Summary
Caenorhabditis elegans è un potente modello per esaminare i determinanti molecolari che guidano le interazioni ospite-microbioma. Presentiamo una pipeline ad alto rendimento che profila i livelli di colonizzazione del microbioma intestinale dei singoli animali insieme ad aspetti chiave della fisiologia di C. elegans.
Abstract
La composizione del microbioma intestinale può avere un impatto drammatico sulla fisiologia dell'ospite durante lo sviluppo e la vita dell'animale. Misurare i cambiamenti di composizione nel microbioma è fondamentale per identificare le relazioni funzionali tra questi cambiamenti fisiologici. Caenorhabditis elegans è emerso come un potente sistema ospite per esaminare i driver molecolari delle interazioni ospite-microbioma. Con la sua pianta corporea trasparente e i microbi naturali marcati con fluorescenza, i livelli relativi di microbi all'interno del microbioma intestinale di un singolo animale di C. elegans possono essere facilmente quantificati utilizzando un grande selezionatore di particelle. Qui descriviamo le procedure per l'impostazione sperimentale di un microbioma, la raccolta e l'analisi delle popolazioni di C. elegans nella fase di vita desiderata, il funzionamento e la manutenzione del selezionatore e le analisi statistiche dei set di dati risultanti. Discutiamo anche le considerazioni per l'ottimizzazione delle impostazioni del selezionatore in base ai microbi di interesse, lo sviluppo di strategie di gating efficaci per le fasi di vita di C. elegans e come utilizzare le capacità del selezionatore per arricchire le popolazioni animali in base alla composizione del microbioma intestinale. Esempi di potenziali applicazioni saranno presentati come parte del protocollo, incluso il potenziale di scalabilità per applicazioni ad alto throughput.
Introduction
L'evoluzione animale è sotto costante influenza microbica1. Da diversi microbi presenti nell'ambiente, gli ospiti animali acquisiscono partner specifici2 che estendono le capacità dell'ospite e guidano la sua fisiologia e suscettibilità alle malattie3. Ad esempio, le analisi metagenomiche del microbioma intestinale hanno scoperto classi metaboliche arricchite di geni microbici che possono conferire una maggiore raccolta e immagazzinamento di energia nei topi obesi4, molti dei quali si trovano anche nel microbioma intestinale umano5. C'è ancora un grande bisogno di stabilire relazioni causali e individuare i determinanti molecolari dell'impatto del microbioma, anche se i progressi sono stati ostacolati dalle complessità del microbioma e dalla trattabilità dei sistemi ospiti per lo screening su larga scala.
L'organismo modello C. elegans fornisce una piattaforma per far progredire la comprensione molecolare dei legami tra microbioma e fisiologia dell'ospite. C. elegans possiede 20 cellule intestinali con uno strato mucoso e strutture di villi. Queste cellule sono dotate di abbondanti geni chemorecettori che rilevano i prodotti microbici e producono molecole antimicrobiche che potenzialmente regolano i loro colonizzatori intestinali 6,7. Questa biologia conservata di C. elegans ha portato a un numero enorme di scoperte nella segnalazione dell'ospite che regola i microbi intestinali, tra cui la segnalazione dell'insulina, il TGF-beta e la MAP chinasi 8,9,10.
C. elegans utilizza i microbi sia come dieta per la crescita durante lo sviluppo che come microbioma da adulti. Con l'avanzare dell'età, alcuni microbi possono accumularsi eccessivamente nel lume intestinale e la relazione ospite-microbo si sposta dalla simbiosi alla patogenesi11. Nel suo habitat naturale, C. elegans incontra una vasta gamma di specie batteriche12,13. Il sequenziamento dell'rDNA 16S da campioni rappresentativi raccolti in habitat naturali (frutti marci, fusto vegetale e vettori animali) ha rivelato che il microbioma naturale di C. elegans è dominato da quattro phyla batterici: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria. All'interno di queste divisioni si trova una grande variazione nella diversità e nella ricchezza dei batteri in base all'habitat12,13,14,15. Sono state istituite diverse comunità definite, tra cui le collezioni di 63 membri (BIGbiome)16 e 12 membri (CeMbio) che rappresentano i principali generi di microbioma creati per la comunità di ricerca di C. elegans 17. Sia i microbiomi che i ceppi componenti possono avere un impatto diverso sulla fisiologia di C. elegans, come le dimensioni corporee, i tassi di crescita e le risposte allo stress 9,16,17. Questi studi forniscono risorse ed esempi per stabilire C. elegans come modello per la ricerca sul microbioma.
Qui viene presentato un flusso di lavoro basato su Large Particle Sorter (LPS) (Figura 1) che utilizza il sistema C. elegans per misurare simultaneamente la composizione del microbioma e le misure di base della fisiologia dell'ospite su scala di popolazione. Dal punto di vista microbico, il flusso di lavoro è adattabile per assemblare un microbioma definito o singoli microbi per testare la robustezza e la plasticità della comunità con interazioni microbiche crescenti. Dal punto di vista dell'ospite, il flusso di lavoro consente saggi ad alto rendimento per misurare i livelli di colonizzazione dei microbi fluorescenti nel microbioma e la lettura fisiologica dell'ospite in termini di sviluppo, dimensioni corporee e riproduzione. Nel complesso, il modello di microbioma di C. elegans consente di individuare i determinanti metabolici e genetici che modulano la fisiologia dell'ospite.
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Protocol
1. Preparazione della miscela di microbioma
- Timbrare o striare i batteri da un brodo congelato di glicerolo su una piastra di brodo di lisogenia (LB) o su un terreno di crescita appropriato e far crescere durante la notte a una temperatura ottimale in base ai ceppi batterici di interesse (in genere 25 °C per i microbi naturali di C. elegans ).
- Dalla piastra LB, utilizzare una singola colonia di ciascun isolato batterico (ad esempio, 12 batteri della collezione CeMbio) per inoculare 800 μL di terreno LB in pozzetti separati di una piastra a pozzetti profondi da 1 mL. Incubare per una notte alla temperatura ottimale agitando a 250 giri/min.
NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per l'uso con microbiomi naturali definiti (ad es. CeMbio), ma può essere facilmente adattato per i singoli microbi mediante crescita in condizioni appropriate o altri recipienti di coltura (provette). - Valutare la crescita di ciascun microbo mediante spettrofotometria. Trasferire un'aliquota da 20 μL a 80 μL di LB e aggiungere la soluzione a una piastra trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti. Misurare l'OD600 su un lettore di piastre.
- Dopo la crescita notturna, centrifugare la piastra di coltura a pozzetti profondi a 4.000 x g per 10 minuti per pellet batterici e rimuovere il surnatante mediante aspirazione utilizzando un collettore di aspirazione a 96 pozzetti o una pipetta multicanale.
- Utilizzando i valori di OD 600, normalizzare la concentrazione di ciascun microbo a un OD finale di600 di 1,0 utilizzando un terreno sterile M9.
- Se si combinano microbi, determinare la quantità di coltura batterica necessaria per l'esperimento e creare una miscela master del microbioma combinando volumi uguali di ciascun ceppo batterico in una provetta di dimensioni sufficienti (ad esempio, provette da 5 mL o 15 mL).
- Individuare 30-50 μL di microbi con un OD finale600 di 1,0 al centro di ciascuna piastra contenente agar del terreno di crescita del nematode (NGM) o del pozzetto18. Lasciare che il microbioma seminato cresca durante la notte a una temperatura ottimale (25 °C qui).
NOTA: Preparare in anticipo le piastre di agar NGM secondo le istruzioni contenute nel Wormbook o utilizzando polvere di NGMpremiscelata 18. Ad esempio, vengono aggiunti 3 mL di NGM per le piastre a 12 pozzetti e 1,5 mL per le piastre a 24 pozzetti.
2. Preparazione di C. elegans sincronizzato per la crescita sul microbioma
- Far crescere circa 100 vermi su piastre NGM (6 cm di diametro) seminate con Escherichia coli OP50, fino a quando i vermi raggiungono l'età adulta gravida. Ai fini di questo protocollo, è stato utilizzato il ceppo N2 di C. elegans , anche se il protocollo può essere facilmente adattato ad altri ceppi di nematodi.
- Aggiungere 6 mL di tampone M9 (più lo 0,01% di tritone X-100; M9-TX) alla piastra, pipettando su e giù per lavare via circa 100 vermi adulti gravidi in una provetta conica da 15 ml.
- Prepara la soluzione di candeggina appena preparata mescolando due parti di candeggina con una parte di NaOH 5 M.
- Centrifugare i vermi a 3.000 x g per 30 secondi per pellettare i vermi. Aspirare per ridurre il volume a 4 ml, quindi aggiungere 2 ml di soluzione di candeggina.
- Chiudere bene il coperchio e agitare il tubo. Monitorare i vermi adulti nella soluzione con uno stereomicroscopio con un ingrandimento 10x. Quando i corpi adulti iniziano a rompersi, in genere dopo 3,5 minuti, interrompere l'agitazione e centrifugare a 3.000 x g per 30 secondi.
- Aspirare a un volume minimo con una pipetta. Risospendere, centrifugare e aspirare quattro volte in M9-TX per lavare via la candeggina.
- Risospendere in 4-6 mL di M9-TX e posizionare la provetta su un rotatore durante la notte, consentendo alle uova di schiudersi e sincronizzarsi allo stadio L1.
- Il giorno successivo, prelevare 10 μL di vermi L1 in M9-TX dalla provetta e lasciarli cadere su una capsula di Petri pulita. Conta il numero di vermi L1 viventi sotto uno stereomicroscopio con un ingrandimento totale di 20x.
- In base alla densità L1, pipettare il volume appropriato per far cadere ~50 larve L1 sincronizzate sul bordo delle piastre NGM seminate nel microbioma e incubare a 20 °C. Lascia crescere i vermi fino all'età desiderata (Giorno 2 o Giorno 3 dell'età adulta).
3. Raccolta della popolazione di vermi per l'analisi del microbioma intestinale
- Lavare via i vermi dal prato batterico con 1-2 ml di M9-TX in una piastra profonda sterilizzata da 2 mL a 96 pozzetti.
NOTA: Per i ceppi microbici che creano biofilm significativi, agitare la piastra con liquido per 5 minuti per rompere i detriti microbici. - Centrifugare la piastra a pozzetti profondi a 300 x g per 1 minuto per pellettare i vermi, quindi rimuovere il liquido utilizzando un collettore di aspirazione.
NOTA: Gli utenti possono utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere manualmente il liquido se non è disponibile un collettore di aspirazione. Assicurarsi che i puntali delle pipette non tocchino il fondo dei pozzetti per evitare la perdita di campioni di vermi. - Aggiungere 1,8 mL di M9-TX a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi utilizzando una pipetta multicanale da 1,2 mL. Mescolare pipettando su e giù un paio di volte e centrifugare a 300 x g per 1 min. Ripeti questo passaggio quattro volte per rimuovere i batteri nel liquido.
- Dopo il lavaggio finale, portare il volume in ogni pozzetto a 100 μL utilizzando il collettore di aspirazione.
NOTA: Per separare gli adulti dalle larve usando la gravità, lasciare la piastra sul banco per 30-60 s, consentendo ai vermi adulti di affondare sul fondo del pozzo. Quindi, aspirare la piastra per rimuovere le larve dalla sospensione. - Aggiungere 100 μL di levamisolo 10 mM in M9-TX a ciascun pozzetto e lasciare che i vermi si paralizzino per 5 minuti. Dopo il trattamento con levamisolo, aggiungere il 4% della soluzione di candeggina descritta al punto 2.3 in ciascun pozzetto per 2 minuti per ridurre i grumi batterici, se necessario. Lavare con M9-TX due volte dopo il trattamento con candeggina e aspirare fino a un volume finale di 100 μL dopo il secondo lavaggio.
- Trasferire i worm su una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti contenente 150 μL di levamisolo da 10 mM in M9-TX. Mantieni la densità dei vermi a 50-100 per pozzetto e dividi i vermi in più pozzetti se la popolazione è troppo affollata.
4. Impostazione del selezionatore di particelle di grandi dimensioni e dell'autocampionatore
- Accendere il compressore d'aria, il computer e lo strumento LPS. Controllare e svuotare il serbatoio di scarico. Quindi, aggiungere 500 ml di candeggina nel serbatoio di scarico vuoto. Controllare e riempire la guaina e i serbatoi dell'acqua se il volume è basso. Assicurarsi che il gruppo conduttore fluidico e ottico (FOCA) da 250 μm sia in posizione.
- Eseguire le particelle di controllo per il controllo qualità. Aprire il software dello strumento LPS. Nella finestra del software, selezionare Abilita laser per accendere i laser a 488 nm e 561 nm.
NOTA: È possibile saltare i passaggi 4.2-4.5 se le particelle di controllo sono state eseguite nelle 2 settimane precedenti e l'UFAC non è stato modificato in quel periodo. - Selezionare Imposta > particelle di controllo. Selezionare No nel prompt per passare alle impostazioni predefinite. Vortex le particelle di controllo (10 mL dH2O e 10 mL di particelle di controllo in una provetta conica da 50 mL) prima di ogni utilizzo e caricarle sulla porta del campione.
- Quando si è pronti, fare clic su Acquisisci per registrare 500 eventi. Assicurati che la frequenza degli eventi sia compresa tra 15 e 30 eventi/s.
NOTA: Se la frequenza degli eventi non è compresa tra 15 e 30 eventi/s, è necessario contattare un tecnico per regolare le impostazioni della macchina. - Esaminare il coefficiente di variazione (CV) per tutti i parametri. Se CV < 15%, il controllo di qualità è superato e il software LPS può essere chiuso. Se CV > 15%, eseguire di nuovo e regolare i micrometri con particelle di controllo appena realizzate per allineare il laser con la cella di flusso.
- Collegare e accendere l'autocampionatore. Aprire il software dello strumento autocampionatore. In questo modo si apre l'autocampionatore e il software LPS. Nella finestra del software LPS, vai a File > Nuovo esperimento, quindi File > Nuovo campione. Selezionare Abilita laser per accendere laser a 488 nm e 561 nm se non è già stato fatto.
- È possibile creare modelli per i dot plot di acquisizione utilizzando i canali TOF (Time of Flight), EXT (EXT) e fluorescenti nella finestra del software LPS. Un buon numero massimo di partenza per catturare tutti i vermi è 8.000 per TOF ed EXT. Le scale di fluorescenza variano in base a ciascun microbo. Includere campioni di vermi di controllo cresciuti su microbo non fluorescente (ad esempio, OP50) e ciascun microbo fluorescente da solo (se si mescolano microbi) come controlli in ogni esperimento.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno del corpo di un grafico per modificare la scala. Utilizzare animali di controllo come gli adulti del Day 1 o gli L1 sincronizzati (o la popolazione di interesse) per assistere nella selezione del gating TOF ed EXT.
- Nella finestra del campionatore automatico, selezionare Prime. Vai su File > Apri script per selezionare lo script incorporato corretto, quindi fai clic su OK.
- Solo per l'analisi, selezionare lo script con Acquisisci. Per l'ordinamento, selezionare lo script con Dispense. Per l'acquisizione da piastre a 96 pozzetti, selezionare lo script con 96 pozzetti; Per l'acquisizione da piastre a 384 pozzetti, selezionare lo script con 384 pozzetti. Per il volume del campione (40 o 100 μL), selezionare lo script con il volume corrispondente.
- Andare su Modello piastra nel menu del software dell'autocampionatore per selezionare i pozzetti desiderati per l'analisi. Caricare i campioni di controllo. Dopo che la piastra è stata caricata sul tavolino dell'autocampionatore e fissata, premere Run Plate nella finestra dell'autocampionatore. Salvare il file quando richiesto.
NOTA: I campioni di controllo e le impostazioni possono essere eseguiti con una provetta conica da 50 mL sulla porta del campione LPS prima di collegare il campionatore LP. - Al termine dell'acquisizione, fare clic sul pulsante Memorizza dati nella barra multifunzione superiore nella finestra del software LPS e salvare nuovamente i dati.
5. Analisi delle caratteristiche di C. elegans e dei livelli di microbioma intestinale per animale
- I dati grezzi vengono archiviati in tre tipi di file: .lmd, .bxr3, .txt. Caricare il file di testo etichettato .txt nel programma R per l'analisi. Completare i passaggi riportati di seguito in R19.
- Utilizzare il pacchetto tidyverse20 come framework per l'analisi.
- Utilizzando la funzione ggplot (inclusa in tidyverse) traccia i dati LPS utilizzando i valori TOF come asse x e i valori EXT come asse y. Un grafico normale mostrerà due nuvole di punti. Assicurati che uno sia vicino all'origine e all'asse x, indicando particelle più piccole come larve e piccoli detriti e che il secondo gruppo di particelle sia verso l'alto a destra del grafico e rappresenti i nematodi adulti.
- Utilizzando questo raggruppamento come guida, scegliere i valori di cut-off TOF ed EXT adeguati. Il gating può variare in base ai ceppi di C. elegans su diversi microbi in base ai cambiamenti nella fisiologia (ad esempio, gli animali scuri rispetto a quelli chiari o i cambiamenti nel trasporto delle uova possono alterare i coefficienti EXT).
- Utilizzare il sottoinsieme di funzioni per separare adulti e larve mediante gating TOF ed EXT. Nell'esempio riportato di seguito, utilizzare le impostazioni TOF > 1.200 e EXT > 1.000 per il gate per gli animali adulti.
- Analizzare i set di dati risultanti per le differenze statistiche; usare la funzione t-test in R per questo esperimento.
- Per determinare l'impatto del microbioma sulle dimensioni e sulla densità ottica di C. elegans, confrontare i valori TOF ed EXT, rispettivamente, tra le condizioni. Il TOF è un indicatore delle dimensioni dei vermi e può indicare cambiamenti nei tassi di crescita degli animali in momenti specifici. I cambiamenti dell'EXT sono maggiori tra la fine dello sviluppo e l'età adulta a causa della luce diffusa dalle uova e possono essere utilizzati per valutare i cambiamenti nei tempi di tale transizione e fecondità. Valutare la proporzione e le distribuzioni della progenie se sono state mantenute durante le analisi.
- Per determinare i cambiamenti nei livelli di colonizzazione del microbioma intestinale, normalizzare prima i valori di fluorescenza (ad esempio, colonne rosse o verdi) dividendo per i singoli valori TOF per ciascun animale. Man mano che i vermi crescono di dimensioni e diventano adulti, anche il volume del loro intestino aumenta. La normalizzazione aiuta a ridurre gli artefatti derivanti dalle differenze nella distribuzione delle dimensioni degli animali campione. Utilizzare animali normalizzati per valutare i cambiamenti nella colonizzazione del microbioma intestinale in tutte le condizioni.
NOTA: un esempio di dati grezzi e gli script R corrispondenti sono disponibili in Supplementary File 1 JOVE_worm_microbiome.txt e Supplementary File 2 JOVE_worm_microbiome.r. Vedere la Figura 2 e la Figura 3 per un esempio rappresentativo di queste analisi dell'ospite e del microbioma utilizzando due batteri fluorescenti.
6. Selezione degli animali di C. elegans in base alle caratteristiche del microbioma intestinale
- Raccogliere una popolazione di C. elegans cresciuta su microbi marcati con fluorescenza (ad esempio, RFP) come descritto nel passaggio 3. I vermi devono essere posti in provette coniche da 50 mL con un minimo di 5 mL di campione. Punta a circa 2.000 vermi/mL compresi tutti gli adulti e la prole.
NOTA: Questa operazione può essere eseguita anche in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti utilizzando il campionatore LP. Mantenere la densità dei vermi a 50-100 per pozzetto.- Se è stato utilizzato il campionatore LP, spegnere e scollegare il campionatore LP. Ricollegare le linee di campionamento e di spurgo all'LPS prima di eseguire lo smistamento.
- Apri il software LPS, vai su File > Nuovo esperimento , quindi su File > Nuovo campione. Create un dot plot con TOF sull'asse x ed Estinzione sull'asse y. Create un altro grafico a punti con TOF sull'asse x e rosso sull'asse y. Utilizzare la stessa scala degli assi e le stesse impostazioni laser utilizzate in precedenza. Selezionare Abilita laser per l'accensione di laser a 488 nm e 561 nm
NOTA: se questi grafici sono stati creati in precedenza, passare a File > Open Experiment e File > Open Sample per caricare i grafici.- Posizionare la provetta del campione di controllo sulla porta del campione. Nella finestra di dialogo Acquisisci/Eroga fare clic su Acquisisci. Salvare il file quando richiesto. Dopo aver misurato un numero sufficiente di vermi per distinguere le popolazioni, fare clic su Interrompi.
NOTA: Le portate devono essere di circa 15-30 eventi/s. In caso contrario, regolare le concentrazioni di vermi per garantire che i singoli animali vengano analizzati o selezionati per goccia. Nell'LPS, i vermi passano attraverso il percorso del laser in diverse posizioni (dritta o arricciata o piegata). Possono impiegare una quantità di tempo diversa per passare il laser e il rilevatore a seconda delle loro posizioni. - Nel dot plot TOF vs Extinction disegna un cancello intorno alla popolazione adulta. Nel TOF vs Red dot plot disegna i cancelli intorno alle aree con valori di rosso alti e bassi come regioni di interesse per i vermi adulti con diversi livelli di colonizzazione del microbioma. Vai a Visualizza > gerarchia di controllo e assicurati che i cancelli fluorescenti siano elencati sotto il cancello della popolazione adulta. Dopo aver ottimizzato le impostazioni, vai a File > Salva esperimento e File > Salva campione.
NOTA: Nell'esempio riportato di seguito, selezionare gli animali in base alle porte TOF/EXT per gli adulti e ordinarli in pool che presentano un'alta o bassa colonizzazione con batteri fluorescenti rossi che esprimono proteine. Tuttavia, qualsiasi combinazione di parametri misurati dall'LPS può essere utilizzata per identificare la popolazione o le popolazioni di interesse.
- Posizionare la provetta del campione di controllo sulla porta del campione. Nella finestra di dialogo Acquisisci/Eroga fare clic su Acquisisci. Salvare il file quando richiesto. Dopo aver misurato un numero sufficiente di vermi per distinguere le popolazioni, fare clic su Interrompi.
- Prima dello smistamento, assicurarsi che sia stato caricato l'apparecchio di raccolta appropriato. Per caricare la piastra a 96 pozzetti sull'apparecchio di raccolta, selezionare Carica piastra A > Sposta nella sezione Sposta fase della finestra di dialogo Acquisisci/Eroga per consentire alla piastra di raccolta di spostarsi in una posizione preparata per il caricamento di una piastra a 96 pozzetti.
- Per lo smistamento in blocco, selezionare la dimensione appropriata della provetta e fare clic su Sposta per caricare una provetta conica da 15 mL o 50 mL. Nella sezione Ordinamento (Sorting) della finestra di dialogo Acquisisci/Eroga (Acquire/Dispense), scegliete il gate di smistamento dall'elenco a discesa delle regioni create. Immettere il numero di oggetti della regione definita da erogare a una provetta di raccolta direttamente sotto l'ugello della cella di flusso. Fare clic sul pulsante Ordinamento in blocco nella finestra di dialogo Acquisisci/Eroga.
- Per il dosaggio su una piastra a 96 pozzetti, andare a Configurazione delle piastre > > Piastre calibrate > Piastra a 96 pozzetti. Quindi vai a Visualizza > modello di piastra, seleziona i pozzetti in cui verranno ordinati i vermi, inserisci il numero di oggetti da ordinare in ciascun pozzetto e seleziona le aree chiuse di interesse. Se più di una regione recintata verrà ordinata nella stessa piastra, selezionare la casella Gate Each Well. Fare clic su OK per salvare le modifiche.
- Dopo aver assegnato i numeri e le posizioni di ordinamento, fare clic sui pulsanti Fill Plate (Riempi piastra ) nella finestra di dialogo Acquisisci/Eroga (Acquire/Dispense) per avviare l'erogazione su una piastra a 96 pozzetti.
- Prima di riempire l'intera piastra a 96 pozzetti, eseguire lo smistamento di prova di un sottogruppo di animali o controlli in una piastra a 96 pozzetti e analizzarla utilizzando uno stereomicroscopio per assicurarsi che siano stati ordinati i numeri appropriati e le popolazioni animali desiderate. Una volta confermata l'accurata cernita, ripetere i passaggi 6.3-6.6 per i campioni sperimentali. Fare clic sul pulsante Memorizza dati sulla barra multifunzione in alto nella finestra del software LPS per salvare nuovamente i dati.
NOTA: Tutte le misurazioni (EXT, TOF, RFP, GFP, ecc.) possono essere raccolte anche per gli animali selezionati e confrontate con quelli che non sono stati selezionati. Ciò può consentire l'esecuzione simultanea delle modalità di analisi e ordinamento, se lo si desidera.
- Prima di riempire l'intera piastra a 96 pozzetti, eseguire lo smistamento di prova di un sottogruppo di animali o controlli in una piastra a 96 pozzetti e analizzarla utilizzando uno stereomicroscopio per assicurarsi che siano stati ordinati i numeri appropriati e le popolazioni animali desiderate. Una volta confermata l'accurata cernita, ripetere i passaggi 6.3-6.6 per i campioni sperimentali. Fare clic sul pulsante Memorizza dati sulla barra multifunzione in alto nella finestra del software LPS per salvare nuovamente i dati.
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Representative Results
Definizione dei gate di popolazione di adulti e larve
Qui, i C. elegans L1 sincronizzati sono stati coltivati su una piastra NGM seminata con E. coli OP50 (Eco), una dieta standard di laboratorio. Le popolazioni di C. elegans sono state raccolte per l'analisi LPS dopo 96 o 120 ore di crescita a 20 °C (Figura 2A). Un dot plot dell'estinzione (EXT, un proxy della densità del corpo) rispetto al tempo di volo (TOF, un proxy della lunghezza del corpo) crea due nuvole visivamente separate di animali. Ogni punto rappresenta un singolo animale in cui si osservano valori di EXT e TOF più elevati da parte degli adulti rispetto alle larve (Figura 2B). Questi due parametri sono inferenze preziose per la crescita e la fisiologia della popolazione. Ad esempio, un grafico di densità delle larve TOF può visualizzare la distribuzione degli stadi larvali. Le progenie di adulti di 2 giorni sono state dominate dagli stadi L1 e L2 con un TOF inferiore a 200, mentre la maggior parte delle progenie di adulti di 3 giorni ha raggiunto gli stadi L3 e L4 (Figura 2C). Inoltre, i grafici 2D di densità e baffi a scatola sono utili per visualizzare i cambiamenti nelle dimensioni e nella densità del corpo adulto, poiché i valori di TOF ed EXT aumentano il giorno 3 rispetto al giorno 2 quando viene coltivato su E. coli (Figura 2D-F). Questa relazione è tipicamente lineare durante l'età adulta, ma alcuni cambiamenti nella fisiologia possono avere un impatto maggiore su una caratteristica rispetto a un'altra (ad esempio, gli adulti senza uova possono avere valori di EXT più bassi senza influenzare la TOF).
Profilazione della composizione del microbioma intestinale utilizzando microbi marcati con fluorescenza
Al fine di illustrare i diversi livelli di colonizzazione, confrontiamo un colonizzatore dominante del microbioma naturale di C. elegans con Ochrobactrum BH3 (Och) marcato con pomodoro ed E. coli OP50 marcato con proteina fluorescente verde (GFP). Questi due sono stati seminati singolarmente e in una miscela uguale basata su OD (miscela 1:1) sulla piastra NGM. Gli L1 sincronizzati di C. elegans sono stati coltivati nelle tre condizioni e raccolti a 120 ore per esaminare le dinamiche di colonizzazione negli adulti di 3 giorni (Figura 3A). La densità 2D e i grafici box-whisker hanno mostrato che ci sono differenze nei valori TOF ed EXT degli adulti quando C. elegans viene coltivato su colture Ochrobactrum BH3 e miste (Figura 3B-E). La colonizzazione intestinale dei batteri può essere dedotta dal livello di fluorescenza rilevato nei singoli nematodi. I grafici a baffo di letture fluorescenti rosse mostrano una maggiore colonizzazione di Ochrobactrum BH3 in condizioni di miscela rispetto a Ochrobactrum BH3 da solo. Al contrario, i valori verde-fluorescenti indicano una minore colonizzazione di OP50 nella condizione di miscela rispetto al solo OP50. Tendenze simili si osservano nei segnali fluorescenti normalizzati con TOF, che eliminano l'effetto delle dimensioni corporee e riducono la variazione all'interno della popolazione (Figura 3F-I). Per un microbioma definito con più microbi marcati con fluorescenza, un dot plot può illustrare i modelli di colonizzazione per questi microbi. Ad esempio, nel microbioma misto a due membri, un dot plot della proteina fluorescente rossa (RFP) rispetto ai canali GFP mostra che i vermi sono fortemente inclinati verso l'asse y (RFP), suggerendo che la colonizzazione di OP50 è bassa nella maggior parte dei vermi mentre i livelli di colonizzazione di Ochrobactrum BH3 sono distribuiti uniformemente nella popolazione (Figura 3J). Allo stesso modo, un dot plot di RFP rispetto a EXT può rivelare la relazione tra i livelli di colonizzazione di Ochrobactrum BH3 e lo sviluppo dell'ospite, come la densità corporea (Figura 3K). Inoltre, le differenze nei modelli di riproduzione possono essere osservate tracciando il grafico della densità della rispettiva popolazione di larve sulle tre condizioni (Figura 3L).
Arricchimento per popolazioni mirate in base alla colonizzazione del microbioma
Gli adulti di 3 giorni cresciuti sul microbioma misto a due membri mostrano un'ampia gamma di intensità RFP, indicando variazioni individuali nella colonizzazione di Ochrobactrum BH3 all'interno del gruppo (Figura 4A). Per separare ulteriormente questi sottogruppi, sono stati disegnati manualmente i gate di smistamento per RFP alta e bassa per smistare 15 individui da ciascun gate in una piastra da 96 pozzetti, come mostrato dall'immagine RFP dell'intero pozzetto (Figura 4B). Sotto un ingrandimento più elevato, le immagini sovrapposte di campi luminosi e canali RFP confermano che il metodo di selezione seleziona vermi colonizzati da Ochrobactrum BH3 alti e bassi, il che consente un'ulteriore caratterizzazione delle conseguenze fenotipiche e dei driver molecolari (Figura 4C).
Figura 1: Un diagramma di flusso per i metodi basati sulla vermimetria a flusso per valutare il microbioma intestinale e la fisiologia dell'ospite. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Definizione delle popolazioni adulte e larve. (A) Un flusso di lavoro per raccogliere le popolazioni di C. elegans il giorno 2 e il giorno 3 dell'età adulta. (B) Dot plot del tempo di volo (TOF) rispetto all'estinzione (EXT) per le popolazioni di C. elegans il giorno 2 (grigio) e il giorno 3 (rosso) dell'età adulta. (C) Grafico della densità delle larve TOF il giorno 2 e il giorno 3 dell'età adulta. (D-E) Grafici a punti e baffi di TOF rispetto a EXT per gli adulti il giorno 2 e il giorno 3 dell'età adulta. (F) Grafico a scatola e baffi dell'estinzione dell'adulto il giorno 2 e il giorno 3 dell'età adulta. I valori P sono stati calcolati con il test t dello studente (*** p < 0,001; Giorno 2 n = 38; Giorno 3 n = 88). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profilazione della colonizzazione del microbioma intestinale utilizzando microbi marcati con fluorescenza. (A) Raccolta di popolazioni adulte di 3 giorni cresciute su Ochrobactrum BH3 (dEspressione del pomodoro; Och), E. coli OP50 (che esprime GFP; Eco) o una miscela 1:1 dei due batteri (mix). (B) Dot plot di TOF rispetto a EXT per gli adulti del giorno 3 cresciuti con il Mix. (C-E) Grafici a punti e baffi di TOF rispetto a EXT per adulti di 3 giorni cresciuti su Ochrobactrum BH3. Le linee tratteggiate grigie indicano il valore medio della popolazione cresciuta su OP50. (F-G) Grafico box-and-whisker dei valori di dTomato (RFP) crudo e normalizzato TOF per adulti di 3 giorni coltivati solo con Mix e Ochrobactrum BH3. (H-I) Appezzamenti box-and-whisker di GFP grezza e normalizzata TOF per adulti di 3 giorni coltivati su mix e OP50. (J) Dot plot di Ochrobactrum BH3 (RFP) rispetto a E. coli OP50 (GFP) per adulti di 3 giorni cresciuti su mix. (K) Dot plot di RFP rispetto a EXT per adulti di 3 giorni cresciuti su mix. (L) Grafico della densità delle larve di adulti di 3 giorni cresciuti su mischia, Ochrobactrum BH3 e OP50. Tutti i valori P sono stati generati dal test t di Student (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.s., non significativo; mix n = 230; Och n = 45). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Arricchimento di popolazioni mirate in base alla colonizzazione del microbioma . (A) Dot plot di TOF rispetto a RFP (Ochrobactrum BH3) per adulti di 3 giorni. I cancelli RFP alti (scatola rossa) e bassi (scatola nera) vengono disegnati per arricchire C. elegans con colonizzazione di Ochrobactrum BH3 alta e bassa. (B) Immagini RFP rappresentative (4x) dei pozzetti contenenti 15 vermi selezionati da porte RFP alte e basse (Bar = 1 mm). (C) Immagini rappresentative (10x) di singoli worm da gate RFP alti e bassi (Bar = 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Set di dati rappresentativo generato da un selezionatore di particelle di grandi dimensioni per popolazioni di N2 in età adulta di giorno 2 e giorno 3 coltivate su E. coli OP50 e Ochrobactrum BH3. Fare clic qui per scaricare il file.
File supplementare 2: script utilizzati nell'analisi e nella generazione di figure di set di dati rappresentativi nell'ambiente R. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
La vermimetria a flusso è stata utilizzata per caratterizzare i geni e le vie di C. elegans contro la colonizzazione e la tossicità dei patogeni in diversi studi21,22. Qui, viene presentato un approccio ad alto rendimento che utilizza C. elegans per studiare come i microbiomi intestinali modulano la fisiologia dell'ospite. Rispetto ai metodi esistenti che utilizzano unità formanti colonie (CFU) o il sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S 9,16,17,23,24, questo approccio non richiede un conteggio ad alta intensità di lavoro o introduce potenziali distorsioni PCR. Oltre a misurare i microbiomi in un'intera popolazione, questo approccio consente agli utenti di visualizzare le variazioni individuali all'interno della popolazione. Questo approccio è limitato solo dalla disponibilità di espressione di proteine fluorescenti o dalla colorazione dei microbi e dal numero di canali di rilevamento nell'LPS. Di seguito vengono illustrate considerazioni aggiuntive per la progettazione sperimentale in modo che gli utenti possano creare un flusso di lavoro personalizzato in base alle proprie esigenze.
Considerazioni per la creazione e la semina di un microbioma definito
Innanzitutto, ogni coltura batterica viene normalizzata a un valore OD600 di 1 prima di miscelare ceppi diversi. Vale la pena notare che, a seconda della complessità della comunità e delle relazioni interspecie, la densità di partenza può avere vari impatti sulla composizione del microbioma stabilita23. Mentre l'OD può essere facilmente misurato dagli spettrofotometri, un avvertimento è che batteri diversi avranno concentrazioni diverse (ad esempio, il numero di cellule per mL) per lo stesso valore OD e dovrebbero essere regolati di conseguenza. In secondo luogo, è necessario tenere conto della variazione della composizione del microbioma nei prati. Una volta che il microbioma è stato seminato sulla piastra NGM (o su altri terreni), il microbioma viene lasciato crescere durante la notte a temperatura ambiente prima di far cadere le popolazioni sincronizzate di L1 C. elegans sulle piastre. A causa delle variazioni nei tassi di crescita e nelle interazioni interspecie tra ceppi batterici, i microbiomi coltivati su piastre NGM o su qualsiasi piastra con substrati per la crescita differiranno nella composizione dalla miscela di semi originale. L'uso di una piastra NGM priva di peptoni può preservare la comunità microbica originale13. Tuttavia, a causa della limitata crescita del microbioma sulla piastra priva di peptoni, potrebbe essere necessario un OD di semina più elevato o un numero ridotto di L1 sincronizzati per piastra. In questo modo si evita che la popolazione muoia di fame prima di raggiungere l'età desiderata per il test. Un altro approccio consiste nel sequenziare o determinare in altro modo la proporzione di microbi nel prato.
Misurazione della colonizzazione del microbioma e della fisiologia di C. elegans
In primo luogo, le soglie di estinzione (EXT) e di time-of-flight (TOF) per gli adulti possono variare in base all'età, al background del ceppo di C. elegans e ai microbi su cui vengono coltivati. Avere una popolazione adulta di 1 giorno nell'esperimento per ogni condizione di verme/batterio può essere utile per determinare il TOF e i cutoff di estinzione, nonché per controllare la variazione dovuta ai mezzi di crescita e all'ambiente. Oltre al gating per gli adulti, TOF ed EXT possono essere applicati al gate per le larve, e un grafico della densità della progenie può stimare i tempi e l'output della riproduzione a livello di popolazione (Figura 3L). In secondo luogo, i guadagni PMT e la tensione sull'LPS devono essere regolati per massimizzare il rapporto segnale/rumore e impostare l'intervallo del segnale per evitare la saturazione. Ciò dipende dall'intensità fluorescente dei ceppi batterici e dai loro livelli di colonizzazione. Il PMT predefinito a 350 funziona bene per colonizzatori alti come Ochrobactrum BH3, ma gli utenti potrebbero dover aumentare i valori di PMT o tensione per colonizzatori bassi come E. coli OP50. In terzo luogo, a causa delle differenze nelle proprietà dei fluorofori e nei loro livelli di espressione nei ceppi batterici transgenici, i valori fluorescenti non riflettono il numero assoluto di batteri presenti nel microbioma. Pertanto, i valori di GFP e RFP non possono essere utilizzati per confrontare direttamente la colonizzazione tra due diversi microbi fluorescenti. L'alterazione e la placcatura degli animali per identificare la conta batterica viva possono aiutare a risolvere meglio queste relazioni24.
Potenziali applicazioni per le strategie basate sull'arricchimento
Questo metodo fornisce una piattaforma ad alto rendimento per studiare l'impatto dei cambiamenti del microbioma sulla fisiologia dell'ospite a livello di popolazione. Dal punto di vista microbico, la crescente disponibilità di strumenti e risorse per modificare i genomi batterici25,26,27 aumenterà il numero di mutanti microbici fluorescenti e funzionali correlati al microbioma naturale di C. elegans. Dal lato dell'ospite, sono disponibili numerosi reporter fluorescenti per esplorare il legame tra la segnalazione cellulare e la composizione del microbioma. La capacità di arricchire una popolazione ospite o mutante da una popolazione mutagenizzata (ad esempio, mutagenesi diretta EMS)28 o ceppi selvatici aggregati29, con specifiche caratteristiche di colonizzazione del microbioma può far progredire notevolmente la capacità di collegare i geni dell'ospite che regolano l'impatto del microbioma. Inoltre, la selezione delle popolazioni in base alle caratteristiche dell'ospite e/o del microbioma può facilitare anche una serie di modalità di profilazione basate sull'omica. Questo approccio ha una grande flessibilità e promette di far progredire la comprensione dei mediatori molecolari delle interazioni ospite-microbioma.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH DP2DK116645 (a BSS), dal premio pilota della Fondazione Dunn e dalla sovvenzione NASA 80NSSC22K0250 (a BSS). Questo progetto è stato anche sostenuto dal Cytometry and Cell Sorting Core presso il Baylor College of Medicine con il finanziamento del CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), del NIH (S10 OD025251, CA125123 e RR024574) e l'assistenza di Joel M. Sederstrom, oltre a una sovvenzione per la strumentazione per la sovvenzione LPS NIH (S10 OD025251). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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