Summary
Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modell, um die molekularen Determinanten zu untersuchen, die Wirt-Mikrobiom-Interaktionen steuern. Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Ebenen der Darmmikrobiom-Kolonisierung einzelner Tiere zusammen mit Schlüsselaspekten der Physiologie von C. elegans profiliert.
Abstract
Die Zusammensetzung des Darmmikrobioms kann während der gesamten Entwicklung und des Lebens des Tieres einen dramatischen Einfluss auf die Physiologie des Wirts haben. Die Messung von Veränderungen der Zusammensetzung des Mikrobioms ist entscheidend, um die funktionellen Beziehungen zwischen diesen physiologischen Veränderungen zu identifizieren. Caenorhabditis elegans hat sich als leistungsfähiges Wirtssystem erwiesen, um die molekularen Treiber von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen zu untersuchen. Mit seinem transparenten Körperplan und den fluoreszenzmarkierten natürlichen Mikroben können die relativen Konzentrationen von Mikroben im Darmmikrobiom eines einzelnen C. elegans-Tieres mit einem großen Partikelsortierer leicht quantifiziert werden . Hier beschreiben wir die Vorgehensweisen für den experimentellen Aufbau eines Mikrobioms, die Sammlung und Analyse von C. elegans-Populationen im gewünschten Lebensstadium, den Betrieb und die Wartung des Sortierers sowie statistische Analysen der resultierenden Datensätze . Wir diskutieren auch Überlegungen zur Optimierung der Sortierereinstellungen auf der Grundlage der interessierenden Mikroben, die Entwicklung effektiver Anschnittstrategien für die Lebensstadien von C. elegans und wie die Fähigkeiten von Sortierern genutzt werden können, um Tierpopulationen auf der Grundlage der Zusammensetzung des Darmmikrobioms anzureichern. Im Rahmen des Protokolls werden Beispiele für potenzielle Anwendungen vorgestellt, einschließlich des Potenzials für die Skalierbarkeit auf Anwendungen mit hohem Durchsatz.
Introduction
Die Evolution von Tieren steht unter ständigem mikrobiellen Einfluss1. Aus verschiedenen Mikroben in der Umwelt erwerben tierische Wirte spezifische Partner2 , die die Fähigkeiten des Wirts erweitern und seine Physiologie und Anfälligkeit für Krankheiten3 vorantreiben. Metagenomische Analysen des Darmmikrobioms deckten beispielsweise angereicherte Stoffwechselklassen mikrobieller Gene auf, die bei adipösen Mäusen zu einer größeren Energiegewinnung und -speicherung führen können4, von denen viele auch im menschlichen Darmmikrobiom zu finden sind5. Es besteht immer noch ein großer Bedarf, kausale Zusammenhänge herzustellen und die molekularen Determinanten des Einflusses auf das Mikrobiom zu bestimmen, obwohl der Fortschritt durch die Komplexität des Mikrobioms und die Eignung von Wirtssystemen für ein groß angelegtes Screening behindert wurde.
Der Modellorganismus C. elegans bietet eine Plattform, um das molekulare Verständnis der Zusammenhänge zwischen Mikrobiom und Wirtsphysiologie zu verbessern. C. elegans besitzt 20 Darmzellen mit einer Schleimhautschicht und Zottenstrukturen. Diese Zellen sind mit reichlich Chemorezeptor-Genen ausgestattet, die mikrobielle Produkte erkennen und antimikrobielle Moleküle produzieren, die möglicherweise ihre Darmkolonisatoren regulieren 6,7. Diese konservierte Biologie von C. elegans hat zu einer enormen Anzahl von Entdeckungen in der Wirtssignalisierung geführt, die Darmmikroben regulieren, einschließlich der Insulinsignalisierung, TGF-beta und der MAP-Kinase 8,9,10.
C. elegans nutzt Mikroben sowohl als Nahrung für das Wachstum während der Entwicklung als auch als Mikrobiom als Erwachsene. Mit zunehmendem Alter können sich einige Mikroben im Darmlumen übermäßig anreichern und die Wirt-Mikroben-Beziehung verschiebt sich von der Symbiose zur Pathogenese11. In ihrem natürlichen Lebensraum trifft C. elegans auf eine Vielzahl von Bakterienarten12,13. Die Sequenzierung von 16S rDNA aus repräsentativen Proben, die in natürlichen Lebensräumen (faule Früchte, Pflanzenstängel und tierische Vektoren) gesammelt wurden, ergab, dass das natürliche Mikrobiom von C. elegans von vier Bakterienstämmen dominiert wird: Proteobakterien, Bacteroidetes, Firmicutes und Actinobakterien. Innerhalb dieser Unterteilungen gibt es große Unterschiede in der Vielfalt und dem Reichtum der Bakterien, basierend auf dem Lebensraum12,13,14,15. Es wurden mehrere definierte Gemeinschaften gegründet, darunter die 63-köpfigen (BIGbiome)16 und 12-köpfigen (CeMbio) Sammlungen, die die wichtigsten Mikrobiom-Gattungen repräsentieren, die für die C. elegans-Forschungsgemeinschaft geschaffen wurden17. Sowohl Mikrobiome als auch Komponentenstämme können einen vielfältigen Einfluss auf die Physiologie von C. elegans haben, wie z. B. Körpergröße, Wachstumsraten und Stressreaktionen 9,16,17. Diese Studien liefern Ressourcen und Beispiele, um C. elegans als Modell für die Mikrobiomforschung zu etablieren.
Hier wird ein auf Large Particle Sorter (LPS) basierender Arbeitsablauf (Abbildung 1) vorgestellt, der das C. elegans-System nutzt, um gleichzeitig die Zusammensetzung des Mikrobioms und grundlegende Messungen der Wirtsphysiologie auf Populationsebene zu messen. Von der mikrobiellen Seite aus ist der Arbeitsablauf anpassungsfähig, um ein definiertes Mikrobiom oder einzelne Mikroben zusammenzusetzen, um die Robustheit und Plastizität der Gemeinschaft mit zunehmenden mikrobiellen Interaktionen zu testen. Auf der Wirtsseite ermöglicht der Arbeitsablauf Hochdurchsatz-Assays zur Messung des Besiedlungsgrades fluoreszierender Mikroben im Mikrobiom und zur physiologischen Auslesung des Wirts in Bezug auf Entwicklung, Körpergröße und Fortpflanzung. Zusammenfassend ermöglicht das Mikrobiommodell von C. elegans Hochdurchsatz-Screenings, um die metabolischen und genetischen Determinanten zu bestimmen, die die Physiologie des Wirts modulieren.
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Protocol
1. Vorbereitung der Mikrobiommischung
- Stempeln oder streifen Sie Bakterien aus einem Glycerin-Gefrierschrank auf eine Lysogenese-Bouillon (LB)-Platte oder ein geeignetes Wachstumsmedium und lassen Sie sie über Nacht bei einer optimalen Temperatur wachsen, die auf den interessierenden Bakterienstämmen basiert (typischerweise 25 °C für natürliche Mikroben von C. elegans ).
- Verwenden Sie von der LB-Platte eine einzelne Kolonie aus jedem Bakterienisolat (z. B. 12 Bakterien der CeMbio-Sammlung), um 800 μl LB-Medium in separaten Vertiefungen einer 1-ml-Deep-Well-Platte zu inokulieren. Über Nacht bei optimaler Temperatur unter Schütteln bei 250 U/min inkubieren.
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Verwendung mit definierten natürlichen Mikrobiomen (z. B. CeMbio) optimiert, kann aber durch Wachstum unter geeigneten Bedingungen oder anderen Kulturgefäßen (Röhrchen) leicht an einzelne Mikroben angepasst werden. - Beurteilen Sie das Wachstum jeder Mikrobe durch Spektrophotometrie. Ein 20-μl-Aliquot wird in 80 μl LB überführt und die Lösung auf eine durchsichtige, flache 96-Well-Platte gegeben. Messen Sie den OD600 auf einem Plattenleser.
- Nach dem Wachstum über Nacht zentrifugieren Sie die Tiefbrunnenkulturplatte bei 4.000 x g für 10 Minuten, um Bakterien zu pelletieren, und entfernen Sie den Überstand durch Aspiration mit einem 96-Well-Aspirationsverteiler oder einer Mehrkanalpipette.
- Unter Verwendung von OD 600-Werten wird die Konzentration jeder Mikrobe unter Verwendung eines sterilen M9-Mediums auf einen endgültigen OD600 von 1,0 normalisiert.
- Wenn Sie Mikroben kombinieren, bestimmen Sie die Menge der Bakterienkultur, die für das Experiment benötigt wird, und erstellen Sie einen Mikrobiom-Mastermix, indem Sie gleiche Volumina jedes Bakterienstamms in ein Röhrchen ausreichender Größe (z. B. 5-ml- oder 15-ml-Röhrchen) kombinieren.
- Platzieren Sie 30-50 μl der Mikroben mit einem endgültigen OD600 von 1,0 auf der Mitte jeder Agar-haltigen Platte oder Vertiefung18 des Nematodenwachstumsmediums (NGM). Lassen Sie das ausgesäte Mikrobiom über Nacht bei optimaler Temperatur (hier 25 °C) wachsen.
HINWEIS: Bereiten Sie NGM-Agarplatten im Voraus gemäß den Anweisungen im Wurmbuch oder mit vorgemischtem NGM-Pulver18 vor. Beispielsweise werden 3 ml NGM für 12-Well-Platten und 1,5 ml für 24-Well-Platten hinzugefügt.
2. Vorbereitung von synchronisierten C. elegans für das Wachstum auf dem Mikrobiom
- Züchten Sie etwa 100 Würmer auf NGM-Platten (6 cm Durchmesser), die mit Escherichia coli OP50 besät sind, bis die Würmer das trächtige Erwachsenenalter erreicht haben. Für die Zwecke dieses Protokolls wurde der N2-Stamm von C. elegans verwendet, obwohl das Protokoll leicht an andere Nematodenstämme angepasst werden kann.
- Fügen Sie 6 ml M9-Puffer hinzu (plus 0,01 % Triton X-100; M9-TX) auf die Platte pipettieren, um etwa 100 trächtige erwachsene Würmer in ein konisches 15-ml-Röhrchen abzuwaschen.
- Bereiten Sie eine frisch hergestellte Bleichlösung vor, indem Sie zwei Teile Bleichmittel mit einem Teil 5 M NaOH mischen.
- Zentrifugieren Sie die Würmer bei 3.000 x g für 30 Sekunden, um die Würmer zu pelletieren. Aspirieren, um das Volumen auf 4 ml zu reduzieren, und dann 2 ml Bleichlösung hinzufügen.
- Schließen Sie den Deckel fest und schütteln Sie das Röhrchen. Überwachen Sie die erwachsenen Würmer in der Lösung unter einem Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Wenn der Körper eines Erwachsenen auseinanderzubrechen beginnt, typischerweise nach 3,5 Minuten, hören Sie auf zu zittern und zentrifugieren Sie ihn 30 Sekunden lang bei 3.000 x g .
- Mit einer Pipette auf ein minimales Volumen absaugen. Resuspendieren, zentrifugieren und viermal in M9-TX aspirieren, um das Bleichmittel auszuwaschen.
- Resuspendieren Sie in 4-6 ml M9-TX und legen Sie das Röhrchen über Nacht auf einen Rotator, damit die Eier schlüpfen und sich im L1-Stadium synchronisieren können.
- Nehmen Sie am nächsten Tag 10 μl L1-Würmer in M9-TX aus dem Röhrchen und geben Sie sie auf eine saubere Petrischale. Zählen Sie die Anzahl der lebenden L1-Würmer unter einem Stereomikroskop bei 20-facher Gesamtvergrößerung.
- Basierend auf der L1-Dichte wird das entsprechende Volumen pipettiert, um ~50 synchronisierte L1-Larven auf den Rand der mit Mikrobiom besiedelten NGM-Platten zu legen und bei 20 °C zu inkubieren. Lassen Sie die Würmer bis zum gewünschten Alter (Tag 2 oder Tag 3 des Erwachsenenalters) wachsen.
3. Sammeln von Wurmpopulationen für Darmmikrobiomanalysen
- Waschen Sie die Würmer vom Bakterienrasen mit 1-2 ml M9-TX auf eine sterilisierte 2-ml-96-Well-Tiefe.
HINWEIS: Bei mikrobiellen Stämmen, die signifikante Biofilme erzeugen, schütteln Sie die Platte 5 Minuten lang mit Flüssigkeit, um mikrobielle Ablagerungen aufzubrechen. - Zentrifugieren Sie die Deep-Well-Platte bei 300 x g für 1 Minute, um die Schnecken zu pelletieren, und entfernen Sie dann die Flüssigkeit mit einem Ansaugverteiler.
HINWEIS: Benutzer können eine Mehrkanalpipette verwenden, um die Flüssigkeit manuell zu entfernen, wenn kein Ansaugverteiler verfügbar ist. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitzen nicht den Boden der Vertiefungen berühren, um den Verlust von Wurmproben zu vermeiden. - Geben Sie 1,8 ml M9-TX mit einer 1,2-ml-Mehrkanalpipette in jede Vertiefung der Deep-Well-Platte. Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen und 1 Minute lang bei 300 x g zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal, um Bakterien in der Flüssigkeit zu entfernen.
- Nach dem letzten Waschen wird das Volumen in jeder Vertiefung mit dem Ansaugverteiler auf 100 μl gebracht.
HINWEIS: Um die erwachsenen Würmer mit Hilfe der Schwerkraft von den Larven zu trennen, lassen Sie die Platte 30-60 s lang auf der Bank liegen, damit die erwachsenen Würmer auf den Boden des Brunnens sinken können. Saugen Sie dann die Platte an, um die Larven aus der Suspension zu entfernen. - Geben Sie 100 μl 10 mM Levamisol in M9-TX in jede Vertiefung und lassen Sie die Würmer 5 Minuten lang lähmen. Nach der Levamisol-Behandlung 4 % der in Schritt 2.3 beschriebenen Bleichlösung 2 Minuten lang in jede Vertiefung geben, um Bakterienklumpen zu reduzieren. Nach der Bleichbehandlung zweimal mit M9-TX waschen und nach der zweiten Wäsche auf ein Endvolumen von 100 μl absaugen.
- Die Würmer werden auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden übertragen, die 150 μl 10 mM Levamisol in M9-TX enthält. Halten Sie die Wurmdichte bei 50-100 pro Brunnen und teilen Sie die Würmer auf mehrere Brunnen auf, wenn die Population zu überfüllt ist.
4. Einrichten des Großpartikelsortierers und des Autosamplers
- Schalten Sie den Luftkompressor, den Computer und das LPS-Instrument ein. Überprüfen und entleeren Sie den Fäkalientank. Geben Sie dann 500 ml Bleichmittel in den leeren Fäkalientank. Prüfen und füllen Sie die Mantel- und Wassertanks nach, wenn das Volumen gering ist. Stellen Sie sicher, dass die 250-μm-Fluidik- und optische Kernbaugruppe (FOCA) vorhanden ist.
- Führen Sie die Kontrollpartikel für die Qualitätskontrolle aus. Öffnen Sie die LPS-Gerätesoftware. Aktivieren Sie im Softwarefenster die Option Laser aktivieren , um die 488-nm- und 561-nm-Laser einzuschalten.
HINWEIS: Es ist möglich, die Schritte 4.2-4.5 zu überspringen, wenn die Kontrollpartikel innerhalb der letzten 2 Wochen durchgeführt wurden und das BAZL in dieser Zeit nicht geändert wurde. - Wählen Sie "Partikel > Kontrollpartikel einrichten" aus. Wählen Sie in der Eingabeaufforderung Nein aus, um zu den Standardeinstellungen zu wechseln. Die Kontrollpartikel (10 mL dH,2O und 10 mL Kontrollpartikel in einem konischen 50 mL Röhrchen) vor jedem Gebrauch vortexen und in den Probenanschluss laden.
- Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Erfassen , um 500 Ereignisse aufzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Ereignisrate zwischen 15 und 30 Ereignissen/s liegt.
HINWEIS: Wenn die Ereignisrate nicht 15–30 Ereignisse/s beträgt, sollte ein Techniker kontaktiert werden, um die Maschineneinstellungen anzupassen. - Untersuchen Sie den Variationskoeffizienten (CV) für alle Parameter. Wenn CV 15% <, ist die Qualitätskontrolle bestanden und die LPS-Software kann geschlossen werden. Wenn die CV 15 % >, führen Sie die Mikrometer erneut aus und justieren Sie die Mikrometer mit frisch hergestellten Kontrollpartikeln, um den Laser auf die Durchflusszelle auszurichten.
- Schließen Sie den Autosampler an und schalten Sie ihn ein. Öffnen Sie die Autosampler-Gerätesoftware. Dadurch werden der Autosampler und die LPS-Software geöffnet. Wechseln Sie im LPS-Softwarefenster zu Datei > neues Experiment und dann zu Datei > neuen Beispiel. Aktivieren Sie Laser aktivieren, um 488-nm- und 561-nm-Laser einzuschalten, falls dies noch nicht geschehen ist.
- Erstellen Sie Vorlagen für Erfassungspunktdiagramme unter Verwendung von Laufzeit- (TOF), Extinktions- (EXT) und Fluoreszenzkanälen im LPS-Softwarefenster. Eine gute Ausgangsgröße, um alle Würmer zu fangen, ist 8.000 für TOF und EXT. Die Fluoreszenzskalen variieren je nach Mikrobe. Fügen Sie bei jedem Experiment Kontrollwurmproben hinzu, die auf nicht-fluoreszierenden Mikroben (z. B. OP50) gezüchtet wurden, und jede fluoreszierende Mikrobe allein (wenn Mikroben gemischt werden) als Kontrollen verwenden.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Textkörper eines Diagramms, um die Skalierung zu ändern. Verwenden Sie Kontrolltiere, wie z. B. erwachsene Tiere von Tag 1 oder synchronisierte L1s (oder Population von Interesse), um die Auswahl von TOF- und EXT-Gating zu unterstützen.
- Wählen Sie im Autosampler-Fenster die Option Prime aus. Gehen Sie zu Datei > Skript öffnen, um das richtige integrierte Skript auszuwählen, und klicken Sie dann auf OK.
- Wählen Sie das Skript nur für die Analyse mit Acquire aus. Für die Sortierung wählen Sie das Skript mit Dispense aus. Wählen Sie für die Erfassung von 96-Well-Platten das Skript mit 96-Wells aus. Für die Erfassung von 384-Well-Platten wählen Sie das Skript mit 384-Well-Platten aus. Wählen Sie für das Probenvolumen (40 oder 100 μl) das Skript mit dem entsprechenden Volumen aus.
- Gehen Sie im Menü der Autosampler-Software zu Plattenvorlage , um die gewünschten Wells für die Analyse auszuwählen. Laden Sie die Kontrollproben. Nachdem die Platte auf den Autosampler-Tisch geladen und gesichert wurde, drücken Sie Run Plate im Autosampler-Fenster. Speichern Sie die Datei, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
HINWEIS: Kontrollproben und Einstellungen können mit einem konischen 50-ml-Röhrchen am LPS-Probenanschluss vorgenommen werden, bevor der LP-Sampler angeschlossen wird. - Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Daten speichern im oberen Menüband des LPS-Softwarefensters und speichern Sie die Daten erneut.
5. Analyse der Merkmale von C. elegans und des Darmmikrobioms pro Tier
- Rohdaten werden in drei Dateitypen gespeichert: .lmd, .bxr3, .txt. Laden Sie die Textdatei mit der Bezeichnung .txt zur Analyse in das R-Programm. Führen Sie die folgenden Schritte in R19 aus.
- Verwenden Sie das Paket tidyverse20 als Framework für die Analyse.
- Mit der ggplot-Funktion (in tidyverse enthalten) werden die LPS-Daten mit den TOF-Werten als x-Achse und den EXT-Werten als y-Achse dargestellt. Ein normales Diagramm zeigt zwei Wolken von Punkten. Stellen Sie sicher, dass sich eines in der Nähe des Ursprungs und der x-Achse befindet, was kleinere Partikel wie Larven und kleine Trümmer anzeigt, und die zweite Gruppe von Partikeln befindet sich oben rechts im Diagramm und stellt erwachsene Nematoden dar.
- Wählen Sie anhand dieser Gruppierung geeignete TOF- und EXT-Cutoff-Werte aus. Das Gating kann je nach C. elegans-Stämmen auf verschiedenen Mikroben variieren, basierend auf Veränderungen in der Physiologie (z. B. dunkle vs . klare Tiere oder Änderungen in der Eibeförderung können die EXT-Koeffizienten verändern).
- Verwenden Sie die Funktionsteilmenge, um adulte Tiere und Larven durch TOF- und EXT-Gating zu trennen. Verwenden Sie im folgenden Beispiel die Einstellungen TOF > 1.200 und EXT > 1.000, um das Tor für erwachsene Tiere zu öffnen.
- Analysieren Sie die resultierenden Datensätze auf statistische Unterschiede. Verwenden Sie die t-test-Funktion in R für dieses Experiment.
- Um den Einfluss des Mikrobioms auf die Größe und optische Dichte von C. elegans zu bestimmen, vergleichen Sie die TOF- bzw. EXT-Werte zwischen den Bedingungen. TOF ist ein Indikator für die Wurmgröße und kann Veränderungen in den Wachstumsraten der Tiere zu bestimmten Zeitpunkten anzeigen. EXT-Veränderungen sind aufgrund des von den Eiern gestreuten Lichts zwischen dem Ende der Entwicklung und dem Erwachsenenalter am größten und können verwendet werden, um Veränderungen im Zeitpunkt dieses Übergangs und der Fruchtbarkeit zu beurteilen. Beurteilen Sie den Anteil und die Verteilung der Nachkommen, wenn sie während der Analysen beibehalten wurden.
- Um Veränderungen in der Darmmikrobiom-Kolonisierung zu bestimmen, normalisieren Sie zunächst die Fluoreszenzwerte (z. B. rote oder grüne Säulen), indem Sie mit individuellen TOF-Werten für jedes Tier dividieren. Wenn Würmer größer werden und erwachsen werden, wird auch das Volumen ihres Darms größer. Die Normalisierung trägt dazu bei, Artefakte zu reduzieren, die sich aus Unterschieden in der Größenverteilung der Stichprobentiere ergeben. Verwenden Sie normalisierte Tiere, um Veränderungen in der Darmmikrobiom-Kolonisierung unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen.
HINWEIS: Ein Rohdatenbeispiel und entsprechende R-Skripte finden Sie in der JOVE_worm_microbiome.txt Ergänzungsdatei 1 und der Zusatzdatei 2 JOVE_worm_microbiome.r. In Abbildung 2 und Abbildung 3 finden Sie ein repräsentatives Beispiel für diese Analysen des Wirts und des Mikrobioms mit zwei fluoreszierenden Bakterien.
6. Sortierung von C. elegans-Tieren nach Darmmikrobiommerkmalen
- Sammeln Sie eine C. elegans-Population , die auf fluoreszenzmarkierten Mikroben gezüchtet wurde (z. B. RFP), wie in Schritt 3 beschrieben. Die Würmer sollten in konische 50-ml-Röhrchen mit mindestens 5 ml Probe gegeben werden. Streben Sie etwa 2.000 Würmer/ml an, einschließlich aller erwachsenen Tiere und Nachkommen.
HINWEIS: Dies kann auch in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden mit dem LP-Sampler erfolgen. Halten Sie die Wurmdichte bei 50–100 pro Well.- Wenn der LP-Sampler verwendet wurde, schalten Sie den LP-Sampler aus und trennen Sie ihn. Schließen Sie die Proben- und Spülleitungen vor dem Sortieren wieder an das LPS an.
- Öffnen Sie die LPS-Software, gehen Sie zu Datei > neues Experiment und dann zu Datei > neuen Beispiel. Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit TOF auf der x-Achse und Extinktion auf der y-Achse. Erstellen Sie ein weiteres Punktdiagramm mit TOF auf der x-Achse und Rot auf der y-Achse. Verwenden Sie den gleichen Achsenmaßstab und die gleichen Lasereinstellungen wie zuvor. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Laser aktivieren, um 488-nm- und 561-nm-Laser einzuschalten
HINWEIS: Wenn diese Diagramme zuvor erstellt wurden, wechseln Sie zu Datei > Experiment öffnen und Datei > Beispiel öffnen, um Diagramme zu laden.- Setzen Sie das Kontrollprobenröhrchen auf den Probenanschluss. Klicken Sie im Dialogfeld "Erwerben/Ausgeben" auf " Erwerben". Speichern Sie die Datei, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Nachdem genügend Würmer gemessen wurden, um Populationen zu unterscheiden, klicken Sie auf Abbrechen.
HINWEIS: Die Durchflussraten sollten ca. 15–30 Ereignisse/s betragen. Ist dies nicht der Fall, passen Sie die Wurmkonzentrationen an, um sicherzustellen, dass einzelne Tiere pro Tröpfchen analysiert oder sortiert werden. Bei LPS durchlaufen die Schnecken die Bahn des Lasers in verschiedenen Positionen (gerade oder gekrümmt oder gebogen). Sie können je nach Position unterschiedlich lange brauchen, um den Laser und den Detektor zu passieren. - Zeichnen Sie im Punktdiagramm TOF vs. Extinction ein Tor um die erwachsene Population. Im TOF-vs-Rotpunkt-Diagramm zeichnen Sie Tore um die Bereiche mit hohen und niedrigen Rotwerten als Interessensgebiete für erwachsene Würmer mit unterschiedlichem Grad der Mikrobiom-Besiedlung. Wechseln Sie zu Ansicht > Gating-Hierarchie und stellen Sie sicher, dass die fluoreszierenden Gatter unter dem Adult-Population-Gate aufgeführt sind. Nachdem die Einstellungen optimiert wurden, wechseln Sie zu Datei > Experiment speichern und Beispiel > Datei speichern.
HINWEIS: Wählen Sie im folgenden Beispiel Tiere auf der Grundlage von TOF/EXT-Gattern für Erwachsene aus und sortieren Sie sie in Pools, die entweder eine hohe oder niedrige Besiedlung mit rot fluoreszierenden proteinexprimierenden Bakterien aufweisen. Jede Kombination von Parametern, die vom LPS gemessen werden, kann jedoch verwendet werden, um die interessierende(n) Grundgesamtheit(en) zu identifizieren.
- Setzen Sie das Kontrollprobenröhrchen auf den Probenanschluss. Klicken Sie im Dialogfeld "Erwerben/Ausgeben" auf " Erwerben". Speichern Sie die Datei, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Nachdem genügend Würmer gemessen wurden, um Populationen zu unterscheiden, klicken Sie auf Abbrechen.
- Vergewissern Sie sich vor der Sortierung, dass das entsprechende Sammelgerät geladen wurde. Um die 96-Well-Platte in das Entnahmegerät zu laden, wählen Sie im Dialogfeld "Erfassen/Ausgeben" im Abschnitt "Move Stage" die Option Load Plate A > Move aus, damit die Collection Stage in eine Position bewegt werden kann, die für das Laden einer 96-Well-Platte vorbereitet ist.
- Wählen Sie für die Massensortierung die entsprechende Röhrchengröße aus und klicken Sie auf Verschieben , um entweder ein konisches 15-ml- oder ein 50-ml-Röhrchen zu laden. Wählen Sie im Abschnitt Sortierung des Dialogfelds Erwerben/Ausgeben das Sortiergatter aus der Dropdown-Liste der erstellten Regionen aus. Geben Sie die Anzahl der Objekte aus dem definierten Bereich ein, die in ein Sammelröhrchen direkt unter der Durchflusszellendüse abgegeben werden sollen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Massensortierung im Dialogfeld Erwerben/Ausgeben.
- Um auf eine 96-Well-Platte zu dosieren, gehen Sie zu Einrichten > Platten > kalibrierte Platten > 96-Well-Platte. Gehen Sie dann zu Ansicht > Plattenvorlage, wählen Sie die Wells aus, in die die Würmer sortiert werden sollen, geben Sie die Anzahl der Objekte ein, die in jede Wells sortiert werden sollen, und wählen Sie die gewünschten Bereiche aus. Wenn mehr als ein abgegrenzter Bereich in dieselbe Platte einsortiert werden soll, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Gate Each Well. Klicken Sie auf OK, um die Änderungen zu speichern.
- Nachdem Sortiernummern und Positionen zugewiesen wurden, klicken Sie im Dialogfeld "Erfassen/Ausgeben" auf die Schaltflächen " Platte füllen ", um die Dosierung auf eine 96-Well-Platte zu starten.
- Bevor Sie die gesamte 96-Well-Platte füllen, führen Sie eine Testsortierung einer Untergruppe von Tieren oder Kontrollen in eine 96-Well-Platte durch und analysieren Sie sie mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass die richtige Anzahl und die gewünschten Tierpopulationen sortiert wurden. Sobald die genaue Sortierung bestätigt ist, wiederholen Sie die Schritte 6.3-6.6 für experimentelle Proben. Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten speichern im oberen Menüband des LPS-Softwarefensters, um die Daten erneut zu speichern .
HINWEIS: Alle Messungen (EXT, TOF, RFP, GFP usw.) können auch für sortierte Tiere gesammelt und mit denen verglichen werden, die nicht sortiert wurden. Auf diese Weise können Analyse- und Sortiermodi auf Wunsch gleichzeitig ausgeführt werden.
- Bevor Sie die gesamte 96-Well-Platte füllen, führen Sie eine Testsortierung einer Untergruppe von Tieren oder Kontrollen in eine 96-Well-Platte durch und analysieren Sie sie mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass die richtige Anzahl und die gewünschten Tierpopulationen sortiert wurden. Sobald die genaue Sortierung bestätigt ist, wiederholen Sie die Schritte 6.3-6.6 für experimentelle Proben. Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten speichern im oberen Menüband des LPS-Softwarefensters, um die Daten erneut zu speichern .
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Representative Results
Definition von adulten und larvenartigen Populationstore
Hier wurden synchronisierte C. elegans L1s auf einer NGM-Platte gezüchtet, die mit E. coli OP50 (Eco), einer Standard-Labordiät, ausgesät war. C. elegans-Populationen wurden für die LPS-Analyse nach 96 h oder 120 h Wachstum bei 20 °C gesammelt (Abbildung 2A). Ein Punktdiagramm der Extinktion (EXT, ein Proxy für die Körperdichte) im Vergleich zur Flugzeit (TOF, ein Proxy für die Körperlänge) erzeugt zwei visuell getrennte Wolken von Tieren. Jeder Punkt steht für ein einzelnes Tier, bei dem bei erwachsenen Tieren höhere EXT- und TOF-Werte beobachtet werden als bei Larven (Abbildung 2B). Diese beiden Parameter sind wertvolle Rückschlüsse auf das Bevölkerungswachstum und die Physiologie. Zum Beispiel kann ein Dichtediagramm der Larven-TOF die Verteilung der Larvenstadien visualisieren. Nachkommen von 2 Tage alten Erwachsenen wurden von L1- und L2-Stadien mit einem TOF unter 200 dominiert, während die meisten Nachkommen von 3 Tage alten Erwachsenen L3- und L4-Stadien erreichten (Abbildung 2C). Darüber hinaus sind 2D-Dichte- und Box-Whisker-Diagramme nützlich, um Veränderungen der Körpergröße und -dichte von Erwachsenen zu visualisieren, da die Werte von TOF und EXT an Tag 3 im Vergleich zu Tag 2 ansteigen, wenn sie auf E. coli gezüchtet werden (Abbildung 2D-F). Diese Beziehung ist im Erwachsenenalter typischerweise linear, aber einige Veränderungen in der Physiologie können sich auf ein Merkmal stärker auswirken als auf ein anderes (z. B. können Erwachsene ohne Eizellen niedrigere EXT-Werte haben, ohne die TOF zu beeinflussen).
Profilierung der Zusammensetzung des Darmmikrobioms anhand von fluoreszenzmarkierten Mikroben
Um die verschiedenen Stufen der Besiedlung zu veranschaulichen, vergleichen wir einen dominanten Kolonisator des natürlichen Mikrobioms von C. elegans, dTomato-markiertes Ochrobactrum BH3 (Och) und grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markiertes E. coli OP50. Diese beiden wurden einzeln und in einer gleichmäßigen Mischung basierend auf OD (1:1 Mix) auf der NGM-Platte ausgesät. Synchronisierte C. elegans-L1 wurden unter den drei Bedingungen gezüchtet und nach 120 h gesammelt, um die Kolonisierungsdynamik bei 3 Tage alten Erwachsenen zu untersuchen (Abbildung 3A). 2D-Dichte- und Box-Whisker-Diagramme zeigten, dass es Unterschiede in den adulten TOF- und EXT-Werten gibt, wenn C. elegans auf Ochrobactrum BH3 und Mischkulturen gezüchtet wird (Abbildung 3B-E). Die Darmbesiedlung mit Bakterien lässt sich anhand des in den einzelnen Nematoden nachgewiesenen Fluoreszenzniveaus ablesen. Box-Whisker-Plots rot fluoreszierender Messwerte zeigen eine erhöhte Ochrobactrum BH3-Kolonisierung unter der Mischungsbedingung als in Ochrobactrum BH3 allein. Im Gegensatz dazu deuten grün-fluoreszierende Werte auf eine geringere OP50-Besiedlung in der Mischungsbedingung hin als in OP50 allein. Ähnliche Trends werden bei TOF-normalisierten Fluoreszenzsignalen beobachtet, wodurch der Effekt der Körpergröße beseitigt und die Variation innerhalb der Population reduziert wird (Abbildung 3F-I). Für ein definiertes Mikrobiom mit mehreren fluoreszenzmarkierten Mikroben kann ein Punktdiagramm die Besiedlungsmuster für diese Mikroben veranschaulichen. Zum Beispiel zeigt ein Punktdiagramm des rot fluoreszierenden Proteins (RFP) im Vergleich zu GFP-Kanälen, dass die Würmer stark in Richtung der y-Achse (RFP) verzerrt sind, was darauf hindeutet, dass die OP50-Kolonisierung bei den meisten Würmern gering ist, während die Besiedlung mit Ochrobactrum BH3 gleichmäßig in der Population verteilt ist (Abbildung 3J). In ähnlicher Weise kann ein Punktdiagramm von RFP versus EXT die Beziehung zwischen dem Besiedlungsgrad von Ochrobactrum BH3 und der Wirtsentwicklung, wie z. B. der Körperdichte, aufzeigen (Abbildung 3K). Darüber hinaus können die Unterschiede in den Fortpflanzungsmustern beobachtet werden, indem das Dichtediagramm der jeweiligen Larvenpopulation unter den drei Bedingungen aufgetragen wird (Abbildung 3L).
Anreicherung für Zielpopulationen basierend auf der Besiedlung des Mikrobioms
Die 3 Tage alten erwachsenen Tiere, die auf dem zweiköpfigen Mix-Mikrobiom gezüchtet wurden, weisen ein breites Spektrum an RFP-Intensität auf, was auf individuelle Variationen in der Ochrobactrum BH3-Kolonisierung innerhalb der Gruppe hindeutet (Abbildung 4A). Um diese Untergruppen weiter zu trennen, wurden Sortiertore für hohe und niedrige RFP manuell gezeichnet, um 15 Personen aus jedem Gate in eine 96-Well-Platte zu sortieren, wie das RFP-Bild des gesamten Wells zeigt (Abbildung 4B). Unter höherer Vergrößerung bestätigen Überlagerungsbilder von hellen Feldern und RFP-Kanälen, dass die Sortiermethode Würmer mit hohem und niedrigem Ochrobactrum-BH3-Gehalt selektiert, was eine weitere Charakterisierung der phänotypischen Konsequenzen und molekularen Treiber ermöglicht (Abbildung 4C).
Abbildung 1: Ein Flussdiagramm für flussvermimetriebasierte Methoden zur Beurteilung des Darmmikrobioms und der Wirtsphysiologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Definition von adulten und Larvenpopulationen. (A) Ein Arbeitsablauf zur Erfassung von C. elegans-Populationen an Tag 2 und Tag 3 des Erwachsenenalters. (B) Punktdiagramm der Flugzeit (TOF) im Vergleich zum Aussterben (EXT) für C. elegans-Populationen an Tag 2 (grau) und Tag 3 (rot) des Erwachsenenalters. (C) Dichtediagramm der Larven TOF am Tag 2 und Tag 3 des Erwachsenenalters. (D-E) Punkt- und Box-and-Whisker-Diagramme von TOF versus EXT für Erwachsene an Tag 2 und Tag 3 des Erwachsenenalters. (F) Box-and-Whisker-Plot des Aussterbens von adulten Erwachsenen an Tag 2 und Tag 3 des Erwachsenenalters. Die p-Werte wurden mit dem t-Test der Studierenden berechnet (*** p < 0,001; Tag 2 n = 38; Tag 3 n = 88). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Profilierung der Darmmikrobiom-Kolonisierung mit fluoreszenzmarkierten Mikroben. (A) Sammlung von 3 Tage alten adulten Populationen, die auf Ochrobactrum BH3 gezüchtet wurden (dTomaten-exprimierend; Och), E. coli OP50 (GFP-exprimierend; Eco) oder eine 1:1-Mischung der beiden Bakterien (Mix). (B) Punktdiagramm von TOF im Vergleich zu EXT für Tag 3 erwachsene Tiere, die auf dem Mix angebaut wurden. (C-E) Punkt- und Box-and-Whisker-Parzellen von TOF im Vergleich zu EXT für 3 Tage alte Erwachsene, die auf Ochrobactrum BH3 angebaut wurden. Graue gestrichelte Linien zeigen den Mittelwert der mit OP50 gewachsenen Population an. (F-G) Box-and-Whisker-Plot mit rohen und TOF-normalisierten dTomato (RFP)-Werten für 3 Tage alte Erwachsene, die nur mit Mix und Ochrobactrum BH3 angebaut wurden. (H-I) Box-and-Whisker-Parzellen mit rohem und TOF-normalisiertem GFP für 3 Tage alte Erwachsene, die auf Mix und OP50 angebaut wurden. (J) Punktdiagramm von Ochrobactrum BH3 (RFP) im Vergleich zu E. coli OP50 (GFP) für 3 Tage alte erwachsene Tiere, die in der Mischung angebaut wurden. (K) Punktdiagramm von RFP versus EXT für 3 Tage alte erwachsene Tiere, die in der Mischung angebaut wurden. (L) Dichtediagramm von Larven von 3 Tage alten erwachsenen Tieren, die auf Mischung, Ochrobactrum BH3 und OP50 gezüchtet wurden. Alle p-Werte wurden aus dem t-Test des Studenten generiert (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.s., nicht signifikant; Mischung n = 230; Och n = 45). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Anreicherung von Zielpopulationen auf der Grundlage der Mikrobiom-Besiedlung . (A) Punktdiagramm von TOF versus RFP (Ochrobactrum BH3) für 3 Tage alte Erwachsene. Hohe (Red Box) und niedrige (Black Box) RFP-Gatter werden gezogen, um C. elegans mit hoher und niedriger Ochrobactrum BH3-Kolonisierung anzureichern. (B) Repräsentative RFP-Bilder (4x) der Wells mit 15 sortierten Würmern aus hohen und niedrigen RFP-Gates (Bar = 1 mm). (C) Repräsentative Bilder (10x) einzelner Würmer von hohen und niedrigen RFP-Gattern (Bar = 100 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1: Repräsentativer Datensatz, der von einem großen Partikelsortierer für N2-Populationen im Erwachsenenalter von Tag 2 und Tag 3 generiert wurde, die auf E. coli OP50 und Ochrobactrum BH3 gezüchtet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: Skripts, die bei der Analyse und Abbildungsgenerierung eines repräsentativen Datasets in der R-Umgebung verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Fließvermimetrie wurde in mehreren Studien verwendet, um die Gene und Signalwege von C. elegans gegen die Kolonisierung und Toxizität von Krankheitserregern zu charakterisieren21,22. Hier wird ein Hochdurchsatz-Ansatz vorgestellt, der C. elegans verwendet, um zu untersuchen, wie Darmmikrobiome ihre Wirtsphysiologie modulieren. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die koloniebildende Einheiten (KBE) oder 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung 9,16,17,23,24 verwenden, erfordert dieser Ansatz keine arbeitsintensive Zählung oder führt zu einer potenziellen PCR-Verzerrung. Neben der Messung von Mikrobiomen in einer ganzen Population ermöglicht dieser Ansatz die Visualisierung individueller Variationen innerhalb der Population. Dieser Ansatz ist nur durch die Verfügbarkeit der Expression fluoreszierender Proteine oder die Färbung von Mikroben und die Anzahl der Detektionskanäle im LPS begrenzt. Im Folgenden werden weitere Überlegungen zur Versuchsplanung erläutert, damit Benutzer einen benutzerdefinierten Arbeitsablauf basierend auf ihren Anforderungen erstellen können.
Überlegungen zur Schaffung und Aussaat eines definierten Mikrobioms
Zunächst wird jede Bakterienkultur auf einen OD600-Wert von 1 normalisiert, bevor verschiedene Stämme gemischt werden. Es ist erwähnenswert, dass die Ausgangsdichte je nach Komplexität der Gemeinschaft und den Beziehungen zwischen den Arten verschiedene Auswirkungen auf die etablierte Mikrobiomzusammensetzung haben kann23. Während die OD leicht mit Spektralphotometern gemessen werden kann, besteht eine Einschränkung darin, dass verschiedene Bakterien unterschiedliche Konzentrationen (z. B. die Anzahl der Zellen pro ml) für denselben OD-Wert aufweisen und entsprechend angepasst werden sollten. Zweitens sollte die Variation der Mikrobiomzusammensetzung in Rasenflächen berücksichtigt werden. Sobald das Mikrobiom auf der NGM-Platte (oder einem anderen Medium) ausgesät ist, kann das Mikrobiom über Nacht bei Raumtemperatur wachsen, bevor synchronisierte L1 C. elegans-Populationen auf die Platten fallen . Aufgrund von Variationen in den Wachstumsraten und Interaktionen zwischen den Arten zwischen Bakterienstämmen unterscheiden sich Mikrobiome, die auf NGM-Platten oder Platten mit Wachstumssubstraten gezüchtet werden, in ihrer Zusammensetzung von der ursprünglichen Samenmischung. Durch die Verwendung einer Pepton-freien NGM-Platte kann die ursprüngliche mikrobielle Gemeinschaft erhaltenbleiben 13. Aufgrund des begrenzten Mikrobiomwachstums auf der Pepton-freien Platte kann jedoch ein höherer Aussaat-OD oder eine reduzierte Anzahl synchronisierter L1s pro Platte erforderlich sein. Dadurch wird verhindert, dass die Bevölkerung verhungert, bevor sie das gewünschte Alter für den Test erreicht hat. Ein anderer Ansatz besteht darin, den Anteil der Mikroben im Rasen zu sequenzieren oder anderweitig zu bestimmen.
Messung der Besiedlung des Mikrobioms und der Physiologie von C. elegans
Erstens können die Schwellenwerte für die Extinktion (EXT) und die Flugzeit (TOF) für erwachsene Tiere je nach Alter, dem Hintergrund des C. elegans-Stammes und den Mikroben, auf denen sie gezüchtet werden, variieren. Eine 1 Tag alte erwachsene Population im Experiment für jede Wurm-/Bakterienerkrankung kann nützlich sein, um die TOF- und Extinktionsgrenzwerte zu bestimmen und die Variation aufgrund von Wachstumsmedien und Umgebung zu kontrollieren. Neben dem Gating für adulte Tiere können TOF und EXT auch als Gate für Larven eingesetzt werden, und ein Dichtediagramm der Nachkommen kann den Zeitpunkt und die Leistung der Fortpflanzung auf Populationsebene abschätzen (Abbildung 3L). Zweitens müssen die PMT-Verstärkungen und die Spannung am LPS angepasst werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren und den Signalbereich so einzustellen, dass eine Sättigung vermieden wird. Dies ist abhängig von der Fluoreszenzintensität der Bakterienstämme und deren Besiedlungsgrad. Die Standard-PMT bei 350 funktioniert gut für hohe Kolonisatoren wie Ochrobactrum BH3, aber Benutzer müssen möglicherweise die PMT- oder Spannungswerte für niedrige Kolonisatoren wie E. coli OP50 erhöhen. Drittens spiegeln die Fluoreszenzwerte aufgrund von Unterschieden in den Eigenschaften der Fluorophore und ihrer Expression in transgenen Bakterienstämmen nicht die absolute Anzahl der im Mikrobiom vorhandenen Bakterien wider. Daher können GFP- und RFP-Werte nicht verwendet werden, um die Kolonisierung zwischen zwei verschiedenen fluoreszierenden Mikroben direkt zu vergleichen. Das Aufbrechen und Plattieren von Tieren zur Identifizierung der Anzahl lebender Bakterien kann dazu beitragen, diese Beziehungen besser aufzulösen24.
Mögliche Anwendungen für Anreicherungsstrategien
Diese Methode bietet eine zugängliche Hochdurchsatzplattform, um die Auswirkungen von Mikrobiomveränderungen auf die Wirtsphysiologie auf Populationsebene zu untersuchen. Auf der mikrobiellen Seite wird die zunehmende Verfügbarkeit von Werkzeugen und Ressourcen zur Bearbeitung bakterieller Genome25,26,27 die Anzahl fluoreszierender und funktioneller mikrobieller Mutanten erhöhen, die mit dem natürlichen Mikrobiom von C. elegans in Verbindung stehen. Auf der Wirtsseite stehen zahlreiche fluoreszierende Reporter zur Verfügung, um den Zusammenhang zwischen Zellsignalen und der Zusammensetzung des Mikrobioms zu untersuchen. Die Fähigkeit, eine Wirtspopulation oder Mutante aus einer mutagenisierten Population (z. B. EMS-Vorwärtsmutagenese)28 oder gepoolten Wildstämmen29 mit spezifischen Mikrobiom-Kolonisierungsmerkmalen anzureichern, kann die Fähigkeit, Wirtsgene, die den Einfluss des Mikrobioms regulieren, zu verbinden, erheblich verbessern. Darüber hinaus kann die Auswahl von Populationen auf der Grundlage von Wirts- und/oder Mikrobiommerkmalen auch eine Reihe von Omics-basierten Profiling-Modalitäten erleichtern. Dieser Ansatz ist sehr flexibel und verspricht, das Verständnis der molekularen Mediatoren von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse DP2DK116645 (an B.S.S.), Dunn Foundation Pilot Award und NASA-Zuschuss 80NSSC22K0250 (an B.S.S.) unterstützt. Dieses Projekt wurde auch vom Cytometry and Cell Sorting Core am Baylor College of Medicine mit Mitteln aus dem CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), den NIH (S10 OD025251, CA125123 und RR024574) und der Unterstützung von Joel M. Sederstrom sowie einem Instrumentierungszuschuss für den LPS NIH-Zuschuss (S10 OD025251) unterstützt. Einige Stämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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