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Biology

Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64605
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,2
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans es un modelo poderoso para examinar los determinantes moleculares que impulsan las interacciones entre el huésped y el microbioma. Presentamos una línea de alto rendimiento que perfila los niveles de colonización del microbioma intestinal de un solo animal junto con aspectos clave de la fisiología de C. elegans.

Abstract

La composición del microbioma intestinal puede tener un impacto dramático en la fisiología del huésped a lo largo del desarrollo y la vida del animal. La medición de los cambios en la composición del microbioma es crucial para identificar las relaciones funcionales entre estos cambios fisiológicos. Caenorhabditis elegans ha surgido como un poderoso sistema huésped para examinar los impulsores moleculares de las interacciones huésped-microbioma. Con su plan corporal transparente y sus microbios naturales marcados con fluorescente, los niveles relativos de microbios dentro del microbioma intestinal de un animal individual de C. elegans se pueden cuantificar fácilmente utilizando un clasificador de partículas grandes. Aquí describimos los procedimientos para la configuración experimental de un microbioma, la recolección y el análisis de las poblaciones de C. elegans en la etapa de vida deseada, la operación y el mantenimiento del clasificador, y los análisis estadísticos de los conjuntos de datos resultantes. También discutimos las consideraciones para optimizar la configuración del clasificador en función de los microbios de interés, el desarrollo de estrategias efectivas de compuerta para las etapas de vida de C. elegans y cómo utilizar las capacidades del clasificador para enriquecer las poblaciones de animales en función de la composición del microbioma intestinal. Como parte del protocolo, se presentarán ejemplos de posibles aplicaciones, incluido el potencial de escalabilidad a aplicaciones de alto rendimiento.

Introduction

La evolución animal está sometida a una constante influencia microbiana1. A partir de diversos microbios en el medio ambiente, los huéspedes animales adquieren socios específicos2 que amplían las capacidades del huésped e impulsan su fisiología y susceptibilidad a las enfermedades3. Por ejemplo, los análisis metagenómicos del microbioma intestinal revelaron clases metabólicas enriquecidas de genes microbianos que pueden conferir una mayor recolección y almacenamiento de energía en ratones obesos4, muchos de los cuales también se encuentran en el microbioma intestinal humano5. Todavía existe una gran necesidad de establecer relaciones causales e identificar los determinantes moleculares del impacto del microbioma, aunque el progreso se ha visto obstaculizado por las complejidades del microbioma y la capacidad de tratamiento de los sistemas huéspedes para el cribado a gran escala.

El organismo modelo C. elegans proporciona una plataforma para avanzar en la comprensión molecular de los vínculos entre el microbioma y la fisiología del huésped. C. elegans posee 20 células intestinales con una capa mucosa y estructuras de vellosidades. Estas células están equipadas con abundantes genes quimiorreceptores que detectan productos microbianos y producen moléculas antimicrobianas que potencialmente regulan a sus colonizadores intestinales 6,7. Esta biología conservada de C. elegans ha dado lugar a un gran número de descubrimientos en la señalización del huésped que regula los microbios intestinales, incluida la señalización de la insulina, el TGF-beta y la quinasa MAP 8,9,10.

C. elegans utiliza microbios como su dieta para crecer durante el desarrollo y microbioma como adultos. Con la vejez, algunos microbios pueden acumularse en exceso en la luz intestinal y la relación huésped-microbio pasa de la simbiosis a la patogénesis11. En su hábitat natural, C. elegans se encuentra con una amplia gama de especies bacterianas12,13. La secuenciación del ADNr 16S a partir de muestras representativas recogidas en hábitats naturales (frutas podridas, tallos de plantas y vectores animales) reveló que el microbioma natural de C. elegans está dominado por cuatro filos bacterianos: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria. Dentro de estas divisiones se encuentra una gran variación en la diversidad y riqueza de bacterias con base en el hábitat12,13,14,15. Se han establecido varias comunidades definidas, incluidas las colecciones de 63 miembros (BIGbiome)16 y 12 miembros (CeMbio) que representan los principales géneros de microbiomas creados para la comunidad de investigación de C. elegans 17. Tanto los microbiomas como las cepas componentes pueden tener un impacto diverso en la fisiología de C. elegans, como el tamaño corporal, las tasas de crecimiento y las respuestas al estrés 9,16,17. Estos estudios proporcionan recursos y ejemplos para establecer a C. elegans como un modelo para la investigación del microbioma.

Aquí se presenta un flujo de trabajo basado en un clasificador de partículas grandes (LPS) (Figura 1) que utiliza el sistema C. elegans para medir simultáneamente la composición del microbioma y las medidas básicas de la fisiología del huésped a escala poblacional. Desde el punto de vista microbiano, el flujo de trabajo es adaptable para ensamblar un microbioma definido o microbios individuales para probar la robustez y plasticidad de la comunidad con interacciones microbianas cada vez mayores. Desde el lado del huésped, el flujo de trabajo permite realizar ensayos de alto rendimiento para medir los niveles de colonización de microbios fluorescentes en el microbioma y la lectura fisiológica del huésped en términos de desarrollo, tamaño corporal y reproducción. En conjunto, el modelo de microbioma de C. elegans permite que las pantallas de alto rendimiento identifiquen los determinantes metabólicos y genéticos que modulan la fisiología del huésped.

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Protocol

1. Preparación de la mezcla de microbioma

  1. Estampe o elimine las bacterias de un caldo de glicerol congelador en una placa de caldo de lisogenia (LB) o en un medio de cultivo apropiado, y crezca durante la noche a una temperatura óptima basada en las cepas bacterianas de interés (generalmente 25 ° C para los microbios naturales de C. elegans ).
  2. A partir de la placa LB, utilice una sola colonia de cada aislado bacteriano (p. ej., 12 bacterias de la colección CeMbio) para inocular 800 μL de medio LB en pocillos separados de una placa de pocillos profundos de 1 mL. Incubar durante la noche a la temperatura óptima con agitación a 250 rpm.
    NOTA: Este protocolo está optimizado para su uso con microbiomas naturales definidos (por ejemplo, CeMbio), pero se puede ajustar fácilmente para microbios individuales mediante el crecimiento en condiciones apropiadas u otros recipientes de cultivo (tubos).
  3. Evalúe el crecimiento de cada microbio mediante espectrofotometría. Transfiera una alícuota de 20 μL a 80 μL de LB y agregue la solución a una placa transparente de fondo plano de 96 pocillos. Mida el diámetro exterior600 en un lector de placas.
  4. Después del crecimiento durante la noche, centrifugue la placa de cultivo de pocillos profundos a 4.000 x g durante 10 minutos para granular bacterias y elimine el sobrenadante por aspiración utilizando un colector de aspiración de 96 pocillos o una pipeta multicanal.
  5. Utilizando valores de DO 600, normalice la concentración de cada microbio a un DO final600 de 1,0 utilizando un medio M9 estéril.
  6. Si combina microbios, determine la cantidad de cultivo bacteriano necesario para el experimento y cree una mezcla maestra de microbioma combinando volúmenes iguales de cada cepa bacteriana en un tubo de tamaño suficiente (por ejemplo, tubos de 5 ml o 15 ml).
  7. Localice 30-50 μL de los microbios con un OD final600 de 1,0 en el centro de cada placa o pocillo18 que contenga agar del medio de crecimiento de nematodos (NGM). Deje que el microbioma sembrado crezca durante la noche a una temperatura óptima (25 °C aquí).
    NOTA: Prepare las placas de agar NGM con anticipación de acuerdo con las instrucciones del Wormbook o usando polvo de NGM premezclado18. Por ejemplo, se agregan 3 mL de NGM para placas de 12 pocillos y 1,5 mL para placas de 24 pocillos.

2. Preparación de C. elegans sincronizados para su crecimiento en el microbioma

  1. Cultive aproximadamente 100 gusanos en placas NGM (6 cm de diámetro) sembradas con Escherichia coli OP50, hasta que los gusanos alcancen la edad adulta grávida. Para los fines de este protocolo, se utilizó la cepa N2 de C. elegans , aunque el protocolo se puede adaptar fácilmente a otras cepas de nematodos.
  2. Agregue 6 ml de tampón M9 (más 0.01% de tritón X-100; M9-TX) a la placa, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para lavar aproximadamente 100 gusanos adultos grávidos en un tubo cónico de 15 ml.
  3. Prepare una solución de lejía recién hecha mezclando dos partes de lejía con una parte de 5 M de NaOH.
  4. Centrifugar las lombrices a 3.000 x g durante 30 s para pelletizar las lombrices. Aspire para bajar el volumen a 4 ml y luego agregue 2 ml de solución de lejía.
  5. Cierre bien la tapa y agite el tubo. Monitoree los gusanos adultos en la solución bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10x. Cuando los cuerpos adultos comienzan a separarse, generalmente después de 3,5 minutos, deje de temblar y centrifugue a 3.000 x g durante 30 s.
  6. Aspire a un volumen mínimo con una pipeta. Vuelva a suspender, centrifugar y aspirar cuatro veces en M9-TX para eliminar la lejía.
  7. Vuelva a suspender en 4-6 ml de M9-TX y coloque el tubo en un rotador durante la noche, permitiendo que los huevos eclosionen y se sincronicen en la etapa L1.
  8. Al día siguiente, tome 10 μL de gusanos L1 en M9-TX del tubo y colóquelos en una placa de Petri limpia. Cuente el número de gusanos L1 vivos bajo un microscopio estereoscópico con un aumento total de 20x.
  9. En función de la densidad L1, pipetear el volumen adecuado para dejar caer ~50 larvas L1 sincronizadas en el borde de las placas NGM sembradas con microbioma e incubar a 20 °C. Deje que los gusanos crezcan hasta la edad deseada (Día 2 o Día 3 de la edad adulta).

3. Recolección de la población de lombrices para el análisis del microbioma intestinal

  1. Lave las lombrices del césped bacteriano con 1-2 ml de M9-TX en una placa esterilizada de 2 ml de 96 pocillos de profundidad.
    NOTA: Para cepas microbianas que crean biopelículas significativas, agite el plato con líquido durante 5 minutos para romper los desechos microbianos.
  2. Centrifugar la placa de pocillos profundos a 300 x g durante 1 minuto para granular los gusanos y luego eliminar el líquido con un colector de aspiración.
    NOTA: Los usuarios pueden utilizar una pipeta multicanal para extraer manualmente el líquido si no se dispone de un colector de aspiración. Asegúrese de que las puntas de las pipetas no toquen el fondo de los pocillos para evitar la pérdida de muestras de gusanos.
  3. Agregue 1,8 ml de M9-TX a cada pocillo de la placa de pocillos profundos con una pipeta multicanal de 1,2 ml. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo un par de veces, y centrifugar a 300 x g durante 1 min. Repita este paso cuatro veces para eliminar las bacterias en el líquido.
  4. Después del lavado final, lleve el volumen de cada pocillo a 100 μL utilizando el colector de aspiración.
    NOTA: Para separar a los adultos de las larvas usando la gravedad, deje la placa en el banco durante 30-60 s, permitiendo que los gusanos adultos se hundan hasta el fondo del pozo. Luego, aspire la placa para eliminar las larvas de la suspensión.
  5. Agregue 100 μL de 10 mM de levamisol en M9-TX a cada pocillo y deje que las lombrices se paralicen durante 5 min. Después del tratamiento con levamisol, agregue un 4% de la solución de lejía descrita en el paso 2.3 a cada pocillo durante 2 minutos para reducir los grumos bacterianos, si es necesario. Lavar con M9-TX dos veces después del tratamiento con lejía y aspirar hasta un volumen final de 100 μL después del segundo lavado.
  6. Transfiera los gusanos a una placa de fondo plano de 96 pocillos que contenga 150 μL de levamisol de 10 mM en M9-TX. Mantenga la densidad de lombrices entre 50 y 100 por pocillo y divida las lombrices en varios pozos si la población está demasiado abarrotada.

4. Configuración del clasificador de partículas grandes y el muestreador automático

  1. Encienda el compresor de aire, la computadora y el instrumento LPS. Revise y vacíe el depósito de residuos. Luego, agregue 500 ml de lejía al tanque de desechos vacío. Revise y rellene la funda y los tanques de agua si el volumen es bajo. Asegúrese de que el conjunto de núcleo óptico y fluídico (FOCA) de 250 μm esté en su lugar.
  2. Ejecute las partículas de control para el control de calidad. Abra el software del instrumento LPS. En la ventana del software, marque Habilitar láseres para activar los láseres de 488 nm y 561 nm.
    NOTA: Es posible omitir los pasos 4.2-4.5 si las partículas de control se han ejecutado dentro de las 2 semanas anteriores y FOCA no se ha cambiado en ese tiempo.
  3. Seleccione Configurar > Controlar partículas. Seleccione No en el mensaje para ir a la configuración predeterminada. Agite las partículas de control (partículas de control de 10 ml de h,2de O y 10 ml en un tubo cónico de 50 ml) antes de cada uso y cárguelas en el puerto de muestra.
  4. Cuando esté listo, haga clic en Adquirir para registrar 500 eventos. Asegúrese de que la tasa de eventos se lea entre 15 y 30 eventos/s.
    NOTA: Si la tasa de eventos no es de 15 a 30 eventos/s, se debe contactar a un ingeniero para ajustar la configuración de la máquina.
  5. Examine el coeficiente de variación (CV) para todos los parámetros. Si CV < 15%, se pasa el control de calidad y se puede cerrar el software LPS. Si CV > 15%, vuelva a ejecutar y ajuste los micrómetros con partículas de control recién hechas para alinear el láser con la celda de flujo.
  6. Conecte y encienda el muestreador automático. Abra el software del instrumento del muestreador automático. Esto abre el muestreador automático y el software LPS. En la ventana del software LPS, vaya a Archivo > nuevo experimento y, a continuación, a Archivo > nueva muestra. Marque Habilitar láseres para encender láseres de 488 nm y 561 nm si aún no se ha hecho.
  7. Cree plantillas para diagramas de puntos de adquisición utilizando el tiempo de vuelo (TOF), la extinción (EXT) y los canales fluorescentes en la ventana del software LPS. Un buen número máximo inicial para capturar todos los gusanos es 8.000 para TOF y EXT. Las escalas de fluorescencia variarán en función de cada microbio. Incluya muestras de gusanos de control cultivadas en microbios no fluorescentes (por ejemplo, OP50) y cada microbio fluorescente solo (si se mezclan microbios) como controles con cada experimento.
    1. Haga clic con el botón derecho en el cuerpo de un gráfico para modificar la escala. Utilice animales de control, como adultos del día 1 o L1 sincronizados (o población de interés) para ayudar con la selección de la compuerta TOF y EXT.
  8. En la ventana del muestreador automático, seleccione Prime. Vaya a Archivo > Abrir script para seleccionar el script integrado correcto y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    1. Solo para el análisis, seleccione el script con Adquirir. Para ordenar, seleccione el script con Dispensar. Para la adquisición de placas de 96 pocillos, seleccione el script con 96 pocillos; Para la adquisición de placas de 384 pocillos, seleccione el script con 384 pocillos. Para el volumen de muestra (40 o 100 μL), seleccione el script con el volumen correspondiente.
  9. Vaya a Plantilla de placa en el menú del software de muestreo automático para seleccionar los pocillos deseados para el análisis. Cargue las muestras de control. Después de que la placa esté cargada en la platina del muestreador automático y asegurada, presione Run Plate en la ventana del muestreador automático. Guarde el archivo cuando se le solicite.
    NOTA: Las muestras de control y los ajustes se pueden realizar con un tubo cónico de 50 ml en el puerto de muestra LPS antes de conectar el muestreador LP.
  10. Cuando finalice la adquisición, haga clic en el botón Almacenar datos en la cinta superior de la ventana del software LPS y guarde los datos nuevamente.

5. Análisis de las características de C. elegans y los niveles del microbioma intestinal por animal

  1. Los datos sin procesar se almacenan en tres tipos de archivos: .lmd, .bxr3, .txt. Cargue el archivo de texto con la etiqueta archivo .txt en el programa R para su análisis. Complete los pasos a continuación en R19.
  2. Utilice el paquete tidyverse20 como marco para el análisis.
  3. Usando la función ggplot (incluida en tidyverse) trace los datos LPS usando los valores TOF como eje x y los valores EXT como eje y. Un gráfico normal mostrará dos nubes de puntos. Asegúrese de que uno esté cerca del origen y del eje x, lo que indica partículas más pequeñas, como larvas y desechos pequeños, y que el segundo grupo de partículas esté hacia la parte superior derecha de la gráfica y represente nematodos adultos.
  4. Utilizando esta agrupación como guía, elija los valores de corte TOF y EXT adecuados. La activación puede variar según las cepas de C. elegans en diferentes microbios en función de los cambios en la fisiología (p. ej., los animales oscuros frente a los claros o los cambios en el transporte de huevos pueden alterar los coeficientes EXT).
  5. Utilice el subconjunto de funciones para separar adultos y larvas mediante la compuerta TOF y EXT. En el ejemplo que se muestra aquí, utilice los ajustes TOF > 1.200 y EXT > 1.000 para controlar los animales adultos.
  6. Analice los conjuntos de datos resultantes en busca de diferencias estadísticas; use la función de prueba t en R para este experimento.
    1. Para determinar el impacto del microbioma en el tamaño y la densidad óptica de C. elegans, compare los valores de TOF y EXT, respectivamente, entre las condiciones. TOF es un indicador del tamaño del gusano y puede indicar cambios en las tasas de crecimiento de los animales en momentos específicos. Los cambios en la EXT son mayores entre el final del desarrollo y la edad adulta debido a la luz dispersada por los huevos y se pueden utilizar para evaluar los cambios en el momento de esa transición y la fecundidad. Evaluar la proporción y distribución de la progenie si se conservaron durante los análisis.
    2. Para determinar los cambios en los niveles de colonización del microbioma intestinal, primero normalice los valores de fluorescencia (por ejemplo, columnas rojas o verdes) dividiéndolos con valores de TOF individuales para cada animal. A medida que los gusanos crecen en tamaño y se convierten en adultos, el volumen de su intestino también aumenta. La normalización ayuda a reducir los artefactos de las diferencias en las distribuciones de tamaño de los animales de muestra. Utilice animales normalizados para evaluar los cambios en la colonización del microbioma intestinal en todas las afecciones.
      NOTA: Se puede encontrar un ejemplo de datos sin procesar y los scripts de R correspondientes en el Archivo Suplementario 1 JOVE_worm_microbiome.txt y el Archivo Suplementario 2 JOVE_worm_microbiome.r. Consulte la Figura 2 y la Figura 3 para ver un ejemplo representativo de estos análisis del huésped y el microbioma utilizando dos bacterias fluorescentes.

6. Clasificación de los animales de C. elegans según las características del microbioma intestinal

  1. Recolecte una población de C. elegans cultivada en microbios marcados con fluorescencia (p. ej., RFP) como se describe en el Paso 3. Los gusanos deben colocarse en tubos cónicos de 50 ml con un mínimo de 5 ml de muestra. Apunte a aproximadamente 2,000 lombrices/mL, incluidos todos los adultos y crías.
    NOTA: Esto también se puede hacer en una placa de fondo plano de 96 pocillos utilizando el muestreador LP. Mantenga la densidad de gusanos entre 50 y 100 por pocillo.
    1. Si se ha utilizado un sampler LP, apague y desconecte el sampler LP. Vuelva a conectar las líneas de muestra y purga al LPS antes de clasificar.
  2. Abra el software LPS, vaya a Archivo > nuevo experimento y luego a Archivo > nueva muestra. Cree un diagrama de puntos con TOF en el eje x y Extinción en el eje y. Cree otro diagrama de puntos con TOF en el eje x y rojo en el eje y. Utilice la misma escala de eje y la misma configuración de láser que se utilizó anteriormente. Marque Habilitar láseres para activar láseres de 488 nm y 561 nm
    NOTA: Si estos gráficos se han creado previamente, vaya a Archivo > Abrir experimento y Archivo > Abrir muestra para cargar gráficos.
    1. Coloque el tubo de muestra de control en el puerto de muestra. En el cuadro de diálogo Adquirir/Dispensar, haga clic en Adquirir. Guarde el archivo cuando se le solicite. Una vez que se hayan medido suficientes gusanos para distinguir las poblaciones, haga clic en Abortar.
      NOTA: Los caudales deben ser de aproximadamente 15 a 30 eventos/s. De lo contrario, ajuste las concentraciones de gusanos para asegurarse de que los animales individuales se analicen o clasifiquen por gota. En LPS, los gusanos pasan a través de la trayectoria del láser en diferentes posiciones (recto versus rizado o doblado). Pueden tardar una cantidad diferente de tiempo en pasar el láser y el detector dependiendo de sus posiciones.
    2. En el diagrama de puntos TOF vs Extinción, dibuja una puerta alrededor de la población adulta. En el diagrama TOF vs Red dot, dibuje puertas alrededor de las áreas con valores rojos altos y bajos como regiones de interés para los gusanos adultos con diferentes niveles de colonización del microbioma. Vaya a Ver jerarquía de compuertas > y asegúrese de que las puertas fluorescentes aparezcan en la puerta de población adulta. Una vez optimizada la configuración, vaya a Archivo > Guardar experimento y Archivo > Guardar muestra.
      NOTA: En el ejemplo que se muestra aquí, seleccione los animales en función de las puertas TOF/EXT para adultos y clasifíquelos en grupos que exhiban una colonización alta o baja con bacterias fluorescentes rojas que expresan proteínas. Sin embargo, cualquier combinación de parámetros medidos por el LPS puede utilizarse para identificar la(s) población(es) de interés.
  3. Antes de clasificar, asegúrese de que se haya cargado el aparato de recolección adecuado. Para cargar la placa de 96 pocillos en el aparato de recolección, seleccione Cargar placa A > Mover en la sección Mover etapa en el cuadro de diálogo Adquirir/Dispensar para permitir que la etapa de recolección se mueva a una posición preparada para cargar una placa de 96 pocillos.
  4. Para la clasificación a granel, seleccione el tamaño de tubo adecuado y haga clic en Mover para cargar un tubo cónico de 15 ml o 50 ml. En la sección Ordenación del cuadro de diálogo Adquirir/Dispensar, elija la puerta de ordenación en la lista desplegable de las regiones creadas. Introduzca el número de objetos de la región definida para dispensar a un tubo colector directamente debajo de la boquilla de la celda de flujo. Haga clic en el botón Clasificación masiva en el cuadro de diálogo Adquirir/Dispensar.
  5. Para dispensar a una placa de 96 pocillos, vaya a Configuración > placas > Placas calibradas > placa de 96 pocillos. A continuación, vaya a Ver plantilla de placa >, seleccione los pozos en los que se ordenarán los gusanos, introduzca el número de objetos que se clasificarán en cada pozo y seleccione las regiones cerradas de interés. Si se va a clasificar más de una región cerrada en la misma placa, marque la casilla Cerrar cada pozo. Haga clic en Aceptar para guardar los cambios.
  6. Una vez asignados los números de clasificación y las ubicaciones, haga clic en los botones Placa de llenado del cuadro de diálogo Adquirir/Dispensar para iniciar la dispensación a una placa de 96 pocillos.
    1. Antes de llenar toda la placa de 96 pocillos, realice una clasificación de prueba de un subconjunto de animales o controles en una placa de 96 pocillos y analice con un microscopio estereoscópico para asegurarse de que se hayan clasificado los números apropiados y las poblaciones de animales deseadas. Una vez que se haya confirmado la precisión de la clasificación, repita los pasos 6.3-6.6 para las muestras experimentales. Haga clic en el botón Almacenar datos en la cinta superior de la ventana del software LPS para volver a guardar los datos .
      NOTA: Todas las mediciones (EXT, TOF, RFP, GFP, etc.) también se pueden recopilar para los animales clasificados y compararlos con los que no se clasificaron. Esto puede permitir que los modos de análisis y clasificación se ejecuten al mismo tiempo si se desea.

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Representative Results

Definición de las puertas de la población de adultos y larvas
Aquí, las L1 sincronizadas de C. elegans se cultivaron en una placa NGM sembrada con E. coli OP50 (Eco), una dieta estándar de laboratorio. Las poblaciones de C. elegans se colectaron para el análisis de LPS después de 96 h o 120 h de crecimiento a 20 °C (Figura 2A). Un diagrama de puntos de extinción (EXT, un indicador de la densidad corporal) frente al tiempo de vuelo (TOF, un indicador de la longitud del cuerpo) crea dos nubes de animales separadas visualmente. Cada punto representa un solo animal en el que se observan valores más altos de EXT y TOF en los adultos en comparación con las larvas (Figura 2B). Estos dos parámetros son inferencias valiosas para el crecimiento y la fisiología de la población. Por ejemplo, un gráfico de densidad de larvas TOF puede visualizar la distribución de los estadios larvarios. Las progenies de adultos de 2 días de edad estuvieron dominadas por los estadios L1 y L2 con un TOF inferior a 200, mientras que la mayoría de las progenies de adultos de 3 días alcanzaron los estadios L3 y L4 (Figura 2C). Además, los diagramas de densidad 2D y de bigotes de caja son útiles para visualizar los cambios en el tamaño y la densidad corporal de los adultos, ya que los valores de TOF y EXT aumentan en el día 3 en comparación con el día 2 cuando se cultiva en E. coli (Figura 2D-F). Esta relación suele ser lineal durante la edad adulta, pero algunos cambios en la fisiología pueden afectar una característica más que otra (p. ej., los adultos sin huevos pueden tener valores de EXT más bajos sin afectar el TOF).

Elaboración de perfiles de la composición del microbioma intestinal utilizando microbios marcados con fluorescencia
Con el fin de ilustrar los diferentes niveles de colonización, comparamos un colonizador dominante del microbioma natural de C. elegans marcado con tomate Ochrobactrum BH3 (Och) y E. coli OP50 marcada con proteína verde fluorescente (GFP). Estos dos se sembraron individualmente y en una mezcla igual basada en OD (mezcla 1:1) en la placa NGM. Los L1 sincronizados de C. elegans se cultivaron en las tres condiciones y se recolectaron a las 120 h para examinar la dinámica de colonización en adultos de 3 días de edad (Figura 3A). Los diagramas de densidad 2D y de bigotes de caja mostraron que existen diferencias en los valores de TOF y EXT adultos cuando C. elegans se cultiva en Ochrobactrum BH3 y cultivos mixtos (Figura 3B-E). La colonización intestinal de las bacterias se puede inferir por el nivel de fluorescencia detectado en los nematodos individuales. Los diagramas de bigotes de caja de las lecturas fluorescentes rojas muestran un aumento de la colonización de Ochrobactrum BH3 en la condición de mezcla que en Ochrobactrum BH3 solo. Por el contrario, los valores de verde fluorescente indican una menor colonización de OP50 en la condición de mezcla que en OP50 sola. Se observan tendencias similares en las señales fluorescentes normalizadas por TOF, lo que elimina el efecto del tamaño corporal y reduce la variación dentro de la población (Figura 3F-I). Para un microbioma definido con múltiples microbios marcados con fluorescencia, un diagrama de puntos puede ilustrar los patrones de colonización de estos microbios. Por ejemplo, en el microbioma mixto de dos miembros, un diagrama de puntos de la proteína fluorescente roja (RFP) frente a los canales GFP muestra que los gusanos están muy sesgados hacia el eje Y (RFP), lo que sugiere que la colonización de OP50 es baja en la mayoría de los gusanos, mientras que los niveles de colonización de Ochrobactrum BH3 se distribuyen uniformemente en la población (Figura 3J). De manera similar, un diagrama de puntos de RFP versus EXT puede revelar la relación entre los niveles de colonización de Ochrobactrum BH3 y el desarrollo del huésped, como la densidad corporal (Figura 3K). Además, las diferencias en los patrones de reproducción se pueden observar al trazar la gráfica de densidad de la población de larvas respectiva en las tres condiciones (Figura 3L).

Enriquecimiento para poblaciones objetivo basado en la colonización del microbioma
Los adultos de 3 días de edad cultivados en el microbioma mixto de dos miembros exhiben un amplio rango de intensidad de RFP, lo que indica variaciones individuales en la colonización de Ochrobactrum BH3 dentro del grupo (Figura 4A). Para separar aún más estos subgrupos, se dibujaron manualmente compuertas de clasificación para RFP alta y baja para clasificar 15 individuos de cada compuerta en una placa de 96 pocillos, como se muestra en la imagen de RFP de todo el pozo (Figura 4B). Con un aumento mayor, las imágenes superpuestas de campos brillantes y canales RFP confirman que el método de clasificación selecciona gusanos colonizados por Ochrobactrum BH3 altos y bajos, lo que permite una mayor caracterización de las consecuencias fenotípicas y los impulsores moleculares (Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo de los métodos basados en la vermimetría de flujo para evaluar el microbioma intestinal y la fisiología del huésped. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Definición de poblaciones adultas y larvarias. (A) Un flujo de trabajo para recolectar poblaciones de C. elegans en el día 2 y el día 3 de la edad adulta. (B) Diagrama de puntos del tiempo de vuelo (TOF) frente a la extinción (EXT) para las poblaciones de C. elegans en el día 2 (gris) y el día 3 (rojo) de la edad adulta. (C) Parcela de densidad de larvas TOF en el día 2 y día 3 de la edad adulta. (D-E) Diagramas de puntos y cajas y bigotes de TOF versus EXT para adultos en el día 2 y el día 3 de la edad adulta. (F) Diagrama de caja y bigotes de la extinción de adultos en el día 2 y el día 3 de la edad adulta. Los valores de p se calcularon con la prueba t de student (*** p < 0,001; Día 2 n = 38; Día 3 n = 88). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Perfil de la colonización del microbioma intestinal utilizando microbios marcados con fluorescente. (A) Colección de poblaciones adultas de 3 días de edad cultivadas en Ochrobactrum BH3 (que expresan dTomato; Och), E. coli OP50 (que expresa GFP; Eco) o una mezcla 1:1 de las dos bacterias (mezcla). (B) Diagrama de puntos de TOF versus EXT para adultos del día 3 cultivados en la mezcla. (C-E) Diagramas de puntos y cajas y bigotes de TOF versus EXT para adultos de 3 días de edad cultivados en Ochrobactrum BH3. Las líneas discontinuas grises indican el valor medio de la población cultivada en OP50. (F-G) Diagrama de caja y bigotes de los valores de dTomato crudo y normalizado por TOF (RFP) para adultos de 3 días de edad cultivados solo con Mix y Ochrobactrum BH3. (H-I) Diagramas de caja y bigotes de GFP cruda y normalizada por TOF para adultos de 3 días de edad cultivados en mezcla y OP50. (J) Diagrama de puntos de Ochrobactrum BH3 (RFP) versus E. coli OP50 (GFP) para adultos de 3 días de edad cultivados en mezcla. (K) Diagrama de puntos de RFP versus EXT para adultos de 3 días de edad cultivados en mezcla. (L) Parcela de densidad de larvas de adultos de 3 días de edad cultivadas en mezcla, Ochrobactrum BH3 y OP50. Todos los valores de p se generaron a partir de la prueba t de student (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.d., no significativo; mezcla n = 230; Och n = 45). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Enriquecer las poblaciones objetivo en función de la colonización del microbioma . (A) Diagrama de puntos de TOF versus RFP (Ochrobactrum BH3) para adultos de 3 días de edad. Las puertas RFP altas (caja roja) y bajas (caja negra) se dibujan para enriquecer a C. elegans con una colonización alta y baja de Ochrobactrum BH3. (B) Imágenes representativas de RFP (4x) de los pozos que contienen 15 gusanos clasificados de las compuertas RFP altas y bajas (Bar = 1 mm). (C) Imágenes representativas (10x) de gusanos individuales de puertas RFP altas y bajas (Bar = 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1: Conjunto de datos representativos generados por un clasificador de partículas grandes para poblaciones de N2 en la edad adulta de los días 2 y 3 cultivadas con E. coli OP50 y Ochrobactrum BH3. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Scripts utilizados en el análisis y generación de figuras de conjuntos de datos representativos en el entorno R. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La vermimetría de flujo se ha utilizado para caracterizar los genes y las vías de C. elegans contra la colonización y toxicidad de patógenos en varios estudios21,22. Aquí, se presenta un enfoque de alto rendimiento que utiliza C. elegans para investigar cómo los microbiomas intestinales modulan la fisiología de su huésped. En comparación con los métodos existentes que utilizan unidades formadoras de colonias (UFC) o secuenciación de amplicones de ARNr 16S 9,16,17,23,24, este enfoque no requiere un recuento laborioso ni introduce un posible sesgo de PCR. Además de medir los microbiomas en toda una población, este enfoque permite a los usuarios visualizar las variaciones individuales dentro de la población. Este enfoque está limitado solo por la disponibilidad de expresión de proteínas fluorescentes o la tinción de microbios y el número de canales de detección en el LPS. A continuación se analizan consideraciones adicionales para el diseño experimental para que los usuarios puedan crear un flujo de trabajo personalizado basado en sus necesidades.

Consideraciones para crear y sembrar un microbioma definido
En primer lugar, cada cultivo bacteriano se normaliza a un valor OD600 de 1 antes de mezclar diferentes cepas. Vale la pena señalar que, dependiendo de la complejidad de la comunidad y de las relaciones entre especies, la densidad inicial puede tener diversos impactos en la composición del microbioma establecida23. Si bien la DO se puede medir fácilmente con espectrofotómetros, una advertencia es que diferentes bacterias tendrán diferentes concentraciones (por ejemplo, el número de células por ml) para el mismo valor de DO y deben ajustarse en consecuencia. En segundo lugar, se debe tener en cuenta la variación en la composición del microbioma en el césped. Una vez que el microbioma se siembra en la placa NGM (u otro medio), se permite que el microbioma crezca durante la noche a temperatura ambiente antes de dejar caer las poblaciones sincronizadas de C. elegans L1 en las placas. Debido a las variaciones en las tasas de crecimiento y las interacciones entre especies entre cepas bacterianas, los microbiomas cultivados en placas NGM o en cualquier placa con sustratos para el crecimiento diferirán en composición de la mezcla de semillas original. El uso de una placa NGM sin peptona puede preservar la comunidad microbiana original13. Sin embargo, debido al crecimiento limitado del microbioma en la placa libre de peptona, puede ser necesario un OD de siembra más alto o un número reducido de L1 sincronizadas por placa. Esto evita que la población muera de hambre antes de alcanzar la edad deseada para el ensayo. Otro enfoque es secuenciar o determinar la proporción de microbios en el césped.

Medición de la colonización del microbioma y la fisiología de C. elegans
En primer lugar, los umbrales de extinción (EXT) y de tiempo de vuelo (TOF) para los adultos pueden variar en función de la edad, el origen de la cepa de C. elegans y los microbios en los que se cultivan. Tener una población adulta de 1 día de edad en el experimento para cada condición de gusano/bacteria puede ser útil para determinar el TOF y los límites de extinción, así como para controlar la variación debida al medio de crecimiento y al medio ambiente. Además de la compuerta para los adultos, TOF y EXT se pueden aplicar a la compuerta para las larvas, y un diagrama de densidad de la progenie puede estimar el momento y la producción de la reproducción a nivel de población (Figura 3L). En segundo lugar, las ganancias de PMT y el voltaje en el LPS deben ajustarse para maximizar la relación señal-ruido y establecer el rango de la señal para evitar la saturación. Esto depende de la intensidad fluorescente de las cepas bacterianas y de sus niveles de colonización. El PMT predeterminado en 350 funciona bien para colonizadores altos como Ochrobactrum BH3, pero es posible que los usuarios deban aumentar los valores de PMT o voltaje para colonizadores bajos como E. coli OP50. En tercer lugar, debido a las diferencias en las propiedades de los fluoróforos y sus niveles de expresión en cepas bacterianas transgénicas, los valores fluorescentes no reflejan el número absoluto de bacterias presentes en el microbioma. Por lo tanto, los valores de GFP y RFP no se pueden utilizar para comparar directamente la colonización entre dos microbios fluorescentes diferentes. La alteración y el recubrimiento de los animales para identificar los recuentos de bacterias vivas pueden ayudar a resolver mejor estas relaciones24.

Posibles aplicaciones de las estrategias basadas en el enriquecimiento
Este método proporciona una plataforma de alto rendimiento para investigar el impacto de los cambios en el microbioma en la fisiología del huésped a nivel poblacional. Desde el punto de vista microbiano, la creciente disponibilidad de herramientas y recursos para editar genomas bacterianos25,26,27 aumentará el número de mutantes microbianos fluorescentes y funcionales relacionados con el microbioma natural de C. elegans. Desde el lado del huésped, se dispone de numerosos reporteros fluorescentes para explorar el vínculo entre la señalización celular y la composición del microbioma. La capacidad de enriquecer una población huésped o mutante a partir de una población mutagenizada (p. ej., mutagénesis directa EMS)28 o cepas silvestres agrupadas29, con características específicas de colonización del microbioma, puede mejorar en gran medida la capacidad de conectar los genes del huésped que regulan el impacto del microbioma. Además, la selección de poblaciones en función de las características del huésped y/o del microbioma también puede facilitar un cuadro de modalidades de elaboración de perfiles basadas en la ómica. Este enfoque tiene una gran flexibilidad y promete avanzar en la comprensión de los mediadores moleculares de las interacciones huésped-microbioma.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH DP2DK116645 (a B.S.S.), el premio piloto de la Fundación Dunn y la subvención de la NASA 80NSSC22K0250 (a B.S.S.). Este proyecto también contó con el apoyo del Centro de Citometría y Clasificación Celular de Baylor College of Medicine con fondos del Premio de Apoyo a las Instalaciones Centrales de CPRIT (CPRIT-RP180672), los NIH (S10 OD025251, CA125123 y RR024574) y la asistencia de Joel M. Sederstrom, además de una subvención de instrumentación para la subvención de los NIH de LPS (S10 OD025251). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes VWR 10026-076
96 deep-well plates (1 mL) Axygen P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL) Axygen P-DW-20-C
96-well Costar plate Corning 3694
Agar Millipore Sigma Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold V&P scientific VP1171A
Bleach Clorox
Bleach solution  Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader Biotek Cytation 5 Bacterial OD measurement
Centrifuge Thermo scientific  Sorvall Legend XTR For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope Nikon TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. R package Version 3.3.2
Large Particle Autosampler Union Biometrica LP Sampler
Large Particle Sorter Union Biometrica COPAS Biosorter
Levamisole Fisher AC187870100
Lysogeny Broth (LB) RPI L24066 Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution  22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium RPI N81800-1000.0 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio GNU Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite Sigma-Aldrich 5M NaOH
Stereo Microscope Nikon SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes Corning 351029
Sterile 12-well plates VWR 10062-894
Sterile 24-well plates VWR 10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes Corning 351007
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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References

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Biología Número 193 Análisis Microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans Composición Fisiología del huésped Cambios en la composición Relaciones funcionales Impulsores moleculares Interacciones huésped-microbioma Plan corporal transparente Microbios naturales marcados con fluorescente Niveles relativos de microbios Clasificador de partículas grandes Configuración experimental Recolección Análisis Poblaciones de C. elegans Operación y mantenimiento del clasificador Análisis estadísticos Optimización de la configuración del clasificador Estrategias efectivas de compuerta Enriquecimiento de las poblaciones animales la escalabilidad a las aplicaciones de alto rendimiento
Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal <em>de Caenorhabditis elegans</em>
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Zhang, F., Blackburn, D., Hosea, C.… More

Zhang, F., Blackburn, D., Hosea, C. N., Assié, A., Samuel, B. S. Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome. J. Vis. Exp. (193), e64605, doi:10.3791/64605 (2023).

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