Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie van spierstamcellen en fibro-adipogene voorlopers uit individuele skeletspieren bij muizen. Het protocol omvat enkelvoudige spierdissectie, stamcelisolatie door fluorescentie-geactiveerde celsortering, zuiverheidsbeoordeling door immunofluorescentiekleuring en kwantitatieve meting van S-fase-invoer door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-incorporatietest.
Abstract
Skeletspieren herbergen verschillende populaties van volwassen stamcellen die bijdragen aan de homeostase en het herstel van het weefsel. Skeletspierstamcellen (MuSCs) hebben het vermogen om nieuwe spieren te maken, terwijl fibro-adipogene voorlopers (FAPs) bijdragen aan stromale ondersteunende weefsels en het vermogen hebben om fibroblasten en adipocyten te maken. Zowel MuSCs als FAPs bevinden zich in een toestand van langdurige reversibele celcyclusuitgang, rust genoemd. De rusttoestand is de sleutel tot hun functie. Rustige stamcellen worden gewoonlijk gezuiverd uit meerdere spierweefsels die in één monster zijn samengevoegd. Recente studies hebben echter duidelijke verschillen aangetoond in de moleculaire profielen en rustdiepte van MuSCs geïsoleerd uit verschillende spieren. Het huidige protocol beschrijft de isolatie en studie van MuSCs en FAPs uit individuele skeletspieren en presenteert strategieën om moleculaire analyse van stamcelactivatie uit te voeren. Het beschrijft hoe spieren van verschillende ontwikkelingsoorsprong, diktes en functies kunnen worden geïsoleerd en verteerd, zoals het diafragma, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) en de kauwspieren. MuSCs en FAPs worden gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en geanalyseerd door immunofluorescentiekleuring en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) incorporatietest.
Introduction
Skeletspieren hebben een hoge capaciteit voor regeneratie door de aanwezigheid van spierstamcellen (MuSCs). MuSCs bevinden zich op de myofiberen, onder de basale lamina, en bevinden zich in een rustige toestand van langdurige, omkeerbare celcyclus uitgang 1,2,3,4. Na verwonding activeren MuSCs en komen ze in de celcyclus om aanleiding te geven tot versterkende voorlopers die kunnen differentiëren en fuseren om nieuwe myofiberente vormen 2,5. Eerder werk heeft aangetoond dat MuSCs absoluut essentieel zijn voor spierregeneratie 6,7,8. Bovendien kan een enkele MuSC zowel nieuwe stamcellen als nieuwe myofiberen enten en genereren9. Skeletspieren herbergen ook een populatie van mesenchymale stromale cellen genaamd fibro-adipogene voorlopers (FAPs), die een cruciale rol spelen bij het ondersteunen van de MuSC-functie tijdens spierregeneratie 6,10,11,12.
Vanwege hun potentieel om spierregeneratie te coördineren, is er een enorme interesse in het begrijpen van hoe MuSCs en FAPs werken. Rustige MuSC's worden gekenmerkt door expressie van de transcriptiefactoren Pax7 en Sprouty1, en de celoppervlakeiwitcalcitoninereceptor, terwijl rustige FAPs worden gekenmerkt door de van het celoppervlakeiwit afgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Eerdere studies hebben aangetoond dat MuSCs en FAPs kunnen worden gezuiverd uit skeletspieren met behulp van celoppervlakmarkers en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 9,15,16,17,18,19,20,21. Hoewel deze protocollen de mogelijkheid om MuSCs en FAPs te bestuderen enorm hebben verbeterd, is een nadeel dat de meeste van deze protocollen de isolatie van MuSCs uit een pool van verschillende spierweefsels vereisen. Recent werk van ons en anderen heeft verschillen in celfenotype en genexpressieniveaus onthuld tussen MuSCs geïsoleerd uit verschillende weefsels22,23. MuSCs van het diafragma, triceps en gracilis vertonen een snellere activering dan MuSCs van lagere achterspieren22, terwijl MuSCs van extraoculaire spieren een snellere differentiatie vertonen dan MuSCs van het middenrif en de onderste achterste spieren23.
Dit protocol beschrijft de isolatie van MuSCs en FAPs uit individuele skeletspieren (figuur 1). Dit omvat de dissectie van het diafragma, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) en kauwspieren. Ontlede spieren worden vervolgens gedissocieerd door enzymatische vertering met behulp van collagenase II (een protease dat zich specifiek richt op de Pro-X-Gly-Pro aminosequentie in collageen, waardoor de afbraak van bindweefsel en weefseldissociatiemogelijk wordt 24) en dispase (een protease dat fibronectine en collageen IV splitst, waardoor verdere celdissociatie mogelijk wordt25). MuSCs en FAPs worden geïsoleerd van eencellige suspensies door FACS. Als voorbeelden van downstream-assays voor celanalyse wordt stamcelactivering bepaald door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) -opname te testen, terwijl celzuiverheid wordt bepaald door immunofluorescentiekleuring voor de celtypespecifieke markers Pax7 en PDGFRa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het huidige protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierverzorging aan de universiteit van Aarhus en lokale ethische voorschriften.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u voldoet aan de voorschriften van de lokale ethische commissie voor dierproeven en de behandeling van postmortale knaagdiermonsters. Muizen zijn een potentiële bron van allergenen; Schakel, indien beschikbaar, afzuigventilatie in en plaats deze over de werkruimte om overmatige blootstelling aan allergenen te voorkomen. U kunt ook een mondkapje dragen als het experiment regelmatig wordt uitgevoerd. Dit protocol omvat het werken met scherpe voorwerpen en onderzoekers wordt aanbevolen om vertrouwd te raken met de procedures en logistiek voor het toepassen van eerste hulp in het geval van een snee.
1. Bereiding (1-2 uur; de dag voor de dissectie)
OPMERKING: De oplossingen, platen en media worden bereid onder steriele omstandigheden en gefilterd (0,45 μm) voor gebruik, tenzij anders vermeld. Bereid stamoplossingen van dispase (11 E/ml in PBS) en collagenase II (1.000 E/ml in PBS) en bewaar deze bij -20 °C (tabel 1). De voorraden worden ontdooid en gebruikt voor secundaire vertering in stap 4.2.6.
- Collageencoating van een 96-well half-area plaat
- Bereid zuur water. Voeg 5,15 ml ijsazijn toe aan 895 ml geautoclaveerd water in een bekerglas van 2 liter.
- Filtreer de oplossing met een filtereenheid van 0,45 μm van 500 ml. Breng 800 ml van het gefilterde zure water over in een fles van 1 L.
- Voeg 40 ml steriele collageenbouillonoplossing toe aan de fles. Meng de oplossing voorzichtig door te draaien en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen licht, tot gebruik.
- Bedek een of meer 96-well half-area platen met collageen. Voeg 50 μL collageencoatingoplossing toe aan elke put en bekleed de plaat een nacht (ON) bij 4 °C.
- Zuig de collageenoplossing de volgende dag aan met behulp van een op vacuüm gebaseerde aspirator en was de plaat 2x door 100 μL geautoclaveerd water en aspiratie toe te voegen.
- Kantel het deksel van de plaat en laat de plaat 20-30 minuten drogen in de kap.
- Wanneer de plaat volledig droog is, wikkelt u deze in aluminiumfolie en bewaart u deze bij 4 °C tot gebruik. Gecoate platen kunnen tot 4 weken worden bewaard.
OPMERKING: Collageencoating maakt celhechting mogelijk. Het is belangrijk om vrij collageen weg te spoelen omdat het de celfunctie en signalering kan verstoren (bijv. binding van collageen V aan de calcitoninereceptoren op de MuSCs)26.
2. Bereiding (0,5 uur; de dag van de dissectie):
- Voorbereiding van aanvullende oplossingen en werkruimte
- Bereid steriel wasmedium door 50 ml paardenserum en 5 ml pen/streptokokken toe te voegen aan 445 ml HAM's F10-medium. Werk in een laminaire stromingskap om vervuiling te voorkomen.
- Bereken en weeg de juiste hoeveelheid collagenase II die nodig is om de dissociatiebuffer voor te bereiden. (Voor elke muis wordt 26.000 eenheden collagenase II gebruikt om 40 ml dissociatiebuffer te maken bij 650 U / ml collagenase II). Voeg het gewogen poeder toe aan een conische buis van 50 ml en bewaar het op ijs.
- Bereid twee schaaltjes van 10 cm voor spierisolatie. Giet 3 ml wasmiddel (tabel 1) in elke petrischaal. Breng de schalen van 10 cm buiten de laminaire stroomkap voor later gebruik.
- Bereid de materialen voor op spiervertering. Label op basis van het aantal monsters het juiste aantal conische buisjes van 50 ml (acht per muis, één voor elke spier) en laat ze op de bank liggen. Spuit de naalden, 10 ml spuiten en 40 μm celzeven met 70% ethanol (acht van elk per muis, één voor elke spier) en breng ze in de laminaire stroomkap. Bevestig naalden aan de spuiten.
- Bereid de materialen voor op het sorteren. Label 5 ml buisjes met ronde bodems met celzeefdoppen op basis van het aantal monsters. Bedek de buizen met aluminiumfolie en laat ze in de laminaire stroomkap zitten.
- Overeenkomstig het aantal monsters en populaties dat wordt gesorteerd, bereidt u 1,5 ml microcentrifugebuizen met 500 μL wasmedium voor celverzameling (16 per muis, één buis voor elke celpopulatie per spierweefsel). Bewaar deze buizen op ijs.
3. Spierdissectie (20-30 min)
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol wordt uitgevoerd in een niet-steriele omgeving. De procedure kan worden uitgevoerd met behulp van een of meerdere muizen. Eén muis is echter voldoende om zowel monsters voor te bereiden voor sortering als controles voor het instellen van compensatie- en FACS-poorten.
- Spierisolatie initiëren
- Bereid de niet-steriele werkruimte voor op dissectie en spierisolatie. Desinfecteer de werkplek met 70% ethanol. Plaats een steriel beschermend wegwerponderkussen op het werkstation.
- Teken met behulp van een permanente marker een doos voor elke spier bovenop een petrischaaldeksel om de geïsoleerde spier later te plaatsen.
- Spuit de chirurgische instrumenten in met 70% ethanol.
- Euthanaseer de muis door CO 2-inhalatie en/of cervicale dislocatie.
- Isoleer de individuele spieren (van één muis tegelijk als u meerdere muizen gebruikt). Spray de muis in met 70% ethanol om de vacht nat te maken en de huid te desinfecteren. Plaats de muis op het onderpad met de buik naar boven gericht. Een overzicht van alle acht spieren en hun respectievelijke anatomische locatie is weergegeven in figuur 2A.
- Het isoleren van de gracilis spieren
- Gebruik een schaar om een horizontale incisie van 0,5 cm in de buikhuid te maken.
- Verwijder de huid: Gebruik met beide handen de duim en wijsvinger om het bovenste en onderste deel van de incisie vast te pakken. Trek aan elke kant van de incisie om de huid van de romp en de onderste ledematen te scheuren en te scheiden. Trek de huid van de onderste extremiteit naar beneden om beide achterpoten bloot te leggen (naar beneden van heup tot tenen). Trek ook omhoog om de romp bloot te leggen.
- Lokaliseer de gracilis-spier (binnenkant van de dij). Grijp met een gebogen tang naar de gracilis en til de spier iets op (figuur 2B). Maak met een schaar een incisie van 0,5 cm (figuur 2C), waaruit de gracilis wordt uitgeknipt en volledig wordt geïsoleerd (figuur 2D). Herhaal dit voor het andere been om de tweede gracilisspier te isoleren.
- Isoleren van de TA- en EDL-spieren (onderste achterste, ventrale kant)
- Snijd met behulp van een scalpel de fascia door een incisie van 0,5 cm te maken langs de zijkant van het scheenbeen (het dikste onderste achterste bot). Gebruik een gebogen tang om de fascia vast te pakken en trek eraan om deze te verwijderen.
OPMERKING: Wanneer de fascia volledig is verwijderd, zijn de pezen aan het distale uiteinde van het achterbeen zichtbaar en kunnen ze worden gescheiden. - Gebruik een rechte tang met superfijne uiteinden om tussen de distale pees van de TA (laterale kant van het scheenbeen) en de EDL (onder de TA) te gaan (figuur 2E-G).
OPMERKING: Met ervaring kan het stompe uiteinde van een scalpelmes worden gebruikt in plaats van de rechte tang. - Schuif de tang naar het proximale uiteinde van de spier om de spieren te scheiden.
- Breng de rechte tang terug naar het distale uiteinde. Snijd de distale pees door.
- Pak voorzichtig de distale pees van de spier vast met een gebogen tang. Til de spier op en over zijn proximale aanhechting en snijd de proximale pees voorzichtig zo dicht mogelijk bij het aanhechtingspunt. Snijd het andere uiteinde en breng de TA over in een petrischaaltje.
- Gebruik een rechte tang met superfijne uiteinden om onder de distale pees van de EDL te gaan.
- Schuif de tang naar het proximale uiteinde van de spier om de spieren te scheiden.
- Breng de rechte tang terug naar het distale uiteinde. Snijd de distale pees door zonder de spier te beschadigen.
- Pak voorzichtig de distale pees van de EDL vast met een gebogen tang. Til de spier op en over zijn proximale aanhechting en snijd de proximale pees voorzichtig zo dicht mogelijk bij het aanhechtingspunt. Snijd het andere uiteinde en breng de EDL over in een petrischaaltje. Herhaal dit voor de andere achterhand om de tweede TA- en EDL-spieren te isoleren.
- Snijd met behulp van een scalpel de fascia door een incisie van 0,5 cm te maken langs de zijkant van het scheenbeen (het dikste onderste achterste bot). Gebruik een gebogen tang om de fascia vast te pakken en trek eraan om deze te verwijderen.
- Het isoleren van de GA- en soleusspieren (onderste achterpot, dorsale zijde)
- Gebruik een rechte tang met superfijne uiteinden om tussen de achillespees en de onderste achterbeenderen te gaan.
- Schuif de tang naar het proximale uiteinde van de spier om de spier te scheiden.
- Breng de rechte tang terug naar het distale uiteinde. Snijd de distale pees door.
OPMERKING: Om beschadiging van de soleusspier, die onder de GA ligt, te voorkomen, snijdt u zo dicht mogelijk bij de distale achillespeesaanhechting, waardoor een deel van de pees aan de GA blijft zitten (figuur 2H). - Om de soleusspier te onthullen en te isoleren, trekt u de GA omhoog en over het kuitbeen (het dunste bot van de twee botten in de onderste achterpoot).
OPMERKING: De soleusspier onderscheidt zich door zijn karakteristieke donkerrode kleur ten opzichte van de GA (figuur 2I). - Lokaliseer de proximale soleuspees. Ga met een rechte tang tussen de soleus en GA in.
- Beweeg de tang naar het distale uiteinde van de spier om de soleus van de GA te scheiden.
- Isoleer eerst de soleus. Snijd de proximale pees door, pak de pees vast met een gebogen tang en til de soleus voorzichtig op om toegang te krijgen tot zijn distale pees. Snijd de distale pees door om de soleus te isoleren van de GA. Plaats de soleus in de petrischaal met wasmiddel (figuur 2J)
- Snijd de GA en leg deze in de petrischaal. Herhaal dit voor het andere been om de tweede soleus- en GA-spieren te isoleren.
- Isoleren van de tricepsspieren (bovenste voorpoot, dorsale zijde)
- Gebruik een rechte tang met superfijne uiteinden om tussen de tricepsspier en het opperarmbeen (het hoofdbeen van het bovenste voorbeen) te gaan (figuur 2K-M).
- Schuif de tang naar het proximale uiteinde van de spier om de spier te scheiden. Snijd het proximale uiteinde van de spier door.
- Pak het proximale uiteinde van de triceps met een gebogen tang en trek het omhoog en over de elleboog om toegang te krijgen tot de distale pees. Snijd de distale pees van de triceps door, breng de spier over in een petrischaal en herhaal de procedure voor de andere voorpoot.
- Het isoleren van de kauwspieren
- Verwijder de vacht en huid van de kaak. Maak een horizontale incisie van 0,5 cm met een schaar. Knijp met beide handen aan elke kant van de incisie met de duim en wijsvinger. Verwijder de huid door omhoog en omlaag te trekken.
- Lokaliseer de belangrijkste pees van de kauwer (caudaal, onder het oog). Plaats het platte scalpelmesje tussen het bot en de spier (figuur 2N). Snijd de pees door.
- Pak de grote kauwpees vast met een gebogen tang. Knip het met een scalpelmesje of schaar in de rostrale richting om de kauwspier van het kaakbot te scheiden (figuur 2O, P). Plaats de geïsoleerde kauwspier in de petrischaal. Herhaal de procedure voor de tweede masseterspier.
- Het isoleren van de middenrifspier
OPMERKING: Wanneer u de middenrifspier isoleert, zorg er dan voor dat u voorzichtig snijdt om te voorkomen dat u in de binnenste organen en darm snijdt, omdat dit een bron van besmetting is.- Maak met een schaar een thoracotomie (een snee tussen de ribben) in het midden van het borstbeen (een lang plat bot, gelegen in het midden van de borst, dat de ribben verbindt) en snijd door het borstbeen (figuur 2Q).
- Leg het diafragma bloot door 360° door de ribbenkast te snijden.
- Scheid het bovenlichaam van het onderste deel/de buik. Knip met een schaar de luchtpijp, slokdarm, vena cava en abdominale aorta door.
- Scheid het middenrif van het onderlichaam. Maak met een schaar een laparotomie (een chirurgische incisie in de buikholte) 1 cm onder het borstbeen en maak een 360° snede (figuur 2R).
- Plaats de gesloten schaar tussen de ribbenkast en de buikorganen en druk naar beneden. Trek voorzichtig aan de ribbenkast om deze te scheiden van de buikorganen (figuur 2S).
- Scheid het diafragma van de ribbenkast. Houd het middenrif losjes tussen twee vingers en knip met een schaar door de ribbenkast. Gebruik een schaar om het diafragma zo dicht mogelijk bij de ribben te knippen in een 360° snede. Plaats het geïsoleerde diafragma in een petrischaaltje.
OPMERKING: Tijdens cervicale dislocatie kan het diafragma scheuren en instorten tegen de ribbenkast, waardoor het moeilijk te lokaliseren is. De spier kan nog steeds geïsoleerd worden. Identificeer de ingeklapte spier, houd deze tussen twee vingers en snijd 360° na de ribbenkast.
4. Spiervertering naar een eencellige suspensie (~1 h 35 min)
OPMERKING: De volgende stappen omvatten niet-steriele (stappen 4.1-4.2) en steriele werkomgevingen (stap 4.3).
- Mechanische vergisting
- Plaats de geïsoleerde spieren in het deksel van een petrischaal van 10 cm.
- Gebruik een gebogen tang om de geïsoleerde spieren één voor één vast te pakken. Verwijder voor de soleus en GA de resterende delen van de achillespees.
- Hak met een schaar de geïsoleerde spieren één voor één fijn door ze in ongeveer 1 mm3 stukken te snijden.
- Enzymatische spijsvertering
- Bereid de spierdissociatiebuffer voor door 40 ml koud wasmedium toe te voegen aan het gewogen collagenase II-poeder (collagenase II: 650 U/ml in wasmedia).
OPMERKING: Gebruik vers bereide spierdissociatiebuffer om optimale enzymatische activiteit te garanderen. - Breng de gehakte spieren over in een conische buis van 15 ml met 5 ml dissociatiebuffer.
- Incubeer de buis gedurende 35 minuten in een 37 °C schudwaterbad bij 60 tpm.
- Voeg na incubatie wasmedium toe tot een totaal volume van 15 ml. Draai de buis op 1.600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Zuig het supernatant op tot een volume van 4 ml met behulp van een op vacuüm gebaseerde aspirator. Om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord, zuigt u langzaam van de bovenkant af en verwijdert u drijvend vet.
- Ontdooi stock aliquots van dispase en collagenase II. Voeg 500 μL van de collagenase II-oplossing (1.000 U/ml bouillon, -20 °C) toe aan het resterende monster van 4 ml. Voeg vervolgens 500 μL van de dispase-oplossing toe (11 U/ml bouillon, -20 °C).
OPMERKING: Dispase kan een neerslag genereren. Als dit gebeurt, draait u de dispase stockoplossing op 10.000 x g, 1 minuut voor gebruik. Breng het nu heldere supernatant over in de celsuspensie zonder de pellet te verstoren. - Draai de monsters kort om de pellet op te lossen.
- Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een schudwaterbad van 37 °C bij 60 tpm.
OPMERKING: Het verteren van een groot aantal spiermonsters is tijdrovend. Schat voor de stappen 4.3.1-4.3.6 dat u 2-5 minuten per monster nodig heeft. Deze stap gaat sneller wanneer deze parallel wordt uitgevoerd door twee of meer onderzoekers.
- Bereid de spierdissociatiebuffer voor door 40 ml koud wasmedium toe te voegen aan het gewogen collagenase II-poeder (collagenase II: 650 U/ml in wasmedia).
- Homogenisatie van monsters
- Homogeniseer de celsuspensie. Breng de suspensie over van de buis van 15 ml naar een buis van 50 ml. Gebruik een spuit van 10 ml met een naald van 20 G om het monster te resuspenderen door het monster 5x op en neer door de naald te trekken.
OPMERKING: Als stukjes onverteerde spier de naald verstoppen, veeg ze dan af op een papieren zakdoekje. - Plaats een 40 μm celzeef op een nieuwe conische buis van 50 ml.
- Neem de volledige celsuspensie in de spuit en zeef het monster in een nieuwe conische buis van 50 ml met een celzeef erop. Zeef het monster door het totale volume direct op het filter te doseren.
- Om alle mononucleaire cellen op te halen, voegt u 20 ml van het wasmedium toe aan de lege conische buis en giet u dit door de celzeef in de 50 ml conische buis met het gespannen monster. Haal het resterende volume onder de celzeef op met een p1000-pipet.
- Gooi de celzeef weg en draai het monster gedurende 5 minuten bij 4 °C op 1.600 x g .
- Door te pipetteren met een p1000-pipet, zuigt u het supernatant op zonder de pellet te verstoren.
- Door pipetteren met een p1000-pipet de membraankorrel in 500 μL van het wasmedium en de andere spiermonsters in 300 μL van het wasmedium elk resuspendiëren.
OPMERKING: Het diafragma is de grootste van de spieren met het hoogste stamcelgehalte en kan daarom worden gebruikt voor de controlekleuringen.
- Homogeniseer de celsuspensie. Breng de suspensie over van de buis van 15 ml naar een buis van 50 ml. Gebruik een spuit van 10 ml met een naald van 20 G om het monster te resuspenderen door het monster 5x op en neer door de naald te trekken.
5. Beitsen en sorteren (~ 40 min + 30 min sorteren / monster)
OPMERKING: Werk in een steriele omgeving op ijs voor de volgende stappen.
- Breng een aliquot van 50 μL van de membraancelsuspensie over in vier nieuwe microcentrifugebuizen van 2 ml voor de controlevlekken (elk 50 μL). Voeg 250 μL van het wasmedium toe aan elke controlebuis tot een eindvolume van 300 μL.
- Voeg 3 μL (1:100) van de fluorescentie minus-één antilichamen (FMO-controle) toe aan de drie controlekleuringsbuizen en laat één buis zonder antilichamen achter (ongekleurde controle) (zie tabel 2).
- Voeg 3 μL (1:100) van de antilichamen (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC en SCA1-PacificBlue) toe aan de resterende spiereencellige suspensies, inclusief het resterende diafragmamonster.
- Incubeer de celsuspensies gedurende 15 minuten bij 4 °C in een head-over-head shaker.
OPMERKING: De controlekleuringen zijn nodig om achtergrondfluorescentieniveaus te bepalen en de poorten voor flowcytometrie in te stellen. Verschillende antilichamen kunnen worden gebruikt, maar elk heeft een specifieke werkconcentratie en incubatietijd die moet worden getest. Als antilichamen van verschillende leveranciers worden gebruikt, kan de concentratie, en dus de verdunning, variëren. Een cel levensvatbaarheid kleurstof kan worden toegevoegd aan het kleuringsmengsel om dode of stervende cellen tijdens het sorteren te elimineren. - Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C op 1.600 x g . Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren door pipetteren.
- Door pipetteren met een p1000-pipet resuspendeert u elk monster in 800 μL van het wasmiddel.
- Filter de monsters met behulp van een FACS-buis met een celzeefdop (40 μm) om eventuele resterende celklonten (of aggregaten) te verwijderen.
- Was de celzeef door nog eens 800 μL van het wasmedium toe te voegen.
- Houd de monsters bedekt met aluminiumfolie op ijs tot de analyse.
OPMERKING: Als op dit punt de celsuspensie troebel/dicht lijkt vanwege de hoge concentratie cellen, voeg dan nog eens 800 μL van het wasmedium toe om de celdichtheid te verlagen. - Start de FACS op met een mondstuk van 70 μm.
- Gebruik de unstained- en FMO-besturingselementen om de gating-strategie in te stellen: MuSCs zijn negatief voor CD45-FITC, CD31-FITC en SCA1-PacBlue en zijn positief voor VCAM1-PECy7; De FAPs zijn negatief voor CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 en positief voor SCA1-PacBlue.
- Sorteer de gekleurde eencellige suspensies met behulp van tweerichtingssortering en verzamel de MuSCs en FAPs in afzonderlijke opvangbuizen met 500 μL van het wasmedium.
OPMERKING: Met behulp van FACS met vier lasers (configuratie: 70 μm mondstuk, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm), vereist de gekozen combinatie van fluoroforen geen compensatie van fluorescentiesignaal. Als u echter een andere flowcytometer of een andere combinatie van fluoroforen gebruikt, worden extra enkelgekleurde controlemonsters ter compensatie aanbevolen. Van de kleinere spieren (EDL, soleus, TA) zijn opbrengsten van 3.000 MuSCs en 5.000 FAPs te verwachten. Voor de andere grotere spieren zijn opbrengsten van 20.000 MuSCs en FAPs te verwachten. Het aantal gebeurtenissen dat door de FACS-software wordt vermeld, kan afwijken van het werkelijke aantal levensvatbare cellen in de verzamelbuis. Celaantallen kunnen worden bevestigd door celtelling met behulp van een hemocytometer. - Draai de gesorteerde cellen gedurende 5 minuten bij 4 °C af bij 1.600 x g . Door te pipetteren, zuig het supernatant op zonder de celkorrel te verstoren.
- Voeg 100 μL van het wasmedium toe aan elk monster en resuspensie de cellen voorzichtig zonder luchtbellen te creëren. Breng de 100 μL van het geresuspendeerde monster over in een met collageen bedekte half-area 96-well plaat. Plaat 1.000-3.000 cellen per put.
OPMERKING: Als de cellen niet goed worden geresuspendeerd, kunnen de cellen in klonten aan elkaar plakken, waardoor latere microscopieanalyses worden verstoord. - Inspecteer de cellen onder de microscoop en noteer hun verdeling, vorm en grootte.
- Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2. De cellen hechten zich binnen 2 uur.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de zuiverheid van de verzamelde celpopulaties te bevestigen, hetzij door flowcytometrie-analyse (door een aliquot van het gesorteerde monster op de sorteerder te laden en een klein aantal gebeurtenissen te registreren) of door antilichaamkleuring van de vergulde cellen gevolgd door microscopie (Pax7 is een definiërende marker voor muis-MuSCs, PDGFRa is een definiërende marker voor muis-FAPs). Beginnend bij sectie 7 hieronder is een protocol voor de kleuring van cellen voor Pax7- en PDGFRa-eiwitniveaus.
6. EdU-incorporatietest
OPMERKING: Werk onder steriele omstandigheden en gebruik de chemische zuurkast bij het hanteren van paraformaldehyde (PFA) voor de volgende stappen. EdU is een nucleotide-analoog dat in het DNA wordt opgenomen terwijl de cellen de S-fase van de celcyclus doorlopen. Het is mutageen bij hoge concentraties. Draag altijd handschoenen bij het hanteren van EdU. Bekijk de lokale richtlijnen voor het verwerken van EdU-afval.
- EdU pulse (dag 1)
- Bereid een werkoplossing van 2x EdU in een vers wasmedium.
- Haal de 96-well plaat met de cellen uit de couveuse. Inspecteer de cellen onder de microscoop om de samenvloeiing te controleren. Ga naar de laminaire flowkap.
- Verwijder 50 μL medium van de plaat door te pipetteren. Voeg 50 μL 2x EdU-werkoplossing toe, zodat het uiteindelijke volume in de put 100 μL is.
- Kweek de cellen in aanwezigheid van EdU gedurende de beoogde periode bij 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: De timing en duur van de EdU-puls kunnen variëren. Gemiddeld hebben rustige MuSC's 2 dagen nodig om hun eerste celdeling volledig te activeren en te voltooien19. EdU kan direct na het plateren aan de gesorteerde cellen worden toegevoegd.
- Fixatie (dag 2)
LET OP: PFA is kankerverwekkend. Ga altijd zorgvuldig om met PFA. Vertrouwd raken met de lokale regelgeving voor het omgaan met PFA en het verwijderen van afval.- Haal de 96-well plaat met de cellen uit de couveuse. Inspecteer de cellen onder de microscoop en verplaats de plaat in de zuurkast.
- Door te pipetteren, verwijder het medium en fixeer de cellen door 50 μL 4% PFA aan elke put toe te voegen. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) in een chemische zuurkast.
- Verwijder de PFA met een pipet en gooi deze weg in een geschikte afvalcontainer.
- Was de cellen door 100 μL PBS toe te voegen aan alle putjes. Door pipetteren zuig je de PBS op en herhaal je de was. Houd de cellen in 100 μL PBS.
OPMERKING: Om te voorkomen dat cellen worden uitgewassen, doseert u de PBS aan de zijkant van de put door langzaam te pipetteren.
- EdU-etikettering
- Permeabiliseer de cellen voorafgaand aan EdU-detectie door de PBS te verwijderen en 100 μL van 0,5% Triton X-100 in PBS toe te voegen. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Triton X-100 is een oppervlakteactieve stof en kan huidirritatie veroorzaken. Ga voorzichtig om en gebruik altijd handschoenen. - Zuig na 5 minuten de Triton X-100 op en voeg 100 μL PBS toe.
- Bereid een EdU-klikchemiereactiemix voor volgens het protocol van de fabrikant.
- Zuig de PBS aan en voeg 33 μL van de EdU klik-chemie reactiemix toe. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij RT.
- Zuig de EdU klik-chemie reactiemix en was de cellen met 100 μL PBS.
- Zuig de PBS op, voeg 100 μL PBS toe met Hoechst (1:2.000) en incuber beschermd tegen licht gedurende 10 minuten bij RT.
- Zuig de Hoechst aan en was tweemaal door toevoeging van 100 μL PBS. Bewaar de cellen in 100 μL PBS bij 4 °C in het donker.
- Stel de cellen voor op een omgekeerde microscoop. De cellen kunnen maandenlang in het donker worden bewaard zolang de putten niet uitdrogen.
OPMERKING: Het is mogelijk om de cellen samen te kleuren met antilichamen. Ga in dit geval verder met een blokkerende stap gevolgd door incubatie met het primaire antilichaam. Selecteer een secundair antilichaam met een geconjugeerde fluorofoor waarvan het emissiespectrum niet overlapt met dat van de fluorofoor die wordt gebruikt om EdU te detecteren. Zorg ervoor dat u geen secundaire antilichamen gebruikt met fluoroforen die overlappen met het spectrale bereik van Hoechst.
- Permeabiliseer de cellen voorafgaand aan EdU-detectie door de PBS te verwijderen en 100 μL van 0,5% Triton X-100 in PBS toe te voegen. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij 4 °C.
7. Immunofluorescentiekleuring
OPMERKING: Dit deel van het protocol kan onafhankelijk van sectie 6 worden uitgevoerd. Wanneer u sectie 6 overslaat, voert u stap 6.3.1 en 6.3.2 uit om celpermeabilisatie in te schakelen voordat u doorgaat met stap 7.2 hieronder.
- Verwijder de plaat met de EdU-gelabelde cellen.
- Bereid 20 ml blokkeringsbuffer door 2 ml ezelserum toe te voegen aan 18 ml PBS.
- Om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen, verwijdert u 100 μL van de PBS uit elke put en voegt u 50 μL van de blokkerende buffer toe met een p200-pipet. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij RT, beschermd tegen licht en bedekt met aluminiumfolie om fotobleaching van de EdU met het fluorofoorlabel te voorkomen.
OPMERKING: De cellen zijn bevestigd aan de onderkant van de put, maar kunnen loskomen als er te veel kracht wordt uitgeoefend tijdens het pipetteren. - Terwijl u de monsters blokkeert, bereidt u het primaire antilichaammengsel voor. Voeg 8,0 μL (1:100) muis anti-Pax7 en konijn anti-PDGFRa toe aan 800 μL blokkeringsbuffer om 16 putjes (acht weefsels, twee celtypen) te kleuren.
- Verwijder na het blokkeren het ezelserum en voeg 50 μL van het primaire antilichaammengsel toe aan elk putje. Incubeer de plaat een nacht bij 4 °C, bedekt met aluminiumfolie.
- Verwijder na incubatie het primaire antilichaam en voeg 50 μL Triton (0,5% in PBS) toe aan elk van de putjes. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij RT beschermd tegen licht, om het ongebonden antilichaam weg te spoelen. Herhaal de was drie keer.
- Bereid de secundaire antilichaammastermix voor door 1,0 μL (1:1.000) ezel antimuis-Alexa647 en ezel anti-konijn-Alexa555 toe te voegen aan een microcentrifugebuis met 1.000 μL van de blokkeringsbuffer.
- Voeg 33 μL van het secundaire antilichaamhoofdmengsel toe aan elk van de putjes. Incubeer de plaat gedurende 60 minuten bij RT beschermd tegen licht.
- Verwijder het overtollige secundaire antilichaam door pipetteren, voeg 50 μL Triton (0,1% in PBS) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij RT beschermd tegen licht. Herhaal de was drie keer.
- Voeg ten slotte 100 μL PBS toe. Beslis of u de plaat onmiddellijk wilt afbeelden met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een gekoelde CCD-camera, of de plaat bij 4 °C wilt bewaren tot een latere analyse door de plaatranden af te dichten met parafilm en de verzegelde plaat in aluminiumfolie te wikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol voor individuele skeletspierisolatie (figuur 2) werden de gracilis, TA, EDL, GA, soleus, triceps, masseter en middenrifspieren geïsoleerd van drie Zwitserse mannelijke outbred muizen die waren stopgezet uit een lokaal fokprogramma (figuur 2). Na weefseldissociatie en antilichaamkleuring werden MuSCs en FAPs uit de individuele spieren gezuiverd door FACS (figuur 3). De initiële gating werd verkregen met een niet-gekleurd monster om de cellen te identificeren en de singlets van doubletten te scheiden (figuur 3A). De daaropvolgende poorten werden ingesteld met behulp van FMO-bedieningselementen om kleuringsdrempels te identificeren (figuur 3B). Het gekleurde monster werd vervolgens afgesloten voor CD31 / CD45-FITC en Sca1-PacBlue. De SCA1+/CD31-/CD45-populatie (FAPs) werd gesorteerd in een aparte verzamelbuis, terwijl de dubbelnegatieve populatie werd afgesloten en uitgezet voor VCAM1-PECy7 en forward scatter (FSC). De VCAM1+ populatie (MuSCs) werd gesorteerd in een aparte opvangbuis. MuSCs en FAPs werden gekwantificeerd als het percentage singlets (tabel 3) en gesorteerd in afzonderlijke opvangbuizen met 500 μL van het wasmedium. Het middenrif en de tricepsspier eencellige suspensies hebben een hogere relatieve abundantie van MuSCs dan FAPs, terwijl de andere eencellige suspensies een hogere relatieve abundantie van FAPs hebben dan MuSCs (tabel 3).
Van de gesorteerde cellen werden 1.000-3.000 cellen gezaaid en gedurende 24 uur geïncubeerd. Na 24 uur incubatie werd het medium verwijderd en vervangen door een vers medium dat EdU bevatte. De cellen werden gefixeerd op 48 uur, gekleurd voor EdU, en vervolgens met antilichamen tegen Pax7-eiwit of PDGFRa-eiwit, en in beeld gebracht met behulp van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Afbeeldingen werden gekwantificeerd met behulp van de Fiji-plug-in in ImageJ. Robuuste EdU-kleuring werd waargenomen, hoewel de fractie van EdU-positieve cellen verschillend was voor de twee stamceltypen en de verschillende spieren (figuur 4A-C). MuSCs geïsoleerd uit de EDL of GA vertoonden een significant lagere EdU-opname in vergelijking met MuSCs geïsoleerd uit de TA, het diafragma, gracilis of triceps, terwijl MuSCs geïsoleerd uit de masseter en soleus ertussenin vallen en niet significant verschillen van beide groepen (figuur 4A, B). Dit komt overeen met onze eerdere resultaten22. Bovendien zijn de weefsels waaruit de MuSC's hoge EdU-opnameniveaus vertonen, dezelfde weefsels waarvan eerder werd aangetoond dat de MuSCs hoge niveaus van Pax3-eiwit22 tot expressie brachten. FAPs geïsoleerd uit de EDL vertoonden een significant lagere EdU-opname in vergelijking met FAPs geïsoleerd van de GA en soleus, terwijl FAPs geïsoleerd van de TA een significant lagere EdU-opname vertoonden in vergelijking met FAPs geïsoleerd van de soleus (figuur 4A,C). Dit onderstreept het belang van het analyseren van stamcellen uit individuele weefsels in plaats van het bundelen van spieren uit verschillende weefsels voor isolatie. Voor alle weefsels was de gemiddelde fractie van EdU-positieve MuSCs hoger in vergelijking met de gemiddelde fractie van EdU-positieve FAPs, wat suggereert dat MuSCs sneller activeren onder de gegeven omstandigheden.
Ten slotte werd de celzuiverheid bevestigd met immunofluorescentiekleuring (figuur 4D). Gemiddeld was 97,71% (± 1,38%) van de MuSCs positief gekleurd voor Pax7-eiwit en 88,16% (±6,35%) van de FAPs positief gekleurd voor PDGFRa-eiwit, wat de specificiteit van onze stamcelisolatieprocedure bevestigt (figuur 4D).
Figuur 1: Schematische samenvatting van het protocol. Schema met de twee hoofdsegmenten van het protocol, MuSC-isolatie (bovenste paneel), rusttest (onderste paneel) en de belangrijkste stappen van de methodologie die in elk van hen wordt gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Spierlocatie en isolatie. (A) Een schema dat de locatie van elke spier weergeeft. (B-S) Demonstratie van spierisolatie voor (B-D) gracilis, (E-G) TA/EDL, (H-J) triceps, (K-M) GA/soleus, (N-P) masseter en (Q-S) diafragmaspieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gating-strategie die wordt gebruikt om MuSCs en FAPs in een diafragmaspiermonster te identificeren en te sorteren. Cellen worden geïdentificeerd op basis van celgrootte (Forward Scatter (FSC)) en granulariteit (Side Scatter (SSC)). Singlets worden geselecteerd op basis van FSC-A en FSC-W. Lineage-cellen zijn gated voor latere identificatie van MuSCs (Lineage-/VCAM1+), en FAP (Lineage-/SCA1+) cellen zijn gated om FAPs te identificeren. Dezelfde gating-strategie werd toegepast op (A) een niet-gekleurde controle, (B) FMO-controles (FMO-SCA1PacBlue, FMO-CD31/45-FITC en FMO-VCAM1-PECy7) en (C) een gekleurd monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van celactivering door EdU-kleuring. (A) Representatieve afbeeldingen van EdU-kleuring van MuSCs (bovenste panelen) en FAPs (onderste panelen) van een diafragmamonster. Weergegeven zijn samengevoegde afbeeldingen van EdU en Hoechst (linkerpanelen) en de enkele kanalen in groen (EdU, middelste panelen) en blauw (Hoechst, rechterpanelen). (B,C) Staafdiagram met het percentage EdU-positieve (B) MuSCs of (C) FAPs voor geïndiceerde spieren. Uitgezet is het gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt een muis. Statistische analyse werd uitgevoerd in GraphPad met behulp van tweezijdige student's t-tests, met significantie ingesteld op * p < 0,05 en ** p < 0,01. (D) Immunofluorescentiekleuring van MuSCs (bovenste panelen) en FAPs (onderste panelen) met antilichamen tegen de MuSC-marker Pax7 (linkerkant) en de FAP-marker PDGFRa (rechterkant). Getoond worden samengevoegde afbeeldingen van Pax7 met Hoechst, gevolgd door de enkele kanalen, en samengevoegde afbeeldingen van PDGFRa met Hoechst, gevolgd door de afzonderlijke kanalen. N = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossingen | Reagentia | Aantal |
| Wasmiddel | F-10 Nutriëntenmengsel (Ham) (1x), +L-glutamine | 445 ml |
| Paardenserum | 50 ml | |
| Pen/streptokokken | 5 ml | |
| Dissociatiebuffer (1e vertering) | Collagenase type II | 650 U/ml |
| Wasmiddel | 100 ml | |
| Dispase bouillon (2e vertering) | Dispase in PBS | 11 U/ml |
| Collagenasebouillon (2e vertering) | Collagenase type II in PBS | 1000 U/ml |
| PBS 1x | PBS 10x poederconcentraat | 9,89 g/l |
| Autoclaaf/steriel water | 1 l | |
| Zuur water | IJsazijn (100%) Watervrij voor analyse | 5,15 ml |
| Autoclaaf/steriel water | 895 ml | |
| Collageen oplossing (0,002%) | Collageen van kalfshuid | 20 ml |
| Zuur water | 800 ml | |
| Triton X-100 | Triton X-100 | 0,5% (v/v) |
| PBS 1x | 99.5% | |
| Buffer blokkeren | PBS 1x | 18 ml |
| Ezelserum | 2 ml |
Tabel 1: Tabel met recepten.
| Voorbeeldnr. | Naam |
| 1 | Onbevlekt |
| 2 | Fluorescentie minus VCAM1-PeCy7 |
| 3 | Fluorescentie minus SCA1-PacificBlue |
| 4 | Fluorescentie minus CD31/45-FITC |
| 5 | Experimentele kleuring (alle vier de antilichamen) |
Tabel 2: Overzicht van kleuring, controles en monsters die voor elk weefsel zijn voorbereid voordat ze worden gesorteerd.
| Weefsel | Antilichaam mix | Cellen | Enkelingen | Lin neg | FAPs | MuSCs |
| Diafragma | onbevlekt | 100% | 82% | 55% | 0.5% | 0.0% |
| FMO Sca1-PacBlue | 100% | 83% | 19% | 0.3% | 4.3% | |
| FMO CD31/45-488 | 100% | 84% | 40% | 9.4% | 5.6% | |
| FMO Vcam1-PeCy7 | 100% | 78% | 20% | 5.6% | 0.0% | |
| Gekleurd | 100% | 77% | 19% | 2.4% | 3.8% | |
| Gracilis | Gekleurd | 100% | 96% | 11% | 2.6% | 1.4% |
| BEDANKT | Gekleurd | 100% | 88% | 16% | 2.8% | 2.2% |
| EDL | Gekleurd | 100% | 86% | 26% | 19.2% | 0.8% |
| Soleus | Gekleurd | 100% | 91% | 41% | 13.3% | 1.1% |
| GA | Gekleurd | 100% | 94% | 51% | 6.1% | 1.5% |
| Triceps | Gekleurd | 100% | 92% | 30% | 2.6% | 4.5% |
| Masseter | Gekleurd | 100% | 85% | 27% | 19.3% | 2.6% |
Tabel 3: Overzicht van de relatieve celtype-abundantie in de FACS-gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende stappen zijn essentieel in de uitvoering van dit protocol om goede opbrengsten te behalen. De individuele spieren hebben een klein volume in vergelijking met de hoeveelheid spieren die wordt gebruikt in bulkisolatieprotocollen. Dit resulteert in een risico op uitdroging van de spier tijdens de dissectie, wat de opbrengst vermindert. Om dit te voorkomen is het belangrijk om direct na de dissectie medium aan de spieren toe te voegen. Bovendien, als dissectie langer duurt, kan de huid van één ledemaat tegelijk worden verwijderd om de tijd van blootstelling van de spieren aan lucht te verminderen. Het kleinere volume resulteert ook in een verhoogd risico op oververtering. Om dit tegen te gaan, vereist de huidige methode lagere hoeveelheden collagenase II-enzym en kortere verteringstijden in vergelijking met bulkspierprotocollen 9,16. Enzymatische spijsvertering hangt ook af van de zuiverheid van de enzymen, en een lagere zuiverheid kan de opbrengst negatief beïnvloeden. Bovendien is mechanische spijsvertering van cruciaal belang. Bij onvoldoende snijden zal het kleinere oppervlak de enzymatische vertering belemmeren en de stamcelopbrengst verlagen. Bij te veel snijden zal het grotere oppervlak oververtering veroorzaken en de stamcelopbrengst verlagen. Het schuddende waterbad voorkomt neerslag van de verteerde spier, verbetert de verdeling van het enzym en helpt bij het creëren van een homogene temperatuur, waardoor kortere incubatietijden mogelijk zijn. Daarom maakt de huidige methode een aanzienlijke vermindering van de incubatietijd mogelijk in vergelijking met andere methoden.
Dit protocol is afhankelijk van celdissociatie en -zuivering. Deze procedures bootsen weefselbeschadiging na, die de stamcellen activeert. Consequent hebben recente studies aangetoond dat MuSCs hun genexpressieprogramma's veranderen tijdens de isolatieprocedure27,28,29,30. Als gevolg hiervan verschillen de gezuiverde stamcellen in vivo van de cellen in termen van genexpressiepatronen. Een tweede beperkende factor in het protocol is de afhankelijkheid van FACS, die toegang tot dure apparatuur vereist. FACS is de gouden standaard voor het isoleren van meerdere celpopulaties tegelijkertijd met een hoge zuiverheid20. Recente ontwikkelingen met behulp van magnetische kralen en microbubbels bieden een kostenreductie van31,32, maar of ze vergelijkbare opbrengsten bieden om op enkele spieren te werken, moet worden bepaald. Ten slotte is de opbrengst van het protocol beperkt vanwege de kleine omvang van de spieren, waardoor beperkingen worden opgelegd aan potentiële downstream-assays.
Eerdere studies hebben vertrouwd op het poolen van verschillende spieren bij het isoleren van MuSCs en / of FAPs om de celopbrengst te maximaliseren. Dit is echter het gemiddelde van eventuele weefselspecifieke verschillen in stamcelgedrag en -functie tussen verschillende spieren. Het huidige protocol maakt de isolatie van MuSCs en FAPs uit individuele spieren mogelijk voor de downstream analyses van de stamcelfunctie. Als voorbeeld van een downstream-assay werd stamcelactivatie getest door EdU-incorporatie, waaruit bleek dat stamcellen uit verschillende weefsels verschillende activeringskinetiek vertonen. In eerdere werken is de haalbaarheid van het gebruik van andere downstream-assays aangetoond; deze assays vereisen kleinere celaantallen, zoals SmartSeq2 single-cell RNA sequencing, celtransplantatie, microfluïdische PCR en klonale expansie assays 22,33,34,35.
Concluderend beschrijft dit protocol een methode voor de dissectie van individuele spieren om MuSCs en FAPs te isoleren en te bestuderen. Deze strategie zal experimenten mogelijk maken om een beter begrip te krijgen van de stamcelfunctie in verschillende spieren in gezondheid en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen en geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Celsortering werd uitgevoerd in de FACS Core Facility, Universiteit van Aarhus, Denemarken. Figuren zijn gemaakt met behulp van Biorender.com. We bedanken Dr. J. Farup voor het delen van het konijn anti-PDGFRa antilichaam. Dit werk werd ondersteund door een AUFF Starting Grant aan E.P. en Start Package subsidies van NovoNordiskFonden aan E.P. (0071113) en A.D.M. (0071116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
