Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af hvilende stamcellepopulationer fra individuelle skeletmuskler

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver isoleringen af muskelstamceller og fibro-adipogene forfædre fra individuelle skeletmuskler hos mus. Protokollen involverer enkelt muskeldissektion, stamcelleisolering ved fluorescensaktiveret cellesortering, renhedsvurdering ved immunofluorescensfarvning og kvantitativ måling af S-faseindgang ved 5-ethynyl-2'-deoxyuridininkorporeringsassay.

Abstract

Skeletmuskulatur har forskellige populationer af voksne stamceller, der bidrager til homeostase og reparation af vævet. Skeletmuskulaturstamceller (MuSC'er) har evnen til at lave nye muskler, mens fibro-adipogene stamceller (FAP'er) bidrager til stromale understøttende væv og har evnen til at fremstille fibroblaster og adipocytter. Både MuSC'er og FAP'er befinder sig i en tilstand af langvarig reversibel cellecyklusudgang, kaldet hvile. Den hvilende tilstand er nøglen til deres funktion. Hvilende stamceller renses almindeligvis fra flere muskelvæv samlet sammen i en enkelt prøve. Nylige undersøgelser har imidlertid afsløret tydelige forskelle i molekylære profiler og hviledybde af MuSC'er isoleret fra forskellige muskler. Denne protokol beskriver isolering og undersøgelse af MuSC'er og FAP'er fra individuelle skeletmuskler og præsenterer strategier til at udføre molekylær analyse af stamcelleaktivering. Det beskriver, hvordan man isolerer og fordøjer muskler af forskellig udviklingsmæssig oprindelse, tykkelser og funktioner, såsom membran, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) og tyggemusklerne. MuSC'er og FAP'er renses ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og analyseres ved immunofluorescensfarvning og 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporeringsassay.

Introduction

Skeletmuskulatur har en høj kapacitet til regenerering på grund af tilstedeværelsen af muskelstamceller (MuSC'er). MuSC'er er placeret på myofibrene under basallamina og befinder sig i en hvilende tilstand af langvarig, reversibel cellecyklusudgang 1,2,3,4. Ved skade aktiveres MuSC'er og kommer ind i cellecyklussen for at give anledning til forstærkende forfædre, der kan differentiere og smelte sammen til dannelse af nye myofibre 2,5. Tidligere arbejde har vist, at MuSC'er er absolut afgørende for muskelregenerering 6,7,8. Desuden kan en enkelt MuSC indpode og generere både nye stamceller og nye myofibre9. Skeletmuskulatur har også en population af mesenkymale stromale celler kaldet fibro-adipogene forfædre (FAP'er), som spiller en afgørende rolle i at understøtte MuSC-funktionen under muskelregenerering 6,10,11,12.

På grund af deres potentiale til at koordinere muskelregenerering har der været enorm interesse for at forstå, hvordan MuSC'er og FAP'er fungerer. Hvilende MuSC'er er kendetegnet ved ekspression af transkriptionsfaktorerne Pax7 og Sprouty1 og celleoverfladeproteinet calcitoninreceptor, mens hvilende FAP'er er markeret med celleoverfladeproteinblodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Tidligere undersøgelser har vist, at MuSC'er og FAP'er kunne renses fra skeletmuskler ved hjælp af celleoverflademarkører og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Mens disse protokoller i høj grad har avanceret evnen til at studere MuSC'er og FAP'er, er en ulempe, at de fleste af disse protokoller kræver isolering af MuSC'er fra en pulje af forskellige muskelvæv. Nyligt arbejde fra os og andre har afsløret forskelle i cellefænotype og genekspressionsniveauer mellem MuSC'er isoleret fra forskellige væv22,23. MuSC'er fra membranen, triceps og gracilis viser hurtigere aktivering end MuSC'er fra nedre bagbensmuskler22, mens MuSC'er fra ekstraokulær muskel viser hurtigere differentiering end MuSC'er fra membranen og nedre bagbenmuskler23.

Denne protokol beskriver isoleringen af MuSC'er og FAP'er fra individuelle skeletmuskler (figur 1). Dette omfatter dissektion af membranen, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) og tyggemuskler. Dissekerede muskler dissocieres efterfølgende ved enzymatisk fordøjelse ved hjælp af collagenase II (en protease, der specifikt er rettet mod Pro-X-Gly-Pro-aminosekvensen i kollagen, hvilket muliggør nedbrydning af bindevæv og vævsdissociation24) og dispase (en protease, der spalter fibronectin og kollagen IV, hvilket muliggør yderligere celledissociation25). MuSC'er og FAP'er isoleres fra enkeltcellesuspensioner af FACS. Som eksempler på nedstrømsassays til celleanalyse bestemmes stamcelleaktivering ved assay af 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporering, mens cellerenhed bestemmes ved immunofluorescensfarvning for de celletypespecifikke markører Pax7 og PDGFRa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol er udført i overensstemmelse med Aarhus Universitets retningslinjer for dyrepleje og lokale etiske regler.

BEMÆRK: Sørg for at overholde reglerne fra den lokale etiske komité for dyreforsøg og håndtering af post mortem gnaverprøver. Mus er en potentiel kilde til allergener; Hvis det er tilgængeligt, skal du tænde for udstødningsventilation og placere det over arbejdsområdet for at undgå overdreven eksponering for allergener. Alternativt kan du bære en ansigtsmaske, hvis eksperimentet udføres regelmæssigt. Denne protokol indebærer at arbejde med skarpe genstande, og forskere anbefales at gøre sig bekendt med procedurerne og logistikken for anvendelse af førstehjælp i tilfælde af et snit.

1. Forberedelse (1-2 timer; dagen før dissektion)

BEMÆRK: Opløsningerne, pladerne og medierne fremstilles under sterile forhold og filtreres (0,45 μm) før brug, medmindre andet er angivet. Der fremstilles stamopløsninger af dispase (11 E/ml i PBS) og collagenase II (1 000 E/ml i PBS), og de opbevares ved -20 °C (tabel 1). Lagrene optøes og anvendes til sekundær nedbrydning i trin 4.2.6.

  1. Kollagenbelægning af en 96-brønds halvarealplade
    1. Forbered surt vand. Tilsæt 5,15 ml iseddike til 895 ml autoklaveret vand i et 2 L bægerglas.
    2. Filtrer opløsningen ved hjælp af en 0,45 μm, 500 ml filterenhed. Overfør 800 ml af det filtrerede sure vand til en 1 L flaske.
    3. Tilsæt 40 ml steril kollagenstamopløsning til flasken. Bland forsigtigt opløsningen ved omsvøbning og opbevar den ved 4 °C, beskyttet mod lys, indtil brug.
    4. Overtræk en eller flere 96-brønds halvområdeplader med kollagen. Der tilsættes 50 μL kollagenbelægningsopløsning til hvert hul, og pladen belægges natten over (ON) ved 4 °C.
    5. Opsug kollagenopløsningen den følgende dag ved hjælp af en vakuumbaseret aspirator og vask pladen 2x ved at tilsætte 100 μL autoklaveret vand og aspirere.
    6. Vip låget på pladen og lad pladen tørre i emhætten i 20-30 min.
    7. Når pladen er helt tør, pakkes den ind i aluminiumsfolie og opbevares ved 4 °C indtil brug. Overtrukne plader kan opbevares i op til 4 uger.
      BEMÆRK: Kollagenbelægning muliggør cellevedhæftning. Det er vigtigt at vaske frit kollagen væk, da det kan forstyrre cellefunktion og signalering (f.eks. binding af kollagen V til calcitoninreceptorerne på MuSC'erne)26.

2. Forberedelse (0,5 timer; dissektionsdagen):

  1. Udarbejdelse af yderligere løsninger og arbejdsområde
    1. Forbered sterilt vaskemedium ved at tilsætte 50 ml hesteserum og 5 ml pen/strep til 445 ml HAM's F10-medium. Arbejd i en laminar strømningshætte for at forhindre forurening.
    2. Beregn og vej den passende mængde kollagenase II, der er nødvendig for at forberede dissociationsbufferen. (For hver mus bruges 26.000 enheder collagenase II til at fremstille 40 ml dissociationsbuffer ved 650 U / ml collagenase II). Tilsæt det vejede pulver til et 50 ml konisk rør og opbevar det på is.
    3. Forbered to 10 cm retter til muskelisolering. Hæld 3 ml vaskemedium (tabel 1) i hver petriskål. Tag 10 cm skålene uden for laminar flowhætten til senere brug.
    4. Forbered materialerne til muskelfordøjelse. Baseret på antallet af prøver mærkes det passende antal 50 ml koniske rør (otte pr. Mus, en for hver muskel) og efterlades på bænken. Spray nålene, 10 ml sprøjter og 40 μm cellesier ned med 70% ethanol (otte af hver pr. mus, en for hver muskel) og før dem ind i laminar flowhætten. Fastgør nåle til sprøjterne.
    5. Forbered materialerne til sortering. Mærk 5 ml rundbundede rør med cellesihætter baseret på antallet af prøver. Dæk rørene med aluminiumsfolie og lad dem være i den laminære strømningshætte.
    6. Svarende til antallet af prøver og populationer, der sorteres, fremstilles 1,5 ml mikrocentrifugeglas med 500 μL vaskemedium til celleopsamling (16 pr. mus, et rør til hver cellepopulation pr. muskelvæv). Opbevar disse rør på is.

3. Muskeldissektion (20-30 min)

BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen udføres i et ikke-sterilt miljø. Proceduren kan udføres ved hjælp af en eller flere mus. En mus er dog tilstrækkelig til at forberede både prøver til sortering og kontroller til opsætning af kompensations- og FACS-porte.

  1. Initiering af muskelisolering
    1. Forbered det ikke-sterile arbejdsområde til dissektion og muskelisolering. Desinficer arbejdsstationen med 70% ethanol. Placer en steril beskyttende engangsunderpude på arbejdsstationen.
    2. Brug en permanent markør til at tegne en kasse for hver muskel oven på et petriskållåg for senere at placere den isolerede muskel.
    3. Sprøjt de kirurgiske instrumenter med 70% ethanol.
    4. Aflive musen ved CO2 indånding og / eller cervikal dislokation.
    5. Isoler de enkelte muskler (fra en mus ad gangen, hvis du bruger flere mus). Sprøjt musen med 70% ethanol for at våde pelsen og desinficere huden. Placer musen på underpuden med maven opad. En oversigt over alle otte muskler og deres respektive anatomiske placering er vist i figur 2A.
  2. Isolering af gracilis muskler
    1. Brug en saks til at lave et 0,5 cm vandret snit i mavehuden.
    2. Fjern huden: Brug begge hænder til at bruge tommelfingeren og pegefingeren til at gribe fat i den øverste og nederste del af snittet. Træk i hver side af snittet for at rive og dele huden på torso og underekstremiteter. Træk huden i underekstremiteten ned for at udsætte begge bagben (nedad fra hofte til tæer). Træk ligeledes opad for at udsætte torsoen.
    3. Find gracilis muskel (indre lår). Brug buede tang til at gribe fat i gracilis og løft musklen lidt (figur 2B). Lav et 0,5 cm snit med en saks (figur 2C), hvorfra gracilis skæres ud og isoleres fuldstændigt (figur 2D). Gentag dette for det andet ben for at isolere den anden gracilis muskel.
  3. Isolering af TA- og EDL-musklerne (nedre bagben, ventral side)
    1. Brug en skalpel til at skære fascia ved at lave et 0,5 cm snit langs sidesiden af skinnebenet (den tykkeste nedre bagbensknogle). Brug buede tang til at gribe fascia og træk for at fjerne den.
      BEMÆRK: Når fascia er helt fjernet, er senerne i den distale ende af bagbenet synlige og kan adskilles.
    2. Brug lige tang med superfine spidser til at gå ind mellem den distale sene af TA (lateral side af skinnebenet) og EDL (under TA) (figur 2E-G).
      BEMÆRK: Med erfaring kan den stumpe ende af et skalpelblad bruges i stedet for de lige tang.
    3. Skub tangen mod den proksimale ende af musklen for at adskille musklerne.
    4. Bring den lige tang tilbage til den distale ende. Skær den distale sene.
    5. Tag forsigtigt fat i muskelens distale sene med buede tang. Løft musklen op og over dens proksimale fastgørelse og skær forsigtigt den proksimale sene så tæt på dens fastgørelsespunkt som muligt. Skær den anden ende og overfør TA til en petriskål.
    6. Brug lige tang med superfine spidser til at gå under den distale sene af EDL.
    7. Skub tangen mod den proksimale ende af musklen for at adskille musklerne.
    8. Bring den lige tang tilbage til den distale ende. Skær den distale sene uden at beskadige musklen.
    9. Tag forsigtigt fat i EDL's distale sene med buede pincet. Løft musklen op og over dens proksimale fastgørelse og skær forsigtigt den proksimale sene så tæt på dens fastgørelsespunkt som muligt. Skær den anden ende og overfør EDL til en petriskål. Gentag for det andet bagben for at isolere den anden TA- og EDL-muskel.
  4. Isolering af GA- og soleus-musklerne (nedre bagben, dorsal side)
    1. Brug lige tang med superfine spidser til at gå ind mellem akillessenen og de nedre bagben.
    2. Skub tangen mod den proksimale ende af musklen for at adskille musklen.
    3. Bring den lige tang tilbage til den distale ende. Skær den distale sene.
      BEMÆRK: For at undgå at beskadige soleusmusklen, som ligger under GA, skal du skære så tæt på dens distale akillessenefastgørelse som muligt, hvilket efterlader en del af senen, der er fastgjort til GA (figur 2H).
    4. For at afsløre og isolere soleusmusklen skal du trække GA op og over fibula (den tyndeste knogle af de to knogler i underben).
      BEMÆRK: Solus-musklen kendetegnes ved sin karakteristiske mørkerøde farve i forhold til GA (figur 2I).
    5. Find den proksimale soleus sene. Med lige tang, gå ind mellem soleus og GA.
    6. Flyt tangen mod den distale ende af musklen for at adskille soleus fra GA.
    7. Isoler soleus først. Skær dens proksimale sene, tag fat i senen med buede pincet, og løft forsigtigt sålen for at få adgang til dens distale sene. Skær den distale sene for at isolere soleus fra GA. Anbring soleus i petriskålen med vaskemedium (figur 2J)
    8. Skær GA og læg den i petriskålen. Gentag dette for det andet ben for at isolere den anden soleus og GA muskler.
  5. Isolering af tricepsmusklerne (øvre forben, dorsal side)
    1. Brug lige tang med superfine spidser til at gå ind mellem tricepsmusklen og humerusbenet (hovedknoglen i det øverste forben) (figur 2K-M).
    2. Skub tangen mod den proksimale ende af musklen for at adskille musklen. Skær den proksimale ende af musklen.
    3. Tag fat i den proksimale ende af triceps med buede tang og træk den op og over albuen for at få adgang til den distale sene. Skær triceps distale sene, overfør musklen til en petriskål, og gentag proceduren for det andet forben.
  6. Isolering af tyggemusklerne
    1. Fjern pels og hud fra kæben. Lav et vandret snit på 0,5 cm med en saks. Brug begge hænder til at klemme på hver side af snittet ved hjælp af tommel- og pegefingrene. Fjern huden ved at trække opad og nedad.
    2. Find masseterens hovedsene (kaudal, under øjet). Indsæt det flade skalpelblad mellem knoglen og musklen (figur 2N). Skær senen.
    3. Grib den store massetersene med buede pincet. Skær det med et skalpelblad eller en saks i rostral retning for at adskille tyggemusklen fra kæbebenet (figur 2O, P). Placer den isolerede tyggemuskel i petriskålen. Gentag proceduren for den anden massetermuskel.
  7. Isolering af membranmusklen
    BEMÆRK: Når du isolerer membranmusklen, skal du sørge for at skære forsigtigt for at undgå at skære ind i de indre organer og tarmene, da dette er en kilde til forurening.
    1. Brug en saks til at lave en thoracotomi (et snit mellem ribbenene) midt på brystbenet (en lang flad knogle, der ligger midt på brystet, som forbinder ribbenene) og skære gennem brystbenet (figur 2Q).
    2. Udsæt membranen ved at skære 360° gennem brystkassen.
    3. Adskil overkroppen fra den nederste del/abdomen. Brug en saks til at klippe luftrøret, spiserøret, vena cava og abdominal aorta.
    4. Adskil membranen fra underkroppen. Brug en saks til at lave en laparotomi (et kirurgisk snit i bughulen) 1 cm under brystbenet og lav et 360 ° snit (figur 2R).
    5. Placer den lukkede saks mellem brystkassen og maveorganerne og tryk ned. Træk forsigtigt i brystkassen for at adskille den fra abdominale organer (figur 2S).
    6. Adskil membranen fra ribbenburet. Hold membranen løst mellem to fingre og skær gennem brystkassen med en saks. Brug en saks til at klippe membranen så tæt på ribbenene som muligt i et 360° snit. Læg den isolerede membran i en petriskål.
      BEMÆRK: Under cervikal dislokation kan membranen briste og kollapse mod brystkassen, hvilket gør det vanskeligt at lokalisere. Musklen kan stadig isoleres. Identificer den kollapsede muskel, hold den mellem to fingre, og skær 360 ° efter brystkassen.

4. Muskelfordøjelse til en enkeltcellesuspension (~ 1 h 35 min)

BEMÆRK: Følgende trin omfatter ikke-sterile (trin 4.1-4.2) og sterile arbejdsmiljøer (trin 4.3).

  1. Mekanisk fordøjelse
    1. Placer de isolerede muskler i låget på en 10 cm petriskål.
    2. Brug buede tang til at gribe fat i de isolerede muskler en efter en. For soleus og GA, fjern de resterende dele af akillessenen.
    3. Brug en saks til at hakke de isolerede muskler en efter en ved at skære dem i ca. 1 mm3 stykker.
  2. Enzymatisk fordøjelse
    1. Forbered muskeldissociationsbufferen ved at tilsætte 40 ml koldvaskemedium til det vejede collagenase II-pulver (collagenase II: 650 E/ml i vaskemedier).
      BEMÆRK: Brug frisklavet muskeldissociationsbuffer for at sikre optimal enzymatisk aktivitet.
    2. Overfør de hakkede muskler til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml dissociationsbuffer.
    3. Der inkuberes tuben i 35 minutter i et 37 °C rystevandbad ved 60 omdr./min.
    4. Efter inkubation tilsættes vaskemedium til et samlet volumen på 15 ml. Drej røret ved 1.600 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Supernatanten suges ned til et volumen på 4 ml ved hjælp af en vakuumbaseret aspirator. For at undgå at forstyrre pelleten skal du langsomt aspirere fra toppen og fjerne flydende fedt.
    6. Optøning af lageralikvoter af dispase og collagenase II. Der tilsættes 500 μL collagenase II-opløsning (1.000 E/ml stam, -20 °C) til den resterende 4 ml prøve. Derefter tilsættes 500 μL dispasopløsning (11 E/ml bouillon, -20 °C).
      BEMÆRK: Dispase kan generere et bundfald. Hvis dette sker, drejes dispasestamopløsningen ved 10.000 x g, 1 min før brug. Den nu klare supernatant overføres til cellesuspensionen uden at forstyrre pelletsen.
    7. Vortex prøverne kort for at opløse pelleten.
    8. Prøverne inkuberes i 20 minutter i et 37 °C rystevandbad ved 60 omdr./min.
      BEMÆRK: Fordøjelse af et stort antal muskelprøver er tidskrævende. For trin 4.3.1-4.3.6 anslås det, at der tages 2-5 minutter pr. prøve. Dette trin går hurtigere, når det udføres parallelt af to eller flere forskere.
  3. Homogenisering af prøver
    1. Homogeniser cellesuspensionen. Overfør suspensionen fra 15 ml røret til et 50 ml rør. Brug en 10 ml sprøjte med en 20G kanyle til at resuspendere prøven ved at trække prøven op og ned gennem kanylen 5x.
      BEMÆRK: Hvis stykker af ufordøjet muskel tilstopper nålen, skal du tørre dem af på et papirvæv.
    2. Placer en 40 μm cellesi på et nyt 50 ml konisk rør.
    3. Tag hele cellesuspensionen op i sprøjten og sil prøven i et nyt 50 ml konisk rør med en cellesi ovenpå. Sil prøven ved at fordele det samlede volumen direkte på filteret.
    4. For at udtage alle mononukleerede celler tilsættes 20 ml vaskemedie til det tomme koniske rør og hældes gennem cellesien i det 50 ml koniske rør, der indeholder den silede prøve. Hent det resterende volumen under cellesilen med en p1000-pipette.
    5. Kassér cellesien og drej prøven ved 1.600 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    6. Ved pipettering med en p1000-pipette suges supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    7. Ved pipettering med en p1000-pipette resuspenderes membranpillen i 500 μL vaskemediet, og de øvrige muskelprøver resuspenderes i 300 μL vaskemedie hver.
      OBS: Mellemgulvet er den største af musklerne med det højeste stamcelleindhold og kan derfor bruges til kontrolfarvningerne.

5. Farvning og sortering (~ 40 min + 30 min sortering / prøve)

BEMÆRK: Arbejd i et sterilt miljø på is i følgende trin.

  1. En 50 μL prøve af membrancellesuspensionen overføres til fire nye 2 ml mikrocentrifugeglas til kontrolpletterne (50 μL hver). Der tilsættes 250 μL vaskesubstrat til hvert kontrolrør til et slutvolumen på 300 μL.
  2. Der tilsættes 3 μL (1:100) fluorescens minus-one-antistoffer (FMO-kontrol) til de tre kontrolfarverør, og det ene rør efterlades uden antistoffer (ufarvet kontrol) (se tabel 2).
  3. Der tilsættes 3 μL (1:100) antistoffer (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC og SCA1-PacificBlue) til de resterende muskelenkeltcellesuspensioner, inklusive den resterende membranprøve.
  4. Cellesuspensionerne inkuberes i 15 minutter ved 4 °C i en head-over-head shaker.
    BEMÆRK: Kontrolfarvningerne er nødvendige for at bestemme baggrundsfluorescensniveauer og indstille portene til flowcytometri. Forskellige antistoffer kan anvendes, men hver vil have en specifik arbejdskoncentration og inkubationstid, der skal testes. Hvis der anvendes antistoffer fra forskellige leverandører, kan koncentrationen og dermed fortyndingen variere. Et cellelevedygtighedsfarvestof kan tilsættes til farvningsblandingen for at eliminere eventuelle døde eller døende celler under sorteringen.
  5. Centrifuger prøverne ved 1.600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, uden at pelletsen forstyrres ved pipettering.
  6. Ved pipettering med en p1000-pipette resuspenderes hver prøve i 800 μL vaskemedium.
  7. Prøverne filtreres ved hjælp af et FACS-rør med en cellesihætte (40 μm) for at fjerne eventuelle resterende celleklumper (eller aggregater).
  8. Cellesien vaskes ved at tilsætte yderligere 800 μL vaskemediet.
  9. Hold prøverne dækket med aluminiumsfolie på is indtil analyse.
    BEMÆRK: Hvis cellesuspensionen på dette tidspunkt virker uklar/tæt på grund af den høje koncentration af celler, tilsættes yderligere 800 μL af vaskemediet for at reducere celletætheden.
  10. Start FACS med en 70 μm dyse.
  11. Brug kontrolelementerne uden farvning og FMO til at indstille gatingstrategien: MuSC'er er negative for CD45-FITC, CD31-FITC og SCA1-PacBlue og er positive for VCAM1-PECy7; FAP'erne er negative for CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 og positive for SCA1-PacBlue.
  12. De farvede enkeltcellesuspensioner sorteres ved hjælp af tovejssortering, og MuSC'erne og FAP'erne samles i separate opsamlingsrør, der indeholder 500 μL vaskemedium.
    BEMÆRK: Ved brug af FACS med fire lasere (konfiguration: 70 μm dyse, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm) kræver den valgte kombination af fluoroforer ikke kompensation for fluorescenssignal. Hvis der imidlertid anvendes et andet flowcytometer eller en anden kombination af fluoroforer, anbefales yderligere enkeltfarvede kontrolprøver til kompensation. Fra de mindre muskler (EDL, soleus, TA) kan der forventes udbytter på 3.000 MuSC'er og 5.000 FAP'er. For de andre større muskler kan der forventes udbytter på 20.000 MuSC'er og FAP'er. Hændelsestællinger, der er angivet af FACS-softwaren, kan afvige fra det faktiske antal levedygtige celler i opsamlingsrøret. Cellenumre kan bekræftes ved celletælling ved hjælp af et hæmocytometer.
  13. Drej de sorterede celler ned ved 1.600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Ved pipettering aspireres supernatanten uden at forstyrre cellepellet.
  14. Der tilsættes 100 μL vaskesubstrat til hver prøve, og cellerne resuspenderes forsigtigt uden at skabe luftbobler. De 100 μL af den resuspenderede prøve overføres til en kollagenbelagt plade med 96 brønde med halvt areal. Plade 1.000-3.000 celler pr. Brønd.
    BEMÆRK: Hvis cellerne ikke resuspenderes korrekt, kan cellerne klæbe sammen i klumper og forvirre senere mikroskopianalyser.
  15. Undersøg cellerne under mikroskopet og noter deres fordeling, form og størrelse.
  16. Pladen inkuberes ved 37 °C, 5% CO2. Cellerne klæber inden for 2 timer.
    BEMÆRK: Det anbefales at bekræfte renheden af de indsamlede cellepopulationer, enten ved flowcytometrianalyse (ved at lægge en delprøve af den sorterede prøve på sortereren og registrere et lille antal hændelser) eller ved antistoffarvning af de belagte celler efterfulgt af mikroskopi (Pax7 er en definerende markør for muse-MuSC'er, PDGFRa er en definerende markør for muse-FAP'er). Startende ved afsnit 7 nedenfor er en protokol til farvning af celler for Pax7- og PDGFRa-proteinniveauer.

6. EdU-inkorporeringsanalyse

BEMÆRK: Arbejd under sterile forhold, og brug den kemiske damphætte ved håndtering af paraformaldehyd (PFA) til følgende trin. EdU er en nukleotidanalog inkorporeret i DNA'et, når cellerne går gennem S-fasen af cellecyklussen. Det er mutagent i høje koncentrationer. Brug altid handsker, når du håndterer EdU. Tjek de lokale retningslinjer for håndtering af EdU-affald.

  1. EdU-puls (dag 1)
    1. Forbered en arbejdsløsning på 2x EdU i et frisk vaskemedium.
    2. Tag 96-brøndpladen med cellerne ud af inkubatoren. Undersøg cellerne under mikroskopet for at overvåge sammenløbet. Flyt ind i laminar flowhætte.
    3. 50 μL medium fjernes fra pladen ved pipettering. Tilsæt 50 μL 2x EdU-arbejdsløsning, så det endelige volumen i brønden er 100 μL.
    4. Cellerne dyrkes under tilstedeværelse af EdU i det tilsigtede tidsrum ved 37 °C, 5% CO2.
      BEMÆRK: Tidspunktet og varigheden af EdU-pulsen kan variere. I gennemsnit tager hvilende MuSC'er 2 dage at aktivere og fuldføre deres første celledeling19 fuldt ud. EdU kan føjes til de sorterede celler umiddelbart efter plettering.
  2. Fiksering (dag 2)
    OBS: PFA er kræftfremkaldende. Håndter altid PFA med forsigtighed. Gør dig bekendt med de lokale regler for håndtering af PFA og bortskaffelse af affald.
    1. Tag 96-brøndpladen med cellerne ud af inkubatoren. Undersøg cellerne under mikroskopet, og flyt pladen ind i damphætten.
    2. Ved pipettering fjernes mediet, og cellerne fikseres ved at tilsætte 50 μL 4% PFA til hvert hul. Pladen inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) i en kemisk stinkhætte.
    3. Fjern PFA'en med en pipette og kassér den i en egnet affaldsbeholder.
    4. Cellerne vaskes ved at tilsætte 100 μL PBS til alle hullerne. Ved pipettering aspireres PBS og vaskes gentaget. Opbevar cellerne i 100 μL PBS.
      BEMÆRK: For at undgå udvaskning af celler skal PBS fordeles til siden af brønden ved at pipettere langsomt.
  3. EdU-mærkning
    1. Permeabiliser cellerne før EdU-detektion ved at fjerne PBS og tilføje 100 μL 0,5% Triton X-100 i PBS. Pladen inkuberes i 5 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: Triton X-100 er et overfladeaktivt middel og kan forårsage hudirritation. Håndter forsigtigt og brug altid handsker.
    2. Efter 5 minutter aspireres Triton X-100 og tilsættes 100 μL PBS.
    3. Forbered en EdU-klik-kemi-reaktionsblanding i henhold til producentens protokol.
    4. Opsug PBS og tilsæt 33 μL af EdU-klik-kemi-reaktionsblandingen. Inkuber pladen i 30 minutter ved RT.
    5. Opsug EdU-klik-kemi-reaktionsblandingen og vask cellerne med 100 μL PBS.
    6. PBS suges, der tilsættes 100 μL PBS med Hoechst (1:2.000), og der inkuberes lysbeskyttet i 10 minutter ved RT.
    7. Hoechst suges til syn, og der vaskes to gange ved tilsætning af 100 μL PBS. Opbevar cellerne i 100 μL PBS ved 4 °C i mørke.
    8. Billede cellerne på et omvendt mikroskop. Cellerne kan opbevares i mørke i flere måneder, så længe brøndene ikke tørrer ud.
      BEMÆRK: Det er muligt at co-plette cellerne med antistoffer. I dette tilfælde fortsæt med et blokerende trin efterfulgt af inkubation med det primære antistof. Vælg et sekundært antistof med en konjugeret fluorofor, hvis emissionsspektrum ikke overlapper spektret for den fluorofor, der anvendes til at detektere EdU. Sørg for ikke at bruge sekundære antistoffer med fluoroforer, der overlapper Hoechsts spektralområde.

7. Immunofluorescensfarvning

BEMÆRK: Denne del af protokollen kan udføres uafhængigt af afsnit 6. Når du springer afsnit 6 over, skal du udføre trin 6.3.1 og 6.3.2 for at aktivere cellepermeabilisering, før du fortsætter med trin 7.2 nedenfor.

  1. Tag pladen med de EdU-mærkede celler ud.
  2. Forbered 20 ml blokerende buffer ved at tilsætte 2 ml æselserum til 18 ml PBS.
  3. For at forhindre uspecifik antistofbinding fjernes 100 μL PBS fra hvert hul, og der tilsættes 50 μL blokerende buffer med en p200-pipette. Inkuber pladen i 30 minutter ved RT, beskyttet mod lys og dækket af aluminiumsfolie for at forhindre fotoblegning af den fluoroformærkede EdU.
    BEMÆRK: Cellerne er fastgjort til bunden af brønden, men kan løsne sig, hvis der påføres for meget kraft ved pipettering.
  4. Mens du blokerer prøverne, skal du forberede den primære antistofblanding. Der tilsættes 8,0 μL (1:100) anti-Pax7 mus og kanin-PDGFRa til 800 μL blokerende buffer for at plette 16 huller (otte væv, to celletyper).
  5. Efter blokering fjernes æselserumet og tilsættes 50 μL af den primære antistofblanding til hvert hul. Pladen inkuberes natten over ved 4 °C, dækket af aluminiumsfolie.
  6. Efter inkubation fjernes det primære antistof, og der tilsættes 50 μL Triton (0,5% i PBS) til hver af hullerne. Inkuber pladen i 5 minutter ved RT beskyttet mod lys for at vaske det ubundne antistof væk. Gentag vasken tre gange.
  7. Forbered den sekundære antistofmasterblanding ved at tilsætte 1,0 μL (1:1.000) æselanti-mus-Alexa647 og æselanti-kanin-Alexa555 til et mikrocentrifugerør indeholdende 1.000 μL blokerende buffer.
  8. Der tilsættes 33 μL af masterblandingen af sekundære antistoffer til hvert hul. Inkuber pladen i 60 minutter ved RT beskyttet mod lys.
  9. Det overskydende sekundære antistof fjernes ved pipettering, tilsættes 50 μL Triton (0,1% i PBS), og inkuberes i 5 minutter ved RT beskyttet mod lys. Gentag vasken tre gange.
  10. Til sidst tilsættes 100 μL PBS. Beslut, om der straks skal tages billeder af pladen ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop med et afkølet CCD-kamera, eller opbevar pladen ved 4 °C indtil senere analyse ved at forsegle pladekanterne med parafilm og pakke den forseglede plade ind i aluminiumsfolie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter protokollen for individuel skeletmuskelisolering (figur 2) blev gracilis-, TA-, EDL-, GA-, soleus-, triceps-, tygger- og membranmusklerne isoleret fra tre schweiziske hanmus, der var blevet afbrudt fra et lokalt avlsprogram (figur 2). Efter vævsdissociation og antistoffarvning blev MuSC'er og FAP'er fra de enkelte muskler renset af FACS (figur 3). Den oprindelige gating blev opnået med en ufarvet prøve for at identificere cellerne og adskille singlets fra dubletter (figur 3A). De efterfølgende porte blev indstillet ved hjælp af FMO-kontroller til at identificere farvningstærskler (figur 3B). Den farvede prøve blev derefter lukket for CD31/CD45-FITC og Sca1-PacBlue. SCA1+/CD31-/CD45-populationen (FAP'er) blev sorteret i et separat indsamlingsrør, mens den dobbelte negative population blev gated og plottet for VCAM1-PECy7 og forward scatter (FSC). VCAM1+-populationen (MuSC'er) blev sorteret i et separat opsamlingsrør. MuSC'er og FAP'er blev kvantificeret som procentdelen af singlets (tabel 3) og sorteret i separate opsamlingsrør indeholdende 500 μL vaskemedium. Membran- og tricepsmuskel-enkeltcellesuspensionerne har en højere relativ overflod af MuSC'er end FAP'er, mens de andre enkeltcellesuspensioner har en højere relativ overflod af FAP'er end MuSC'er (tabel 3).

Af de sorterede celler blev 1.000-3.000 celler podet og inkuberet i 24 timer. Efter 24 timers inkubation blev substratet fjernet og erstattet med et frisk medium indeholdende EdU. Cellerne blev fikseret til 48 timer, farvet for EdU og efterfølgende med antistoffer mod Pax7-protein eller PDGFRa-protein og afbildet ved hjælp af et inverteret epifluorescensmikroskop. Billeder blev kvantificeret ved hjælp af Fiji-pluginet i ImageJ. Robust EdU-farvning blev observeret, selvom fraktionen af EdU-positive celler var forskellig for de to stamcelletyper og de forskellige muskler (figur 4A-C). MuSC'er isoleret fra enten EDL eller GA viste signifikant lavere EdU-inkorporering sammenlignet med MuSC'er isoleret fra enten TA, membran, gracilis eller triceps, mens MuSC'er isoleret fra tyggemusklerne og soleus falder imellem og ikke er signifikant forskellige fra nogen af grupperne (figur 4A, B). Dette er i overensstemmelse med vores tidligere resultater22. Desuden er de væv, hvorfra MuSC'erne viser høje EdU-inkorporeringsniveauer, de samme væv, hvorfra MuSC'erne tidligere viste sig at udtrykke høje niveauer af Pax3-protein22. FAP'er isoleret fra EDL viste en signifikant lavere EdU-inkorporering sammenlignet med FAP'er isoleret fra GA og soleus, mens FAP'er isoleret fra TA viste en signifikant lavere EdU-inkorporering sammenlignet med FAP'er isoleret fra soleus (figur 4A, C). Dette understreger vigtigheden af at analysere stamceller fra individuelle væv snarere end at samle muskler fra forskellige væv til isolering. For alle væv var den gennemsnitlige fraktion af EdU-positive MuSC'er højere sammenlignet med den gennemsnitlige fraktion af EdU-positive FAP'er, hvilket tyder på, at MuSC'er aktiveres hurtigere under de givne betingelser.

Endelig blev cellerenheden bekræftet med immunofluorescensfarvning (figur 4D). I gennemsnit var 97,71% (± 1,38%) af MuSC'erne farvede positive for Pax7-protein, og 88,16% (±6,35%) af FAP'erne farvede positive for PDGFRa-protein, hvilket bekræfter specificiteten af vores stamcelleisolationsprocedure (figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Skematisk abstrakt af protokollen. Skematisk, der viser de to hovedsegmenter i protokollen, MuSC-isolering (øverste panel), hvilende assay (nederste panel) og de vigtigste trin i den metode, der anvendes i hver af dem. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Muskelplacering og isolation. (A) Et skema, der viser placeringen af hver muskel. (B-S) Påvisning af muskelisolation for (B-D) gracilis, (E-G) TA/EDL, (H-J) triceps, (K-M) GA/soleus, (N-P) masseter og (Q-S) membranmuskler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Gating strategi brugt til at identificere og sortere MuSC'er og FAP'er i en membran muskelprøve. Celler identificeres baseret på cellestørrelse (Forward Scatter (FSC)) og granularitet (Side Scatter (SSC)). Singlets vælges baseret på FSC-A og FSC-W. Afstamningsceller er gated til efterfølgende identifikation af MuSC'er (Lineage-/VCAM1+), og FAP (Lineage-/SCA1+) celler er gated for at identificere FAP'er. Den samme gating-strategi blev anvendt på (A) en ubemandet kontrol, (B) FMO-kontroller (FMO-SCA1PacBlue, FMO-CD31/45-FITC og FMO-VCAM1-PECy7) og (C) en farvet prøve. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kvantificering af celleaktivering ved EdU-farvning. (A) Repræsentative billeder af EdU-farvning af MuSC'er (toppaneler) og FAP'er (bundpaneler) fra en membranprøve. Der vises flettede billeder af EdU og Hoechst (venstre paneler) og de enkelte kanaler i grønt (EdU, midterste paneler) og blåt (Hoechst, højre paneler). (B,C) Søjlediagram, der viser procentdelen af EdU-positive (B) MuSC'er eller (C) FAP'er for angivne muskler. Afbildet er gennemsnittet ± SEM. Hver prik repræsenterer en mus. Statistisk analyse blev udført i GraphPad ved hjælp af to-tailed Student's t-tests, med signifikans sat til *p < 0,05 og **p < 0,01. (D) Immunofluorescensfarvning af MuSC'er (toppaneler) og FAP'er (bundpaneler) med antistoffer mod MuSC-markøren Pax7 (venstre side) og FAP-markøren PDGFRa (højre side). Der vises flettede billeder af Pax7 med Hoechst efterfulgt af de enkelte kanaler og flettede billeder af PDGFRa med Hoechst efterfulgt af de enkelte kanaler. N = 3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Løsninger Reagenser Beløb 
Vaskemiddel F-10 Næringsstofblanding (skinke) (1x), +L-glutamin 445 ml
Hest serum 50 ml
Pen/strep 5 ml
Dissociationsbuffer (1. fordøjelse) Collagenase type II 650 U/ml
Vaskemiddel 100 ml
Dispase bestand (2. fordøjelse) Dispase i PBS 11 U/ml
Collagenase bestand (2. fordøjelse) Collagenase type II i PBS 1000 U/ml
PBS 1x PBS 10x pulverkoncentrat 9,89 g/l
Autoklaveret/sterilt vand 1 L
Surt vand Iseddike (100%) Vandfri til analyse 5,15 ml
Autoklaveret/sterilt vand 895 ml
Kollagenopløsning (0,002%) Kollagen fra kalveskind 20 ml
Surt vand 800 ml
Triton X-100 Triton X-100 0,5% (v/v)
PBS 1x 99.5%
Blokering af buffer PBS 1x 18 ml
Æselserum 2 ml

Tabel 1: Tabel over opskrifter.

Prøve nr. Navn 
1 Ufarvet
2 Fluorescens minus VCAM1-PeCy7
3 Fluorescens minus SCA1-PacificBlue
4 Fluorescens minus CD31/45-FITC
5 Eksperimentel plet (alle fire antistoffer)

Tabel 2: Oversigt over farvning, kontrol og prøver forberedt for hvert væv før sortering.

Væv Antistofblanding Celler Slåbrokker Lin neg FAP'er MuSC'er
Mellemgulv ubejdset 100% 82% 55% 0.5% 0.0%
FMO Sca1-PacBlue 100% 83% 19% 0.3% 4.3%
FMO CD31/45-488 100% 84% 40% 9.4% 5.6%
FMO Vcam1-PeCy7 100% 78% 20% 5.6% 0.0%
Farves 100% 77% 19% 2.4% 3.8%
Gracilis Farves 100% 96% 11% 2.6% 1.4%
TAK Farves 100% 88% 16% 2.8% 2.2%
EDL Farves 100% 86% 26% 19.2% 0.8%
Soleus Farves 100% 91% 41% 13.3% 1.1%
GA Farves 100% 94% 51% 6.1% 1.5%
Triceps Farves 100% 92% 30% 2.6% 4.5%
Masseter Farves 100% 85% 27% 19.3% 2.6%

Tabel 3: Oversigt over relativ celletypetæthed i FACS-dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere trin er nøglen til udførelsen af denne protokol for at opnå gode udbytter. De enkelte muskler har et lille volumen sammenlignet med mængden af muskler, der anvendes i bulkisoleringsprotokoller. Dette resulterer i en risiko for, at musklen tørrer ud under dissektionen, hvilket reducerer udbyttet. For at forhindre dette er det vigtigt at tilføje medium til musklerne umiddelbart efter dissektion. Hertil kommer, at hvis dissektion tager længere tid, kan huden fjernes fra et lem ad gangen for at reducere musklernes eksponering for luft. Det mindre volumen resulterer også i en øget risiko for overfordøjelse. For at imødegå dette kræver den nuværende metode lavere mængder collagenase II-enzym og reducerede fordøjelsestider sammenlignet med bulkmuskelprotokoller 9,16. Enzymatisk fordøjelse afhænger også af enzymernes renhed, og lavere renhed kan påvirke udbyttet negativt. Derudover er mekanisk fordøjelse kritisk. I tilfælde af utilstrækkelig skæring vil det reducerede overfladeareal hæmme enzymatisk fordøjelse og sænke stamcelleudbyttet. I tilfælde af at skære for meget, vil det øgede overfladeareal forårsage overfordøjelse og sænke stamcelleudbyttet. Det rystende vandbad forhindrer udfældning af den fordøjede muskel, forbedrer fordelingen af enzymet og hjælper med at skabe en homogen temperatur, hvilket tilsammen muliggør kortere inkubationstider. Derfor tillader den nuværende metode en signifikant reduktion af inkubationstiden sammenlignet med andre metoder.

Denne protokol afhænger af celledissociation og oprensning. Disse procedurer efterligner vævsskade, som aktiverer stamcellerne. Konsekvent har nylige undersøgelser afsløret, at MuSC'er ændrer deres genekspressionsprogrammer under isolationsproceduren27,28,29,30. Som følge heraf er de rensede stamceller forskellige fra cellerne in vivo med hensyn til genekspressionsmønstre. En anden begrænsende faktor i protokollen er dens afhængighed af FACS, som kræver adgang til dyrt udstyr. FACS er guldstandarden til isolering af flere cellepopulationer samtidigt med høj renhed20. Nylige fremskridt ved hjælp af magnetiske perler og mikrobobler giver reduktioner i omkostningerne31,32, men om de tilbyder sammenlignelige udbytter til at arbejde på enkelte muskler skal bestemmes. Endelig er udbyttet af protokollen begrænset på grund af musklernes lille størrelse, hvilket udgør begrænsninger for potentielle nedstrømsanalyser.

Tidligere undersøgelser har været afhængige af at samle forskellige muskler ved isolering af MuSC'er og / eller FAP'er for at maksimere celleudbyttet. Dette udregner dog eventuelle vævsspecifikke forskelle i stamcelleadfærd og funktion mellem forskellige muskler. Den nuværende protokol muliggør isolering af MuSC'er og FAP'er fra individuelle muskler til downstream-analyser af stamcellefunktionen. Som et eksempel på et downstream-assay blev stamcelleaktivering analyseret af EdU-inkorporering, hvilket afslørede, at stamceller fra forskellige væv viser forskellig aktiveringskinetik. I tidligere værker er muligheden for at anvende andre downstream-assays blevet vist; disse assays kræver mindre celletal, såsom SmartSeq2 enkeltcelle RNA-sekventering, celletransplantation, mikrofluidisk PCR og klonale ekspansionsassays 22,33,34,35.

Afslutningsvis beskriver denne protokol en metode til dissektion af individuelle muskler for at isolere og studere MuSC'er og FAP'er. Denne strategi vil gøre det muligt for eksperimenter at få en bedre forståelse af stamcellefunktionen på tværs af forskellige muskler i sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser og ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Cellesortering blev udført på FACS Core Facility, Aarhus Universitet, Danmark. Figurer blev oprettet ved hjælp af Biorender.com. Vi takker Dr. J. Farup for at dele kanin-anti-PDGFRa-antistoffet. Dette arbejde blev støttet af en AUFF Starting Grant til E.P. og Start Package bevillinger fra NovoNordiskFonden til E.P. (0071113) og til A.D.M. (0071116).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 72.706.700 1.5 mL tube
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.554.502 15 mL tube
5 mL polystyrene round-bottom tube Falcon, Fisher Scientific  352054 FACS tube without strainer cap
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap Falcon, Fisher Scientific   352235 FACS tube with strainer cap
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) VWR collection 525.0946 5 mL tube
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.547.254 50 mL tube
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387458 (Cat # A31572)
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2420713 (Cat#A31571)
ARIA 3 BD FACS, Core facility Aarhus University
Centrifuge 5810 eppendorf EP022628188 Centrifuge
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387287 (Cat# C10337) Cell Proliferation Kit
Collagen from calf-skin  Bioreagent, Sigma Aldrich  Source: SLCK6209 (Cat# C8919)
Collagenase type II Worthington, Fisher Scientific  Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) Collagenase
Dispase Gibco, Fisher Scientific  Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) Dispase
Donkey serum (non-sterile) Sigma Aldrich, Merck Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)
Dumont nr. 5, 110 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.327 Straight forceps with fine tips
Dumont nr. 7, 115 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.335 Curved forceps
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2453614 (cat# 31550-023)
FITC anti-mouse CD31 BioLegend, NordicBioSite MEC13.3 (Cat # 102506)
FITC Anti-mouse CD45 BioLegend, NordicBioSite 30-F11 (Cat# 103108)
Glacial acetic acid (100%) EMSURE, Merck   K44104563 9Cat # 1000631000)
Head over head mini-tube rotator  Fisher Scientific  15534080 (Model no. 88861052) Head over head mini-tube rotator
Horse serum Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2482639 (cat# 10368902 )
Isotemp SWB 15 FisherBrand, Fisher Scientific 15325887 Shaking water bath
MS2 mini-shaker  IKA  Vortex unit
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) BD microlance, Fisher Scientific  304827 20G needle 
Neutral formalin buffer 10% CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3945.040 Cell strainer 
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend, NordicBioSite D7 (Cat# 108120)
Pax7 primary antibody DSHB Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)
PBS 10x powder concentrate Fisher BioReagents, Fisher Scientific BP665-1
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) BioLegend, NordicBioSite 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)
Pen/strep Gibco, Fisher Scientific  Lot. 163589 (cat# 11548876 )
Pipette tips p10 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2140-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p1000 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2279-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p20 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2149P-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p200 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2069-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Protective underpad Abena  ACTC-7712  60 x 40cm, 8 layers
Rainin, pipet-lite XLS Mettler Toledo, Thermo Scientific  2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 Pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Recombinant anti-PDGFR-alpha RabMAb, abcam AB134123
Scalpel (shaft no. 3) Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.502 Scalpel
Scalpel blade no. 11 Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.0911 Scalpel
Scanlaf mars Labogene class 2 cabinet: Mars Flow bench
ScanR Olympus Microscope, Core facility Aarhus University
Scissors FST 14568-09
Series 8000 DH Thermo Scientific 3540-MAR Incubator
Serological pipette 10 mL VWR 612-3700 Sterile, non-pyrogenic
Serological pipette 5 mL VWR, Avantor delivered by VWR 612-3702 Sterile, non-pyrogenic
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile  BD Emerald, Fisher Scientific 307731 Syringe
TC Dish 100, standard Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3902 Petri dish 
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 Corning, Sigma Aldrich 3764 96-well Half bottom plate
Triton X-100 Sigma Aldrich, Merck Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  2. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
  4. Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
  5. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  7. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  8. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  9. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
  10. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  11. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  12. Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  13. Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  14. Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
  15. Fukada, S. -I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
  16. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  17. Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
  18. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
  19. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
  20. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  21. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
  22. de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
  23. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
  24. Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
  25. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  26. Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
  27. van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
  28. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  29. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  30. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  31. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
  32. Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
  33. Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
  34. Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  35. de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).

Tags

Tilbagetrækning nummer 190
Isolering af hvilende stamcellepopulationer fra individuelle skeletmuskler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frimand, Z., Das Barman, S.,… More

Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., de Morrée, A. Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (190), e64557, doi:10.3791/64557 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter