Summary
Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.
Abstract
De samenstelling van het darmmicrobioom kan een dramatische invloed hebben op de fysiologie van de gastheer tijdens de ontwikkeling en het leven van het dier. Het meten van veranderingen in de samenstelling van het microbioom is cruciaal bij het identificeren van de functionele relaties tussen deze fysiologische veranderingen. Caenorhabditis elegans is naar voren gekomen als een krachtig gastheersysteem om de moleculaire drijfveren van gastheer-microbioominteracties te onderzoeken. Met zijn transparante lichaamsplan en fluorescerend gelabelde natuurlijke microben kunnen de relatieve niveaus van microben in het darmmicrobioom van een individueel C. elegans-dier gemakkelijk worden gekwantificeerd met behulp van een grote deeltjessorteerder. Hier beschrijven we de procedures voor het experimenteel opzetten van een microbioom, het verzamelen en analyseren van C. elegans-populaties in de gewenste levensfase, de werking en het onderhoud van de sorteerder, en statistische analyses van de resulterende datasets. We bespreken ook overwegingen voor het optimaliseren van sorteerinstellingen op basis van de microben die van belang zijn, de ontwikkeling van effectieve poortstrategieën voor de levensfasen van C. elegans en hoe sorteermogelijkheden kunnen worden gebruikt om dierpopulaties te verrijken op basis van de samenstelling van het darmmicrobioom. Voorbeelden van mogelijke toepassingen zullen worden gepresenteerd als onderdeel van het protocol, waaronder het potentieel voor schaalbaarheid naar toepassingen met een hoge doorvoer.
Introduction
De evolutie van dieren staat onder constante microbiële invloed1. Van diverse microben in de omgeving verwerven dierlijke gastheren specifieke partners2 die de mogelijkheden van de gastheer uitbreiden en zijn fysiologie en vatbaarheid voor ziekten stimuleren3. Metagenomische analyses van het darmmicrobioom brachten bijvoorbeeld verrijkte metabole klassen van microbiële genen aan het licht die een grotere energieoogst en -opslag kunnen opleveren bij zwaarlijvige muizen4, waarvan er vele ook worden aangetroffen in het menselijke darmmicrobioom5. Er is nog steeds een grote behoefte om causale verbanden vast te stellen en de moleculaire determinanten van de impact van het microbioom vast te stellen, hoewel de vooruitgang wordt belemmerd door de complexiteit van het microbioom en de traceerbaarheid van gastheersystemen voor grootschalige screening.
Het modelorganisme C. elegans biedt een platform om het moleculaire begrip van verbanden tussen microbioom en gastheerfysiologie te bevorderen. C. elegans bezit 20 darmcellen met een slijmvlieslaag en villistructuren. Deze cellen zijn uitgerust met overvloedige chemoreceptorgenen die microbiële producten detecteren en antimicrobiële moleculen produceren die mogelijk hun darmkolonisatoren reguleren 6,7. Deze geconserveerde biologie van C. elegans heeft geleid tot een enorm aantal ontdekkingen in gastheersignalering die darmmicroben reguleren, waaronder insulinesignalering, TGF-bèta en MAP-kinase 8,9,10.
C. elegans gebruiken microben als zowel hun dieet voor groei tijdens de ontwikkeling als het microbioom als volwassenen. Naarmate ouder worden, kunnen sommige microben zich te veel ophopen in het darmlumen en verschuift de relatie tussen gastheer en microbe van symbiose naar pathogenese11. In hun natuurlijke habitat komt C. elegans een breed scala aan bacteriesoorten tegen12,13. Sequencing van 16S rDNA van representatieve monsters verzameld in natuurlijke habitats (rot fruit, plantenstengel en dierlijke vectoren) onthulde dat het natuurlijke microbioom van C. elegans wordt gedomineerd door vier bacteriële phyla: Proteobacteriën, Bacteroidetes, Firmicutes en Actinobacteriën. Binnen deze divisies ligt een grote variatie in de diversiteit en rijkdom van bacteriën op basis van de habitat12,13,14,15. Er zijn verschillende gedefinieerde gemeenschappen opgericht, waaronder de 63-leden (BIGbiome)16 en 12-leden (CeMbio) collecties die de belangrijkste microbioomgeslachten vertegenwoordigen die zijn gecreëerd voor de C. elegans-onderzoeksgemeenschap 17. Zowel microbiomen als samenstellende stammen kunnen een diverse invloed hebben op de fysiologie van C. elegans, zoals lichaamsgrootte, groeisnelheid en stressreacties9,16,17. Deze studies bieden middelen en voorbeelden om C. elegans vast te stellen als een model voor microbioomonderzoek.
Hier wordt een op grote deeltjessorteerder (LPS) gebaseerde workflow (Figuur 1) gepresenteerd die gebruik maakt van het C. elegans-systeem om tegelijkertijd de samenstelling van het microbioom en basismetingen van de fysiologie van de gastheer op populatieschaal te meten. Aan de microbiële kant is de workflow aanpasbaar om een gedefinieerd microbioom of enkele microben samen te stellen om de robuustheid en plasticiteit van de gemeenschap te testen met toenemende microbiële interacties. Aan de kant van de gastheer maakt de workflow high-throughput-assays mogelijk om kolonisatieniveaus van fluorescerende microben in het microbioom te meten en de fysiologische uitlezing van de gastheer in termen van ontwikkeling, lichaamsgrootte en reproductie. Alles bij elkaar maakt het microbioommodel van C. elegans high-throughput screens mogelijk om de metabole en genetische determinanten te lokaliseren die de fysiologie van de gastheer moduleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van het microbioommengsel
- Stamp of streep bacteriën uit een glycerol-diepvriesbouillon op een lysogene bouillon (LB)-plaat, of een geschikt groeimedium, en kweek 's nachts bij een optimale temperatuur op basis van bacteriestammen die van belang zijn (meestal 25 °C voor natuurlijke microben van C. elegans ).
- Gebruik van de LB-plaat een enkele kolonie van elk bacterie-isolaat (bijv. 12 bacteriën van de CeMbio-collectie) om 800 μL LB-medium te inoculeren in afzonderlijke putjes van een 1 ml deepwell-plaat. Incubeer een nacht op de optimale temperatuur met schudden op 250 tpm.
OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met gedefinieerde natuurlijke microbiomen (bijv. CeMbio), maar kan eenvoudig worden aangepast voor individuele microben door groei onder geschikte omstandigheden of andere kweekvaten (buisjes). - Beoordeel de groei van elke microbe door middel van spectrofotometrie. Breng een aliquot van 20 μl over op 80 μl LB en voeg de oplossing toe aan een doorzichtige plaat met 96 putjes met platte bodem. Meet de OD600 op een plaatlezer.
- Centrifugeer na een nacht groei de deepwell-kweekplaat gedurende 10 minuten bij 4.000 x g om bacteriën te pelleteren en verwijder het supernatans door aspiratie met behulp van een 96-wells aspiratiespruitstuk of meerkanaalspipet.
- Gebruik OD 600-waarden om de concentratie van elke microbe te normaliseren tot een uiteindelijke OD600 van 1,0 met behulp van steriel M9-medium.
- Als u microben combineert, bepaal dan de hoeveelheid bacteriecultuur die nodig is voor het experiment en creëer een microbioom-mastermix door gelijke volumes van elke bacteriestam te combineren in een buis van voldoende grootte (bijv. 5 ml of 15 ml buisjes).
- Spot 30-50 μL van de microben met een uiteindelijke OD600 van 1,0 op het midden van elk nematodengroeimedium (NGM) agar-bevattende plaat of putje18. Laat het gezaaide microbioom 's nachts groeien bij een optimale temperatuur (hier 25 °C).
NOTITIE: Bereid NGM-agarplaten van tevoren voor volgens de instructies in het wormboek of met behulp van voorgemengd NGM-poeder18. Er wordt bijvoorbeeld 3 ml NGM toegevoegd voor platen met 12 putjes en 1,5 ml voor platen met 24 putjes.
2. Voorbereiding van gesynchroniseerde C. elegans voor groei op het microbioom
- Kweek ongeveer 100 wormen op NGM-platen (6 cm diameter) bezaaid met Escherichia coli OP50, totdat de wormen de volwassen leeftijd bereiken. Voor de doeleinden van dit protocol werd de C. elegans N2-stam gebruikt, hoewel het protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan andere nematodenstammen.
- Voeg 6 ml M9-buffer toe (plus 0,01% triton X-100; M9-TX) op de plaat, pipetteren op en neer om ongeveer 100 drachtige volwassen wormen in een conische buis van 15 ml te spoelen.
- Bereid vers gemaakte bleekoplossing door twee delen bleekmiddel te mengen met een deel 5 M NaOH.
- Centrifugeer de wormen gedurende 30 seconden op 3.000 x g om de wormen te pelleteren. Zuig aan om het volume terug te brengen tot 4 ml en voeg vervolgens 2 ml bleekoplossing toe.
- Sluit het deksel goed en schud de buis. Bewaak de volwassen wormen in de oplossing onder een stereomicroscoop met een vergroting van 10x. Wanneer volwassen lichamen uit elkaar beginnen te vallen, meestal na 3,5 minuut, stop dan met schudden en centrifugeer gedurende 30 seconden op 3.000 x g .
- Zuig op tot een minimaal volume met een pipet. Resuspendeer, centrifugeer en zuig vier keer op in M9-TX om het bleekmiddel uit te wassen.
- Resuspendeer in 4-6 ml M9-TX en plaats de buis een nacht op een rotator, zodat de eieren kunnen uitkomen en synchroniseren in de L1-fase.
- Neem de volgende dag 10 μL L1-wormen in M9-TX uit de buis en laat ze op een schone petrischaal vallen. Tel het aantal levende L1-wormen onder een stereomicroscoop met een totale vergroting van 20x.
- Op basis van de L1-dichtheid pipetteert u het juiste volume om ~50 gesynchroniseerde L1-larven op de rand van de met microbioom gezaaide NGM-platen te laten vallen en te incuberen bij 20 °C. Laat wormen groeien tot de gewenste leeftijd (dag 2 of dag 3 van de volwassenheid).
3. Verzamelen van wormpopulatie voor darmmicrobioomanalyses
- Was de wormen van het bacteriële gazon met 1-2 ml M9-TX op een gesteriliseerde 2 ml 96-well diepe plaat.
NOTITIE: Voor microbiële stammen die significante biofilms creëren, schudt u de plaat gedurende 5 minuten met vloeistof om microbieel afval te breken. - Centrifugeer de deepwell-plaat gedurende 1 minuut op 300 x g om de wormen te pelleteren en verwijder vervolgens de vloeistof met behulp van een aanzuigspruitstuk.
OPMERKING: Gebruikers kunnen een meerkanaalspipet gebruiken om de vloeistof handmatig te verwijderen als er geen aanzuigspruitstuk beschikbaar is. Zorg ervoor dat de pipetpunten de bodem van de putjes niet raken om verlies van wormmonsters te voorkomen. - Voeg 1,8 ml M9-TX toe aan elk putje van de deepwell-plaat met behulp van een meerkanaalspipet van 1,2 ml. Meng door een paar keer op en neer te pipetteren en centrifugeer gedurende 1 minuut op 300 x g . Herhaal deze stap vier keer om bacteriën in de vloeistof te verwijderen.
- Breng na de laatste wasbeurt het volume in elk putje op 100 μL met behulp van het aanzuigspruitstuk.
OPMERKING: Om volwassenen van de larven te scheiden met behulp van de zwaartekracht, laat u de plaat 30-60 s op de bank staan, zodat volwassen wormen naar de bodem van de put kunnen zinken. Zuig vervolgens de plaat op om larven uit de suspensie te verwijderen. - Voeg 100 μL 10 mM levamisol in M9-TX toe aan elk putje en laat de wormen 5 minuten verlammen. Voeg na de behandeling met levamisol 4% van de bleekoplossing beschreven in stap 2.3 toe aan elk putje gedurende 2 minuten om bacteriële klonten te verminderen, indien nodig. Was tweemaal met M9-TX na de bleekbehandeling en zuig na de tweede wasbeurt op tot een eindvolume van 100 μL.
- Breng de wormen over naar een vlakke bodem met 96 putjes die 150 μL 10 mM levamisol in M9-TX bevat. Houd de wormdichtheid op 50-100 per put en splits de wormen in meerdere putten als de populatie te druk is.
4. Instellen van de grote deeltjessorteerder en autosampler
- Schakel de luchtcompressor, de computer en het LPS-instrument in. Controleer en leeg de afvaltank. Voeg vervolgens 500 ml bleekmiddel toe aan de lege afvaltank. Controleer en vul de schede en watertanks bij als het volume laag is. Zorg ervoor dat de 250 μm fluidic and optical core assembly (FOCA) op zijn plaats zit.
- Voer de controledeeltjes uit voor kwaliteitscontrole. Open de LPS-instrumentsoftware. Vink in het softwarevenster Lasers inschakelen aan om de lasers van 488 nm en 561 nm in te schakelen.
OPMERKING: Het is mogelijk om stap 4.2-4.5 over te slaan als de controledeeltjes in de afgelopen 2 weken zijn uitgevoerd en de FOCA in die tijd niet is gewijzigd. - Selecteer Deeltjes instellen > beheersen. Selecteer Nee in de prompt om naar de standaardinstellingen te gaan. Draai de controledeeltjes (10 ml dH, 2O en 10 ml controledeeltjes in een conische buis van 50 ml) voor elk gebruik en laad ze op de monsterpoort.
- Als u klaar bent, klikt u op Acquireren om 500 gebeurtenissen op te nemen. Zorg ervoor dat de gebeurtenissnelheid tussen de 15 en 30 gebeurtenissen/s ligt.
NOTITIE: Als de gebeurtenissnelheid niet 15-30 gebeurtenissen/s is, moet contact worden opgenomen met een technicus om de machine-instellingen aan te passen. - Onderzoek de variatiecoëfficiënt (CV) voor alle parameters. Als CV 15% <, is de kwaliteitscontrole geslaagd en kan de LPS-software worden afgesloten. Als CV 15% >, voer dan opnieuw uit en pas micrometers aan met vers gemaakte controledeeltjes om de laser uit te lijnen met de stroomcel.
- Sluit de autosampler aan en zet hem aan. Open de software van het autosampler-instrument. Dit opent de autosampler en de LPS-software. Ga in het LPS-softwarevenster naar Bestand > nieuw experiment en vervolgens naar Bestand > nieuw voorbeeld. Vink Lasers inschakelen aan om lasers van 488 nm en 561 nm in te schakelen als dit nog niet is gedaan.
- Maak sjablonen voor acquisitiepuntplots met behulp van vluchttijd (TOF), extinctie (EXT) en fluorescerende kanalen in het LPS-softwarevenster. Een goed startmaximum om alle wormen te vangen is 8.000 voor TOF en EXT. Fluorescentieschalen variëren op basis van elke microbe. Neem controlewormmonsters op die zijn gekweekt op niet-fluorescerende microbe (bijv. OP50) en elke fluorescerende microbe alleen (als microben worden gemengd) als controles bij elk experiment.
- Klik met de rechtermuisknop in de hoofdtekst van een grafiek om de schaal te wijzigen. Gebruik controledieren zoals volwassen dag 1 of gesynchroniseerde L1's (of populatie van belang) om te helpen bij de selectie van TOF en EXT gating.
- Selecteer in het autosampler-venster de optie Prime. Ga naar Bestand > Open Script om het juiste ingebouwde script te selecteren en klik vervolgens op OK.
- Selecteer het script met Acquire, alleen voor analyse. Als u wilt sorteren, selecteert u het script met Dispense. Voor acquisitie van platen met 96 putjes, selecteert u het script met 96 putjes; Voor het verkrijgen van platen met 384 putjes, selecteert u het script met 384 wells. Voor het monstervolume (40 of 100 μL) selecteert u het script met het bijbehorende volume.
- Ga naar Plate Template in het autosampler-softwaremenu om de gewenste putjes voor analyse te selecteren. Laad de controlemonsters. Nadat de plaat op de autosampler-tafel is geladen en vastgezet, drukt u op Run Plate in het autosampler-venster. Sla het bestand op wanneer daarom wordt gevraagd.
NOTITIE: Controlemonsters en instellingen kunnen worden gedaan met een conische buis van 50 ml op de LPS-monsterpoort voordat de LP-sampler wordt bevestigd. - Wanneer de acquisitie is voltooid, klikt u op de knop Gegevens opslaan op het bovenste lint in het LPS-softwarevenster en slaat u de gegevens opnieuw op.
5. Analyse van de kenmerken van C. elegans en het niveau van het darmmicrobioom per dier
- Ruwe gegevens worden opgeslagen in drie bestandstypen: .lmd, .bxr3, .txt. Laad het tekstbestand met het label .txt bestand in het R-programma voor analyse. Voer de onderstaande stappen in V19 uit.
- Gebruik het pakket tidyverse20 als raamwerk voor de analyse.
- Met behulp van de ggplot-functie (inbegrepen in tidyverse) worden de LPS-gegevens geplot met behulp van de TOF-waarden als x-as en EXT-waarden als y-as. Een normale grafiek toont twee wolken van stippen. Zorg ervoor dat men zich dicht bij de oorsprong en de x-as bevindt, wat wijst op kleinere deeltjes zoals larven en klein puin en de tweede groep deeltjes bevindt zich rechtsboven in de grafiek en vertegenwoordigt volwassen nematoden.
- Gebruik deze groepering als richtlijn en kies geschikte TOF- en EXT-afkapwaarden. Gating kan variëren per C. elegans-stam op verschillende microben op basis van veranderingen in de fysiologie (bijv. donkere versus heldere dieren of veranderingen in het vervoer van eieren kunnen de EXT-coëfficiënten veranderen).
- Gebruik de functiesubset om volwassenen en larven te scheiden door TOF- en EXT-gating. Gebruik in het voorbeeld hier TOF > 1.200 en EXT > 1.000 instellingen om volwassen dieren te poorten.
- Analyseer de resulterende datasets op statistische verschillen; gebruik de t-toets functie in R voor dit experiment.
- Om de impact van het microbioom op de grootte en optische dichtheid van C. elegans te bepalen, vergelijkt u respectievelijk de TOF- en EXT-waarden tussen de omstandigheden. TOF is een proxy voor de grootte van de worm en kan veranderingen in de groeisnelheid van de dieren op specifieke tijdstippen aangeven. EXT-veranderingen zijn het grootst tussen het einde van de ontwikkeling en de volwassenheid vanwege het licht dat door eieren wordt verstrooid en kunnen worden gebruikt om veranderingen in de timing van die overgang en vruchtbaarheid te beoordelen. Beoordeel het aandeel en de verdeling van de nakomelingen als ze tijdens de analyses zijn behouden.
- Om veranderingen in de kolonisatieniveaus van het darmmicrobioom te bepalen, normaliseert u eerst de fluorescentiewaarden (bijv. rode of groene kolommen) door te delen met individuele TOF-waarden voor elk dier. Naarmate wormen groter worden en volwassen worden, wordt het volume van hun darmen ook groter. Normalisatie helpt bij het verminderen van artefacten door verschillen in de verdeling van de grootte van steekproefdieren. Gebruik genormaliseerde dieren om veranderingen in de kolonisatie van het darmmicrobioom onder verschillende omstandigheden te beoordelen.
OPMERKING: Een voorbeeld van ruwe gegevens en bijbehorende R-scripts zijn te vinden in het aanvullende bestand 1 JOVE_worm_microbiome.txt en het aanvullende bestand 2 JOVE_worm_microbiome.r. Zie figuur 2 en figuur 3 voor een representatief voorbeeld van deze analyses van de gastheer en het microbioom met behulp van twee fluorescerende bacteriën.
6. Sorteren van C. elegans-dieren op basis van darmmicrobioomkenmerken
- Verzamel een C. elegans-populatie die is gekweekt op fluorescerend gelabelde microben (bijv. RFP) zoals beschreven in stap 3. Wormen moeten in kegelvormige buisjes van 50 ml worden geplaatst met minimaal 5 ml monster. Streef naar ongeveer 2.000 wormen/ml, inclusief alle volwassen dieren en nakomelingen.
OPMERKING: Dit kan ook worden gedaan in een vlakke bodem met 96 putjes met behulp van de LP-sampler. Houd de wormdichtheid op 50-100 per putje.- Als de LP-sampler is gebruikt, schakelt u de LP-sampler uit en koppelt u deze los. Sluit de monster- en spoellijnen opnieuw aan op de LPS voordat u gaat sorteren.
- Open de LPS-software, ga naar Bestand > nieuw experiment en vervolgens naar Bestand > nieuw voorbeeld. Maak een dot plot met TOF op de x-as en Extinction op de y-as. Maak nog een puntplot met TOF op de x-as en rood op de y-as. Gebruik dezelfde asschaal en laserinstellingen als voorheen. Vink Lasers inschakelen aan om lasers van 488 nm en 561 nm in te schakelen
OPMERKING: Als deze plots eerder zijn gemaakt, gaat u naar Bestand > Experiment openen en Bestand > Steekproef openen om grafieken te laden.- Plaats het controlemonsterbuisje op de monsterpoort. Klik in het dialoogvenster Verkrijgen/afgeven op Verkrijgen. Sla het bestand op wanneer daarom wordt gevraagd. Nadat er voldoende wormen zijn gemeten om populaties te onderscheiden, klikt u op Afbreken.
NOTITIE: Het debiet moet ongeveer 15-30 gebeurtenissen/s zijn. Als dit niet het geval is, pas dan de wormconcentraties aan om ervoor te zorgen dat individuele dieren per druppel worden geanalyseerd of gesorteerd. Bij LPS passeren wormen het pad van de laser in verschillende posities (recht versus gekruld of gebogen). Ze kunnen een verschillende hoeveelheid tijd nodig hebben om de laser en detector te passeren, afhankelijk van hun posities. - Teken in de TOF vs Extinction dot plot een poort rond de volwassen populatie. In de TOF vs Red dot plot teken je poorten rond de gebieden met hoge en lage rode waarden als interessegebieden voor volwassen wormen met verschillende niveaus van microbioomkolonisatie. Ga naar View > Gating Hierarchy en zorg ervoor dat de fluorescerende poorten worden vermeld onder de poort voor volwassen bevolking. Nadat de instellingen zijn geoptimaliseerd, gaat u naar Bestand > Experiment opslaan en Bestand > Voorbeeld opslaan.
OPMERKING: Selecteer in het voorbeeld hier dieren op basis van TOF/EXT-poorten voor volwassenen en sorteer in pools die een hoge of lage kolonisatie vertonen met rode fluorescerende eiwitexpressiebacteriën. Elke combinatie van parameters die door de LPS wordt gemeten, kan echter worden gebruikt om de populatie(s) van belang te identificeren.
- Plaats het controlemonsterbuisje op de monsterpoort. Klik in het dialoogvenster Verkrijgen/afgeven op Verkrijgen. Sla het bestand op wanneer daarom wordt gevraagd. Nadat er voldoende wormen zijn gemeten om populaties te onderscheiden, klikt u op Afbreken.
- Controleer voor het sorteren of de juiste opvangapparatuur is geladen. Als u de plaat met 96 putjes op het opvangapparaat wilt plaatsen, selecteert u Laadplaat A > Verplaatsen onder de sectie Fase verplaatsen in het dialoogvenster Verkrijgen/doseren om de verzamelfase naar een positie te laten gaan die is voorbereid voor het laden van een plaat met 96 putjes.
- Voor bulksortering selecteert u de juiste buismaat en klikt u op Verplaatsen om een conische buis van 15 ml of 50 ml te laden. Kies in de sectie Sorteren van het dialoogvenster Verkrijgen/afgeven de sorteerpoort in de vervolgkeuzelijst met de gemaakte regio's. Voer het aantal objecten uit het gedefinieerde gebied in dat moet worden afgegeven aan een opvangbuis direct onder het mondstuk van de stroomcel. Klik op de knop Bulksortering onder het dialoogvenster Verkrijgen/afgeven.
- Voor het doseren op een plaat met 96 putjes gaat u naar Platen > instellen > gekalibreerde platen > plaat met 96 putjes. Ga vervolgens naar View > Plate Template, selecteer de putten waarnaar de wormen zullen worden gesorteerd, voer het aantal objecten in dat in elke put moet worden gesorteerd en selecteer de omheinde gebieden van belang. Als er meer dan één omheind gebied op hetzelfde bord wordt gesorteerd, vink dan het vakje Gate Each Well aan. Klik op OK om de wijzigingen op te slaan.
- Nadat de sorteernummers en locaties zijn toegewezen, klikt u op de knoppen Plaat vullen in het dialoogvenster Verkrijgen/doseren om de dosering op een plaat met 96 putjes te starten.
- Voordat u de volledige plaat met 96 putjes vult, voert u een testsortering uit van een subset van dieren of controles in een plaat met 96 putjes en analyseert u deze met behulp van een stereomicroscoop om er zeker van te zijn dat de juiste aantallen en gewenste dierpopulaties zijn gesorteerd. Zodra de nauwkeurige sortering is bevestigd, herhaalt u stap 6.3-6.6 voor experimentele monsters. Klik op de knop Gegevens opslaan op het bovenste lint in het LPS-softwarevenster om gegevens opnieuw op te slaan.
OPMERKING: Alle metingen (EXT, TOF, RFP, GFP, enz.) kunnen ook worden verzameld voor gesorteerde dieren en worden vergeleken met dieren die niet zijn gesorteerd. Hierdoor kunnen analyse- en sorteermodi desgewenst tegelijkertijd worden uitgevoerd.
- Voordat u de volledige plaat met 96 putjes vult, voert u een testsortering uit van een subset van dieren of controles in een plaat met 96 putjes en analyseert u deze met behulp van een stereomicroscoop om er zeker van te zijn dat de juiste aantallen en gewenste dierpopulaties zijn gesorteerd. Zodra de nauwkeurige sortering is bevestigd, herhaalt u stap 6.3-6.6 voor experimentele monsters. Klik op de knop Gegevens opslaan op het bovenste lint in het LPS-softwarevenster om gegevens opnieuw op te slaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Definiëren van populatiepoorten voor volwassen dieren en larven
Hier werden gesynchroniseerde C. elegans L1's gekweekt op een NGM-plaat bezaaid met E. coli OP50 (Eco), een standaard laboratoriumdieet. C. elegans-populaties werden verzameld voor LPS-analyse na 96 uur of 120 uur groei bij 20 °C (figuur 2A). Een dot plot van uitsterven (EXT, een proxy van lichaamsdichtheid) versus time-of-flight (TOF, een proxy van lichaamslengte) creëert twee visueel gescheiden wolken van dieren. Elke stip vertegenwoordigt een enkel dier waar hogere EXT- en TOF-waarden worden waargenomen bij volwassenen in vergelijking met larven (Figuur 2B). Deze twee parameters zijn waardevolle gevolgtrekkingen voor bevolkingsgroei en fysiologie. Een dichtheidsgrafiek van larven TOF kan bijvoorbeeld de verdeling van larvale stadia visualiseren. Nakomelingen van volwassenen van 2 dagen oud werden gedomineerd door L1- en L2-stadia met een TOF van minder dan 200, terwijl de meeste nakomelingen van volwassenen van 3 dagen oud L3- en L4-stadia bereikten (Figuur 2C). Bovendien zijn 2D-dichtheids- en doos-snorharenplots nuttig om veranderingen in de lichaamsgrootte en -dichtheid van volwassenen te visualiseren, aangezien de waarden van TOF en EXT op dag 3 toenemen in vergelijking met dag 2 wanneer ze worden gekweekt op E. coli (Figuur 2D-F). Deze relatie is meestal lineair tijdens de volwassenheid, maar sommige veranderingen in de fysiologie kunnen het ene kenmerk meer beïnvloeden dan het andere (volwassenen zonder eieren kunnen bijvoorbeeld lagere EXT-waarden hebben zonder TOF te beïnvloeden).
Profilering van de samenstelling van het darmmicrobioom met behulp van fluorescerend gelabelde microben
Om verschillende niveaus van kolonisatie te illustreren, vergelijken we een dominante kolonisator van het natuurlijke C. elegans-microbioom dTomato-gelabelde Ochrobactrum BH3 (Och) en groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabelde E. coli OP50. Deze twee werden afzonderlijk en in een gelijk mengsel op basis van OD (1:1 mix) op de NGM-plaat gezaaid. Gesynchroniseerde C. elegans L1's werden gekweekt onder de drie omstandigheden en verzameld om 120 uur om de kolonisatiedynamiek bij volwassenen van 3 dagen oud te onderzoeken (Figuur 3A). 2D-dichtheids- en buxus-snorharenplots toonden aan dat er verschillen zijn in volwassen TOF- en EXT-waarden wanneer C. elegans wordt gekweekt op Ochrobactrum BH3 en mengculturen (Figuur 3B-E). Darmkolonisatie van bacteriën kan worden afgeleid uit het fluorescentieniveau dat wordt gedetecteerd in de individuele nematoden. Box-whisker-plots van rode fluorescerende metingen tonen een verhoogde kolonisatie van Ochrobactrum BH3 in de mixconditie dan in Ochrobactrum BH3 alleen. Daarentegen duiden groen-fluorescerende waarden op een lagere OP50-kolonisatie in de mixconditie dan in OP50 alleen. Vergelijkbare trends worden waargenomen in TOF-genormaliseerde fluorescerende signalen, waardoor het effect van lichaamsgrootte wordt weggenomen en de variatie binnen de populatie wordt verminderd (Figuur 3F-I). Voor een gedefinieerd microbioom met meerdere fluorescerend gelabelde microben kan een puntdiagram kolonisatiepatronen voor deze microben illustreren. In het tweekoppige microbioom laat een stipdiagram van rood fluorescerend eiwit (RFP) versus GFP-kanalen bijvoorbeeld zien dat wormen sterk scheef zijn in de richting van de y-as (RFP), wat suggereert dat OP50-kolonisatie bij de meeste wormen laag is, terwijl de niveaus van Ochrobactrum BH3-kolonisatie gelijkmatig verdeeld zijn over de populatie (Figuur 3J). Evenzo kan een puntdiagram van RFP versus EXT de relatie onthullen tussen de kolonisatieniveaus van Ochrobactrum BH3 en de ontwikkeling van de gastheer, zoals lichaamsdichtheid (Figuur 3K). Bovendien kunnen de verschillen in voortplantingspatronen worden waargenomen door de dichtheidsgrafiek van de respectieve larvenpopulatie uit te zetten op de drie voorwaarden (figuur 3L).
Verrijking voor doelgroepen op basis van microbioomkolonisatie
De 3 dagen oude volwassenen die op het tweekoppige microbioom worden gekweekt, vertonen een breed scala aan RFP-intensiteit, wat wijst op individuele variaties in de kolonisatie van Ochrobactrum BH3 binnen de groep (Figuur 4A). Om deze subgroepen verder te scheiden, werden sorteerpoorten voor hoge en lage RFP handmatig getekend om 15 individuen van elke poort te sorteren in een plaat met 96 putjes, zoals te zien is op de RFP-afbeelding van de hele put (Figuur 4B). Bij een hogere vergroting bevestigen overlay-beelden van heldere velden en RFP-kanalen dat de sorteermethode hoge en lage Ochrobactrum BH3-gekoloniseerde wormen selecteert, wat verdere karakterisering van fenotypische gevolgen en moleculaire drijfveren mogelijk maakt (Figuur 4C).
Figuur 1: Een stroomschema voor op stromingsvermimetrie gebaseerde methoden om het darmmicrobioom en de fysiologie van de gastheer te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Definitie van volwassen en larvenpopulaties. (A) Een workflow voor het verzamelen van C. elegans-populaties op dag 2 en dag 3 van de volwassenheid. (B) Dot plot van time-of-flight (TOF) versus extinctie (EXT) voor C. elegans-populaties op dag 2 (grijs) en dag 3 (rood) van de volwassenheid. (C) Dichtheidsgrafiek van larven TOF op dag 2 en dag 3 van de volwassenheid. (D-E) Punt- en doos-en-snorharenplots van TOF versus EXT voor volwassenen op dag 2 en dag 3 van de volwassenheid. (F) Box-and-whisker-plot van het uitsterven van volwassen dieren op dag 2 en dag 3 van de volwassenheid. P-waarden werden berekend met de t-toets van de student (*** p < 0,001; Dag 2 n = 38; Dag 3 n = 88). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Profilering van de kolonisatie van het darmmicrobioom met behulp van fluorescerend gelabelde microben. (A) Verzameling van volwassen populaties van 3 dagen oud gekweekt op Ochrobactrum BH3 (dTomaat-expressie; Och), E. coli OP50 (GFP-expressie; Eco) of een 1:1 mix van de twee bacteriën (mix). (B) Dot plot van TOF versus EXT voor volwassen dieren op dag 3 gekweekt op de Mix. (C-E) Punt- en doos-en-snorharenplots van TOF versus EXT voor volwassenen van 3 dagen oud gekweekt op Ochrobactrum BH3. Grijze streepjes geven de gemiddelde waarde aan van de populatie die op OP50 is gegroeid. (F-G) Box-and-whisker-plot van rauwe en TOF-genormaliseerde dTomato (RFP)-waarden voor volwassenen van 3 dagen oud die alleen op Mix en Ochrobactrum BH3 worden gekweekt. (H-I) Box-and-whisker-plots van rauwe en TOF-genormaliseerde GFP voor volwassenen van 3 dagen oud gekweekt op mix en OP50. (J) Puntdiagram van Ochrobactrum BH3 (RFP) versus E. coli OP50 (GFP) voor volwassenen van 3 dagen oud die op een mix worden gekweekt. (K) Dot plot van RFP versus EXT voor volwassenen van 3 dagen oud die op mix worden gekweekt. (L) Dichtheidsgrafiek van larven van volwassen dieren van 3 dagen oud gekweekt op mengsel, Ochrobactrum BH3 en OP50. Alle P-waarden zijn gegenereerd op basis van de t-toets van de student (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.s., niet significant; mix n = 230; Och n = 45). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Doelgerichte populaties verrijken op basis van microbioomkolonisatie . (A) Dot plot van TOF versus RFP (Ochrobactrum BH3) voor volwassenen van 3 dagen oud. Hoge (rode doos) en lage (zwarte doos) RFP-poorten worden getekend om C. elegans te verrijken met hoge en lage Ochrobactrum BH3-kolonisatie. (B) Representatieve RFP-beelden (4x) van de putjes met 15 gesorteerde wormen van hoge en lage RFP-poorten (Bar = 1 mm). (C) Representatieve beelden (10x) van individuele wormen van hoge en lage RFP-poorten (Bar = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Representatieve dataset gegenereerd door grote deeltjessorteerder voor N2-populaties in volwassen jaren op dag 2 en dag 3 gekweekt op E. coli OP50 en Ochrobactrum BH3. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Scripts die worden gebruikt bij de analyse en het genereren van figuren van representatieve datasets in de R-omgeving. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flowvermimetrie is gebruikt om C. elegans-genen en -routes tegen pathogene kolonisatie en toxiciteit in verschillende onderzoeken te karakteriseren21,22. Hier wordt een 'high throughput alife' benadering gepresenteerd die C. elegans gebruikt om te onderzoeken hoe darmmicrobiomen hun gastheerfysiologie moduleren. Vergeleken met bestaande methoden die gebruik maken van kolonievormende eenheden (CFU) of 16S rRNA-ampliconsequencing 9,16,17,23,24, vereist deze aanpak geen arbeidsintensief tellen of introduceert het geen mogelijke PCR-bias. Naast het meten van microbiomen in een hele populatie, stelt deze aanpak gebruikers in staat om individuele variaties binnen de populatie te visualiseren. Deze aanpak wordt alleen beperkt door de beschikbaarheid van fluorescerende eiwitexpressie of kleuring van microben en het aantal detectiekanalen in de LPS. Aanvullende overwegingen voor experimenteel ontwerp worden hieronder besproken, zodat gebruikers een aangepaste workflow kunnen maken op basis van hun behoeften.
Overwegingen voor het creëren en zaaien van een gedefinieerd microbioom
Eerst wordt elke bacteriecultuur genormaliseerd naar een OD600-waarde van 1 voordat verschillende stammen worden gemengd. Het is vermeldenswaard dat, afhankelijk van de complexiteit van de gemeenschap en de relaties tussen soorten, de startdichtheid verschillende effecten kan hebben op de vastgestelde samenstelling van het microbioom23. Hoewel OD gemakkelijk kan worden gemeten door spectrofotometers, is een voorbehoud dat verschillende bacteriën verschillende concentraties hebben (bijv. het aantal cellen per ml) voor dezelfde OD-waarde en dienovereenkomstig moeten worden aangepast. Ten tweede moet rekening worden gehouden met variatie in de samenstelling van het microbioom in gazons. Zodra het microbioom op de NGM-plaat (of andere media) is gezaaid, mag het microbioom 's nachts bij kamertemperatuur groeien voordat gesynchroniseerde L1 C. elegans-populaties op de platen vallen. Als gevolg van variaties in groeisnelheden en interacties tussen soorten tussen bacteriestammen, zullen microbiomen die op NGM-platen of een plaat met substraten voor groei worden gekweekt, in samenstelling verschillen van het oorspronkelijke zaadmengsel. Het gebruik van een peptonvrije NGM-plaat kan de oorspronkelijke microbiële gemeenschap behouden13. Vanwege de beperkte groei van het microbioom op de peptonvrije plaat kan echter een hogere zaai-OD of een verminderd aantal gesynchroniseerde L1's per plaat nodig zijn. Dit voorkomt dat de populatie verhongert voordat de gewenste leeftijd voor onderzoek is bereikt. Een andere benadering is om het aandeel microben in het gazon te sequencen of anderszins te bepalen.
Het meten van microbioomkolonisatie en C. elegans fysiologie
Ten eerste kunnen de drempels voor uitsterven (EXT) en time-of-flight (TOF) voor volwassenen variëren op basis van leeftijd, achtergrond van de C. elegans-stam en de microben waarop ze worden gekweekt. Het hebben van een volwassen populatie van 1 dag oud in het experiment voor elke worm/bacteriële aandoening kan nuttig zijn om de TOF- en uitstervingsgrenswaarden te bepalen en om de variatie als gevolg van groeimedia en omgeving te beheersen. Naast gating voor volwassen dieren kunnen TOF en EXT worden toegepast om larven te poorten, en een dichtheidsgrafiek van het nageslacht kan de timing en output van de voortplanting op populatieniveau schatten (Figuur 3L). Ten tweede moeten de PMT-versterking en de spanning op de LPS worden aangepast om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren en het signaalbereik in te stellen om verzadiging te voorkomen. Dit is afhankelijk van de fluorescerende intensiteit van de bacteriestammen en hun kolonisatieniveaus. Standaard PMT op 350 werkt goed voor hoge kolonisatoren zoals Ochrobactrum BH3, maar gebruikers moeten mogelijk PMT of spanningswaarden verhogen voor lage kolonisatoren zoals E. coli OP50. Ten derde, als gevolg van verschillen in de eigenschappen van de fluoroforen en hun expressieniveaus in transgene bacteriestammen, weerspiegelen fluorescerende waarden niet het absolute aantal bacteriën dat in het microbioom aanwezig is. Daarom kunnen GFP- en RFP-waarden niet worden gebruikt om kolonisatie tussen twee verschillende fluorescerende microben rechtstreeks te vergelijken. Het verstoren en uitplateren van dieren om levende kiemgetallen te identificeren, kan helpen om deze relaties beter op te lossen24.
Mogelijke toepassingen voor op verrijking gebaseerde strategieën
Deze methode biedt een ontvankelijk platform met hoge doorvoer om de impact van microbioomveranderingen op de fysiologie van de gastheer op populatieniveau te onderzoeken. Aan de microbiële kant zal de toenemende beschikbaarheid van tools en middelen om bacteriële genomen 25,26,27 te bewerken het aantal fluorescerende en functionele microbiële mutanten die verband houden met het natuurlijke microbioom van C. elegans doen toenemen. Van de kant van de gastheer zijn tal van fluorescerende reporters beschikbaar om het verband tussen celsignalering en de samenstelling van het microbioom te onderzoeken. Het vermogen om een gastheerpopulatie of mutant uit een gemutageniseerde populatie (bijv. EMS forward mutagenese)28 of gepoolde wilde stammen29 te verrijken met specifieke kenmerken van microbioomkolonisatie, kan het vermogen om gastheergenen te verbinden die de impact van het microbioom reguleren, aanzienlijk verbeteren. Bovendien kan de selectie van populaties op basis van gastheer- en/of microbioomkenmerken ook een kader van op omics gebaseerde profileringsmodaliteiten vergemakkelijken. Deze aanpak heeft een grote flexibiliteit en belooft het begrip van de moleculaire mediatoren van gastheer-microbioominteracties te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies DP2DK116645 (aan BSS), Dunn Foundation pilot award en NASA-subsidie 80NSSC22K0250 (aan BSS). Dit project werd ook ondersteund door de Cytometry and Cell Sorting Core van het Baylor College of Medicine met financiering van de CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), de NIH (S10 OD025251, CA125123 en RR024574), en de hulp van Joel M. Sederstrom, plus een instrumentatiesubsidie voor de LPS NIH-subsidie (S10 OD025251). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I.
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T.
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).
