Summary
Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения молекулярных детерминант, управляющих взаимодействием между хозяином и микробиомом. Мы представляем высокопроизводительный конвейер, профилирующий уровни колонизации микробиома кишечника у отдельных животных, а также ключевые аспекты физиологии C. elegans.
Abstract
Состав микробиома кишечника может оказывать существенное влияние на физиологию хозяина на протяжении всего развития и жизни животного. Измерение изменений состава микробиома имеет решающее значение для выявления функциональных взаимосвязей между этими физиологическими изменениями. Caenorhabditis elegans стал мощной системой хозяина для изучения молекулярных факторов взаимодействия микробиома хозяина. Благодаря прозрачному строению тела и флуоресцентным меткам естественных микробов, относительные уровни микробов в микробиоме кишечника отдельного животного C. elegans могут быть легко количественно определены с помощью большого сортировщика частиц. В этой статье мы опишем процедуры экспериментальной настройки микробиома, сбора и анализа популяций C. elegans на желаемой стадии жизни, эксплуатации и обслуживания сортировщика, а также статистического анализа полученных наборов данных. Мы также обсудим соображения по оптимизации настроек сортировщика на основе интересующих микробов, разработку эффективных стратегий стробирования для этапов жизни C. elegans и то, как использовать возможности сортировщика для обогащения популяций животных на основе состава микробиома кишечника. В рамках протокола будут представлены примеры потенциальных приложений, в том числе потенциал масштабируемости для приложений с высокой пропускной способностью.
Introduction
Эволюция животных находится под постоянным микробным влиянием1. Из разнообразных микробов в окружающей среде животные-хозяева приобретают специфическихпартнеров2 , которые расширяют возможности хозяина и управляют его физиологией и восприимчивостью к болезням3. Например, метагеномный анализ микробиома кишечника выявил обогащенные метаболические классы микробных генов, которые могут обеспечить больший сбор и хранение энергии у мышей с ожирением4, многие из которых также обнаружены в микробиоме кишечника человека5. По-прежнему существует большая потребность в установлении причинно-следственных связей и определении молекулярных детерминант воздействия на микробиом, хотя прогресс затруднен из-за сложности микробиома и восприимчивости систем хозяев к широкомасштабному скринингу.
Модельный организм C. elegans обеспечивает платформу для углубления молекулярного понимания связей между микробиомом и физиологией хозяина. C. elegans обладает 20 клетками кишечника со слоем слизистой оболочки и ворсинчатыми структурами. Эти клетки оснащены многочисленными генами хеморецепторов, которые воспринимают микробные продукты и вырабатывают антимикробные молекулы, которые потенциально регулируют их кишечные колонизаторы. Эта консервативная биология C. elegans привела к огромному количеству открытий в области передачи сигналов хозяина, которые регулируют кишечные микробы, включая передачу сигналов инсулина, TGF-бета и MAP-киназу 8,9,10.
C. elegans используют микробы как пищу для роста во время развития и микробиом во взрослом возрасте. С возрастом некоторые микробы могут чрезмерно накапливаться в просвете кишечника, и отношения между хозяином и микробом смещаются от симбиоза к патогенезу11. В естественной среде обитания C. elegans встречает широкий спектр видов бактерий12,13. Секвенирование 16S рДНК из репрезентативных образцов, собранных в естественной среде обитания (гнилые плоды, стебли растений и животные переносчики), показало, что в природном микробиоме C. elegans доминируют четыре типа бактерий: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Actinobacteria. В пределах этих подразделений лежит большая вариативность в разнообразии и богатстве бактерий в зависимости от среды обитания12,13,14,15. Было создано несколько определенных сообществ, в том числе коллекции из 63 членов (BIGbiome)16 и 12 членов (CeMbio), представляющие ведущие роды микробиома, созданные для исследовательского сообщества C. elegans 17. Как микробиомы, так и компонентные штаммы могут оказывать различное влияние на физиологию C. elegans, например, на размер тела, скорость роста и реакцию на стресс 9,16,17. Эти исследования предоставляют ресурсы и примеры, позволяющие установить C. elegans в качестве модели для исследования микробиома.
Здесь представлен рабочий процесс, основанный на сортировщике больших частиц (LPS) (рис. 1), который использует систему C. elegans для одновременного измерения состава микробиома и основных показателей физиологии хозяина в масштабе популяции. С микробной стороны рабочий процесс адаптируется для сборки определенного микробиома или отдельных микробов для проверки надежности и пластичности сообщества с увеличением микробных взаимодействий. На стороне хозяина рабочий процесс позволяет проводить высокопроизводительные анализы для измерения уровней колонизации флуоресцентных микробов в микробиоме и физиологического считывания хозяина с точки зрения развития, размера тела и размножения. В совокупности модель микробиома C. elegans позволяет проводить высокопроизводительные скрининги для выявления метаболических и генетических детерминант, модулирующих физиологию хозяина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление смеси микробиома
- Выдавите или выдавите бактерии из глицериновой морозильной камеры на тарелку для лизогенного бульона (LB) или соответствующую питательную среду и выращивайте в течение ночи при оптимальной температуре в зависимости от интересующих штаммов бактерий (обычно 25 °C для естественных микробов C. elegans ).
- Используя одну колонию из каждого бактериального изолята (например, 12 бактерий из коллекции CeMbio) для посева 800 мкл среды LB в отдельные лунки глубоколунной пластины объемом 1 мл. Инкубируют в течение ночи при оптимальной температуре при встряхивании при 250 оборотах в минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для использования с определенными естественными микробиомами (например, CeMbio), но может быть легко адаптирован для отдельных микробов путем роста в соответствующих условиях или других культуральных сосудов (пробирок). - Оцените рост каждого микроба с помощью спектрофотометрии. Перенесите аликвоту 20 мкл на 80 мкл LB и добавьте раствор в прозрачную 96-луночную планшет с плоским дном. Измерьте наружный диаметр600 на считывателе пластин.
- После ночного выращивания центрифугируют глубоко луночный культуральный планшет при 4 000 x g в течение 10 мин, чтобы гранулировать бактерии и удалить надосадочную жидкость путем аспирации с помощью 96-луночного аспирационного коллектора или многоканальной пипетки.
- Используя значения OD 600, нормализуйте концентрацию каждого микроба до конечного OD600, равного 1,0, используя стерильную среду M9.
- При объединении микробов определите количество бактериальной культуры, необходимое для эксперимента, и создайте мастер-микс микробиома, объединив равные объемы каждого бактериального штамма в пробирку достаточного размера (например, пробирки по 5 мл или 15 мл).
- Нанесите 30-50 мкл микробов с окончательным наружным диаметром600 1,0 на центр каждой питательной среды нематоды (NGM) с агар-содержащей пластиной или лункой18. Дайте засеянному микробиому вырасти в течение ночи при оптимальной температуре (здесь 25 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее подготовьте пластины с агаром NGM в соответствии с инструкциями в Wormbook или используя предварительно смешанный порошок NGM18. Например, для 12-луночных планшетов добавляется 3 мл NGM, а для 24-луночных планшетов — 1,5 мл.
2. Подготовка синхронизированных C. elegans к росту на микробиоме
- Выращивайте около 100 червей на пластинах NGM (6 см в диаметре), засеянных Escherichia coli OP50, пока черви не достигнут зрелого возраста. Для целей этого протокола использовался штамм C. elegans N2, хотя протокол может быть легко адаптирован к другим штаммам нематод.
- Добавьте 6 мл буфера M9 (плюс 0,01% тритона X-100; M9-TX) на планшет, пипетируя вверх и вниз, чтобы смыть примерно 100 взрослых червей в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Приготовьте свежеприготовленный раствор хлорной извести, смешав две части хлорной извести с одной частью 5 М NaOH.
- Центрифугируйте червей при 3 000 x g в течение 30 с, чтобы гранулировать червей. Аспирируйте, чтобы уменьшить объем до 4 мл, а затем добавьте 2 мл раствора отбеливателя.
- Плотно закройте крышку и встряхните тюбик. Наблюдайте за взрослыми червями в растворе под стереомикроскопом при 10-кратном увеличении. Когда взрослые тела начинают распадаться на части, обычно через 3,5 минуты, прекратите тряску и центрифугируйте при 3000 x g в течение 30 с.
- Отсасывайте пипеткой до минимального объема. Ресуспендировать, центрифугировать и аспирировать четыре раза в M9-TX, чтобы смыть отбеливатель.
- Ресуспендируйте в 4-6 мл M9-TX и поместите пробирку на ротатор на ночь, позволяя яйцам вылупиться и синхронизироваться на стадии L1.
- На следующий день возьмите из пробирки 10 мкл червей L1 в M9-TX и опустите их в чистую чашку Петри. Подсчитайте количество живых червей L1 под стереомикроскопом при 20-кратном общем увеличении.
- В зависимости от плотности L1 пипетку соответствующего объема, чтобы выбросить ~50 синхронизированных личинок L1 на край засеянных микробиомом планшетов NGM и инкубировать при 20 °C. Дайте червям расти до желаемого возраста (2 день или 3 день взрослой жизни).
3. Сбор популяции червей для анализа микробиома кишечника
- Смыть червей с бактериального газона 1-2 мл M9-TX в стерилизованную тарелку глубиной 2 мл на 96 лунок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для микробных штаммов, создающих значительные биопленки, встряхните планшет с жидкостью в течение 5 минут, чтобы разбить микробный мусор. - Центрифугируйте глубоколуночную пластину при 300 x g в течение 1 мин, чтобы гранулировать червей, а затем удалите жидкость с помощью аспирационного коллектора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут использовать многоканальную пипетку для ручного удаления жидкости, если аспирационный коллектор недоступен. Следите за тем, чтобы наконечники пипеток не касались дна лунок, чтобы избежать потери образцов червей. - Добавьте 1,8 мл M9-TX в каждую лунку глубоколуночного планшета с помощью многоканальной пипетки объемом 1,2 мл. Перемешайте, пипетируя вверх и вниз пару раз, и центрифугируйте при 300 x g в течение 1 минуты. Повторите этот шаг четыре раза, чтобы удалить бактерии из жидкости.
- После окончательной промывки доведите объем в каждой лунке до 100 мкл с помощью аспирационного коллектора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отделить взрослых особей от личинок с помощью силы тяжести, оставьте тарелку на скамейке на 30-60 с, позволив взрослым червям опуститься на дно колодца. Затем аспирируйте пластину, чтобы удалить личинки из суспензии. - Добавьте 100 мкл 10 мМ левамизола в M9-TX в каждую лунку и дайте червям парализоваться в течение 5 минут. После обработки левамизолом добавьте 4% раствора отбеливателя, описанного в шаге 2.3, в каждую лунку в течение 2 минут, чтобы уменьшить скопление бактерий, если это необходимо. После обработки отбеливателем дважды промыть с помощью M9-TX и после второй стирки отсосать до конечного объема 100 мкл.
- Переложите шнеки на плоскодонную 96-луночную пластину, содержащую 150 мкл 10 мМ левамизола в M9-TX. Поддерживайте плотность червей на уровне 50-100 на лунку и разделяйте червей на несколько лунок, если популяция слишком скучена.
4. Настройка сортировщика крупных частиц и автосамплера
- Включите воздушный компрессор, компьютер и прибор LPS. Проверьте и опорожните бак для отходов. Затем добавьте 500 мл отбеливателя в пустой резервуар для отходов. Проверьте и заправьте чехол и резервуары для воды, если объем недостаточен. Убедитесь, что узел флюидного и оптического сердечника (FOCA) 250 мкм установлен.
- Запустите контрольные частицы для контроля качества. Откройте программное обеспечение прибора LPS. В окне программного обеспечения установите флажок «Включить лазеры », чтобы включить лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.2-4.5 можно пропустить, если контрольные частицы были обработаны в течение предыдущих 2 недель и FOCA не изменялся за это время. - Выберите «Настройка > управление частицами». Выберите Нет в запросе, чтобы перейти к настройкам по умолчанию. Перед каждым использованием вбейте контрольные частицы (10 мл dH, 2O и 10 мл контрольных частиц в коническую пробирку объемом 50 мл) и загрузите их в порт для образца.
- Когда все будет готово, нажмите «Получить », чтобы записать 500 событий. Убедитесь, что частота событий составляет от 15 до 30 событий в секунду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если частота событий не составляет 15–30 событий/с, следует обратиться к инженеру для настройки параметров машины. - Исследуйте коэффициент вариации (CV) по всем параметрам. Если CV < 15%, проверка качества пройдена, и программное обеспечение LPS может быть закрыто. Если CV > 15%, запустите еще раз и настройте микрометры свежими контрольными частицами, чтобы выровнять лазер с проточной ячейкой.
- Подключите и включите автосамплер. Откройте программное обеспечение прибора автосамплера. Откроется автосамплер и программное обеспечение LPS. В окне программного обеспечения LPS перейдите в раздел File > New Experiment (Файл новый эксперимент), а затем File > New Sample (Файл новый образец). Установите флажок Включить лазеры, чтобы включить лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм, если это еще не было сделано.
- Создавайте шаблоны для точечных диаграмм сбора данных с использованием каналов времени пролета (TOF), экстинкции (EXT) и флуоресцентных каналов в окне программного обеспечения LPS. Хорошее начальное максимальное число для захвата всех червей составляет 8000 для TOF и EXT. Шкалы флуоресценции будут варьироваться в зависимости от каждого микроба. Включайте контрольные образцы червей, выращенных на нефлуоресцентных микробах (например, OP50), и каждый флуоресцентный микроб в отдельности (при смешивании микробов) в качестве контроля в каждом эксперименте.
- Щелкните правой кнопкой мыши в теле диаграммы, чтобы изменить масштабирование. Используйте контрольных животных, таких как взрослые особи 1-го дня или синхронизированные L1 (или интересующая популяция), чтобы помочь в выборе стробирования TOF и EXT.
- В окне автосамплера выберите Prime. Перейдите в раздел «Файл» > «Открыть сценарий», чтобы выбрать правильный встроенный сценарий, а затем нажмите «ОК».
- Только для анализа выберите скрипт с помощью Acquire. Для сортировки выберите скрипт с Дозированием. Для захвата с 96-луночных планшетов выберите скрипт с 96 лунками; Для получения данных с 384-луночных планшетов выберите скрипт с 384-луночным планшетом. Для объема образца (40 или 100 мкл) выберите сценарий с соответствующим объемом.
- Перейдите в раздел Plate Template (Шаблон пластины ) в меню программного обеспечения автосамплера, чтобы выбрать нужные лунки для анализа. Загрузите контрольные образцы. После того, как пластина загружена на столик автосамплера и закреплена, нажмите кнопку Run Plate в окне автосамплера. Сохраните файл при появлении запроса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные образцы и настройки могут быть выполнены с помощью конической пробирки объемом 50 мл на порте для образцов LPS перед присоединением пробоотборника LP. - Когда сбор данных будет завершен, нажмите кнопку «Сохранить данные» на верхней ленте в окне программного обеспечения LPS и снова сохраните данные.
5. Анализ особенностей C. elegans и уровней микробиома кишечника у каждого животного
- Необработанные данные хранятся в трех типах файлов: .lmd, .bxr3, .txt. Загрузите текстовый файл с меткой .txt file в программу R для анализа. Выполните следующие действия в R19.
- Используйте пакет tidyverse20 в качестве основы для анализа.
- Используя функцию ggplot (включенную в tidyverse), постройте график данных LPS, используя значения TOF в качестве оси X и значения EXT в качестве оси Y. Обычный график покажет два облака точек. Убедитесь, что одна из них находится близко к началу координат и оси x, указывая на более мелкие частицы, такие как личинки и мелкий мусор, а вторая группа частиц находится в правом верхнем углу графика и представляет взрослых нематод.
- Используя эту группировку в качестве ориентира, выберите адекватные значения отсечения TOF и EXT. Стробирование может варьироваться в зависимости от штаммов C. elegans на разных микробах в зависимости от изменений в физиологии (например, темные и прозрачные животные или изменения в яйценоскости могут изменять коэффициенты EXT).
- Используйте подмножество функций для разделения взрослых особей и личинок с помощью стробирования TOF и EXT. В приведенном ниже примере используйте настройки TOF > 1,200 и EXT > 1,000 для ворот для взрослых животных.
- Анализ полученных наборов данных на предмет статистических различий; Для этого эксперимента используйте функцию t-критерия в R.
- Чтобы определить влияние микробиома на размер и оптическую плотность C. elegans, сравните значения TOF и EXT соответственно в разных условиях. TOF является показателем размера червя и может указывать на изменения в темпах роста животных в определенное время. Изменения EXT наиболее заметны в период между окончанием развития и взрослой жизнью из-за света, рассеянного яйцами, и могут быть использованы для оценки изменений в сроках этого перехода и плодовитости. Оцените долю и распределение потомства, если оно было сохранено во время анализов.
- Чтобы определить изменения в уровнях колонизации микробиома кишечника, сначала нормализуйте значения флуоресценции (например, красные или зеленые столбцы) путем деления на индивидуальные значения TOF для каждого животного. По мере того, как черви увеличиваются в размерах и становятся взрослыми, объем их кишечника также увеличивается. Нормализация помогает уменьшить количество артефактов, связанных с различиями в распределении размеров животных выборки. Используйте нормализованных животных для оценки изменений в колонизации микробиома кишечника в разных условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример необработанных данных и соответствующие скрипты R можно найти в Дополнительном файле 1 JOVE_worm_microbiome.txt и Дополнительном файле 2 JOVE_worm_microbiome.r. На рисунках 2 и 3 приведен репрезентативный пример анализа организма хозяина и микробиома с использованием двух флуоресцентных бактерий.
6. Сортировка животных C. elegans по признакам микробиома кишечника
- Соберите популяцию C. elegans , выращенную на микроорганизмах с флуоресцентными метками (например, RFP), как описано в шаге 3. Червей следует помещать в конические пробирки объемом 50 мл с минимум 5 мл образца. Стремитесь к примерно 2000 червей/мл, включая всех взрослых особей и потомство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно сделать в плоской 96-луночной пластине с помощью LP-сэмплера. Поддерживайте плотность червей на уровне 50–100 на лунку.- Если использовался LP сэмплер, то выключите и отсоедините LP сэмплер. Перед сортировкой повторно подключите линии отбора проб и продувки к LPS.
- Откройте программное обеспечение LPS, перейдите в File > New Experiment, затем File > New Sample. Создайте точечную диаграмму с TOF по оси X и Extinction по оси y. Создайте еще одну точечную диаграмму с TOF на оси x и красным цветом на оси y. Используйте тот же масштаб оси и настройки лазера, что и ранее. Установите флажок Включить лазеры, чтобы включить лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эти графики были созданы ранее, перейдите в Файл > Открыть эксперимент и Файл > Открыть образец, чтобы загрузить графики.- Поместите пробирку с контрольным образцом в отверстие для образца. В диалоговом окне Приобретение/Выдача нажмите кнопку Приобретение. Сохраните файл при появлении запроса. После того, как будет измерено достаточное количество червей для различения популяций, нажмите кнопку Прервать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока должна составлять примерно 15–30 событий/с. Если нет, отрегулируйте концентрацию червей, чтобы убедиться, что отдельные животные анализируются или сортируются по капле. При ЛПС черви проходят по пути лазера в разных положениях (прямые, скрученные или изогнутые). Им может потребоваться разное количество времени для прохождения лазера и детектора в зависимости от их положения. - На точечном графике TOF vs Extinction нарисуйте ворота вокруг взрослого населения. На графике TOF vs Red Dot нарисуйте ворота вокруг областей с высокими и низкими значениями красного цвета в качестве областей, представляющих интерес для взрослых червей с различными уровнями колонизации микробиома. Перейдите > Просмотр иерархии стробирования и убедитесь, что флуоресцентные вентили перечислены под воротами взрослой популяции. После оптимизации настроек перейдите в раздел Файл > Сохранить эксперимент и Файл > Сохранить образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном здесь примере отбираются животные на основе TOF/EXT гейтов для взрослых особей и сортируются по пулам, которые демонстрируют либо высокую, либо низкую колонизацию красными флуоресцентными белок-экспрессирующими бактериями. Тем не менее, любая комбинация параметров, измеренных с помощью LPS, может быть использована для идентификации интересующей популяции (популяций).
- Поместите пробирку с контрольным образцом в отверстие для образца. В диалоговом окне Приобретение/Выдача нажмите кнопку Приобретение. Сохраните файл при появлении запроса. После того, как будет измерено достаточное количество червей для различения популяций, нажмите кнопку Прервать.
- Перед сортировкой убедитесь, что загружено соответствующее оборудование для сбора. Чтобы загрузить 96-луночный планшет на сборное устройство, выберите « Загрузить пластину А » > «Переместить» в разделе « Переместить стадию» диалогового окна «Получение/выдача», чтобы позволить этапу сбора переместиться в положение, подготовленное для загрузки 96-луночного планшета.
- Для оптовой сортировки выберите подходящий размер пробирки и нажмите «Переместить », чтобы загрузить коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл. В разделе «Сортировка» диалогового окна «Получение/выдача» выберите ворота сортировки из выпадающего списка созданных регионов. Введите количество объектов из заданной области для дозирования в сборную трубку, расположенную непосредственно под соплом проточной ячейки. Нажмите кнопку «Массовая сортировка » в диалоговом окне «Получить/Выдать».
- Для дозирования на 96-луночный планшет перейдите в раздел Настройка > планшетов > калиброванных планшетов > 96-луночных планшетов. Затем перейдите в View > Plate Template, выберите лунки, в которые будут сортироваться черви, введите количество объектов, которые будут отсортированы по каждой лунке, и выберите интересующие вас области стробирования. Если несколько закрытых регионов будут отсортированы в одну и ту же пластину, установите флажок Gate Each Well. Нажмите кнопку ОК, чтобы сохранить изменения.
- После того, как были назначены номера и местоположения сортировки, нажмите кнопку «Заполнить пластину» в диалоговом окне «Получить/Выдать», чтобы начать дозирование на 96-луночную пластину .
- Перед заполнением всей 96-луночной планшета выполните тестовую сортировку подмножества животных или контрольной группы в 96-луночную планшет и проанализируйте с помощью стереомикроскопа, чтобы убедиться, что соответствующее количество и желаемые популяции животных были отсортированы. После подтверждения правильности сортировки повторите шаги 6.3-6.6 для экспериментальных образцов. Нажмите кнопку «Сохранить данные» на верхней ленте в окне программного обеспечения LPS, чтобы снова сохранить данные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все измерения (EXT, TOF, RFP, GFP и т.д.) также могут быть собраны для отсортированных животных и сравнены с теми, которые не были отсортированы. Это позволяет одновременно запускать режимы анализа и сортировки, если это необходимо.
- Перед заполнением всей 96-луночной планшета выполните тестовую сортировку подмножества животных или контрольной группы в 96-луночную планшет и проанализируйте с помощью стереомикроскопа, чтобы убедиться, что соответствующее количество и желаемые популяции животных были отсортированы. После подтверждения правильности сортировки повторите шаги 6.3-6.6 для экспериментальных образцов. Нажмите кнопку «Сохранить данные» на верхней ленте в окне программного обеспечения LPS, чтобы снова сохранить данные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение ворот популяции взрослых особей и личинок
Здесь синхронизированные C. elegans L1 выращивали на планшете NGM, засеянном E. coli OP50 (Eco), стандартной лабораторной диетой. Популяции C. elegans собирали для анализа ЛПС через 96 ч или 120 ч роста при 20 °C (рис. 2А). Точечная диаграмма вымирания (EXT, показатель плотности тела) и времени полета (TOF, величина длины тела) создает два визуально разделенных облака животных. Каждая точка представляет одно животное, у которого наблюдаются более высокие значения EXT и TOF у взрослых особей по сравнению с личинками (рис. 2B). Эти два параметра являются ценными выводами для роста населения и физиологии. Например, график плотности личинок TOF может визуализировать распределение личиночных стадий. У потомства от 2-дневных взрослых особей преобладали стадии L1 и L2 с TOF ниже 200, в то время как большинство потомков от 3-дневных взрослых достигли стадий L3 и L4 (рис. 2C). Кроме того, 2D-графики плотности и коробчатых усов полезны для визуализации изменений размера и плотности тела взрослой особи, поскольку значения TOF и EXT увеличиваются на 3-й день по сравнению со 2-м днем при выращивании на E. coli (рис. 2D-F). Эта зависимость, как правило, линейна во взрослом возрасте, но некоторые изменения в физиологии могут влиять на один признак больше, чем на другой (например, взрослые без яиц могут иметь более низкие значения EXT, не влияя на TOF).
Профилирование состава микробиома кишечника с использованием флуоресцентно меченых микробов
Чтобы проиллюстрировать различные уровни колонизации, мы сравнили доминирующего колонизатора естественного микробиома C. elegans dOchrobactrum BH3 (Och), меченного помидорами, и E. coli OP50, меченного зеленым флуоресцентным белком (GFP). Их высевали по отдельности и в равной смеси на основе наружного диаметра (смесь 1:1) на пластине NGM. Синхронизированные L1 C. elegans выращивали в трех условиях и собирали через 120 ч для изучения динамики колонизации у 3-дневных взрослых особей (рис. 3A). 2D-графики плотности и коробчатых усов показали, что существуют различия в значениях TOF и EXT взрослых особей при выращивании C. elegans на Ochrobactrum BH3 и смешанных культурах (рис. 3B-E). О колонизации кишечника бактериями можно судить по уровню флуоресценции, обнаруженному у отдельных нематод. Коробчатые графики показаний красных флуоресцентных ламп показывают повышенную колонизацию Ochrobactrum BH3 в смешанном состоянии, чем у только Ochrobactrum BH3. Напротив, значения зеленой флуоресценции указывают на более низкую колонизацию OP50 в условиях смеси, чем только в OP50. Аналогичные тенденции наблюдаются и в TOF-нормализованных флуоресцентных сигналах, что устраняет влияние размера тела и уменьшает изменчивость в популяции (рис. 3F-I). Для определенного микробиома с несколькими микроорганизмами, помеченными флуоресцентными метками, точечная диаграмма может проиллюстрировать закономерности колонизации этих микробов. Например, в двухчленном смешанном микробиоме точечная диаграмма между красным флуоресцентным белком (RFP) и каналами GFP показывает, что черви сильно смещены к оси Y (RFP), что позволяет предположить, что колонизация OP50 у большинства червей низкая, в то время как уровни колонизации Ochrobactrum BH3 равномерно распределены в популяции (рис. 3J). Аналогичным образом, точечная диаграмма RFP в сравнении с EXT может выявить взаимосвязь между уровнями колонизации Ochrobactrum BH3 и развитием хозяина, например, плотностью тела (рис. 3K). Кроме того, различия в характере размножения можно проследить, построив график плотности соответствующей популяции личинок по трем условиям (рис. 3L).
Обогащение целевых групп населения на основе колонизации микробиома
3-дневные взрослые особи, выращенные на микробиоме из двух членов, демонстрируют широкий диапазон интенсивности RFP, что указывает на индивидуальные вариации колонизации Ochrobactrum BH3 в группе (рис. 4A). Для дальнейшего разделения этих подгрупп были вручную нарисованы сортировочные стробы для высокого и низкого RFP, чтобы отсортировать по 15 особей из каждого затвора в 96-луночную пластину, как показано на изображении всей скважины в RFP (рис. 4B). При большем увеличении наложенные изображения ярких полей и каналов RFP подтверждают, что метод сортировки отбирает червей с высоким и низким уровнем колонизации Ochrobactrum BH3, что позволяет дополнительно охарактеризовать фенотипические последствия и молекулярные драйверы (рис. 4C).
Рисунок 1: Блок-схема методов на основе вермиметрии для оценки микробиома кишечника и физиологии хозяина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Определение популяций взрослых особей и личинок. (A) Рабочий процесс для сбора популяций C. elegans на 2-й и 3-й день взрослой жизни. (B) Точечный график зависимости времени пролета (TOF) от вымирания (EXT) для популяций C. elegans на 2-й день (серый) и 3-й день (красный) взрослой жизни. (C) График плотности личинок ТОФ на 2-й и 3-й день взрослой особи. (Д-Э) Точечные и коробчатые графики TOF и EXT для взрослых на 2-й и 3-й день взрослой жизни. (F) Диаграмма вымирания взрослых особей на 2-й и 3-й день взрослой жизни. P-значения рассчитывали с помощью t-критерия Стьюдента (*** p < 0,001; День 2 n = 38; День 3 n = 88). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Профилирование колонизации микробиома кишечника с помощью микроорганизмов, помеченных флуоресцентными лампами. (A) Коллекция 3-дневных взрослых популяций, выращенных на Ochrobactrum BH3 (dTomato-экспрессирующий; Och), E. coli OP50 (экспрессирующая GFP; Eco) или смесь двух бактерий в соотношении 1:1 (смесь). (B) Точечный график TOF в сравнении с EXT для взрослых особей 3-го дня, выращенных на смеси. (К-Э) Точечные и коробчатые графики TOF в сравнении с EXT для 3-дневных взрослых особей, выращенных на Ochrobactrum BH3. Серыми пунктирными линиями показано среднее значение популяции, выращенной на OP50. (Ф-Г) Коробочно-усовый график сырых и нормализованных TOF-нормализованных значений dTomato (RFP) для 3-дневных взрослых особей, выращенных только на Mix и Ochrobactrum BH3. (Х-И) Коробчатые графики сырых и нормализованных TOF GFP для 3-дневных взрослых особей, выращенных на смеси и OP50. (J) Точечная диаграмма Ochrobactrum BH3 (RFP) в сравнении с E. coli OP50 (GFP) для 3-дневных взрослых особей, выращенных на смеси. (K) Точечная диаграмма RFP в сравнении с EXT для 3-дневных взрослых особей, выращенных на смеси. (L) График плотности личинок 3-дневных взрослых особей, выращенных на смеси, Ochrobactrum BH3 и OP50. Все P-значения были получены из t-критерия Стьюдента (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.s., незначимо; микс n = 230; Och n = 45). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Обогащение целевых популяций на основе колонизации микробиома . (A) Точечная диаграмма TOF в сравнении с RFP (Ochrobactrum BH3) для взрослых в возрасте 3 дней. Высокие (красный прямоугольник) и низкие (черный ящик) вентили RFP используются для обогащения C. elegans высокой и низкой колонизацией Ochrobactrum BH3. (B) Репрезентативные изображения RFP (4x) скважин, содержащих 15 отсортированных червяков из верхних и низких затворов RFP (Bar = 1 мм). (C) Репрезентативные изображения (10x) отдельных червей из верхних и низких затворов RFP (Bar = 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Репрезентативный набор данных, сгенерированный большим сортировщиком частиц для популяций N2 на 2-й и 3-й день взрослого возраста, выращенных на E. coli OP50 и Ochrobactrum BH3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 2: сценарии, используемые при анализе и создании рисунков репрезентативного набора данных в среде R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нескольких исследованиях для характеристики генов и путей C. elegans против колонизации и токсичности патогенов использовалась проточная вермиметрия21,22. Здесь представлен высокопроизводительный подход, который использует C. elegans для изучения того, как кишечные микробиомы модулируют физиологию своего хозяина. По сравнению с существующими методами, использующими колониеобразующие единицы (КОЕ) или секвенирование ампликонов 16S рРНК 9,16,17,23,24, этот подход не требует трудоемкого подсчета и не вносит потенциальную смещение ПЦР. В дополнение к измерению микробиомов в популяции, этот подход позволяет пользователям визуализировать индивидуальные вариации в популяции. Такой подход ограничен только доступностью флуоресцентной экспрессии белков или окрашивания микробов и количеством каналов детектирования в ЛПС. Ниже обсуждаются дополнительные рекомендации по планированию эксперимента, чтобы пользователи могли создать настраиваемый рабочий процесс в соответствии со своими потребностями.
Рекомендации по созданию и засеиванию определенного микробиома
Сначала каждую бактериальную культуру нормализуют до значения OD600 , равного 1, перед смешиванием различных штаммов. Стоит отметить, что в зависимости от сложности сообщества и межвидовых взаимоотношений начальная плотность может оказывать различное влияние на установленный состав микробиома23. Несмотря на то, что ОД можно легко измерить с помощью спектрофотометров, одно предостережение заключается в том, что разные бактерии будут иметь разную концентрацию (например, количество клеток на мл) при одном и том же значении ОД и должны быть соответствующим образом скорректированы. Во-вторых, следует учитывать различия в составе микробиома на газонах. После того, как микробиом посеян на планшете NGM (или другой среде), микробиому дают расти в течение ночи при комнатной температуре, прежде чем выбросить синхронизированные популяции L1 C. elegans на планшеты. Из-за различий в скорости роста и межвидовых взаимодействиях между бактериальными штаммами микробиомы, выращенные на планшетах NGM или любой пластине с субстратами для роста, будут отличаться по составу от исходной смеси семян. Использование планшета NGM, не содержащего пептонов, позволяет сохранить исходное микробное сообщество13. Однако из-за ограниченного роста микробиома на пластине без пептона может потребоваться более высокий наружный диаметр посева или меньшее количество синхронизированных L1 на пластину. Это предотвращает голодную смерть населения до достижения желаемого возраста для анализа. Другой подход заключается в том, чтобы упорядочить или иным образом определить долю микробов на газоне.
Измерение колонизации микробиома и физиологии C. elegans
Во-первых, пороги вымирания (EXT) и времени пролета (TOF) для взрослых особей могут варьироваться в зависимости от возраста, происхождения штамма C. elegans и микробов, на которых они выращены. Наличие в эксперименте взрослой популяции в возрасте 1 дня для каждого червя/бактериального состояния может быть полезно для определения предельных значений TOF и вымирания, а также для контроля вариаций, обусловленных питательной средой и окружающей средой. Помимо стробирования для взрослых особей, TOF и EXT могут быть применены для ворот для личинок, а график плотности потомства позволяет оценить сроки и продуктивность размножения на популяционном уровне (рис. 3L). Во-вторых, усиление ФЭУ и напряжение на LPS необходимо отрегулировать, чтобы максимизировать соотношение сигнал/шум и установить диапазон сигнала, чтобы избежать насыщения. Это зависит от интенсивности флуоресценции бактериальных штаммов и уровня их колонизации. Стандартное значение ФЭУ при 350 хорошо работает для высоких колонизаторов, таких как Ochrobactrum BH3, но пользователям может потребоваться увеличить значения ФЭУ или напряжения для низких колонизаторов, таких как E. coli OP50. В-третьих, из-за различий в свойствах флуорофоров и уровнях их экспрессии в трансгенных штаммах бактерий значения флуоресценции не отражают абсолютное количество бактерий, присутствующих в микробиоме. Таким образом, значения GFP и RFP не могут быть использованы для прямого сравнения колонизации между двумя различными флуоресцентными микробами. Разрушение и нанесение покрытий на животных для выявления количества живых бактерий может помочь лучше разрешить эти взаимосвязи24.
Потенциальные области применения стратегий, основанных на обогащении
Этот метод обеспечивает гибкую высокопроизводительную платформу для изучения влияния изменений микробиома на физиологию хозяина на популяционном уровне. Что касается микробов, то растущая доступность инструментов и ресурсов для редактирования бактериальных геномов25,26,27 приведет к увеличению числа флуоресцентных и функциональных микробных мутантов, связанных с естественным микробиомом C. elegans. Со стороны хозяина доступны многочисленные флуоресцентные репортеры, чтобы изучить связь между клеточной сигнализацией и составом микробиома. Способность обогащать популяцию хозяина или мутанта мутагенизированной популяцией (например, прямой мутагенез EMS)28 или объединенные дикие штаммы29 со специфическими особенностями колонизации микробиома может значительно улучшить способность связывать гены хозяина, которые регулируют воздействие на микробиом. Кроме того, отбор популяций на основе характеристик хозяина и/или микробиома также может способствовать созданию методов профилирования на основе омиксов. Этот подход обладает большой гибкостью и обещает продвинуть понимание молекулярных медиаторов взаимодействия микробиома хозяина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH DP2DK116645 (для B.S.S.), Dunn Foundation Pilot Award и грантом NASA 80NSSC22K0250 (для B.S.S.). Этот проект также был поддержан Центром цитометрии и сортировки клеток в Медицинском колледже Бэйлора при финансировании со стороны CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 и RR024574) и помощи Джоэла М. Седерстрома, а также гранта на инструментарий для гранта LPS NIH (S10 OD025251). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры NIH (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I.
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T.
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).
