Summary
線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用を促進する分子決定因子を調べるための強力なモデルです。本稿では、腸内細菌叢のコロニー形成における単一動物レベルのプロファイリングを、 線虫 生理学の重要な側面とともにプロファイリングするハイスループットパイプラインを提示する。
Abstract
腸内細菌叢の構成は、動物の発育と生涯を通じて宿主の生理機能に劇的な影響を与える可能性があります。マイクロバイオームの組成変化を測定することは、これらの生理学的変化の間の機能的関係を特定する上で非常に重要です。 線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用の分子的要因を調べるための強力な宿主系として浮上しています。透明なボディプランと蛍光タグ付き天然微生物により、個々の C.エレガンス 動物の腸内細菌叢内の微生物の相対レベルは、大型粒子選別機を使用して簡単に定量化できます。ここでは、マイクロバイオームの実験セットアップ、目的のライフステージにおける 線虫 集団の収集と分析、ソーターの操作と保守、および得られたデータセットの統計分析の手順について説明します。また、対象微生物に基づいて選別機の設定を最適化するための考慮事項、 線虫 のライフステージに対する効果的なゲーティング戦略の開発、および腸内細菌叢の構成に基づいて動物集団を豊かにするために選別機機能を利用する方法についても説明します。プロトコルの一部として、高スループットアプリケーションへのスケーラビリティの可能性など、潜在的なアプリケーションの例を示します。
Introduction
動物の進化は絶え間ない微生物の影響下にある1.動物の宿主は、環境中の多様な微生物から、宿主の能力を拡張し、その生理機能や病気に対する感受性を駆動する特定のパートナー2を獲得します3。例えば、腸内細菌叢のメタゲノム解析により、肥満マウスにおいて、より大きなエネルギー収穫と貯蔵をもたらす可能性のある微生物遺伝子の代謝クラスが濃縮されていることが明らかになり4、その多くはヒトの腸内細菌叢にも見られます5。因果関係を確立し、マイクロバイオームの影響の分子決定要因を特定する必要性は依然として高いが、マイクロバイオームの複雑さと大規模なスクリーニングに対する宿主システムの扱いやすさによって進歩が妨げられている。
モデル生物であるC.エレガンスは、マイクロバイオームと宿主の生理機能との関連性に関する分子的理解を深めるためのプラットフォームを提供します。C.エレガンスは、粘膜層と絨毛構造を持つ20個の腸細胞を持っています。これらの細胞は、微生物産物を感知し、腸内コロニー形成体を調節する可能性のある抗菌分子を産生する豊富な化学受容体遺伝子を備えています6,7。線虫のこの保存された生物学は、インスリンシグナル伝達、TGF-β、MAPキナーゼ8,9,10など、腸内細菌を調節する宿主シグナル伝達の膨大な数の発見につながりました。
線虫は、発生中の成長のための食事として微生物を利用し、成体としてのマイクロバイオームの両方を利用します。老齢に伴い、一部の微生物が腸管腔に過剰に蓄積し、宿主と微生物の関係が共生から病因へと移行する11。自然の生息地では、C.エレガンスはさまざまな細菌種に遭遇します12,13。自然の生息地(腐った果実、植物の茎、動物媒介動物)で採取された代表的なサンプルから16S rDNAの塩基配列を解読したところ、線虫の自然なマイクロバイオームは、プロテオバクテリア、バクテロイデス、ファーミキューテス、放線菌の4つの細菌門によって支配されていることが明らかになりました。これらの区分の中には、生息地に基づくバクテリアの多様性と豊富さの大きなばらつきがあります12,13,14,15。C.エレガンス研究コミュニティのために作成された上位のマイクロバイオーム属を代表する63メンバー(BIGbio)16および12メンバー(CeMbio)コレクション17など、いくつかの定義されたコミュニティが確立されています。マイクロバイオームと成分株の両方が、体の大きさ、成長率、ストレス反応など、線虫の生理機能に多様な影響を与える可能性があります9,16,17。これらの研究は、線虫群をマイクロバイオーム研究のモデルとして確立するためのリソースと例を提供します。
ここでは、C.エレガンスシステムを利用して、マイクロバイオームの組成と宿主の生理学の基本的な測定値を集団スケールで同時に測定する、大型粒子選別機(LPS)ベースのワークフロー(図1)を紹介します。微生物側から見ると、ワークフローは適応性があり、定義されたマイクロバイオームまたは単一の微生物を組み立てて、微生物の相互作用が増加しているコミュニティの頑健性と可塑性をテストします。宿主側から見ると、このワークフローにより、マイクロバイオーム内の蛍光微生物のコロニー形成レベルを測定し、発生、体の大きさ、生殖の観点から宿主の生理学的読み出しを行うハイスループットアッセイが可能になります。まとめると、C.エレガンスマイクロバイオームモデルにより、宿主の生理機能を調節する代謝および遺伝的決定要因を特定するためのハイスループットスクリーニングが可能になります。
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Protocol
1. マイクロバイオーム混合物の調製
- グリセロールフリーザーストックからリソジェニーブロス(LB)プレートまたは適切な増殖培地に細菌をスタンプまたはストリークアウトし、目的の細菌株( C.エレガンス 天然微生物の場合は通常25°C)に基づいて最適な温度で一晩増殖させます。
- LBプレートから、各細菌分離株の1つのコロニー(例:CeMbioコレクションの12個の細菌)を使用して、1 mLのディープウェルプレートの別々のウェルに800 μLのLB培地を接種します。250rpmで振とうしながら、最適な温度で一晩インキュベートします。
注:このプロトコルは、定義された天然マイクロバイオーム(CeMbioなど)での使用に最適化されていますが、適切な条件下での増殖または他の培養容器(チューブ)により、個々の微生物に合わせて簡単に調整できます。 - 分光光度法によって各微生物の成長を評価します。20 μL のアリコートを 80 μL の LB に移し、透明で平底の 96 ウェルプレートに溶液を加えます。プレートリーダーでOD600 を測定します。
- 一晩増殖させた後、ディープウェル培養プレートを4,000 x g で10分間遠心分離してバクテリアをペレット化し、96ウェル吸引マニホールドまたはマルチチャンネルピペットを使用して吸引により上清を除去します。
- OD 600 値を使用して、滅菌 M9 培地を使用して、各微生物の濃度を最終的な OD600 の1.0 に正規化します。
- 微生物を組み合わせる場合は、実験に必要な細菌培養の量を決定し、各細菌株を等量で十分なサイズのチューブ(5 mLまたは15 mLのチューブなど)に組み合わせてマイクロバイオームマスターミックスを作成します。
- 最終OD600が1.0の微生物30〜50μL を、各線虫増殖培地(NGM)寒天含有プレートまたはウェル18の中心にスポットする。播種したマイクロバイオームを最適な温度(ここでは25°C)で一晩成長させます。
注:Wormbookの指示に従って、または事前に混合されたNGM粉末18を使用して、NGM寒天プレートを事前に準備します。例えば、12ウェルプレートには3 mLのNGMを添加し、24ウェルプレートには1.5 mLを添加します。
2. マイクロバイオーム上での増殖のための同期線 虫 の調製
- 大 腸菌 OP50を播種したNGMプレート(直径6cm)で、約100匹の線虫を成虫になるまで育てます。このプロトコルの目的のために、 C.のelegans N2緊張はプロトコルが他の線虫の緊張に容易に合わせることができるが、使用された。
- 6 mL の M9 バッファー (プラス 0.01% triton X-100;M9-TX)をプレートに移し、ピペッティングで上下にピペッティングし、約100匹の成虫を15 mLのコニカルチューブで洗い流します。
- 2部の漂白剤と1部の5 M NaOHを混合して、作りたての漂白剤溶液を調製します。
- 線虫を3,000 x g で30秒間遠心分離し、線虫をペレット化します。吸引して容量を4 mLに減らし、次に2 mLの漂白剤溶液を加えます。
- 蓋をしっかり閉め、チューブを振ってください。溶液中の成虫を実体顕微鏡で10倍の倍率でモニターします。成体の体がバラバラになり始めたら(通常は3.5分後)、振とうをやめ、3,000 x g で30秒間遠心分離します。
- ピペットで最小容量まで吸引します。再懸濁、遠心分離、吸引を M9-TX に 4 回行い、漂白剤を洗い流します。
- 4〜6 mLのM9-TXに再懸濁し、チューブをローテーターに一晩置き、卵が孵化してL1段階で同期できるようにします。
- 翌日、チューブからM9-TX中のL1ワーム10 μLを取り出し、清潔なペトリ皿に落とします。実体顕微鏡で20倍の倍率で生きているL1線虫の数を数えます。
- L1密度に基づいて、適切な容量をピペットで移動し、マイクロバイオーム播種NGMプレートの端に~50匹の同期したL1幼虫を滴下し、20°Cでインキュベートします。 ワームを希望の年齢(成虫の2日目または3日目)まで成長させます。
3. 腸内細菌叢解析のための線虫集団の収集
- 1〜2 mLのM9-TXで細菌の芝生からワームを滅菌した2 mLの96ウェルディーププレートに洗い流します。
注:重要なバイオフィルムを生成する微生物株の場合は、プレートを液体で5分間振って微生物の破片を分解します。 - ディープウェルプレートを300 x g で1分間遠心分離してワームをペレット化し、吸引マニホールドを使用して液体を除去します。
注:吸引マニホールドが利用できない場合、ユーザーはマルチチャンネルピペットを使用して手動で液体を取り除くことができます。ワームサンプルの損失を防ぐために、ピペットチップがウェルの底に触れないようにしてください。 - 1.2 mLのマルチチャンネルピペットを使用して、ディープウェルプレートの各ウェルに1.8 mLのM9-TXを加えます。ピペッティングで数回上下させて混合し、300 x g で1分間遠心分離します。この手順を4回繰り返して、液体中のバクテリアを取り除きます。
- 最終洗浄後、吸引マニホールドを使用して各ウェルの容量を100 μLにします。
注意: 重力を使用して幼虫から成虫を分離するには、プレートをベンチに30〜60秒間置いて、成虫を井戸の底に沈めます。次に、プレートを吸引して、懸濁液から幼虫を除去します。 - 100 μL の 10 mM レバミゾールを M9-TX に各ウェルに加え、線虫を 5 分間麻痺させます。レバミゾール処理後、必要に応じて、ステップ2.3で説明した漂白剤溶液4%を各ウェルに2分間加え、細菌の塊を減らします。漂白処理後、M9-TXで2回洗浄し、2回目の洗浄後、最終容量100μLまで吸引します。
- M9-TX に 150 μL の 10 mM レバミゾールを添加した平底 96 ウェルプレートに線虫を移します。ワームの密度をウェルあたり50〜100に保ち、人口が混雑しすぎる場合はワームを複数のウェルに分割します。
4. 大型粒子選別機とオートサンプラーのセットアップ
- エアコンプレッサー、コンピューター、およびLPS機器の電源を入れます。廃液タンクを確認して空にします。次に、空の廃液タンクに500mLの漂白剤を追加します。容量が少ない場合は、シースと水タンクを確認して補充します。250 μmの流体および光学コアアセンブリ(FOCA)が所定の位置にあることを確認します。
- 品質管理のためにコントロール粒子を実行します。LPS機器ソフトウェアを開きます。ソフトウェアウィンドウで、Enable Lasers にチェックを入れて、488nmと561nmのレーザーをオンにします。
注:コントロール粒子が過去2週間以内に実行され、その間にFOCAが変更されていない場合は、手順4.2〜4.5をスキップできます。 - [Set Up > Control Particles] を選択します。プロンプトで [いいえ ] を選択して、既定の設定に移動します。毎回使用前にコントロール粒子(10 mL の dH2O および 10 mL のコントロール粒子を 50 mL のコニカルチューブに浸けてボルテックス)し、サンプルポートにロードします。
- 準備ができたら、[ 取得 ]をクリックして500件のイベントを記録します。イベントレートが 15 〜 30 イベント/秒であることを確認します。
注意: イベントレートが15〜30イベント/秒でない場合は、エンジニアに連絡してマシン設定を調整する必要があります。 - すべてのパラメータの変動係数(CV)を調べます。CV<15%の場合、品質管理に合格し、LPSソフトウェアを閉じることができます。CV>15%の場合は、再度実行し、新しく作成したコントロール粒子でマイクロメーターを調整して、レーザーをフローセルに位置合わせします。
- オートサンプラーを接続して電源を入れます。オートサンプラー装置ソフトウェアを開きます。これにより、オートサンプラーとLPSソフトウェアが開きます。LPSソフトウェアウィンドウで、[File > New Experiment]、[File > New Sample]の順に移動します。[Enable Lasers to turn on 488 nm and 561 nm lasers] にチェックを入れます。
- LPSソフトウェアウィンドウで、飛行時間(TOF)、消光(EXT)、および蛍光チャンネルを使用して、取得ドットプロットのテンプレートを作成します。すべての線虫を捕獲するための適切な開始最大数は、TOFおよびEXTで8,000です。 蛍光スケールは各微生物によって異なります。非蛍光微生物(OP50など)で増殖した対照線虫サンプルと、各蛍光微生物のみ(微生物を混合する場合)を対照としてすべての実験に含めます。
- グラフの本体内を右クリックして、スケーリングを変更します。1日目の成体や同期したL1(または対象集団)などの対照動物を使用して、TOFおよびEXTゲーティングの選択を支援します。
- オートサンプラーウィンドウで、[ Prime]を選択します。[ ファイル]>[スクリプトを開く]に移動し て正しい組み込みスクリプトを選択し、[ OK]をクリックします。
- 分析の場合のみ、[ 取得]でスクリプトを選択します。並べ替えの場合は、 ディスペンスでスクリプトを選択します。96ウェルプレートから取得する場合は、 96ウェルのスクリプトを選択します。384ウェルプレートからの取得には、 384ウェルのスクリプトを選択します。サンプル量(40 または 100 μL)の場合は、対応する容量のスクリプトを選択します。
- オートサンプラーソフトウェアメニューの [プレートテンプレート ]に移動して、分析に必要なウェルを選択します。コントロールサンプルをロードします。プレートをオートサンプラーステージにセットして固定したら、オートサンプラーウィンドウの [プレートの分析] を押します。プロンプトが表示されたら、ファイルを保存します。
注意: コントロールサンプルと設定は、LPSサンプルポートの50 mLコニカルチューブを使用して、LPサンプラーを取り付ける前に行うことができます。 - 取り込みが終了したら、LPSソフトウェアウィンドウの上部リボンにある[ データの保存 ]ボタンをクリックして、データを再度保存します。
5. 線虫 の特徴と腸内細菌叢の解析
- 生データは、.lmd、.bxr3、..txtの3つのファイルタイプに保存されます。分析のために、.txt ファイルというラベルの付いたテキスト ファイルを R プログラムに読み込みます。以下の R19 の手順を実行します。
- 分析のフレームワークとしてパッケージ tidyverse20 を使用します。
- 関数 ggplot (tidyverse に含まれています) を使用して、TOF 値を x 軸、EXT 値を y 軸として使用して LPS データをプロットします。通常のプロットでは、2つのドットの雲が表示されます。1 つが原点と X 軸に近く、幼虫や小さな破片などの小さな粒子を示し、2 番目の粒子のグループがプロットの右上に向かっていて、成虫の線虫を表していることを確認します。
- このグループ化をガイドとして使用して、適切なTOFおよびEXTカットオフ値を選択します。ゲーティングは、生理機能の変化に基づいて、異なる微生物に対する 線虫 株によって異なる可能性があります(例えば、暗い動物と透明な動物、または卵輸送の変化はEXT係数を変化させる可能性があります)。
- 関数サブセットを使用して、TOFおよびEXTゲーティングによって成虫と幼虫を分離します。この例では、TOF > 1,200 と EXT > 1,000 の設定を使用して、成獣のゲートを作成します。
- 結果のデータセットを分析して、統計的な違いを確認します。この実験では、R の 関数 t 検定を使用します。
- 線虫の大きさと光学密度に対するマイクロバイオームの影響を判断するには、条件間でそれぞれTOF値とEXT値を比較します。TOFは線虫のサイズの代理であり、特定の時期における動物の成長率の変化を示すことができます。EXTの変化は、卵子が散乱する光により、発生末期から成体期までの間に最も大きく、その移行のタイミングと繁殖力の変化を評価するために使用できます。子孫の割合と分布が分析中に保持されていたかどうかを評価します。
- 腸内細菌叢のコロニー形成レベルの変化を決定するには、まず、各動物の個々のTOF値で除算することにより、蛍光値(赤または緑の列など)を正規化します。ワームが大きくなり、成虫になると、腸の体積も大きくなります。正規化は、サンプルの動物のサイズ分布の違いによるアーチファクトを減らすのに役立ちます。正規化された動物を用いて、腸内細菌叢のコロニー形成の変化を条件間で評価します。
注: 生データの例と対応する R スクリプトは、補足ファイル 1 JOVE_worm_microbiome.txtおよび補足ファイル 2 JOVE_worm_microbiome.r にあります。図2および図3は、2つの蛍光細菌を用いた宿主とマイクロバイオームの分析の代表的な例です。
6. 腸内細菌叢による 線虫 動物の選別
- ステップ3で説明したように、蛍光タグ付き微生物(RFPなど)で増殖した C.エレガンス 集団を収集します。ワームは、最低5 mLのサンプルを含む50 mLのコニカルチューブに入れる必要があります。全成虫・仔動物を含み、約2,000匹/mLを目安とする。
注:これは、LPサンプラーを使用して平底の96ウェルプレートで行うこともできます。ワームの密度をウェルあたり50〜100に保ちます。- LPサンプラーを使用した場合は、LPサンプラーの電源を切り、取り外します。選別する前に、サンプルラインとパージラインをLPSに再接続してください。
- LPS ソフトウェアを開き、[File > New Experiment] (新しい実験) > [File > New Sample] (新しいサンプルファイル) の順に移動します。X 軸に TOF を、Y 軸に Extinction をもつドット プロットを作成します。x軸にTOF、y軸に赤を持つ別のドットプロットを作成します。以前と同じ軸スケールとレーザー設定を使用します。Enable Lasers to turn on 488 nm and 561 nm lasersにチェックを入れます
注: これらのプロットが以前に作成されている場合は、ファイル>開いた実験とファイル>開いたサンプルに移動してグラフをロードします。- コントロールサンプルチューブをサンプルポートに置きます。[Acquire/Dispense]ダイアログボックスで、[ Acquire]をクリックします。プロンプトが表示されたら、ファイルを保存します。個体群を区別するのに十分な数の線虫が測定されたら、[ 中止]をクリックします。
注:流量は約15〜30イベント/秒である必要があります。そうでない場合は、線虫の濃度を調整して、個々の動物が液滴ごとに分析または選別されるようにします。LPSでは、ワームはさまざまな位置(まっすぐな位置、カールした位置、曲がった位置)でレーザーの経路を通過します。位置によって、レーザーと検出器を通過するのにかかる時間が異なる場合があります。 - TOFとExtinctionのドットプロットで、成体集団の周囲にゲートを描きます。TOFと赤のドットプロットでは、マイクロバイオームのコロニー形成レベルが異なる成虫の関心領域として、赤の値が高い領域と低い領域の周囲にゲートを描画します。[View > Gating Hierarchy] に移動し、蛍光ゲートが成人の母集団ゲートの下にリストされていることを確認します。設定が最適化されたら、 [ファイル] > [実験の保存] と [ファイルの> サンプルの保存] に移動します。
注:この例では、成体のTOF/EXTゲートに基づいて動物を選択し、赤色蛍光タンパク質発現細菌によるコロニー形成が高いまたは低いプールに分類します。ただし、LPSによって測定されたパラメータの任意の組み合わせを使用して、関心のある母集団を特定できます。
- コントロールサンプルチューブをサンプルポートに置きます。[Acquire/Dispense]ダイアログボックスで、[ Acquire]をクリックします。プロンプトが表示されたら、ファイルを保存します。個体群を区別するのに十分な数の線虫が測定されたら、[ 中止]をクリックします。
- 選別する前に、適切な収集装置がロードされていることを確認してください。96 ウェルプレートを回収装置にロードするには、Acquire/Dispense ダイアログ ボックスの Move Stage セクションにある Load Plate A > Move を選択して、コレクションステージを 96 ウェルプレートのロードに適した位置に移動させます。
- バルクソートの場合は、適切なチューブサイズを選択し、[ 移動 ]をクリックして、15 mLまたは50 mLのコニカルチューブをロードします。[Acquire/Dispense] ダイアログボックスの [Sorting] セクションで、作成した領域のドロップダウン リストから [Sorting gate] を選択します。定義された領域から、フローセルノズルの真下にあるコレクションチューブに分注するオブジェクトの数を入力します。[Acquire/Dispense]ダイアログボックスの[ Bulk Sort ]ボタンをクリックします。
- 96ウェルプレートへの分注については、96ウェルプレート>キャリブレーション済みプレート>>プレートの設定に進みます。次に、プレートテンプレート>表示に移動し、ワームをソートするウェルを選択し、各ウェルにソートするオブジェクトの数を入力して、ゲートされた関心領域を選択します。複数のゲート領域を同じプレートにソートする場合は、[各ウェルをゲート]ボックスにチェックを入れます。「OK」をクリックして変更を保存します。
- ソート番号と位置を割り当てたら、取得/分注ダイアログボックスの[充填プレート]ボタンをクリックして、96ウェル プレート への分注を開始します。
- 96ウェルプレート全体を充填する前に、動物のサブセットまたはコントロールを96ウェルプレートにテストソーティングし、実体顕微鏡を使用して分析し、適切な数と目的の動物集団がソートされていることを確認します。正確な選別が確認されたら、実験サンプルに対して手順6.3〜6.6を繰り返します。LPSソフトウェアウィンドウの上部のリボンにある[ データの保存 ]ボタンをクリックして、データを再度保存します。
注:すべての測定値(EXT、TOF、RFP、GFPなど)は、選別された動物について収集し、選別されなかった動物と比較することもできます。これにより、必要に応じて分析モードとソートモードを同時に実行できます。
- 96ウェルプレート全体を充填する前に、動物のサブセットまたはコントロールを96ウェルプレートにテストソーティングし、実体顕微鏡を使用して分析し、適切な数と目的の動物集団がソートされていることを確認します。正確な選別が確認されたら、実験サンプルに対して手順6.3〜6.6を繰り返します。LPSソフトウェアウィンドウの上部のリボンにある[ データの保存 ]ボタンをクリックして、データを再度保存します。
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Representative Results
成虫と幼虫の個体群ゲートの定義
ここでは、標準的な実験室用飼料である大腸菌OP50(Eco)を播種したNGMプレート上で、同期したC.エレガンスL1を増殖させました。C.エレガンスの個体群は、20°Cで96時間または120時間増殖した後、LPS分析のために収集されました(図2A)。絶滅(EXT、体密度のプロキシ)と飛行時間(TOF、体長のプロキシ)のドットプロットは、視覚的に分離された2つの動物の雲を作成します。各ドットは、幼虫と比較して成虫のEXT値とTOF値が高い1匹の動物を表しています(図2B)。これら2つのパラメータは、個体数増加と生理学に関する貴重な推論です。例えば、幼虫のTOFの密度プロットは、幼虫期の分布を可視化することができます。生後2日の成体の子孫は、TOFが200未満のL1およびL2ステージが優勢であったが、3日齢の成体のほとんどの子孫はL3およびL4ステージに達した(図2C)。さらに、大腸菌で増殖した場合、TOFとEXTの値は2日目と比較して3日目に増加するため、2D密度と箱ひげプロットは、成人の体の大きさと密度の変化を視覚化するのに役立ちます(図2D-F)。この関係は典型的には成人期には線形であるが、生理機能におけるいくつかの変化は、ある特徴に他の特徴よりも大きな影響を与える可能性がある(例えば、卵を持たない成人は、TOFに影響を与えずにEXT値が低い可能性がある)。
蛍光タグ付き微生物を用いた腸内細菌叢組成のプロファイリング
さまざまなレベルのコロニー形成を説明するために、天然の線虫マイクロバイオームdTomatoタグ付きOchrobactrum BH3(Och)と緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き大腸菌OP50の優勢なコロニー形成者を比較します。これら2つを個別に播種し、NGMプレート上のOD(1:1混合)に基づいて均等に混合しました。同期したC.エレガンスL1を3つの条件で増殖させ、120時間後に収集して、生後3日の成体のコロニー形成動態を調べました(図3A)。2D密度とボックスウィスカープロットは、C.エレガンスをOchrobactrum BH3と混合培養で増殖させると、成体のTOF値とEXT値に違いがあることを示しました(図3B-E)。細菌の腸内コロニー形成は、個々の線虫で検出される蛍光レベルから推測できます。赤色蛍光測定値のボックスウィスカープロットは、Ochrobactrum BH3単独の場合よりも混合条件でOchrobactrum BH3のコロニー形成が増加していることを示しています。対照的に、緑色蛍光値は、OP50単独の場合よりも混合条件でのOP50のコロニー形成が低いことを示しています。TOFで標準化された蛍光シグナルでも同様の傾向が観察され、体の大きさの影響がなくなり、集団内のばらつきが減少します(図3F-I)。複数の蛍光タグ付き微生物を持つ定義されたマイクロバイオームの場合、ドットプロットはこれらの微生物のコロニー形成パターンを示すことができます。例えば、2員混合マイクロバイオームでは、赤色蛍光タンパク質(RFP)とGFPチャネルのドットプロットは、線虫がy軸(RFP)に向かって大きく歪んでいることを示しており、ほとんどの線虫でOP50のコロニー形成が低く、Ochrobactrum BH3のコロニー形成のレベルが集団に均等に分布していることを示唆しています(図3J)。同様に、RFPとEXTのドットプロットは、Ochrobactrum BH3のコロニー形成レベルと体密度などの宿主発生との関係を明らかにすることができます(図3K)。さらに、繁殖パターンの違いは、3つの条件でそれぞれの幼虫集団の密度プロットをプロットすることで観察できます(図3L)。
マイクロバイオームコロニー形成に基づく標的集団のエンリッチメント
2員混合マイクロバイオームで培養された生後3日の成体は、広範囲のRFP強度を示し、グループ内での Ochrobactrum BH3コロニー形成の個人差を示しています(図4A)。これらのサブグループをさらに分離するために、ウェル全体のRFP画像(図4B)に示すように、RFPの高いグループと低いRFPのソーティングゲートを手動で描画し、各ゲートから15個の個体を96ウェルプレートにソートしました。高倍率では、明視野とRFPチャンネルの重ね合わせ画像により、選別法が高低の Ochrobactrum BH3コロニー形成線虫を選択することが確認され、表現型の結果と分子ドライバーのさらなる特性評価が可能になります(図4C)。
図1:腸内細菌叢と宿主の生理機能を評価するためのフローミミメトリーベースの方法のフローチャート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:成虫と幼虫の個体数の定義。 (A)成虫の2日目と3日目にC.エレガンスの個体群を収集するワークフロー。(B)成体2日目(灰色)と3日目(赤)におけるC.エレガンス個体群の飛行時間(TOF)と絶滅(EXT)のドットプロット。(C)成虫の2日目と3日目の幼虫TOFの密度プロット。(D-E)成人の2日目と3日目の成人のTOF対EXTのドットプロットと箱ひげプロット。(F)成虫の2日目と3日目の成虫絶滅の箱ひげプロット。p値は、学生のt検定(*** p < 0.001;2日目n = 38;3日目 n = 88)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:蛍光タグ付き微生物を用いた腸内細菌叢のコロニー形成のプロファイリング。 (A)Ochrobactrum BH3(dTomato-expressing;Och)、大腸菌OP50(GFP発現;エコ)または2つのバクテリアの1:1のミックス(ミックス)。(B)ミックスで育てた3日目の成虫のTOFとEXTのドットプロット。(C-E)Ochrobactrum BH3で成長した3日齢の成体に対するTOFとEXTのドットプロットとボックスアンドウィスカープロット。灰色の破線は、OP50で成長した母集団の平均値を示しています。(F-G)Mix と Ochrobactrum BH3 のみで栽培された 3 日齢の成体の生および TOF 正規化 dTomato (RFP) 値の箱ひげプロット。(H-I)ミックスとOP50で育てた生齢3日の成体に対する生およびTOFで標準化されたGFPの箱ひげプロット。(J) 混合で育てた生後3日の成虫のOchrobactrum BH3(RFP)と大腸菌OP50(GFP)のドットプロット。(K)ミックスで育てた3日齢の成虫のRFPとEXTのドットプロット。(左)Ochrobactrum BH3とOP50のミックスで育てた生後3日の成虫の密度プロット。すべてのp値は、スチューデントのt検定(*** p < 0.001; ** p < 0.01; n.s., 有意ではない; 混合 n = 230;Och n = 45)です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:マイクロバイオームのコロニー形成に基づく標的集団のエンリッチメント 。 (A)生後3日の成人のTOFとRFP(Ochrobactrum BH3)のドットプロット。高(赤枠)と低(黒枠)のRFPゲートが描かれており、 C.エレガンスに 高低の Ochrobactrum BH3コロニー形成が豊富になります。(B)高RFPゲートと低RFPゲート(Bar = 1 mm)から選別された15匹のワームを含むウェルの代表的なRFP画像(4倍)。(C)高RFPゲートと低RFPゲート(Bar = 100 μm)からの個々の線虫の代表的な画像(10倍)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:大腸菌OP50およびOchrobactrum BH3で増殖した成人期の2日目および3日目のN2集団について、大型粒子選別機によって生成された代表的なデータセット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:R環境での代表的なデータセットの分析と図作成に使用したスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
フローバーミメトリーは、いくつかの研究で病原体のコロニー形成と毒性に対するC.エレガンスの遺伝子と経路を特徴付けるために使用されています21,22。ここでは、C.エレガンスを用いて腸内細菌叢が宿主の生理機能をどのように調節するかを調査するハイスループットで従順なアプローチを紹介します。コロニー形成単位(CFU)または16S rRNAアンプリコンシーケンシング9,16,17,23,24を使用する既存の方法と比較して、このアプローチは労働集約的なカウントを必要とせず、潜在的なPCRバイアスを導入しません。このアプローチでは、集団全体のマイクロバイオームを測定するだけでなく、集団内の個人差を視覚化することができます。このアプローチは、微生物の蛍光タンパク質発現または染色の利用可能性、およびLPS内の検出チャネルの数によってのみ制限されます。実験計画に関するその他の考慮事項については、ユーザーがニーズに基づいてカスタマイズされたワークフローを作成できるように、以下で説明します。
定義されたマイクロバイオームの作成とシードに関する考慮事項
まず、各細菌培養物をOD600 値1に正規化してから、異なる菌株を混合します。コミュニティの複雑さと種間の関係に応じて、開始密度が確立されたマイクロバイオームの構成にさまざまな影響を与える可能性があることは注目に値します23。ODは分光光度計で簡単に測定できますが、同じOD値でも細菌が異なれば濃度(mLあたりの細胞数など)も異なるため、それに応じて調整する必要があるという注意点があります。第二に、芝生のマイクロバイオーム組成のばらつきを考慮する必要があります。マイクロバイオームをNGMプレート(または他の培地)に播種すると、マイクロバイオームは室温で一晩増殖させてから、同期したL1 C.エレガンス 集団をプレートに落とします。細菌株間の増殖速度や種間相互作用のばらつきにより、NGMプレートまたは増殖基質を持つプレートで増殖したマイクロバイオームは、元の種子混合物とは組成が異なります。ペプトンフリーのNGMプレートを使用すると、元の微生物群集を保存できます13。ただし、ペプトンフリープレートでのマイクロバイオームの増殖が限られているため、播種ODを高くするか、プレートあたりの同期したL1の数を減らす必要がある場合があります。これにより、アッセイの所望の年齢に達する前に集団が飢餓に陥るのを防ぎます。別のアプローチは、芝生中の微生物の割合を配列するか、またはその他の方法で決定することです。
マイクロバイオームコロニー形成と線虫生理学の測定
まず、成虫の絶滅(EXT)および飛行時間(TOF)ゲーティングの閾値は、年齢、 C.エレガンスの 系統の背景、およびそれらが成長する微生物によって異なる場合があります。線虫/細菌の状態ごとに1日齢の成体集団を実験に投入することは、TOFと絶滅のカットオフを決定し、増殖培地と環境による変動を制御するのに役立ちます。成虫のゲーティングの他に、TOFとEXTは幼虫のゲートにも適用でき、子孫の密度プロットは、個体群レベルでの繁殖のタイミングと出力を推定することができます(図3L)。第2に、LPSのPMTゲインと電圧を調整して、S/N比を最大化し、飽和しないように信号範囲を設定する必要があります。これは、細菌株の蛍光強度とそのコロニー形成レベルに依存します。デフォルトのPMTである350は、 Ochrobactrum BH3などの高コロニーではうまく機能しますが、 大腸菌 OP50などの低コロニーではPMTまたは電圧値を上げる必要がある場合があります。第三に、トランスジェニック細菌株では蛍光色素の特性と発現レベルが異なるため、蛍光値はマイクロバイオームに存在する細菌の絶対数を反映していません。したがって、GFP値とRFP値を使用して、2つの異なる蛍光微生物間のコロニー形成を直接比較することはできません。生きた細菌の数を特定するための動物の破壊とプレーティングは、これらの関係をよりよく解決するのに役立ちます24。
エンリッチメントベースの戦略の潜在的な用途
この分析法は、マイクロバイオームの変化が宿主の生理機能に及ぼす影響を集団レベルで調査するための、優れたハイスループットプラットフォームを提供します。微生物側では、細菌のゲノムを編集するためのツールとリソースの利用可能性が高まる25,26,27により、C.エレガンスの自然マイクロバイオームに関連する蛍光および機能的な微生物変異体の数が増加します。宿主側からは、細胞シグナル伝達とマイクロバイオーム組成の関連性を探るために、多数の蛍光レポーターが利用可能です。宿主集団または突然変異集団(例えば、EMS前方突然変異誘発)28またはプールされた野生株29の変異体を、特定のマイクロバイオームコロニー形成の特徴で濃縮する能力は、マイクロバイオームの影響を調節する宿主遺伝子を結合する能力を大幅に向上させることができる。さらに、宿主やマイクロバイオームの特性に基づいて集団を選択することで、オミクスベースのプロファイリングモダリティの幹部も容易になります。このアプローチは柔軟性が高く、宿主とマイクロバイオームの相互作用の分子メディエーターの理解を深めることが期待されています。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、NIHの助成金DP2DK116645(B.S.S.)、Dunn Foundationパイロット賞、NASAの助成金80NSSC22K0250(B.S.S.)の支援を受けました。このプロジェクトは、ベイラー医科大学のサイトメトリーおよびセルソーティングコアの支援も受けており、CPRIT Core Facility Support Award(CPRIT-RP180672)、NIH(S10 OD025251、CA125123、およびRR024574)、Joel M. Sederstromの支援、およびLPS NIH助成金(S10 OD025251)の機器助成金から資金提供を受けました。一部の株は、NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)から資金提供を受けているCGCによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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