan för att isolera soleus från GA. Placera soleus i petriskålen med tvättmedel (figur 2J)
    8. Skär GA och lägg den i petriskålen. Upprepa detta för det andra benet för att isolera de andra soleus- och GA-musklerna.
  5. Isolera tricepsmusklerna (övre framben, dorsala sidan)
    1. Använd raka pincett med superfina spetsar för att gå in mellan tricepsmuskeln och humerusbenet (huvudbenet i övre frambenet) (figur 2K-M).
    2. Skjut pincetten mot den proximala änden av muskeln för att separera muskeln. Skär den proximala änden av muskeln.
    3. Ta tag i den proximala änden av triceps med böjda pincett och dra den upp och över armbågen för att komma åt den distala senan. Skär triceps distala sena, överför muskeln till en petriskål och upprepa proceduren för den andra frambenet.
  6. Isolera massetermusklerna
    1. Ta bort pälsen och huden från käken. Gör ett horisontellt snitt på 0,5 cm med sax. Nyp med båda händerna på vardera sidan av snittet med tummen och pekfingrarna. Ta bort huden genom att dra uppåt och nedåt.
    2. Leta reda på massörens huvudsena (caudal, under ögat). För in det platta skalpellbladet mellan benet och muskeln (figur 2N). Skär senan.
    3. Ta tag i den stora massetersenan med böjda pincett. Skär den med ett skalpellblad eller sax i rostral riktning för att separera massetermuskeln från käkbenet (figur 2O, P). Placera den isolerade massetermuskeln i petriskålen. Upprepa proceduren för den andra massetermuskeln.
  7. Isolera membranmuskeln
    OBS: När du isolerar membranmuskeln, se till att skära försiktigt för att undvika att skära in i de inre organen och tarmarna, eftersom detta är en källa till kontaminering.
    1. Använd sax, gör en thorakotomi (ett snitt mellan revbenen) i mitten av bröstbenet (ett långt platt ben, beläget i mitten av bröstet, som förbinder revbenen) och skär genom bröstbenet (figur 2Q).
    2. Exponera membranet genom att skära 360° genom bröstkorgen.
    3. Separera överkroppen från underdelen/buken. Skär luftstrupen, matstrupen, vena cava och bukaorta med en sax.
    4. Separera membranet från underkroppen. Använd sax, gör en laparotomi (ett kirurgiskt snitt i bukhålan) 1 cm under bröstbenet och gör ett 360 ° snitt (figur 2R).
    5. Placera den stängda saxen mellan bröstkorgen och bukorganen och tryck ner. Dra försiktigt i bröstkorgen för att separera den från bukorganen (figur 2S).
    6. Separera membranet från ribbburet. Håll membranet löst mellan två fingrar och skär genom bröstkorgen med sax. Använd sax för att klippa membranet så nära revbenen som möjligt i ett 360 ° snitt. Lägg det isolerade membranet i en petriskål.
      OBS: Under cervikal dislokation kan membranet brista och kollapsa mot bröstkorgen, vilket gör det svårt att lokalisera. Muskeln kan fortfarande isoleras. Identifiera den kollapsade muskeln, håll den mellan två fingrar och skär 360 ° efter bröstkorgen.

4. Muskeluppslutning till en encellssuspension (~1 h 35 min)

Följande steg omfattar icke-sterila (steg 4.1-4.2) och sterila arbetsmiljöer (steg 4.3).

  1. Mekanisk matsmältning
    1. Placera de isolerade musklerna i locket på en 10 cm petriskål.
    2. Använd böjda pincett, ta tag i de isolerade musklerna en efter en. För soleus och GA, ta bort de återstående delarna av akillessenen.
    3. Hacka de isolerade musklerna en efter en med saxen genom att skära dem i ungefär 1 mm3 bitar.
  2. Enzymatisk matsmältning
    1. Bered muskeldissociationsbufferten genom att tillsätta 40 ml kalltvättmedium till det vägda kollagenas II-pulvret (kollagenas II: 650 E/ml i tvättmediet).
      OBS: Använd nyberedd muskeldissociationsbuffert för att säkerställa optimal enzymatisk aktivitet.
    2. Överför de malda musklerna till ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml dissociationsbuffert.
    3. Inkubera röret i 35 minuter i ett 37 °C skakvattenbad vid 60 rpm.
    4. Efter inkubation tillsätt tvättmedel till en total volym av 15 ml. Snurra röret vid 1 600 x g i 5 min vid 4 °C.
    5. Aspirera supernatanten ner till en volym på 4 ml med hjälp av en vakuumbaserad aspirerare. För att undvika att störa pelleten, aspirera långsamt från toppen och ta bort eventuellt flytande fett.
    6. Tina lager alikvoter av dispase och kollagenas II. Tillsätt 500 μl kollagenas II-lösning (1 000 E/ml stam, -20 °C) till det återstående 4 ml provet. Tillsätt sedan 500 μl dispaslösning (11 E/ml stam, -20 °C).
      OBS: Dispase kan generera en fällning. Om detta inträffar, snurra stamlösningen vid 10 000 x g, 1 min före användning. Överför den nu klara supernatanten till cellsuspensionen utan att störa pelleten.
    7. Virvla proverna kort för att lösa upp pelleten.
    8. Inkubera proverna i 20 minuter i ett 37 °C skakvattenbad vid 60 varv/min.
      OBS: Att smälta ett stort antal muskelprover är tidskrävande. För steg 4.3.1-4.3.6, uppskattning med 2-5 minuter per prov. Detta steg går snabbare när det utförs parallellt av två eller flera forskare.
  3. Homogenisering av prover
    1. Homogenisera cellsuspensionen. Överför suspensionen från 15 ml röret till ett 50 ml rör. Använd en 10 ml spruta med en 20G nål för att resuspendera provet genom att dra provet upp och ner genom nålen 5x.
      OBS: Om bitar av osmält muskel täpper till nålen, torka av dem på en pappersduk.
    2. Placera en 40 μm cellsil på ett nytt 50 ml koniskt rör.
    3. Ta upp hela cellsuspensionen i sprutan och sila provet i ett nytt 50 ml koniskt rör med en cellsil ovanpå. Sila provet genom att dosera den totala volymen direkt på filtret.
    4. För att hämta alla enkärniga celler, tillsätt 20 ml tvättmedium till det tomma koniska röret och häll detta genom cellsilen i det 50 ml koniska röret som innehåller det ansträngda provet. Hämta den återstående volymen under cellsilen med en p1000-pipett.
    5. Kassera silcellen och snurra provet vid 1 600 x g i 5 min vid 4 °C.
    6. Genom pipettering med en p1000-pipett, aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
    7. Genom pipettering med en p1000-pipett suspenderas membranpelleten på nytt i 500 μL av tvättmediet och de övriga muskelproverna återsuspenderas i vardera 300 μL av tvättmedlet.
      OBS: Diafragman är den största av musklerna med högst stamcellsinnehåll och kan därför användas för kontrollfärgningarna.

5. Färgning och sortering (~40 min + 30 min sortering/prov)

OBS: Arbeta i en steril miljö på is för följande steg.

  1. Överför en alikvot på 50 μl av membrancellsuspensionen till fyra nya 2 ml mikrocentrifugrör för kontrollfläckarna (50 μl vardera). Tillsätt 250 μl av tvättmedlet till varje kontrollrör till en slutlig volym på 300 μl.
  2. Tillsätt 3 μl (1:100) av fluorescens minus en-antikropparna (FMO-kontroll) till de tre kontrollfärgningsrören och lämna ett rör utan antikroppar (ofärgad kontroll) (se tabell 2).
  3. Tillsätt 3 μL (1:100) av antikropparna (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC och SCA1-PacificBlue) till de återstående muskelcellsuspensionerna, inklusive det återstående membranprovet.
  4. Inkubera cellsuspensionerna i 15 minuter vid 4 °C i en huvudskakapparat.
    OBS: Kontrollfärgningarna är nödvändiga för att bestämma bakgrundsfluorescensnivåer och ställa in grindarna för flödescytometri. Olika antikroppar kan användas, men var och en kommer att ha en specifik arbetskoncentration och inkubationstid som måste testas. Om antikroppar från olika leverantörer används kan koncentrationen, och därmed utspädningen, variera. Ett cellviabilitetsfärgämne kan sättas till färgningsblandningen för att eliminera eventuella döda eller döende celler under sorteringen.
  5. Snurra proverna vid 1 600 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten utan att störa pelleten genom pipettering.
  6. Genom pipettering med en p1000-pipett suspenderas varje prov på 800 μl av tvättmedlet.
  7. Filtrera proverna med ett FACS-rör med ett cellsillock (40 μm) för att avlägsna eventuella kvarvarande cellklumpar (eller aggregat).
  8. Tvätta cellsilen genom att tillsätta ytterligare 800 μL av tvättmediet.
  9. Håll proverna täckta med aluminiumfolie på is tills analys.
    OBS: Om cellsuspensionen vid denna tidpunkt verkar grumlig/tät på grund av den höga koncentrationen av celler, tillsätt ytterligare 800 μL av tvättmediet för att minska celldensiteten.
  10. Starta FACS med ett munstycke på 70 μm.
  11. Använd kontrollerna för ofärgade och FMO för att ställa in grindstrategin: MuSCs är negativa för CD45-FITC, CD31-FITC och SCA1-PacBlue och är positiva för VCAM1-PECy7; FAPs är negativa för CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 och positiva för SCA1-PacBlue.
  12. Sortera de färgade encellssuspensionerna med tvåvägssortering och samla upp MuSC och FAP i separata uppsamlingsrör som innehåller 500 μL av tvättmediet.
    OBS: Användning av FACS med fyra lasrar (konfiguration: 70 μm munstycke, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm) kräver den valda kombinationen av fluoroforer inte kompensation av fluorescenssignalen. Om du använder en annan flödescytometer eller en annan kombination av fluoroforer rekommenderas dock ytterligare enkelfärgade kontrollprover för kompensation. Från de mindre musklerna (EDL, soleus, TA) kan utbyten på 3 000 MuSC och 5 000 FAP förväntas. För de andra större musklerna kan utbyten på 20 000 MuSC och FAP förväntas. Antalet händelser som anges av FACS-programvaran kan avvika från det faktiska antalet viabla celler i uppsamlingsröret. Cellnummer kan bekräftas genom cellräkning med hjälp av en hemocytometer.
  13. Snurra ner de sorterade cellerna vid 1 600 x g i 5 minuter vid 4 °C. Genom pipettering, aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten.
  14. Tillsätt 100 μl tvättmedium till varje prov och suspendera försiktigt cellerna utan att skapa luftbubblor. Överför 100 μL av det återsuspenderade provet till en kollagenbelagd platta med 96 brunnar med 96 kärnor. Platta 1 000-3 000 celler per brunn.
    OBS: Om cellerna inte är ordentligt resuspenderade kan cellerna hålla ihop i klumpar, vilket förvirrar senare mikroskopianalyser.
  15. Inspektera cellerna under mikroskopet och notera deras fördelning, form och storlek.
  16. Inkubera plattan vid 37 °C, 5 %CO2. Cellerna kommer att fästa inom 2 timmar.
    OBS: Det rekommenderas att bekräfta renheten hos de insamlade cellpopulationerna, antingen genom flödescytometrianalys (genom att ladda en alikvot av det sorterade provet på sorteraren och registrera ett litet antal händelser) eller genom antikroppsfärgning av de pläterade cellerna följt av mikroskopi (Pax7 är en definierande markör för mus MuSCs, PDGFRa är en definierande markör för mus FAPs). Från och med avsnitt 7 nedan finns ett protokoll för färgning av celler för Pax7- och PDGFRa-proteinnivåer.

6. EdU-inkorporeringsanalys

OBS: Arbeta under sterila förhållanden och använd den kemiska dragskåpet vid hantering av paraformaldehyd (PFA) för följande steg. EdU är en nukleotidanalog som införlivas i DNA när cellerna går igenom S-fasen i cellcykeln. Det är mutagent vid höga koncentrationer. Använd alltid handskar vid hantering av EdU. Kontrollera de lokala riktlinjerna för hantering av EdU-avfall.

  1. EdU-puls (dag 1)
    1. Förbered en arbetslösning av 2x EdU i ett nytt tvättmedium.
    2. Ta 96-brunnsplattan med cellerna ur inkubatorn. Inspektera cellerna under mikroskopet för att övervaka sammanflödet. Flytta in i den laminära flödeshuven.
    3. Ta bort 50 μl medium från plattan genom pipettering. Tillsätt 50 μL 2x EdU-arbetslösning så att den slutliga volymen i brunnen är 100 μL.
    4. Odla cellerna i närvaro av EdU under den avsedda tidsperioden vid 37 °C, 5%CO2.
      OBS: Tidpunkten och varaktigheten för EdU-pulsen kan variera. I genomsnitt tar vilande MuSC 2 dagar att aktivera och slutföra sin första celldelning19. EdU kan läggas till de sorterade cellerna omedelbart efter plätering.
  2. Fixering (dag 2)
    OBS: PFA är cancerframkallande. Hantera alltid PFA varsamt. Bekanta dig med de lokala bestämmelserna för hantering av PFA och bortskaffande av avfall.
    1. Ta 96-brunnsplattan med cellerna ur inkubatorn. Inspektera cellerna under mikroskopet och flytta plattan in i dragskåpet.
    2. Genom pipettering, ta bort mediet och fixera cellerna genom att tillsätta 50 μL 4% PFA till varje brunn. Inkubera plattan i 10 minuter vid rumstemperatur (RT) i en kemisk dragskåp.
    3. Ta bort PFA med en pipett och kasta den i en lämplig avfallsbehållare.
    4. Tvätta cellerna genom att tillsätta 100 μL PBS till alla brunnar. Genom pipettering, aspirera PBS och upprepa tvätten. Förvara cellerna i 100 μL PBS.
      OBS: För att undvika att tvätta ut några celler, fördela PBS till sidan av brunnen genom att pipettera långsamt.
  3. EdU-märkning
    1. Permeabilisera cellerna före EdU-detektion genom att ta bort PBS och tillsätta 100 μL 0,5% Triton X-100 i PBS. Inkubera plattan i 5 minuter vid 4 °C.
      Triton X-100 är ett ytaktivt ämne och kan orsaka hudirritation. Hantera försiktigt och använd alltid handskar.
    2. Efter 5 minuter, aspirera Triton X-100 och tillsätt 100 μL PBS.
    3. Förbered en EdU-klickkemireaktionsblandning enligt tillverkarens protokoll.
    4. Aspirera PBS och tillsätt 33 μL av EdU-klickkemireaktionsblandningen. Inkubera plattan i 30 minuter vid rumstemperatur.
    5. Aspirera EdU-klickkemireaktionsblandningen och tvätta cellerna med 100 μL PBS.
    6. Aspirera PBS, tillsätt 100 μL PBS med Hoechst (1:2 000) och inkubera skyddat från ljus i 10 minuter vid rumstemperatur.
    7. Aspirera Hoechst och tvätta två gånger genom att tillsätta 100 μL PBS. Förvara cellerna i 100 μl PBS vid 4 °C i mörker.
    8. Avbilda cellerna på ett inverterat mikroskop. Cellerna kan förvaras i mörker i månader så länge brunnarna inte torkar ut.
      OBS: Det är möjligt att samfärga cellerna med antikroppar. Fortsätt i så fall med ett blockeringssteg följt av inkubation med den primära antikroppen. Välj en sekundär antikropp med en konjugerad fluorofor vars emissionsspektrum inte överlappar det för fluoroforen som används för att detektera EdU. Se till att inte använda sekundära antikroppar med fluoroforer som överlappar Hoechsts spektralområde.

7. Färgning av immunofluorescens

OBS: Denna del av protokollet kan utföras oberoende av avsnitt 6. När du hoppar över avsnitt 6, utför steg 6.3.1 och 6.3.2 för att aktivera cellpermeabilisering innan du fortsätter med steg 7.2 nedan.

  1. Ta ut plattan som innehåller de EdU-märkta cellerna.
  2. Bered 20 ml blockerande buffert genom att tillsätta 2 ml åsneserum till 18 ml PBS.
  3. För att förhindra ospecifik antikroppsbindning, avlägsna 100 μL PBS från varje brunn och tillsätt 50 μL av blockeringsbufferten med en p200-pipett. Inkubera plattan i 30 minuter vid rumstemperatur, skyddad från ljus och täckt med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning av den fluoroformärkta EdU.
    OBS: Cellerna är fästa vid botten av brunnen men kan lossna om för mycket kraft appliceras vid pipettering.
  4. Medan proverna blockeras, förbered den primära antikroppsblandningen. Tillsätt 8,0 μL (1:100) mus anti-Pax7 och kanin anti-PDGFRa till 800 μL blockerande buffert för att färga 16 brunnar (åtta vävnader, två celltyper).
  5. Efter blockering, ta bort åsneserumet och tillsätt 50 μL av den primära antikroppsblandningen till varje brunn. Inkubera plattan över natten vid 4 °C, täckt med aluminiumfolie.
  6. Efter inkubation, avlägsna den primära antikroppen och tillsätt 50 μL Triton (0,5% i PBS) till var och en av brunnarna. Inkubera plattan i 5 minuter vid RT skyddad från ljus, för att tvätta bort den obundna antikroppen. Upprepa tvätten tre gånger.
  7. Bered den sekundära antikroppsmasterblandningen genom att tillsätta 1,0 μL (1:1 000) åsna anti-mus-Alexa647 och åsna anti-kanin-Alexa555 till ett mikrocentrifugrör innehållande 1 000 μL av den blockerande bufferten.
  8. Tillsätt 33 μl av den sekundära antikroppsmasterblandningen till var och en av brunnarna. Inkubera plattan i 60 minuter vid rumstemperatur skyddad från ljus.
  9. Ta bort överskottet av sekundär antikropp genom pipettering, tillsätt 50 μL Triton (0,1% i PBS) och inkubera i 5 minuter vid RT skyddad från ljus. Upprepa tvätten tre gånger.
  10. Slutligen tillsätt 100 μL PBS. Bestäm om du ska avbilda plattan omedelbart med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop med en kyld CCD-kamera, eller förvara plattan vid 4 °C tills senare analys genom att försegla plattans kanter med parafilm och linda in den förseglade plattan i aluminiumfolie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter protokollet för individuell skelettmuskelisolering (figur 2) isolerades gracilis-, TA-, EDL-, GA-, soleus-, triceps-, masseter- och membranmusklerna från tre schweiziska manliga utavlade möss som hade avbrutits från ett lokalt avelsprogram (figur 2). Efter vävnadsdissociation och antikroppsfärgning renades MuSC och FAP från de enskilda musklerna med FACS (figur 3). Den ursprungliga grinden erhölls med ett ofärgat prov för att identifiera cellerna och separera singlets från dubletter (figur 3A). De efterföljande grindarna sattes med hjälp av FMO-kontroller för att identifiera färgningströsklar (figur 3B). Det färgade provet gated sedan för CD31 / CD45-FITC och Sca1-PacBlue. SCA1+/CD31-/CD45- populationen (FAPs) sorterades in i ett separat uppsamlingsrör, medan den dubbla negativa populationen gated och plottades för VCAM1-PECy7 och forward scatter (FSC). VCAM1+-populationen (MuSCs) sorterades i ett separat uppsamlingsrör. MuSC och FAP kvantifierades som procentandelen singlets (tabell 3) och sorterades i separata uppsamlingsrör innehållande 500 μL av tvättmedlet. Diafragma- och tricepsmuskelsuspensionerna har en högre relativ förekomst av MuSC än FAPs, medan de andra encellssuspensionerna har en högre relativ förekomst av FAP än MuSC (tabell 3).

Av de sorterade cellerna såddes 1 000-3 000 celler och inkuberades i 24 timmar. Efter 24 timmars inkubation avlägsnades mediet och ersattes med ett färskt medium innehållande EdU. Cellerna fixerades vid 48 timmar, färgades för EdU och därefter med antikroppar mot Pax7-protein eller PDGFRa-protein och avbildades med hjälp av ett inverterat epifluorescensmikroskop. Bilder kvantifierades med hjälp av Fiji-plugin i ImageJ. Robust EdU-färgning observerades, även om fraktionen av EdU-positiva celler var olika för de två stamcellstyperna och de olika musklerna (figur 4A-C). MuSCs isolerade från antingen EDL eller GA visade signifikant lägre EdU-inkorporering jämfört med MuSCs isolerade från antingen TA, membran, gracilis eller triceps, medan MuSCs isolerade från masseter och soleus faller däremellan och skiljer sig inte signifikant från någon av grupperna (figur 4A,B). Detta överensstämmer med våra tidigare resultat22. Dessutom är vävnaderna från vilka MuSCs visar höga EdU-inkorporeringsnivåer samma vävnader från vilka MuSCs tidigare visat sig uttrycka höga nivåer av Pax3-protein22. FAP isolerade från EDL visade en signifikant lägre EdU-inkorporering jämfört med FAP isolerade från GA och soleus, medan FAP isolerade från TA visade en signifikant lägre EdU-inkorporering jämfört med FAP isolerade från soleus (figur 4A, C). Detta understryker vikten av att analysera stamceller från enskilda vävnader snarare än att slå samman muskler från olika vävnader för isolering. För alla vävnader var den genomsnittliga fraktionen av EdU-positiva MuSCs högre jämfört med den genomsnittliga fraktionen av EdU-positiva FAPs, vilket tyder på att MuSCs aktiveras snabbare under de givna förhållandena.

Slutligen bekräftades cellrenhet med immunofluorescensfärgning (figur 4D). I genomsnitt var 97,71% (± 1,38%) av MuSCs färgade positiva för Pax7-protein och 88,16% (±6,35%) av FAPs färgade positiva för PDGFRa-protein, vilket bekräftar specificiteten av vårt stamcellsisoleringsförfarande (figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Schematisk sammanfattning av protokollet. Schematisk som visar protokollets två huvudsegment, MuSC-isolering (övre panel), quiescensanalys (nedre panel) och de viktigaste stegen i metoden som används i var och en av dem. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Muskelns placering och isolering. (A) Ett schema som visar placeringen av varje muskel. (B-S) Påvisande av muskelisolering för (B-D) gracilis, (E-G) TA/EDL, (H-J) triceps, (K-M) GA/soleus, (N-P) masseter och (Q-S) diafragmamuskler. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Gating strategi som används för att identifiera och sortera MuSC och FAP i ett membranmuskelprov. Celler identifieras baserat på cellstorlek (Forward Scatter (FSC)) och granularitet (Side Scatter (SSC)). Singlets väljs baserat på FSC-A och FSC-W. Härstamningsceller är gated för efterföljande identifiering av MuSCs (Lineage-/VCAM1+), och FAP-celler (Lineage-/SCA1+) är gated för att identifiera FAPs. Samma grindstrategi tillämpades på (A) en ofärgad kontroll, (B) FMO-kontroller (FMO-SCA1PacBlue, FMO-CD31/45-FITC och FMO-VCAM1-PECy7) och (C) ett färgat prov. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Kvantifiering av cellaktivering genom EdU-färgning. (A) Representativa bilder av EdU-färgning av MuSC (övre paneler) och FAP (nedre paneler) från ett membranprov. Här visas sammanslagna bilder av EdU och Hoechst (vänster paneler) och de enskilda kanalerna i grönt (EdU, mittpaneler) och blått (Hoechst, höger panel). (B,C) Stapeldiagram som visar procentandelen EdU-positiva (B) MuSCs eller (C) FAPs för indikerade muskler. Plotted är medelvärdet ± SEM. Varje punkt representerar en mus. Statistisk analys utfördes i GraphPad med hjälp av tvåsidiga Students t-test, med signifikans inställd på *p < 0,05 och **p < 0,01. (D) Immunofluorescensfärgning av MuSCs (övre paneler) och FAP (nedre paneler) med antikroppar mot MuSC-markören Pax7 (vänster sida) och FAP-markören PDGFRa (höger sida). Sammanslagna bilder av Pax7 med Hoechst visas, följt av de enskilda kanalerna, och sammanslagna bilder av PDGFRa med Hoechst, följt av de enskilda kanalerna. N = 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Lösningar Reagenser Belopp 
Tvättmedel F-10 Näringsblandning (Ham) (1x), +L-glutamin 445 ml
Häst serum 50 ml
Penna/strep 5 ml
Dissociationsbuffert (1: a matsmältningen) Kollagenas typ II 650 E/ml
Tvättmedel 100 ml
Dispase lager (2: a matsmältningen) Dispase i PBS 11 E/ml
Kollagenasfond (2: a matsmältningen) Kollagenas typ II i PBS 1000 E/ml
PBS 1x PBS 10x pulverkoncentrat 9,89 g/l
Autoklaverat/sterilt vatten 1 L
Surt vatten Isättika (100%) Vattenfri för analys 5,15 ml
Autoklaverat/sterilt vatten 895 ml
Kollagenlösning (0,002%) Kollagen från kalvhud 20 ml
Surt vatten 800 ml
Triton X-100 Triton X-100 0,5 % (v/v)
PBS 1x 99.5%
Blockerande buffert PBS 1x 18 ml
Åsna serum 2 ml

Tabell 1: Tabell med recept.

Exempel nr. Namn 
1 Ofärgad
2 Fluorescens minus VCAM1-PeCy7
3 Fluorescens minus SCA1-PacificBlue
4 Fluorescens minus CD31/45-FITC
5 Experimentell fläck (alla fyra antikroppar)

Tabell 2: Översikt över färgning, kontroller och prover som beretts för varje vävnad före sortering.

Vävnad Blandning av antikroppar Celler Undertröjor Lin neg FAP MuSC
Mellangärde ofärgad 100% 82% 55% 0.5% 0.0%
FMO Sca1-PacBlue 100% 83% 19% 0.3% 4.3%
FMO CD31/45-488 100% 84% 40% 9.4% 5.6%
FMO Vcam1-PeCy7 100% 78% 20% 5.6% 0.0%
Målat 100% 77% 19% 2.4% 3.8%
Gracilis Målat 100% 96% 11% 2.6% 1.4%
TACK Målat 100% 88% 16% 2.8% 2.2%
EDL Målat 100% 86% 26% 19.2% 0.8%
Soleus Målat 100% 91% 41% 13.3% 1.1%
GA Målat 100% 94% 51% 6.1% 1.5%
Triceps Målat 100% 92% 30% 2.6% 4.5%
Massör Målat 100% 85% 27% 19.3% 2.6%

Tabell 3: Översikt över relativ förekomst av celltyp i FACS-data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera steg är nyckeln till genomförandet av detta protokoll för att uppnå god avkastning. De enskilda musklerna har en liten volym jämfört med mängden muskler som används i bulkisoleringsprotokoll. Detta resulterar i en risk för att muskeln torkar ut under dissektionen, vilket minskar avkastningen. För att förhindra detta är det viktigt att lägga till medium i musklerna omedelbart efter dissektion. Dessutom, om dissektion tar längre tid, kan huden avlägsnas från en lem i taget för att minska tiden för exponering av musklerna för luft. Den mindre volymen resulterar också i en ökad risk för övermatsmältning. För att motverka detta kräver den nuvarande metoden lägre mängder kollagenas II-enzym och minskade matsmältningstider jämfört med bulkmuskelprotokoll 9,16. Enzymatisk matsmältning beror också på enzymernas renhet, och lägre renhet kan påverka avkastningen negativt. Dessutom är mekanisk matsmältning kritisk. Vid otillräcklig skärning kommer den minskade ytan att hämma enzymatisk nedbrytning och sänka stamcellsutbytet. Vid skärning för mycket kommer den ökade ytan att orsaka översmältning och sänka stamcellsutbytet. Det skakande vattenbadet förhindrar utfällning av den smälta muskeln, förbättrar fördelningen av enzymet och hjälper till att skapa en homogen temperatur, vilket helt och hållet möjliggör kortare inkubationstider. Därför tillåter den nuvarande metoden en signifikant minskning av inkubationstiden jämfört med andra metoder.

Detta protokoll beror på celldissociation och rening. Dessa procedurer efterliknar vävnadsskada, vilket aktiverar stamcellerna. Konsekvent har nya studier visat att MuSCs ändrar sina genuttrycksprogram under isoleringsproceduren27,28,29,30. Som ett resultat skiljer sig de renade stamcellerna från cellerna in vivo när det gäller genuttrycksmönster. En andra begränsande faktor i protokollet är dess beroende av FACS, vilket kräver tillgång till dyr utrustning. FACS är guldstandarden för att isolera flera cellpopulationer samtidigt med hög renhet20. Nya framsteg med magnetiska pärlor och mikrobubblor erbjuder kostnadsminskningar31,32, men om de erbjuder jämförbara utbyten för att arbeta på enskilda muskler måste bestämmas. Slutligen är utbytet av protokollet begränsat på grund av musklernas lilla storlek, vilket medför begränsningar för potentiella nedströmsanalyser.

Tidigare studier har förlitat sig på att slå samman olika muskler vid isolering av MuSC och / eller FAP för att maximera cellutbytet. Detta är dock ett genomsnitt av eventuella vävnadsspecifika skillnader i stamcellsbeteende och funktion mellan olika muskler. Det nuvarande protokollet möjliggör isolering av MuSC och FAP från enskilda muskler för nedströmsanalyser av stamcellsfunktion. Som ett exempel på en nedströmsanalys analyserades stamcellsaktivering genom EdU-inkorporering, vilket avslöjade att stamceller från olika vävnader uppvisar olika aktiveringskinetik. I tidigare arbeten har möjligheten att använda andra nedströmsanalyser visats; dessa analyser kräver mindre cellantal, såsom SmartSeq2 encells-RNA-sekvensering, celltransplantation, mikrofluidisk PCR och klonala expansionsanalyser 22,33,34,35.

Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en metod för dissektion av enskilda muskler för att isolera och studera MuSC och FAPs. Denna strategi kommer att möjliggöra experiment för att få en bättre förståelse för stamcellsfunktionen över olika muskler i hälsa och sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen och inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Cellsortering utfördes vid FACS Core Facility, Århus universitet, Danmark. Siffror skapades med hjälp av Biorender.com. Vi tackar Dr. J. Farup för att dela kaninanti-PDGFRa-antikroppen. Detta arbete stöddes av ett AUFF Starting Grant till E.P. och Start Package bidrag från NovoNordiskFonden till E.P. (0071113) och A.D.M. (0071116).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 72.706.700 1.5 mL tube
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.554.502 15 mL tube
5 mL polystyrene round-bottom tube Falcon, Fisher Scientific  352054 FACS tube without strainer cap
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap Falcon, Fisher Scientific   352235 FACS tube with strainer cap
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) VWR collection 525.0946 5 mL tube
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.547.254 50 mL tube
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387458 (Cat # A31572)
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2420713 (Cat#A31571)
ARIA 3 BD FACS, Core facility Aarhus University
Centrifuge 5810 eppendorf EP022628188 Centrifuge
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387287 (Cat# C10337) Cell Proliferation Kit
Collagen from calf-skin  Bioreagent, Sigma Aldrich  Source: SLCK6209 (Cat# C8919)
Collagenase type II Worthington, Fisher Scientific  Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) Collagenase
Dispase Gibco, Fisher Scientific  Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) Dispase
Donkey serum (non-sterile) Sigma Aldrich, Merck Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)
Dumont nr. 5, 110 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.327 Straight forceps with fine tips
Dumont nr. 7, 115 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.335 Curved forceps
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2453614 (cat# 31550-023)
FITC anti-mouse CD31 BioLegend, NordicBioSite MEC13.3 (Cat # 102506)
FITC Anti-mouse CD45 BioLegend, NordicBioSite 30-F11 (Cat# 103108)
Glacial acetic acid (100%) EMSURE, Merck   K44104563 9Cat # 1000631000)
Head over head mini-tube rotator  Fisher Scientific  15534080 (Model no. 88861052) Head over head mini-tube rotator
Horse serum Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2482639 (cat# 10368902 )
Isotemp SWB 15 FisherBrand, Fisher Scientific 15325887 Shaking water bath
MS2 mini-shaker  IKA  Vortex unit
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) BD microlance, Fisher Scientific  304827 20G needle 
Neutral formalin buffer 10% CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3945.040 Cell strainer 
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend, NordicBioSite D7 (Cat# 108120)
Pax7 primary antibody DSHB Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)
PBS 10x powder concentrate Fisher BioReagents, Fisher Scientific BP665-1
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) BioLegend, NordicBioSite 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)
Pen/strep Gibco, Fisher Scientific  Lot. 163589 (cat# 11548876 )
Pipette tips p10 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2140-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p1000 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2279-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p20 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2149P-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p200 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2069-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Protective underpad Abena  ACTC-7712  60 x 40cm, 8 layers
Rainin, pipet-lite XLS Mettler Toledo, Thermo Scientific  2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 Pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Recombinant anti-PDGFR-alpha RabMAb, abcam AB134123
Scalpel (shaft no. 3) Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.502 Scalpel
Scalpel blade no. 11 Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.0911 Scalpel
Scanlaf mars Labogene class 2 cabinet: Mars Flow bench
ScanR Olympus Microscope, Core facility Aarhus University
Scissors FST 14568-09
Series 8000 DH Thermo Scientific 3540-MAR Incubator
Serological pipette 10 mL VWR 612-3700 Sterile, non-pyrogenic
Serological pipette 5 mL VWR, Avantor delivered by VWR 612-3702 Sterile, non-pyrogenic
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile  BD Emerald, Fisher Scientific 307731 Syringe
TC Dish 100, standard Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3902 Petri dish 
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 Corning, Sigma Aldrich 3764 96-well Half bottom plate
Triton X-100 Sigma Aldrich, Merck Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  2. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
  4. Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
  5. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  7. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  8. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  9. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
  10. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  11. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  12. Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  13. Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  14. Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
  15. Fukada, S. -I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
  16. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  17. Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
  18. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
  19. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
  20. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  21. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
  22. de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
  23. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
  24. Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
  25. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  26. Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
  27. van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
  28. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  29. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  30. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  31. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
  32. Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
  33. Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
  34. Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  35. de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).

Tags

Indragning utgåva 190
Isolering av vilande stamcellspopulationer från enskilda skelettmuskler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frimand, Z., Das Barman, S.,… More

Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., de Morrée, A. Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (190), e64557, doi:10.3791/64557 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter