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Biology

"केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंत माइक्रोबायोम के परिमाणीकरण और विश्लेषण के लिए फ्लो वर्मिमेट्री का अनुप्रयोग"।

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64605
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,2
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन को चलाने वाले आणविक निर्धारकों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। एलिगेंस फिजियोलॉजी के प्रमुख पहलुओं के साथ आंत माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण के एकल पशु स्तर की रूपरेखा तैयार करने वाली एक उच्च थ्रूपुट पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

आंत माइक्रोबायोम की संरचना पूरे विकास और जानवर के जीवन में मेजबान शरीर विज्ञान पर नाटकीय प्रभाव डाल सकती है। माइक्रोबायोम में संरचनात्मक परिवर्तनों को मापना इन शारीरिक परिवर्तनों के बीच कार्यात्मक संबंधों की पहचान करने में महत्वपूर्ण है। केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन के आणविक ड्राइवरों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मेजबान प्रणाली के रूप में उभरा है। इसकी पारदर्शी शरीर योजना और फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्राकृतिक रोगाणुओं के साथ, एक व्यक्तिगत सी एलिगेंस जानवर के आंत माइक्रोबायोम के भीतर रोगाणुओं के सापेक्ष स्तर को एक बड़े कण सॉर्टर का उपयोग करके आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। यहां हम एक माइक्रोबायोम के प्रयोगात्मक सेटअप, वांछित जीवन चरण, सॉर्टर के संचालन और रखरखाव में सी एलिगेंस आबादी के संग्रह और विश्लेषण और परिणामी डेटासेट के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। एलिगेंस जीवन चरणों के लिए प्रभावी गेटिंग रणनीतियों के विकास, और आंत माइक्रोबायोम संरचना के आधार पर पशु आबादी को समृद्ध करने के लिए सॉर्टर क्षमताओं का उपयोग कैसे करें, इसके आधार पर सॉर्टर सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए विचारों पर भी चर्चा करते हैं। संभावित अनुप्रयोगों के उदाहरण प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में प्रस्तुत किए जाएंगे, जिसमें उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए स्केलेबिलिटी की क्षमता शामिल है।

Introduction

पशु विकास निरंतर माइक्रोबियल प्रभाव में है1. पर्यावरण में विविध रोगाणुओं से, पशु मेजबानविशिष्ट भागीदारों 2 का अधिग्रहण करते हैं जो मेजबान की क्षमताओं का विस्तार करते हैं और इसके शरीर विज्ञान और रोग3 के लिए संवेदनशीलता को चलाते हैं। उदाहरण के लिए, आंत माइक्रोबायोम के मेटाजेनोमिक विश्लेषण ने माइक्रोबियल जीन के समृद्ध चयापचय वर्गों को उजागर किया जो मोटापे सेग्रस्त चूहों में अधिक ऊर्जा फसल और भंडारण प्रदान कर सकते हैं4, जिनमें से कई मानव आंत माइक्रोबायोम5 में भी पाए जाते हैं। अभी भी कारण संबंधों को स्थापित करने और माइक्रोबायोम प्रभाव के आणविक निर्धारकों को इंगित करने की बहुत आवश्यकता है, हालांकि माइक्रोबायोम जटिलताओं और बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए मेजबान प्रणालियों की ट्रैक्टेबिलिटी से प्रगति बाधित हुई है।

एलिगेंस माइक्रोबायोम और मेजबान शरीर विज्ञान के बीच संबंधों की आणविक समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक मंच प्रदान करता है। एलिगेंस में एक म्यूकोसल परत और विली संरचनाओं के साथ 20 आंतों की कोशिकाएं होती हैं। ये कोशिकाएं प्रचुर मात्रा में केमोसेप्टर जीन से लैस होती हैं जो माइक्रोबियल उत्पादों को समझती हैं और रोगाणुरोधी अणुओं का उत्पादन करती हैं जो संभावित रूप से अपने आंत कॉलोनाइज़र 6,7 को नियंत्रित करती हैं। एलिगेंस के इस संरक्षित जीव विज्ञान ने मेजबान सिग्नलिंग में जबरदस्त संख्या में खोजों को जन्म दिया है जो इंसुलिन सिग्नलिंग, टीजीएफ-बीटा और एमएपी काइनेज 8,9,10 सहित आंत रोगाणुओं को नियंत्रित करते हैं।

एलिगेंस विकास के दौरान विकास के लिए अपने आहार और वयस्कों के रूप में माइक्रोबायोम दोनों के रूप में रोगाणुओं का उपयोग करते हैं। बुढ़ापे के साथ, कुछ रोगाणु आंत लुमेन में अधिक जमा हो सकते हैं और मेजबान-माइक्रोब संबंध सहजीवन से रोगजनन11 में बदल जाता है। अपने प्राकृतिक आवासों में, सी एलिगेंस बैक्टीरिया प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला का सामना करता है12,13. प्राकृतिक आवासों (सड़े हुए फल, पौधे के तने और पशु वैक्टर) में एकत्र किए गए प्रतिनिधि नमूनों से अनुक्रमण 16 एस आरडीएनए से पता चला है कि सी एलिगेंस के प्राकृतिक माइक्रोबायोम में चार बैक्टीरियल फ़ाइला का वर्चस्व है: प्रोटियोबैक्टीरिया, बैक्टेरोइड्स, फर्मिक्यूट्स और एक्टिनोबैक्टीरिया। इन विभाजनों के भीतर निवास स्थान12,13,14,15 के आधार पर बैक्टीरिया की विविधता और समृद्धि में बहुत भिन्नता है। कई परिभाषित समुदायों की स्थापना की गई है, जिसमें 63-सदस्यीय (BIGbiome) 16 और 12-सदस्यीय (CeMbio) संग्रह शामिल हैं जो सी एलिगेंस अनुसंधान समुदाय17 के लिए बनाए गए शीर्ष माइक्रोबायोम जेनेरा का प्रतिनिधित्व करते हैं। माइक्रोबायोम और घटक उपभेददोनों सी एलिगेंस के शरीर विज्ञान पर विविध प्रभाव डाल सकते हैं जैसे कि शरीर का आकार, विकास दर और तनाव प्रतिक्रियाएं 9,16,17। ये अध्ययन माइक्रोबायोम अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में सी एलिगेंस को स्थापित करने के लिए संसाधन और उदाहरण प्रदान करते हैं।

यहां एक बड़े कण सॉर्टर (एलपीएस) आधारित वर्कफ़्लो (चित्रा 1) प्रस्तुत किया गया है जो जनसंख्या पैमाने पर माइक्रोबायोम संरचना और मेजबान शरीर विज्ञान के बुनियादी उपायों को एक साथ मापने के लिए सी एलिगेंस सिस्टम का उपयोग करता है। माइक्रोबियल पक्ष से, वर्कफ़्लो बढ़ते माइक्रोबियल इंटरैक्शन के साथ समुदाय की मजबूती और प्लास्टिसिटी का परीक्षण करने के लिए एक परिभाषित माइक्रोबायोम या एकल रोगाणुओं को इकट्ठा करने के लिए अनुकूलनीय है। मेजबान पक्ष से, वर्कफ़्लो माइक्रोबायोम में फ्लोरोसेंट रोगाणुओं के उपनिवेशस्तर को मापने और विकास, शरीर के आकार और प्रजनन के संदर्भ में मेजबान शारीरिक रीडआउट को मापने के लिए उच्च थ्रूपुट परख को सक्षम बनाता है। एलिगेंस माइक्रोबायोम मॉडल उच्च थ्रूपुट स्क्रीन को मेजबान शरीर विज्ञान को संशोधित करने वाले चयापचय और आनुवंशिक निर्धारकों को इंगित करने में सक्षम बनाता है।

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Protocol

1. माइक्रोबायोम मिश्रण की तैयारी

  1. ग्लिसरॉल फ्रीजर स्टॉक से बैक्टीरिया को एक लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) प्लेट, या उचित विकास माध्यम पर स्टैम्प या स्ट्रीक करें, और रुचि के जीवाणु उपभेदों (आमतौर पर सी एलिगेंस प्राकृतिक रोगाणुओं के लिए 25 डिग्री सेल्सियस) के आधार पर इष्टतम तापमान पर रात भर बढ़ते हैं।
  2. एलबी प्लेट से, प्रत्येक बैक्टीरियल आइसोलेट (जैसे, सीम्बियो संग्रह के 12 बैक्टीरिया) से एक एकल कॉलोनी का उपयोग करें ताकि 1 एमएल गहरे कुएं की प्लेट के अलग-अलग कुओं में एलबी माध्यम के 800 μL को टीका लगाया जा सके। 250 आरपीएम पर झटकों के साथ इष्टतम तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल परिभाषित प्राकृतिक माइक्रोबायोम (जैसे, सेम्बियो) के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित है, लेकिन उचित परिस्थितियों या अन्य संस्कृति वाहिकाओं (ट्यूबों) के तहत विकास द्वारा व्यक्तिगत रोगाणुओं के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है।
  3. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा प्रत्येक माइक्रोब के विकास का आकलन करें। 20 μL एलिकोट को 80 μL LB में स्थानांतरित करें और घोल को एक स्पष्ट सपाट तल 96-वेल प्लेट में जोड़ें। प्लेट रीडर पर OD600 मापें।
  4. रात भर के विकास के बाद, गहरी वेल कल्चर प्लेट को 10 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें ताकि पेलेट बैक्टीरिया और 96-वेल एस्पिरेशन मैनिफोल्ड या मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके आकांक्षा द्वारा सुपरनैटेंट को हटा दिया जा सके।
  5. ओडी 600 मानों का उपयोग करके, बाँझ एम 9 माध्यम का उपयोग करके प्रत्येक माइक्रोब की एकाग्रता को 1.0 के अंतिम ओडी600 तक सामान्य करें।
  6. यदि रोगाणुओं का संयोजन किया जाता है, तो प्रयोग के लिए आवश्यक जीवाणु संस्कृति की मात्रा निर्धारित करें और पर्याप्त आकार की ट्यूब (जैसे, 5 एमएल या 15 एमएल ट्यूबों) में प्रत्येक जीवाणु तनाव की समान मात्रा को मिलाकर एक माइक्रोबायोम मास्टर मिक्स बनाएं।
  7. प्रत्येक नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) एगर युक्त प्लेट या वेल 18 के केंद्र पर 1.0 के अंतिम ओडी600 के साथ रोगाणुओं के 30-50μL को स्पॉट करें। बीज वाले माइक्रोबायोम को एक इष्टतम तापमान (यहां 25 डिग्री सेल्सियस) पर रात भर बढ़ने दें।
    नोट: वर्मबुक में दिए गए निर्देशों के अनुसार या पूर्व-मिश्रित एनजीएम पाउडर18 का उपयोग करके पहले से एनजीएम एगर प्लेटें तैयार करें। उदाहरण के लिए, 12-वेल प्लेटों के लिए 3 एमएल एनजीएम जोड़ा जाता है, और 24-वेल प्लेटों के लिए 1.5 एमएल जोड़ा जाता है।

2. माइक्रोबायोम पर विकास के लिए सिंक्रनाइज़ सी एलिगेंस की तैयारी।

  1. एनजीएम प्लेटों (6 सेमी व्यास) पर लगभग 100 कीड़े उगाएं, जिन्हें एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50 के साथ बीज दिया जाता है, जब तक कि कीड़े वयस्कता तक नहीं पहुंच जाते। इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, सी एलिगेंस एन 2 स्ट्रेन का उपयोग किया गया था, हालांकि प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य नेमाटोड उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
  2. एम 9 बफर के 6 एमएल जोड़ें (प्लस 0.01% ट्राइटन एक्स -100; एम 9-टीएक्स) प्लेट में, लगभग 100 ग्रेविड वयस्क कीड़े को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में धोने के लिए ऊपर और नीचे पाइप किया जाता है।
  3. 5 एम एनएओएच के एक भाग के साथ ब्लीच के दो भागों को मिलाकर ताजा बनाया गया ब्लीच घोल तैयार करें।
  4. कीड़े को पेलेट करने के लिए 30 सेकंड के लिए 3,000 x g पर कीड़े को सेंट्रीफ्यूज करें। मात्रा को 4 एमएल तक लाने के लिए एस्पिरेट करें, और फिर 2 एमएल ब्लीच समाधान जोड़ें।
  5. ढक्कन को कसकर बंद करें और ट्यूब को हिलाएं। 10x आवर्धन पर स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत समाधान में वयस्क कीड़े की निगरानी करें। जब वयस्क शरीर अलग होने लगते हैं, आमतौर पर 3.5 मिनट के बाद, 30 सेकंड के लिए 3,000 x g पर हिलाना और सेंट्रीफ्यूज करना बंद कर दें।
  6. एक पिपेट के साथ न्यूनतम मात्रा में एस्पिरेट करें। ब्लीच को धोने के लिए एम 9-टीएक्स में चार बार निलंबित, सेंट्रीफ्यूज और एस्पिरेट करें।
  7. एम 9-टीएक्स के 4-6 एमएल में पुन: निलंबित करें और ट्यूब को रात भर घूमने वाले पर रखें, जिससे अंडे एल 1 चरण में बाहर निकल सकें और सिंक्रनाइज़ हो सकें।
  8. अगले दिन, ट्यूब से एम 9-टीएक्स में एल 1 कीड़े के 10 μL लें और उन्हें एक साफ पेट्री डिश पर छोड़ दें। 20x कुल आवर्धन पर स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत जीवित एल 1 कीड़े की संख्या की गणना करें।
  9. एल 1 घनत्व के आधार पर, माइक्रोबायोम बीज वाले एनजीएम प्लेटों के किनारे पर ~ 50 सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा को छोड़ने और 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए उपयुक्त मात्रा को पिपेट करें। कीड़े को वांछित उम्र (वयस्कता के दिन 2 या दिन 3) तक बढ़ने दें।

3. आंत माइक्रोबायोम विश्लेषण के लिए कीड़े की आबादी एकत्र करना

  1. जीवाणु लॉन से कीड़े को 1-2 मिलीलीटर एम 9-टीएक्स के साथ एक निष्फल 2 एमएल 96-अच्छी तरह से गहरी प्लेट में धो लें।
    नोट: माइक्रोबियल उपभेदों के लिए जो महत्वपूर्ण बायोफिल्म बनाते हैं, माइक्रोबियल मलबे को तोड़ने के लिए 5 मिनट के लिए तरल के साथ प्लेट को हिलाएं।
  2. कीड़े को पेलेट करने के लिए 1 मिनट के लिए 300 x g पर गहरी कुएं की प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर एस्पिरेटिंग मैनिफोल्ड का उपयोग करके तरल को हटा दें।
    नोट: उपयोगकर्ता तरल को मैन्युअल रूप से हटाने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर सकते हैं यदि एक एस्पिरेटिंग मैनिफोल्ड उपलब्ध नहीं है। सुनिश्चित करें कि कृमि के नमूनों के नुकसान से बचने के लिए पिपेट युक्तियां कुओं के तल को नहीं छूती हैं।
  3. 1.2 एमएल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके डीप-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1.8 एमएल एम 9-टीएक्स जोड़ें। एक-दो बार ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, और 1 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। तरल में बैक्टीरिया को हटाने के लिए इस चरण को चार बार दोहराएं।
  4. अंतिम धोने के बाद, एस्पिरेटिंग मैनिफोल्ड का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में मात्रा को 100 μL तक लाएं।
    नोट: गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करके लार्वा से वयस्कों को अलग करने के लिए, प्लेट को 30-60 सेकंड के लिए बेंच पर छोड़ दें, जिससे वयस्क कीड़े कुएं के तल तक डूब जाएं। फिर, निलंबन से लार्वा को हटाने के लिए प्लेट को एस्पिरेट करें।
  5. प्रत्येक कुएं में एम 9-टीएक्स में 100 मिलियन लेवामिसोल के 100 μL जोड़ें और कीड़े को 5 मिनट के लिए लकवाग्रस्त होने दें। लेवामिसोल उपचार के बाद, यदि आवश्यक हो, तो बैक्टीरिया के झुरमुट को कम करने के लिए चरण 2.3 में वर्णित ब्लीच समाधान का 4% प्रत्येक कुएं में 2 मिनट के लिए जोड़ें। ब्लीच उपचार के बाद दो बार एम 9-टीएक्स से धोएं और दूसरे धोने के बाद 100 μL की अंतिम मात्रा में एस्पिरेट करें।
  6. कीड़े को एक सपाट तल 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें एम 9-टीएक्स में 10 एमएम लेवामिसोल के 150 μL होते हैं। कीड़े का घनत्व 50-100 प्रति कुएं पर रखें और यदि आबादी बहुत अधिक है तो कीड़े को कई कुओं में विभाजित करें।

4. बड़े कण सॉर्टर और ऑटोसैंपलर की स्थापना

  1. एयर कंप्रेसर, कंप्यूटर और एलपीएस उपकरण चालू करें। कचरे के टैंक की जाँच करें और खाली करें। फिर, खाली अपशिष्ट टैंक में 500 एमएल ब्लीच जोड़ें। यदि मात्रा कम है तो म्यान और पानी के टैंक की जांच करें और फिर से भरें। सुनिश्चित करें कि 250 μm फ्लुइडिक और ऑप्टिकल कोर असेंबली (FOCA) जगह में है।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नियंत्रण कण चलाएँ। LPS उपकरण सॉफ्टवेयर खोलें। सॉफ्टवेयर विंडो पर, 488 एनएम और 561 एनएम लेजर चालू करने के लिए लेजर सक्षम करें।
    नोट: चरण 4.2-4.5 को छोड़ना संभव है यदि नियंत्रण कण पिछले 2 सप्ताह के भीतर चलाए गए हैं और उस समय में एफओसीए नहीं बदला गया है।
  3. नियंत्रण कण ों > सेट अप का चयन करें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर जाने के लिए प्रॉम्प्ट में नहीं का चयन करें। प्रत्येक उपयोग से पहले नियंत्रण कणों (10 एमएल, डीएच,2ओ और 10 एमएल नियंत्रण कणों, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में) को भंवर करें और उन्हें नमूना पोर्ट पर लोड करें।
  4. तैयार होने पर, 500 घटनाओं को रिकॉर्ड करने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि घटना दर 15-30 घटनाओं / सेकंड के बीच पढ़ती है।
    नोट: यदि घटना दर 15-30 घटनाओं / सेकंड नहीं है, तो मशीन सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए एक इंजीनियर से संपर्क किया जाना चाहिए।
  5. सभी मापदंडों के लिए भिन्नता गुणांक (CV) की जांच करें। यदि सीवी 15% <, तो गुणवत्ता नियंत्रण पारित किया जाता है और एलपीएस सॉफ्टवेयर को बंद किया जा सकता है। यदि सीवी 15% > है, तो फिर से चलाएं और फ्लो सेल के साथ लेजर को संरेखित करने के लिए ताजा बनाए गए नियंत्रण कणों के साथ माइक्रोमीटर को समायोजित करें।
  6. कनेक्ट करें और ऑटोसैंपलर चालू करें। ऑटोसैंपलर उपकरण सॉफ्टवेयर खोलें। यह ऑटोसैंपलर और एलपीएस सॉफ्टवेयर खोलता है। LPS सॉफ़्टवेयर विंडो पर, फ़ाइल > नया प्रयोग करें और फिर नया नमूना फ़ाइल करें > जाएँ। यदि यह पहले से नहीं किया गया है तो 488 एनएम और 561 एनएम लेजर चालू करने के लिए लेजर सक्षम करें।
  7. एलपीएस सॉफ्टवेयर विंडो में उड़ान के समय (टीओएफ), विलुप्त होने (एक्सटी), और फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग करके डॉट प्लॉट के अधिग्रहण के लिए टेम्पलेट बनाएं। सभी कीड़े को पकड़ने के लिए एक अच्छी प्रारंभिक अधिकतम संख्या टीओएफ और एक्सटी के लिए 8,000 है। प्रतिदीप्ति तराजू प्रत्येक माइक्रोब के आधार पर भिन्न होंगे। गैर-फ्लोरोसेंट माइक्रोब (जैसे, ओपी 50) और प्रत्येक फ्लोरोसेंट माइक्रोब (यदि रोगाणुओं को मिलाते हैं) पर उगाए गए नियंत्रण कृमि नमूने हर प्रयोग के साथ नियंत्रण के रूप में शामिल करें।
    1. स्केलिंग को संशोधित करने के लिए ग्राफ़ के मुख्य भाग के भीतर राइट-क्लिक करें। टीओएफ और एक्सटी गेटिंग चयन में सहायता के लिए दिन 1 वयस्क या सिंक्रनाइज़ किए गए एल 1 (या रुचि की आबादी) जैसे नियंत्रण जानवरों का उपयोग करें।
  8. ऑटोसैंपलर विंडो पर, प्राइम का चयन करें। सही अंतर्निहित स्क्रिप्ट का चयन करने के लिए फ़ाइल > ओपन स्क्रिप्ट पर जाएं, और फिर ओके पर क्लिक करें।
    1. केवल विश्लेषण के लिए, अधिग्रहण के साथ स्क्रिप्ट का चयन करें। सॉर्टिंग के लिए, डिस्पेंसर के साथ स्क्रिप्ट का चयन करें। 96-वेल प्लेटों से अधिग्रहण के लिए, 96 अच्छी तरह से स्क्रिप्ट का चयन करें; 384-वेल प्लेटों से अधिग्रहण के लिए, 384 के साथ स्क्रिप्ट का चयन करें। नमूना वॉल्यूम (40 या 100 μL) के लिए, संबंधित वॉल्यूम के साथ स्क्रिप्ट का चयन करें।
  9. विश्लेषण के लिए वांछित कुओं का चयन करने के लिए ऑटोसैंपलर सॉफ़्टवेयर मेनू पर प्लेट टेम्पलेट पर जाएं। नियंत्रण नमूने लोड करें। प्लेट को ऑटोसैंपलर स्टेज पर लोड करने और सुरक्षित करने के बाद, ऑटोसैंपलर विंडो पर रन प्लेट दबाएं। संकेत मिलने पर फ़ाइल सहेजें.
    नोट: नियंत्रण नमूने और सेटिंग्स एलपीएस नमूना पोर्ट पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के साथ एलपी नमूना संलग्न करने से पहले किया जा सकता है।
  10. जब अधिग्रहण समाप्त हो जाता है, तो एलपीएस सॉफ़्टवेयर विंडो में शीर्ष रिबन पर स्टोर डेटा बटन पर क्लिक करें और डेटा को फिर से सहेजें।

एलिगेंस विशेषताओं और प्रति जानवर आंत माइक्रोबायोम स्तर का विश्लेषण।

  1. कच्चा डेटा तीन फ़ाइल प्रकारों में संग्रहीत किया जाता है: .lmd, .bxr3, .txt. विश्लेषण के लिए R प्रोग्राम में फ़ाइल .txt लेबल की गई पाठ फ़ाइल लोड करें। आर19 में नीचे दिए गए चरणों को पूरा करें।
  2. विश्लेषण के लिए एक ढांचे के रूप में पैकेज टिडीवर्स20 का उपयोग करें।
  3. जीजीप्लॉट फ़ंक्शन (टिडीवर्स में शामिल) का उपयोग करके एलपीएस डेटा को टीओएफ मानों को एक्स-अक्ष और एक्सटी मानों को वाई-अक्ष के रूप में उपयोग करके प्लॉट करें। एक सामान्य प्लॉट डॉट्स के दो बादलों को दिखाएगा। सुनिश्चित करें कि एक मूल और एक्स-अक्ष के करीब है, जो लार्वा और छोटे मलबे जैसे छोटे कणों को दर्शाता है और कणों का दूसरा समूह भूखंड के ऊपरी दाईं ओर है और वयस्क नेमाटोड का प्रतिनिधित्व करता है।
  4. एक मार्गदर्शिका के रूप में इस समूहीकरण का उपयोग करके, पर्याप्त TOF और EXT कट-ऑफ मान चुनें. शरीर विज्ञान में परिवर्तन के आधार पर विभिन्न रोगाणुओं पर सी एलिगेंस उपभेदों द्वारा गेटिंग भिन्न हो सकती है (उदाहरण के लिए, अंधेरे बनाम स्पष्ट जानवर या अंडे की गाड़ी में परिवर्तन एक्सटी गुणांक को बदल सकता है)।
  5. टीओएफ और एक्सटी गेटिंग द्वारा वयस्कों और लार्वा को अलग करने के लिए फ़ंक्शन उप-समूह का उपयोग करें। यहां दिए गए उदाहरण में, वयस्क जानवरों के लिए गेट करने के लिए टीओएफ > 1,200 और एक्सटी > 1,000 सेटिंग्स का उपयोग करें।
  6. सांख्यिकीय मतभेदों के लिए परिणामी डेटासेट का विश्लेषण करें; इस प्रयोग के लिए R में T-test फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    1. एलिगेंस के आकार और ऑप्टिकल घनत्व पर माइक्रोबायोम के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, स्थितियों के बीच क्रमशः टीओएफ और एक्सटी मूल्यों की तुलना करें। टीओएफ कृमि आकार के लिए एक प्रॉक्सी है और विशिष्ट समय पर जानवरों की वृद्धि दर में परिवर्तन का संकेत दे सकता है। अंडे द्वारा बिखरे प्रकाश के कारण विकास और वयस्कता के अंत के बीच एक्सटी परिवर्तन सबसे बड़े होते हैं और इसका उपयोग उस संक्रमण और प्रजनन के समय में परिवर्तन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। संतान के अनुपात और वितरण का आकलन करें यदि उन्हें विश्लेषण के दौरान बनाए रखा गया था।
    2. आंत माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण स्तरों में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए, पहले प्रत्येक जानवर के लिए अलग-अलग टीओएफ मूल्यों के साथ विभाजित करके प्रतिदीप्ति मूल्यों (जैसे, लाल या हरे कॉलम) को सामान्य करें। जैसे-जैसे कीड़े आकार में बढ़ते हैं और वयस्क हो जाते हैं, उनकी आंत की मात्रा भी बड़ी हो जाती है। सामान्यीकरण नमूना पशु आकार वितरण में अंतर से कलाकृतियों को कम करने में मदद करता है। स्थितियों में आंत माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण में परिवर्तन का आकलन करने के लिए सामान्यीकृत जानवरों का उपयोग करें।
      नोट: एक कच्चा डेटा उदाहरण और संबंधित आर स्क्रिप्ट पूरक फ़ाइल 1 JOVE_worm_microbiome.txt और पूरक फ़ाइल 2 JOVE_worm_microbiome.r में पाया जा सकता है। दो फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया का उपयोग करके मेजबान और माइक्रोबायोम के इन विश्लेषणों के प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्रा 2 और चित्रा 3 देखें।

6. आंत माइक्रोबायोम विशेषताओं द्वारा सी एलिगेंस जानवरों की छंटाई।

  1. चरण 3 में वर्णित फ्लोरोसेंट-टैग किए गए रोगाणुओं (जैसे, आरएफपी) पर उगाई गई सी एलिगेंस आबादी एकत्र करें। कीड़े को न्यूनतम 5 एमएल नमूने के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में रखा जाना चाहिए। सभी वयस्कों और संतानों सहित लगभग 2,000 कीड़े / एमएल का लक्ष्य रखें।
    नोट: यह एलपी सैंपलर का उपयोग करके एक फ्लैट बॉटम 96-वेल प्लेट में भी किया जा सकता है। कृमि घनत्व को 50-100 प्रति कुएं पर रखें।
    1. यदि एलपी सैंपलर का उपयोग किया गया है तो एलपी सैंपलर को बंद और डिस्कनेक्ट करें। सॉर्ट करने से पहले नमूने को फिर से कनेक्ट करें और लाइनों को एलपीएस से शुद्ध करें।
  2. LPS सॉफ़्टवेयर खोलें, फ़ाइल > नया प्रयोग करें फिर नया नमूना > फ़ाइल करें। एक्स-अक्ष पर टीओएफ और वाई-अक्ष पर विलुप्त होने के साथ एक डॉट प्लॉट बनाएं। एक्स-अक्ष पर टीओएफ और वाई-अक्ष पर लाल के साथ एक और डॉट प्लॉट बनाएं। पहले उपयोग किए गए समान अक्ष पैमाने और लेजर सेटिंग्स का उपयोग करें। 488 एनएम और 561 एनएम लेजर चालू करने के लिए लेजर सक्षम करें
    नोट: यदि ये प्लॉट पहले बनाए गए हैं, तो ग्राफ़ लोड करने के लिए फ़ाइल > ओपन एक्सपेरिमेंट और फाइल > ओपन सैंपल पर जाएं।
    1. नमूना पोर्ट पर नियंत्रण नमूना ट्यूब रखें। अधिग्रहण/वितरण संवाद बॉक्स में, अधिग्रहण करें क्लिक करें. संकेत मिलने पर फ़ाइल सहेजें. आबादी को अलग करने के लिए पर्याप्त कीड़े को मापने के बाद, गर्भपात पर क्लिक करें।
      नोट: प्रवाह दर लगभग 15-30 घटनाओं / यदि नहीं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कृमि सांद्रता को समायोजित करें कि व्यक्तिगत जानवरों का विश्लेषण किया जाता है या प्रति बूंद क्रमबद्ध किया जाता है। एलपीएस में, कीड़े विभिन्न स्थितियों (सीधे बनाम घुंघराले या मुड़े हुए) में लेजर के मार्ग से गुजरते हैं। वे अपनी स्थिति के आधार पर लेजर और डिटेक्टर को पारित करने के लिए अलग-अलग समय ले सकते हैं।
    2. टीओएफ बनाम विलुप्त होने के डॉट प्लॉट में वयस्क आबादी के चारों ओर एक गेट खींचा जाता है। टीओएफ बनाम रेड डॉट प्लॉट में, माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण के विभिन्न स्तरों के साथ वयस्क कीड़े के लिए रुचि के क्षेत्रों के रूप में उच्च और निम्न लाल मूल्यों वाले क्षेत्रों के चारों ओर गेट खींचें। गेटिंग पदानुक्रम > देखें पर जाएं और सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट गेट वयस्क जनसंख्या गेट के नीचे सूचीबद्ध हैं। सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ हो जाने के बाद, फ़ाइल > प्रयोग सहेजें और फ़ाइल > नमूना सहेजें पर जाएँ.
      नोट: यहां उदाहरण में, वयस्कों के लिए टीओएफ / एक्सटी गेट के आधार पर जानवरों का चयन करें और उन पूलों में क्रमबद्ध करें जो लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया के साथ उच्च या निम्न उपनिवेशीकरण प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, एलपीएस द्वारा मापा मापदंडों के किसी भी संयोजन का उपयोग रुचि की आबादी (ओं) की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।
  3. छंटाई से पहले, सुनिश्चित करें कि उचित संग्रह उपकरण लोड किया गया है। संग्रह उपकरण पर 96-वेल प्लेट लोड करने के लिए, अधिग्रहण/वितरण संवाद बॉक्स में मूव स्टेज अनुभाग के तहत लोड प्लेट ए > मूव का चयन करें ताकि संग्रह चरण को 96-वेल प्लेट लोड करने के लिए प्राइम स्थिति में ले जाने की अनुमति मिल सके।
  4. थोक छंटाई के लिए, उपयुक्त ट्यूब आकार का चयन करें और 15 एमएल या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब लोड करने के लिए स्थानांतरित करें पर क्लिक करें। एक्वायर/डिस्पेंसर संवाद बॉक्स के सॉर्टिंग अनुभाग में, बनाए गए क्षेत्रों की ड्रॉप-डाउन सूची से सॉर्टिंग गेट चुनें. प्रवाह सेल नोजल के ठीक नीचे एक संग्रह ट्यूब में वितरित करने के लिए परिभाषित क्षेत्र से वस्तुओं की संख्या इनपुट करें। अधिग्रहण/वितरण संवाद बॉक्स के अंतर्गत बल्क सॉर्ट बटन पर क्लिक करें.
  5. 96-वेल प्लेट के वितरण के लिए, 96-वेल प्लेट > कैलिब्रेटेड प्लेट्स > सेटअप > प्लेट्स पर जाएं। फिर व्यू > प्लेट टेम्प्लेट पर जाएं, उन कुओं का चयन करें जिनमें कीड़े सॉर्ट किए जाएंगे, प्रत्येक कुएं में क्रमबद्ध की जाने वाली वस्तुओं की संख्या इनपुट करें, और रुचि के गेटेड क्षेत्रों का चयन करें। यदि एक से अधिक गेटेड क्षेत्र को एक ही प्लेट में क्रमबद्ध किया जाएगा, तो बॉक्स गेट प्रत्येक कुएं को चेक करें। परिवर्तन सहेजने के लिए ठीक क्लिक करें.
  6. क्रमबद्ध संख्याओं और स्थानों को असाइन किए जाने के बाद, 96-वेल प्लेट पर वितरण शुरू करने के लिए अधिग्रहण / डिस्पेंसर संवाद बॉक्स से फिल प्लेट बटन पर क्लिक करें।
    1. पूरे 96-वेल प्लेट को भरने से पहले, जानवरों या नियंत्रणों के एक उप-समूह की 96-वेल प्लेट में परीक्षण छंटाई करें, और उचित संख्या और वांछित पशु आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके विश्लेषण करें। एक बार सटीक सॉर्टिंग की पुष्टि हो जाने के बाद, प्रयोगात्मक नमूनों के लिए चरण 6.3-6.6 दोहराएं। डेटा को फिर से सहेजने के लिए LPS सॉफ़्टवेयर विंडो में शीर्ष रिबन पर संग्रह डेटा बटन पर क्लिक करें।
      नोट: सभी माप (EXT, TOF, RFP, GFP, आदि) को क्रमबद्ध जानवरों के लिए भी एकत्र किया जा सकता है और उन लोगों की तुलना की जा सकती है जिन्हें क्रमबद्ध नहीं किया गया था। यदि वांछित हो तो यह विश्लेषण और सॉर्टिंग मोड को एक ही समय में चलाने की अनुमति दे सकता है।

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Representative Results

वयस्क और लार्वा आबादी द्वार को परिभाषित करना।
एलिगेंस एल 1 एस को एक मानक प्रयोगशाला आहार ई कोलाई ओपी 50 (इको) के साथ बीजित एनजीएम प्लेट पर उगाया गया था। एलिगेंस आबादी को 20 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 ए) पर 96 घंटे या 120 घंटे की वृद्धि के बाद एलपीएस विश्लेषण के लिए एकत्र किया गया था। विलुप्त होने का एक डॉट प्लॉट (EXT, शरीर घनत्व का एक प्रॉक्सी) बनाम टाइम-ऑफ-फ्लाइट (टीओएफ, शरीर की लंबाई का एक प्रॉक्सी) जानवरों के दो नेत्रहीन अलग-अलग बादल बनाता है। प्रत्येक बिंदु एक एकल जानवर का प्रतिनिधित्व करता है जहां लार्वा की तुलना में वयस्कों से उच्च एक्सटी और टीओएफ मान देखे जाते हैं (चित्रा 2 बी)। ये दो पैरामीटर जनसंख्या वृद्धि और शरीर विज्ञान के लिए मूल्यवान निष्कर्ष हैं। उदाहरण के लिए, लार्वा टीओएफ का एक घनत्व भूखंड लार्वा चरणों के वितरण की कल्पना कर सकता है। 2-दिवसीय वयस्कों की संतानों में एल 1 और एल 2 चरणों का वर्चस्व था, जिसमें टीओएफ 200 से नीचे था, जबकि 3-दिवसीय वयस्कों की अधिकांश संतान एल 3 और एल 4 चरणों तक पहुंच गई (चित्रा 2 सी)। इसके अतिरिक्त, 2 डी घनत्व और बॉक्स-मूंछ भूखंड वयस्क शरीर के आकार और घनत्व में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए उपयोगी होते हैं क्योंकि ई कोलाई पर उगाए जाने पर दिन 2 की तुलना में टीओएफ और एक्सटी के मूल्य दिन 3 पर बढ़ जाते हैं (चित्रा 2 डी-एफ)। यह संबंध आम तौर पर वयस्कता के दौरान एक रैखिक होता है, लेकिन शरीर विज्ञान में कुछ परिवर्तन एक विशेषता को दूसरे से अधिक प्रभावित कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, अंडे के बिना वयस्कों में टीओएफ को प्रभावित किए बिना कम एक्सटी मान हो सकते हैं)।

फ्लोरोसेंटली टैग किए गए रोगाणुओं का उपयोग करके आंत माइक्रोबायोम संरचना की रूपरेखा
उपनिवेशीकरण के विभिन्न स्तरों को चित्रित करने के लिए, हम प्राकृतिक सी एलिगेंस माइक्रोबायोम डी टमाटर-टैग किए गए ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 (ओसीएच) और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -टैग किए गए ई कोलाई ओपी 50 के एक प्रमुख कॉलोनाइजर की तुलना करते हैं। इन दोनों को एनजीएम प्लेट पर ओडी (1: 1 मिश्रण) के आधार पर व्यक्तिगत रूप से और समान मिश्रण में बीज दिया गया था। एलिगेंस एल 1 को तीन स्थितियों पर उगाया गया था और 3 दिन के वयस्कों में उपनिवेशगतिशीलता की जांच करने के लिए 120 घंटे में एकत्र किया गया था (चित्रा 3 ए)। 2 डी घनत्व और बॉक्स-मूंछ भूखंडों से पता चला है कि वयस्क टीओएफ और एक्सटी मूल्यों में अंतर हैं जब सी एलिगेंस को ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 और मिक्स संस्कृतियों (चित्रा 3 बी-ई) पर उगाया जाता है। बैक्टीरिया के आंत उपनिवेशीकरण का अनुमान व्यक्तिगत नेमाटोड में पाए गए प्रतिदीप्ति स्तर से लगाया जा सकता है। लाल फ्लोरोसेंट रीडिंग के बॉक्स-मूंछ प्लॉट अकेले ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 की तुलना में मिश्रण की स्थिति में ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 उपनिवेशीकरण में वृद्धि दिखाते हैं। इसके विपरीत, हरे-फ्लोरोसेंट मान अकेले ओपी 50 की तुलना में मिश्रण की स्थिति में कम ओपी 50 उपनिवेशीकरण का संकेत देते हैं। टीओएफ-सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट संकेतों में इसी तरह के रुझान देखे जाते हैं, जो शरीर के आकार के प्रभाव को दूर करता है और आबादी के भीतर भिन्नता को कम करता है (चित्रा 3 एफ-आई)। कई फ्लोरोसेंट-टैग किए गए रोगाणुओं के साथ एक परिभाषित माइक्रोबायोम के लिए, एक डॉट प्लॉट इन रोगाणुओं के लिए उपनिवेशीकरण पैटर्न को चित्रित कर सकता है। उदाहरण के लिए, दो सदस्यीय मिश्रण माइक्रोबायोम में, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) बनाम जीएफपी चैनलों का एक डॉट प्लॉट दिखाता है कि कीड़े वाई-अक्ष (आरएफपी) की ओर भारी तिरछे हैं, जिससे पता चलता है कि ओपी 50 उपनिवेशीकरण अधिकांश कीड़े में कम है, जबकि ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 उपनिवेशीकरण का स्तर आबादी में समान रूप से वितरित किया जाता है (चित्रा 3 जे)। इसी तरह, आरएफपी बनाम एक्सटी का एक डॉट प्लॉट ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 उपनिवेशीकरण स्तरों और मेजबान विकास जैसे शरीर घनत्व (चित्रा 3 के) के बीच संबंधों को प्रकट कर सकता है। इसके अलावा, प्रजनन पैटर्न में अंतर को तीन स्थितियों (चित्रा 3 एल) पर संबंधित लार्वा आबादी के घनत्व भूखंड को प्लॉट करके देखा जा सकता है।

माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण के आधार पर लक्षित आबादी के लिए संवर्धन
दो सदस्यीय मिश्रण माइक्रोबायोम पर उगाए गए 3-दिवसीय वयस्क आरएफपी तीव्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रदर्शन करते हैं, जो समूह के भीतर ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 उपनिवेशीकरण में व्यक्तिगत भिन्नताओं का संकेत देते हैं (चित्रा 4 ए)। इन उप-समूहों को और अलग करने के लिए, उच्च और निम्न आरएफपी के लिए सॉर्टिंग गेट मैन्युअल रूप से तैयार किए गए थे ताकि प्रत्येक गेट से 15 व्यक्तियों को 96-वेल प्लेट में क्रमबद्ध किया जा सके, जैसा कि पूरे कुएं की आरएफपी छवि (चित्रा 4 बी) द्वारा दिखाया गया है। उच्च आवर्धन के तहत, उज्ज्वल क्षेत्रों और आरएफपी चैनलों की ओवरले छवियां पुष्टि करती हैं कि सॉर्टिंग विधि उच्च और निम्न ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3-उपनिवेशित कीड़े का चयन करती है, जो फेनोटाइपिक परिणामों और आणविक ड्राइवरों (चित्रा 4 सी) के आगे लक्षण वर्णन की अनुमति देती है।

Figure 1
चित्रा 1: आंत माइक्रोबायोम और मेजबान शरीर विज्ञान का आकलन करने के लिए प्रवाह वर्मिमेट्री-आधारित विधियों के लिए एक प्रवाह चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क और लार्वा आबादी को परिभाषित करना। (ए) वयस्कता के दिन 2 और दिन 3 पर सी एलिगेंस आबादी एकत्र करने के लिए एक वर्कफ़्लो। (बी) वयस्कता के दिन 2 (ग्रे) और दिन 3 (लाल) पर सी एलिगेंस आबादी के लिए समय-उड़ान (टीओएफ) बनाम विलुप्त होने (एक्सटी) का डॉट प्लॉट। (सी) वयस्कता के दिन 2 और दिन 3 पर लार्वा टीओएफ का घनत्व प्लॉट। (D-E) वयस्कता के दिन 2 और दिन 3 पर वयस्कों के लिए टीओएफ बनाम एक्सटी के डॉट और बॉक्स-एंड-मूंछ प्लॉट। (एफ) वयस्कता के दिन 2 और दिन 3 पर वयस्क विलुप्त होने का बॉक्स-एंड-मूंछ प्लॉट। पी-मानों की गणना छात्र के टी-टेस्ट (*** पी < 0.001) के साथ की गई थी; दिन 2 n = 38; दिन 3 एन = 88)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसेंट-टैग किए गए रोगाणुओं का उपयोग करके आंत माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण की रूपरेखा। (ए) ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 (डी टमाटर-एक्सप्रेसिंग) पर उगाई गई 3-दिवसीय वयस्क आबादी का संग्रह; कोलाई ओपी 50 (जीएफपी-व्यक्त; इको) या दो बैक्टीरिया (मिश्रण) का 1: 1 मिश्रण। (बी) मिश्रण पर उगाए गए दिन 3 वयस्कों के लिए टीओएफ बनाम एक्सटी का डॉट प्लॉट। (C-E) ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 पर उगाए गए 3-दिवसीय वयस्कों के लिए टीओएफ बनाम एक्सटी के डॉट और बॉक्स-एंड-मूंछ प्लॉट। ग्रे डैश लाइनें ओपी 50 पर उगाई गई आबादी के औसत मूल्य को इंगित करती हैं। (F-G) अकेले मिक्स और ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 पर उगाए गए 3-दिवसीय वयस्कों के लिए कच्चे और टीओएफ-सामान्यीकृत डीटोमैटो (आरएफपी) मूल्यों का बॉक्स-और-मूंछ प्लॉट। (H-I) मिक्स और ओपी 50 पर उगाए गए 3-दिवसीय वयस्कों के लिए कच्चे और टीओएफ-सामान्यीकृत जीएफपी के बॉक्स-और-मूंछ भूखंड। (जे) मिश्रण पर उगाए गए 3 दिन के वयस्कों के लिए ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 (आरएफपी) बनाम ई कोलाई ओपी 50 (जीएफपी) का डॉट प्लॉट। (के) मिश्रण पर उगाए गए 3 दिन के वयस्कों के लिए आरएफपी बनाम एक्सटी का डॉट प्लॉट। (एल) मिश्रण, ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3, और ओपी 50 पर उगाए गए 3-दिवसीय वयस्कों से लार्वा का घनत्व प्लॉट। सभी पी-मान छात्र के टी-टेस्ट (*** पी < 0.001; ** पी < 0.01; एन.एस., महत्वपूर्ण नहीं; मिक्स एन = 230) से उत्पन्न हुए थे; Och n = 45)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण के आधार पर लक्षित आबादी को समृद्ध करें। (ए) 3 दिन के वयस्कों के लिए टीओएफ बनाम आरएफपी (ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3) का डॉट प्लॉट। उच्च (लाल बॉक्स) और निम्न (ब्लैक बॉक्स) आरएफपी गेट उच्च और निम्न ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 उपनिवेशके साथ सी एलिगेंस को समृद्ध करने के लिए तैयार किए जाते हैं। (बी) कुओं की प्रतिनिधि आरएफपी छवियां (4x) जिसमें उच्च और निम्न आरएफपी गेट (बार = 1 मिमी) से 15 क्रमबद्ध कीड़े होते हैं। (सी) उच्च और निम्न आरएफपी गेट (बार = 100 μm) से अलग-अलग कीड़े की प्रतिनिधि छवियां (10x)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: ई कोलाई ओपी 50 और ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 पर उगाए गए दिन 2 और दिन 3 वयस्कता में एन 2 आबादी के लिए बड़े कण सॉर्टर द्वारा उत्पन्न प्रतिनिधि डेटासेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: आर वातावरण में प्रतिनिधि डेटासेट के विश्लेषण और आंकड़ा पीढ़ी में उपयोग की जाने वाली स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फ्लो वर्मिमेट्री का उपयोग कईअध्ययनों में रोगज़नक़ उपनिवेशीकरण और विषाक्तता के खिलाफ सी एलिगेंस जीन और मार्गों को चिह्नित करने के लिए किया गया है। यहां, एक उच्च थ्रूपुट उत्तरदायी दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है जो सी एलिगेंस का उपयोग यह जांचने के लिए करता है कि आंतों के माइक्रोबायोम अपने मेजबान शरीर विज्ञान को कैसे संशोधित करते हैं। कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) या 16 एस आरआरएनए एम्प्लिकॉन अनुक्रमण 9,16,17,23,24 का उपयोग करने वाले मौजूदा तरीकों की तुलना में, इस दृष्टिकोण को श्रम-गहन गिनती या संभावित पीसीआर पूर्वाग्रह पेश करने की आवश्यकता नहीं है। एक पूरी आबादी में माइक्रोबायोम को मापने के अलावा, यह दृष्टिकोण उपयोगकर्ताओं को आबादी के भीतर व्यक्तिगत विविधताओं की कल्पना करने की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण केवल फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की उपलब्धता या रोगाणुओं के धुंधला होने और एलपीएस में पहचान चैनलों की संख्या से सीमित है। प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए अतिरिक्त विचारों पर नीचे चर्चा की गई है ताकि उपयोगकर्ता अपनी आवश्यकताओं के आधार पर एक अनुकूलित वर्कफ़्लो बना सकें।

परिभाषित माइक्रोबायोम बनाने और बोने के लिए विचार
सबसे पहले, प्रत्येक जीवाणु संस्कृति को विभिन्न उपभेदों को मिलाने से पहले 1 के ओडी600 मान के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। यह ध्यान देने योग्य है कि, समुदाय की जटिलता और अंतर-प्रजाति संबंधों के आधार पर, शुरुआती घनत्व स्थापित माइक्रोबायोम संरचना23 पर विभिन्न प्रभाव डाल सकता है। जबकि ओडी को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा आसानी से मापा जा सकता है, एक चेतावनी यह है कि विभिन्न बैक्टीरिया में एक ही ओडी मूल्य के लिए अलग-अलग सांद्रता (जैसे, प्रति एमएल कोशिकाओं की संख्या) होगी और तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। दूसरा, लॉन में माइक्रोबायोम संरचना में भिन्नता का हिसाब रखा जाना चाहिए। एक बार जब माइक्रोबायोम को एनजीएम प्लेट (या अन्य मीडिया) पर बीज दिया जाता है, तो प्लेटों पर सिंक्रनाइज़ एल 1 सी एलिगेंस आबादी को छोड़ने से पहले माइक्रोबायोम को कमरे के तापमान पर रात भर बढ़ने की अनुमति दी जाती है। बैक्टीरिया उपभेदों के बीच विकास दर और अंतर-प्रजाति बातचीत में भिन्नता के कारण, एनजीएम प्लेटों या विकास के लिए सब्सट्रेट के साथ किसी भी प्लेट पर उगाए गए माइक्रोबायोम मूल बीज मिश्रण से संरचना में भिन्न होंगे। पेप्टोन-मुक्त एनजीएम प्लेट का उपयोग मूल माइक्रोबियल समुदाय13 को संरक्षित कर सकता है। हालांकि, पेप्टोन-मुक्त प्लेट पर सीमित माइक्रोबायोम वृद्धि के कारण, एक उच्च सीडिंग ओडी या प्रति प्लेट सिंक्रनाइज़ एल 1 की कम संख्या की आवश्यकता हो सकती है। यह परख के लिए वांछित उम्र तक पहुंचने से पहले आबादी को भूखे रहने से रोकता है। एक अन्य दृष्टिकोण लॉन में रोगाणुओं के अनुपात को अनुक्रमित या अन्यथा निर्धारित करना है।

माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण और सी एलिगेंस फिजियोलॉजी को मापना।
सबसे पहले, वयस्कों के लिए विलुप्त होने (एक्सटी) और टाइम-ऑफ-फ्लाइट (टीओएफ) गेटिंग थ्रेसहोल्ड उम्र, सी एलिगेंस तनाव पृष्ठभूमि और रोगाणुओं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, जिन पर वे उगाए जाते हैं। बैक्टीरिया की स्थिति के लिए प्रयोग में 1 दिन की वयस्क आबादी होने से टीओएफ और विलुप्त होने के कटऑफ को निर्धारित करने के साथ-साथ विकास मीडिया और पर्यावरण के कारण भिन्नता को नियंत्रित करने के लिए उपयोगी हो सकता है। वयस्कों के लिए सिंचाई के अलावा, टीओएफ और एक्सटी को लार्वा के लिए गेट पर लागू किया जा सकता है, और संतान का घनत्व प्लॉट जनसंख्या स्तर पर प्रजनन के समय और उत्पादन का अनुमान लगा सकता है (चित्रा 3 एल)। दूसरा, एलपीएस पर पीएमटी लाभ और वोल्टेज को सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने और संतृप्ति से बचने के लिए सिग्नल रेंज सेट करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है। यह बैक्टीरिया उपभेदों की फ्लोरोसेंट तीव्रता और उनके उपनिवेशस्तर पर निर्भर है। 350 पर डिफ़ॉल्ट पीएमटी उच्च कॉलोनाइजर्स जैसे कि ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन उपयोगकर्ताओं को ई कोलाई ओपी 50 जैसे कम कॉलोनाइजर्स के लिए पीएमटी या वोल्टेज मान बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है। तीसरा, फ्लोरोफोरेस के गुणों और ट्रांसजेनिक जीवाणु उपभेदों में उनकी अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर के कारण, फ्लोरोसेंट मान माइक्रोबायोम में मौजूद बैक्टीरिया की पूर्ण संख्या को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इसलिए, जीएफपी और आरएफपी मूल्यों का उपयोग सीधे दो अलग-अलग फ्लोरोसेंट रोगाणुओं के बीच उपनिवेशीकरण की तुलना करने के लिए नहीं किया जा सकता है। जीवित जीवाणु ओं की संख्या की पहचान करने के लिए जानवरों का विघटन और चढ़ानाइन संबंधों को बेहतर ढंग से हल करने में मदद कर सकता है।

संवर्धन-आधारित रणनीतियों के लिए संभावित अनुप्रयोग
यह विधि जनसंख्या स्तर पर मेजबान शरीर विज्ञान पर माइक्रोबायोम परिवर्तनों के प्रभाव की जांच करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट मंच प्रदान करती है। माइक्रोबियल पक्ष पर, बैक्टीरियल जीनोम 25,26,27 को संपादित करने के लिए उपकरणों और संसाधनों की बढ़ती उपलब्धता सी एलिगेंस प्राकृतिक माइक्रोबायोम से संबंधित फ्लोरोसेंट और कार्यात्मक माइक्रोबियल म्यूटेंट की संख्या में वृद्धि करेगी। मेजबान पक्ष से, सेल सिग्नलिंग और माइक्रोबायोम संरचना के बीच की कड़ी का पता लगाने के लिए कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर उपलब्ध हैं। विशिष्ट माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण विशेषताओं के साथ एक उत्परिवर्तित आबादी (जैसे, ईएमएस फॉरवर्ड म्यूटेनेसिस) 28 या पूल किए गए जंगली उपभेदों29 से एक मेजबान आबादी या उत्परिवर्ती को समृद्ध करने की क्षमता मेजबान जीन को जोड़ने की क्षमता को बहुत आगे बढ़ा सकती है जो माइक्रोबायोम प्रभाव को नियंत्रित करती है। इसके अलावा, मेजबान और / या माइक्रोबायोम विशेषताओं के आधार पर आबादी का चयन ओमिक्स-आधारित प्रोफाइलिंग तौर-तरीकों के एक कैडर की सुविधा भी प्रदान कर सकता है। इस दृष्टिकोण में बहुत लचीलापन है और मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन के आणविक मध्यस्थों की समझ को आगे बढ़ाने का वादा करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान DP2DK116645 (बीएसएस को), डन फाउंडेशन पायलट अवार्ड और नासा अनुदान 80एनएसएससी 22के0250 (बीएसएस को) द्वारा समर्थित किया गया था। इस परियोजना को बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसमें सीपीआरआईटी कोर सुविधा समर्थन पुरस्कार (सीपीआरआईटी -RP180672), एनआईएच (एस 10 OD025251, CA125123 और RR024574) और जोएल एम सेडरस्ट्रॉम की सहायता से एलपीएस एनआईएच अनुदान (एस 10 OD025251) के लिए एक इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान शामिल था। कुछ उपभेदों को सीजीसी द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (पी 40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes VWR 10026-076
96 deep-well plates (1 mL) Axygen P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL) Axygen P-DW-20-C
96-well Costar plate Corning 3694
Agar Millipore Sigma Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold V&P scientific VP1171A
Bleach Clorox
Bleach solution  Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader Biotek Cytation 5 Bacterial OD measurement
Centrifuge Thermo scientific  Sorvall Legend XTR For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope Nikon TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. R package Version 3.3.2
Large Particle Autosampler Union Biometrica LP Sampler
Large Particle Sorter Union Biometrica COPAS Biosorter
Levamisole Fisher AC187870100
Lysogeny Broth (LB) RPI L24066 Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution  22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium RPI N81800-1000.0 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio GNU Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite Sigma-Aldrich 5M NaOH
Stereo Microscope Nikon SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes Corning 351029
Sterile 12-well plates VWR 10062-894
Sterile 24-well plates VWR 10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes Corning 351007
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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References

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  2. Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
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जीव विज्ञान अंक 193 विश्लेषण केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंत माइक्रोबायोम संरचना मेजबान फिजियोलॉजी रचनात्मक परिवर्तन कार्यात्मक संबंध आणविक ड्राइवर मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन पारदर्शी शरीर योजना फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्राकृतिक रोगाणुओं रोगाणुओं के सापेक्ष स्तर बड़े कण सॉर्टर प्रयोगात्मक सेटअप संग्रह विश्लेषण सी एलिगेंस आबादी सॉर्टर ऑपरेशन और रखरखाव सांख्यिकीय विश्लेषण सॉर्टर सेटिंग्स का अनुकूलन प्रभावी गेटिंग रणनीतियों संवर्धन पशु आबादी उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए मापनीयता।
<em>"केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> आंत माइक्रोबायोम के परिमाणीकरण और विश्लेषण के लिए फ्लो वर्मिमेट्री का अनुप्रयोग"।
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Zhang, F., Blackburn, D., Hosea, C.… More

Zhang, F., Blackburn, D., Hosea, C. N., Assié, A., Samuel, B. S. Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome. J. Vis. Exp. (193), e64605, doi:10.3791/64605 (2023).

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