Summary
Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.
Abstract
A composição do microbioma intestinal pode ter um impacto dramático na fisiologia do hospedeiro ao longo do desenvolvimento e da vida do animal. Medir as mudanças composicionais no microbioma é crucial para identificar as relações funcionais entre essas mudanças fisiológicas. Caenorhabditis elegans emergiu como um poderoso sistema hospedeiro para examinar os drivers moleculares das interações hospedeiro-microbioma. Com seu plano corporal transparente e micróbios naturais marcados com fluorescência, os níveis relativos de micróbios dentro do microbioma intestinal de um animal de C. elegans individual podem ser facilmente quantificados usando um grande classificador de partículas. Aqui descrevemos os procedimentos para o arranjo experimental de um microbioma, coleta e análise de populações de C. elegans no estágio de vida desejado, operação e manutenção do classificador, e análises estatísticas dos conjuntos de dados resultantes. Também discutimos considerações para otimizar as configurações de classificação com base nos micróbios de interesse, o desenvolvimento de estratégias de confinamento eficazes para os estágios de vida de C. elegans e como utilizar as capacidades de classificação para enriquecer as populações animais com base na composição do microbioma intestinal. Exemplos de aplicações potenciais serão apresentados como parte do protocolo, incluindo o potencial de escalabilidade para aplicativos de alto rendimento.
Introduction
A evolução animal está sob constante influência microbiana1. A partir de diversos micróbios no ambiente, os hospedeiros animais adquirem parceiros específicos2 que ampliam as capacidades do hospedeiro e impulsionam sua fisiologia e suscetibilidade a doenças3. Por exemplo, análises metagenômicas do microbioma intestinal descobriram classes metabólicas enriquecidas de genes microbianos que podem conferir maior colheita e armazenamento de energia em camundongos obesos4, muitos dos quais também são encontrados no microbioma intestinal humano5. Ainda há uma grande necessidade de estabelecer relações causais e identificar os determinantes moleculares do impacto do microbioma, embora o progresso tenha sido prejudicado pelas complexidades do microbioma e pela tratabilidade dos sistemas hospedeiros para triagem em larga escala.
O organismo modelo C. elegans fornece uma plataforma para avançar a compreensão molecular das ligações entre o microbioma e a fisiologia do hospedeiro. C. elegans possui 20 células intestinais com camada mucosa e estruturas vilosidades. Essas células são equipadas com abundantes genes quimiorreceptores que detectam produtos microbianos e produzem moléculas antimicrobianas que potencialmente regulam seus colonizadores intestinais 6,7. Essa biologia conservada de C. elegans levou a um grande número de descobertas na sinalização do hospedeiro que regula micróbios intestinais, incluindo sinalização de insulina, TGF-beta e MAP quinase 8,9,10.
C. elegans utilizam micróbios como sua dieta para o crescimento durante o desenvolvimento e microbioma como adultos. Com a velhice, alguns micróbios podem se acumular em excesso no lúmen intestinal e a relação hospedeiro-micróbio muda da simbiose para a patogênese11. Em seus habitats naturais, C. elegans encontra uma grande variedade de espécies bacterianas12,13. O sequenciamento do 16S rDNA a partir de amostras representativas coletadas em habitats naturais (frutos podres, caule de plantas e vetores animais) revelou que o microbioma natural de C. elegans é dominado por quatro filos bacterianos: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria. Dentro dessas divisões encontra-se grande variação na diversidade e riqueza de bactérias com base no habitat12,13,14,15. Várias comunidades definidas foram estabelecidas, incluindo as coleções de 63 membros (BIGbiome)16 e 12 membros (CeMbio) representando os principais gêneros de microbioma criados para a comunidade de pesquisa de C. elegans 17. Tanto os microbiomas quanto as linhagens componentes podem ter um impacto diverso na fisiologia de C. elegans, como tamanho corporal, taxas de crescimento e respostas ao estresse 9,16,17. Esses estudos fornecem recursos e exemplos para estabelecer C. elegans como um modelo para a pesquisa do microbioma.
Aqui é apresentado um fluxo de trabalho baseado em grandes classificadores de partículas (LPS) (Figura 1) que utiliza o sistema C. elegans para medir simultaneamente a composição do microbioma e medidas básicas da fisiologia do hospedeiro em escala populacional. Do lado microbiano, o fluxo de trabalho é adaptável para montar um microbioma definido ou micróbios únicos para testar a robustez e plasticidade da comunidade com interações microbianas crescentes. Do lado do hospedeiro, o fluxo de trabalho permite ensaios de alto rendimento para medir os níveis de colonização de micróbios fluorescentes no microbioma e leitura fisiológica do hospedeiro em termos de desenvolvimento, tamanho do corpo e reprodução. Em conjunto, o modelo do microbioma de C. elegans permite que telas de alto rendimento identifiquem os determinantes metabólicos e genéticos que modulam a fisiologia do hospedeiro.
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Protocol
1. Preparação da mistura do microbioma
- Carimbar ou riscar bactérias de um congelador de glicerol em uma placa de caldo de lisogenia (LB), ou meio de crescimento apropriado, e crescer durante a noite a uma temperatura ideal com base em cepas bacterianas de interesse (tipicamente 25 °C para micróbios naturais de C. elegans ).
- A partir da placa LB, use uma única colônia de cada isolado bacteriano (por exemplo, 12 bactérias da coleção CeMbio) para inocular 800 μL de meio LB em poços separados de uma placa de poço profundo de 1 mL. Incubar durante a noite à temperatura ideal com agitação a 250 rpm.
NOTA: Este protocolo é otimizado para uso com microbiomas naturais definidos (por exemplo, CeMbio), mas pode ser facilmente ajustado para micróbios individuais pelo crescimento sob condições apropriadas ou outros vasos de cultura (tubos). - Avaliar o crescimento de cada micróbio por espectrofotometria. Transfira uma alíquota de 20 μL para 80 μL de LB e adicione a solução a uma placa de fundo plano transparente de 96 poços. Meça o OD600 em um leitor de placas.
- Após o crescimento durante a noite, centrifugar a placa de cultura de poço profundo a 4.000 x g por 10 min para pellets de bactérias e remover o sobrenadante por aspiração usando um coletor de aspiração de 96 poços ou pipeta multicanal.
- Usando valores de OD600 , normalize a concentração de cada micróbio para um OD600 final de 1,0 usando meio M9 estéril.
- Se combinar micróbios, determine a quantidade de cultura bacteriana necessária para o experimento e crie uma mistura mestre de microbioma combinando volumes iguais de cada cepa bacteriana em um tubo de tamanho suficiente (por exemplo, tubos de 5 mL ou 15 mL).
- Detectar 30-50 μL dos micróbios com um ODfinal de 600 de 1,0 no centro de cada placa ou poço contendo ágar meio de crescimento de nematoide (NGM)18. Permita que o microbioma semeado cresça durante a noite a uma temperatura ideal (25 °C aqui).
NOTA: Prepare as placas de ágar NGM com antecedência de acordo com as instruções no Wormbook ou usando pó NGM pré-misturado18. Por exemplo, 3 mL de NGM é adicionado para placas de 12 poços, e 1,5 mL é adicionado para placas de 24 poços.
2. Preparação de C. elegans sincronizados para crescimento no microbioma
- Cultivar aproximadamente 100 vermes em placas NGM (6 cm de diâmetro) semeadas com Escherichia coli OP50, até que os vermes atinjam a idade adulta gravídica. Para os propósitos deste protocolo, a cepa N2 de C. elegans foi utilizada, embora o protocolo possa ser facilmente adaptado a outras cepas de nematoides.
- Adicionar 6 mL de tampão M9 (mais 0,01% de triton X-100; M9-TX) para a placa, pipetando para cima e para baixo para lavar aproximadamente 100 vermes adultos gravídicos em um tubo cônico de 15 mL.
- Prepare a solução de água sanitária recém-feita misturando duas partes de água sanitária com uma parte de NaOH 5 M.
- Centrifugar os vermes a 3.000 x g por 30 s para peletizar os vermes. Aspirar para reduzir o volume para 4 mL e, em seguida, adicionar 2 mL de solução de água sanitária.
- Feche bem a tampa e agite o tubo. Monitorar os vermes adultos na solução sob um microscópio estéreo em aumento de 10x. Quando os corpos adultos começam a se separar, normalmente após 3,5 min, pare de tremer e centrífuga a 3.000 x g por 30 s.
- Aspirar a um volume mínimo com uma pipeta. Ressuspender, centrifugar e aspirar quatro vezes em M9-TX para lavar a água sanitária.
- Ressuspender em 4-6 mL de M9-TX e colocar o tubo em um rotador durante a noite, permitindo que os ovos eclodam e sincronizem no estágio L1.
- No dia seguinte, pegue 10 μL de vermes L1 em M9-TX do tubo e solte-os em uma placa de Petri limpa. Conte o número de vermes L1 vivos sob um microscópio estéreo com aumento total de 20x.
- Com base na densidade L1, pipetar o volume apropriado para soltar ~50 larvas L1 sincronizadas na borda das placas NGM semeadas do microbioma e incubar a 20 °C. Permita que os vermes cresçam até a idade desejada (Dia 2 ou Dia 3 da idade adulta).
3. Coleta de população de vermes para análises do microbioma intestinal
- Lave os vermes do gramado bacteriano com 1-2 mL de M9-TX para uma placa esterilizada de 2 mL e 96 poços de profundidade.
NOTA: Para cepas microbianas que criam biofilmes significativos, agite a placa com líquido por 5 minutos para quebrar os detritos microbianos. - Centrifugar a placa de poço profundo a 300 x g por 1 min para peletizar os vermes e, em seguida, remover o líquido usando um coletor de aspiração.
Observação : os usuários podem usar uma pipeta multicanal para remover manualmente o líquido se um coletor de aspiração não estiver disponível. Certifique-se de que as pontas da pipeta não tocam no fundo dos poços para evitar a perda de amostras de minhocas. - Adicionar 1,8 mL de M9-TX a cada poço da placa de poço profundo usando uma pipeta multicanal de 1,2 mL. Misture pipetando para cima e para baixo algumas vezes e centrifugando a 300 x g por 1 min. Repita este passo quatro vezes para remover as bactérias no líquido.
- Após a lavagem final, levar o volume de cada poço para 100 μL usando o coletor aspirador.
NOTA: Para separar os adultos das larvas usando a gravidade, deixe a placa no banco por 30-60 s, permitindo que os vermes adultos afundem no fundo do poço. Em seguida, aspirar a placa para remover as larvas da suspensão. - Adicionar 100 μL de levamisol 10 mM em M9-TX a cada poço e deixar os vermes paralisarem por 5 min. Após o tratamento com levamisol, adicionar 4% da solução de água sanitária descrita na etapa 2.3 a cada poço por 2 minutos para reduzir os aglomerados bacterianos, se necessário. Lavar com M9-TX duas vezes após o tratamento com água sanitária e aspirar até um volume final de 100 μL após a segunda lavagem.
- Transfira os vermes para uma placa de fundo plano de 96 poços contendo 150 μL de levamisol 10 mM em M9-TX. Mantenha a densidade de vermes em 50-100 por poço e divida as minhocas em vários poços se a população estiver muito lotada.
4. Configuração do classificador de partículas grandes e do amostrador automático
- Ligue o compressor de ar, o computador e o instrumento LPS. Verifique e esvazie o tanque de resíduos. Em seguida, adicione 500 mL de água sanitária ao tanque de resíduos vazio. Verifique e reabasteça bainha e caixas d'água se o volume estiver baixo. Certifique-se de que o conjunto de núcleo fluídico e óptico (FOCA) de 250 μm esteja no lugar.
- Execute as partículas de controle para controle de qualidade. Abra o software do instrumento LPS. Na janela do software, marque Ativar lasers para ativar os lasers de 488 nm e 561 nm.
NOTA: É possível pular as etapas 4.2-4.5 se as partículas de controle tiverem sido executadas nas últimas 2 semanas e o FOCA não tiver sido alterado nesse período. - Selecione Configurar > partículas de controle. Selecione Não no prompt para ir para as configurações padrão. Vórtice as partículas controle (10 mL dH,2O e 10 mL partículas controle em um tubo cônico de 50 mL) antes de cada uso e carregue-as no orifício da amostra.
- Quando estiver pronto, clique em Adquirir para registrar 500 eventos. Certifique-se de que a taxa de eventos seja lida entre 15 e 30 eventos/s.
NOTA: Se a taxa de eventos não for de 15 a 30 eventos/s, um engenheiro deverá ser contatado para ajustar as configurações da máquina. - Examine o coeficiente de variação (CV) para todos os parâmetros. Se o CV < 15%, o controle de qualidade é passado e o software LPS pode ser fechado. Se CV > 15%, execute novamente e ajuste os micrômetros com partículas de controle recém-feitas para alinhar o laser com a célula de fluxo.
- Conecte e ative o amostrador automático. Abra o software do instrumento do amostrador automático. Isso abre o amostrador automático e o software LPS. Na janela do software LPS, vá para Arquivo > Novo Experimento e, em seguida, Arquivo > Novo Exemplo. Marque Ativar lasers para ativar lasers de 488 nm e 561 nm, se isso ainda não tiver sido feito.
- Crie modelos para gráficos de pontos de aquisição usando tempo de voo (TOF), extinção (EXT) e canais fluorescentes na janela do software LPS. Um bom número máximo inicial para capturar todos os vermes é de 8.000 para TOF e EXT. As escalas de fluorescência variam de acordo com cada micróbio. Inclua amostras de vermes de controle cultivadas em micróbios não fluorescentes (por exemplo, OP50) e cada micróbio fluorescente sozinho (se misturar micróbios) como controles em cada experimento.
- Clique com o botão direito do mouse no corpo de um gráfico para modificar o dimensionamento. Use animais de controle, como adultos do Dia 1 ou L1s sincronizados (ou população de interesse) para ajudar na seleção de TOF e EXT.
- Na janela do amostrador automático, selecione Prime. Vá para Arquivo > Script Aberto para selecionar o script interno correto e clique em OK.
- Somente para análise, selecione o script com Acquire. Para classificar, selecione o script com Dispense. Para aquisição a partir de placas de 96 poços, selecione o roteiro com 96 poços; Para aquisição de placas de 384 poços, selecione o roteiro com 384 poços. Para o volume da amostra (40 ou 100 μL), selecione o script com o volume correspondente.
- Vá para Modelo de placa no menu do software do amostrador automático para selecionar os poços desejados para análise. Carregue as amostras de controle. Depois que a placa for carregada no estágio do amostrador automático e protegida, pressione Executar placa na janela do amostrador automático. Salve o arquivo quando solicitado.
NOTA: As amostras de controle e as configurações podem ser feitas com um tubo cônico de 50 mL na porta de amostra LPS antes de conectar o amostrador LP. - Quando a aquisição estiver concluída, clique no botão Armazenar Dados na faixa de opções superior na janela do software LPS e salve os dados novamente.
5. Análise das características de C. elegans e dos níveis de microbioma intestinal por animal
- Os dados brutos são armazenados em três tipos de arquivo: .lmd, .bxr3 .txt. Carregue o arquivo de texto rotulado .txt arquivo no programa R para análise. Conclua as etapas abaixo na R19.
- Use o pacote tidyverse20 como uma estrutura para a análise.
- Usando a função ggplot (incluída no tidyverse), plote os dados LPS usando os valores TOF como eixo x e valores EXT como eixo y. Um gráfico normal mostrará duas nuvens de pontos. Certifique-se de que um está próximo da origem e do eixo x, indicando partículas menores, como larvas e pequenos detritos, e o segundo grupo de partículas está na parte superior direita da parcela e representa nematoides adultos.
- Usando esse agrupamento como guia, escolha valores de corte TOF e EXT adequados. O gating pode variar de acordo com as cepas de C. elegans em diferentes micróbios com base em mudanças na fisiologia (por exemplo, animais escuros versus claros ou mudanças no transporte de ovos podem alterar os coeficientes EXT).
- Use o subconjunto de funções para separar adultos e larvas por TOF e EXT gating. No exemplo aqui, use TOF > 1.200 e EXT > 1.000 configurações para portar para animais adultos.
- Analisar os conjuntos de dados resultantes para diferenças estatísticas; use a função t-test em R para este experimento.
- Para determinar o impacto do microbioma no tamanho e densidade óptica de C. elegans, compare os valores de TOF e EXT, respectivamente, entre as condições. A SQE é uma proxy para o tamanho do verme e pode indicar mudanças nas taxas de crescimento dos animais em momentos específicos. As alterações no EXT são maiores entre o final do desenvolvimento e a idade adulta devido à luz espalhada pelos ovos e podem ser usadas para avaliar mudanças no momento dessa transição e fecundidade. Avaliar a proporção e a distribuição da progênie se elas foram retidas durante as análises.
- Para determinar mudanças nos níveis de colonização do microbioma intestinal, primeiro normalize os valores de fluorescência (por exemplo, colunas vermelhas ou verdes) dividindo com valores individuais de TOF para cada animal. À medida que os vermes crescem em tamanho e se tornam adultos, o volume de seu intestino também aumenta. A normalização ajuda a reduzir os artefatos das diferenças nas distribuições de tamanho dos animais da amostra. Use animais normalizados para avaliar mudanças na colonização do microbioma intestinal através das condições.
Observação : um exemplo de dados brutos e scripts R correspondentes podem ser encontrados no arquivo suplementar 1 JOVE_worm_microbiome.txt e arquivo suplementar 2 JOVE_worm_microbiome.r. Veja a Figura 2 e a Figura 3 para um exemplo representativo dessas análises do hospedeiro e do microbioma usando duas bactérias fluorescentes.
6. Classificação de animais de C. elegans por características do microbioma intestinal
- Coletar uma população de C. elegans cultivada em micróbios marcados com fluorescência (por exemplo, RFP), conforme descrito na Etapa 3. Os vermes devem ser colocados em tubos cônicos de 50 mL com um mínimo de 5 mL de amostra. Procure aproximadamente 2.000 vermes/mL, incluindo todos os adultos e descendentes.
NOTA: Isso também pode ser feito em uma placa de fundo plano de 96 poços usando o amostrador LP. Mantenha a densidade de vermes em 50-100 por poço.- Se o amostrador de LP tiver sido usado, desligue e desconecte o amostrador de LP. Reconecte as linhas de amostra e limpeza ao LPS antes de classificar.
- Abra o software LPS, vá para Arquivo > Novo Experimento e, em seguida, Arquivo > Novo Exemplo. Crie um gráfico de pontos com TOF no eixo x e Extinção no eixo y. Crie outro gráfico de pontos com TOF no eixo x e Vermelho no eixo y. Use a mesma escala de eixo e configurações de laser usadas anteriormente. Marque Ativar lasers para ativar lasers de 488 nm e 561 nm
Observação : se esses gráficos foram criados anteriormente, vá para arquivo > Abrir experimento e arquivo > abrir amostra para carregar gráficos.- Coloque o tubo de amostra de controle na porta de amostra. Na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar, clique em Adquirir. Salve o arquivo quando solicitado. Depois que vermes suficientes tiverem sido medidos para distinguir populações, clique em Abortar.
NOTA: As taxas de fluxo devem ser de aproximadamente 15 a 30 eventos/s. Caso contrário, ajuste as concentrações de vermes para garantir que os animais individuais sejam analisados ou classificados por gotícula. No LPS, os vermes passam pelo caminho do laser em diferentes posições (reta versus enrolada ou dobrada). Eles podem levar uma quantidade diferente de tempo para passar o laser e o detector, dependendo de suas posições. - No TOF vs Extinction dot plot desenhe um portão em torno da população adulta. No TOF vs Red dot plot desenhamos portões ao redor das áreas com altos e baixos valores vermelhos como regiões de interesse para vermes adultos com diferentes níveis de colonização do microbioma. Vá para Exibir > hierarquia de gating e verifique se os portões fluorescentes estão listados sob o portão da população adulta. Depois que as configurações forem otimizadas, vá para Arquivo > Salvar Experimento e Arquivo > Salvar Amostra.
NOTA: No exemplo aqui, selecione animais com base em portões TOF/EXT para adultos e classifique em pools que exibem alta ou baixa colonização por bactérias que expressam proteínas fluorescentes vermelhas. No entanto, qualquer combinação de parâmetros medidos pelo LPS pode ser usada para identificar a(s) população(s) de interesse.
- Coloque o tubo de amostra de controle na porta de amostra. Na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar, clique em Adquirir. Salve o arquivo quando solicitado. Depois que vermes suficientes tiverem sido medidos para distinguir populações, clique em Abortar.
- Antes da triagem, certifique-se de que o aparelho de recolha adequado foi carregado. Para carregar a placa de 96 poços no aparelho de coleta, selecione Carregar placa A > Mover na seção Mover estágio na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar para permitir que o estágio de coleta se mova para uma posição preparada para carregar uma placa de 96 poços.
- Para classificação em massa, selecione o tamanho apropriado do tubo e clique em Mover para carregar um tubo cônico de 15 mL ou 50 mL. Na seção Classificação da caixa de diálogo Adquirir/Dispensar, escolha o portão de classificação na lista suspensa das regiões criadas. Insira o número de objetos da região definida para dispensar em um tubo de coleta diretamente abaixo do bocal da célula de fluxo. Clique no botão Classificação em massa na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar.
- Para dispensar uma placa de 96 poços, vá para Configurar placas > > placas calibradas > placa de 96 poços. Em seguida, vá para Exibir > modelo de placa, selecione os poços para os quais os vermes serão classificados, insira o número de objetos a serem classificados em cada poço e selecione as regiões fechadas de interesse. Se mais de uma região fechada for classificada na mesma placa, marque a caixa Portar cada poço. Clique em OK para salvar as alterações.
- Depois que os números e locais de classificação tiverem sido atribuídos, clique nos botões Preencher placa na caixa de diálogo Adquirir/Dispensar para iniciar a distribuição em uma placa de 96 poços.
- Antes de encher toda a placa de 96 poços, realize a triagem de teste de um subconjunto de animais ou controles em uma placa de 96 poços e analise usando um estereomicroscópio para garantir que o número apropriado e as populações de animais desejadas tenham sido classificados. Uma vez confirmada a classificação precisa, repita as etapas 6.3-6.6 para amostras experimentais. Clique no botão Armazenar Dados na faixa de opções superior na janela do software LPS para salvar os dados novamente.
NOTA: Todas as medidas (EXT, TOF, RFP, GFP, etc.) também podem ser coletadas para animais classificados e comparadas com aquelas que não foram classificadas. Isso pode permitir que os modos de análise e classificação sejam executados ao mesmo tempo, se desejado.
- Antes de encher toda a placa de 96 poços, realize a triagem de teste de um subconjunto de animais ou controles em uma placa de 96 poços e analise usando um estereomicroscópio para garantir que o número apropriado e as populações de animais desejadas tenham sido classificados. Uma vez confirmada a classificação precisa, repita as etapas 6.3-6.6 para amostras experimentais. Clique no botão Armazenar Dados na faixa de opções superior na janela do software LPS para salvar os dados novamente.
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Representative Results
Definição de portões populacionais de adultos e larvas
Aqui, C. elegans L1s sincronizados foram cultivados em uma placa NGM semeada com E. coli OP50 (Eco), uma dieta padrão de laboratório. Populações de C. elegans foram coletadas para análise de LPS após 96 h ou 120 h de crescimento a 20 °C (Figura 2A). Um gráfico de pontos de extinção (EXT, um proxy de densidade corporal) versus tempo de voo (TOF, um proxy de comprimento do corpo) cria duas nuvens de animais visualmente separadas. Cada ponto representa um único animal onde maiores valores de EXT e TOF são observados em adultos em comparação com larvas (Figura 2B). Esses dois parâmetros são inferências valiosas para o crescimento populacional e fisiologia. Por exemplo, um gráfico de densidade de larvas TOF pode visualizar a distribuição dos estágios larvais. Progênies de adultos de 2 dias de idade foram dominadas pelos estágios L1 e L2 com SQE abaixo de 200, enquanto a maioria das progênies de adultos de 3 dias atingiu os estágios L3 e L4 (Figura 2C). Além disso, a densidade 2D e os gráficos de box-whisker são úteis para visualizar mudanças no tamanho e densidade corporal de adultos, uma vez que os valores de TOF e EXT aumentam no Dia 3 em comparação com o Dia 2 quando cultivados em E. coli (Figura 2D-F). Essa relação é tipicamente linear durante a idade adulta, mas algumas mudanças na fisiologia podem afetar uma característica mais do que outra (por exemplo, adultos sem ovos podem ter valores mais baixos de EXT sem afetar a SQE).
Perfil da composição do microbioma intestinal usando micróbios marcados fluorescentemente
A fim de ilustrar diferentes níveis de colonização, comparamos um colonizador dominante do microbioma natural de C. elegans dTomato-tagged Ochrobactrum BH3 (Och) e E. coli OP50 marcada com proteína fluorescente verde (GFP). Estes dois foram semeados individualmente e em uma mistura igual à base de OD (mistura 1:1) na placa NGM. C. elegans L1s sincronizados foram cultivados nas três condições e coletados em 120 h para examinar a dinâmica de colonização em adultos de 3 dias de idade (Figura 3A). Os gráficos de densidade 2D e box-whisker mostraram que há diferenças nos valores de TOF e EXT de adultos quando C. elegans é cultivada em culturas de Ochrobactrum BH3 e mistas (Figura 3B-E). A colonização intestinal de bactérias pode ser inferida pelo nível de fluorescência detectado nos nematoides individuais. Gráficos de box-whisker de leituras fluorescentes vermelhas mostram maior colonização por Ochrobactrum BH3 na condição de mistura do que em Ochrobactrum BH3 isoladamente. Em contraste, valores de fluorescência verde indicam menor colonização de OP50 na condição de mistura do que em OP50 isoladamente. Tendências semelhantes são observadas nos sinais fluorescentes normalizados pela SQE, o que remove o efeito do tamanho corporal e reduz a variação dentro da população (Figura 3F-I). Para um microbioma definido com múltiplos micróbios marcados com fluorescência, um gráfico de pontos pode ilustrar os padrões de colonização desses micróbios. Por exemplo, no microbioma de mistura de dois membros, um gráfico de pontos de proteína fluorescente vermelha (RFP) versus canais de GFP mostra que os vermes estão fortemente inclinados em direção ao eixo y (RFP), sugerindo que a colonização por OP50 é baixa na maioria dos vermes, enquanto os níveis de colonização por Ochrobactrum BH3 estão uniformemente distribuídos na população (Figura 3J). Da mesma forma, um gráfico de pontos de RFP versus EXT pode revelar a relação entre os níveis de colonização por Ochrobactrum BH3 e o desenvolvimento do hospedeiro, como a densidade corporal (Figura 3K). Além disso, as diferenças nos padrões de reprodução podem ser observadas plotando-se a parcela de densidade das respectivas populações de larvas nas três condições (Figura 3L).
Enriquecimento para populações-alvo com base na colonização do microbioma
Os adultos de 3 dias de idade cultivados no microbioma de mistura de dois membros exibem uma ampla gama de intensidade de RFP, indicando variações individuais na colonização por Ochrobactrum BH3 dentro do grupo (Figura 4A). Para separar ainda mais esses subgrupos, as comportas de classificação para RFP alto e baixo foram sorteadas manualmente para classificar 15 indivíduos de cada porta em uma placa de 96 poços, como mostrado pela imagem RFP de todo o poço (Figura 4B). Sob maior ampliação, imagens de sobreposição de campos brilhantes e canais de RFP confirmam que o método de classificação seleciona vermes colonizados por Ochrobactrum BH3 de alto e baixo, o que permite uma caracterização mais detalhada das consequências fenotípicas e dos drivers moleculares (Figura 4C).
Figura 1: Fluxograma para métodos baseados em vermimometria de fluxo para avaliar o microbioma intestinal e a fisiologia do hospedeiro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Definição das populações de adultos e larvas. (A) Um fluxo de trabalho para coletar populações de C. elegans no Dia 2 e Dia 3 da idade adulta. (B) Dot plot de tempo-de-vôo (TOF) versus extinção (EXT) para populações de C. elegans nos dias 2 (cinza) e 3 (vermelho) da idade adulta. (C) Parcela de densidade de larvas TOF nos dias 2 e 3 da idade adulta. (D-E) Gráficos de pontos e caixas e whisker de TOF versus EXT para adultos no Dia 2 e Dia 3 da idade adulta. (F) Parcela de extinção de adultos no Dia 2 e Dia 3 da idade adulta. Os valores de p foram calculados com o teste t de Student (*** p < 0,001; Dia 2 n = 38; Dia 3 n = 88). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Perfil da colonização do microbioma intestinal usando micróbios marcados com fluorescência. (A) Coleta de populações adultas de 3 dias de idade cultivadas em Ochrobactrum BH3 (dTomato-expressing; Och), E. coli OP50 (expressão de GFP; Eco) ou uma mistura 1:1 das duas bactérias (mistura). (B) Gráfico de pontos de TOF versus EXT para adultos do Dia 3 cultivados no Mix. (C-E) Gráficos de pontos e caixas e whisker de TOF versus EXT para adultos de 3 dias de idade cultivados em Ochrobactrum BH3. As linhas de traço cinza indicam o valor médio da população cultivada no OP50. (F-G) Gráfico box-and-whisker dos valores de dTomato cru e normalizado por TOF (RFP) para adultos de 3 dias de idade cultivados apenas em Mix e Ochrobactrum BH3. (H-I) Parcelas de Box-and-whisker de GFP cru e normalizado por TOF para adultos de 3 dias de idade cultivados em mix e OP50. (J) Dot plot de Ochrobactrum BH3 (RFP) versus E. coli OP50 (GFP) para adultos de 3 dias de idade cultivados em mistura. (K) Gráfico de pontos de RFP versus EXT para adultos de 3 dias de idade cultivados em mistura. (L) Parcela de densidade de larvas de adultos de 3 dias de idade cultivadas em mistura de Ochrobactrum BH3 e OP50. Todos os valores de P foram gerados a partir do teste t de Student (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.s., não significante; mix n = 230; Och n = 45). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Enriquecer populações-alvo com base na colonização do microbioma . (A) Dot plot de TOF versus RFP (Ochrobactrum BH3) para adultos de 3 dias de idade. Portões RFP altos (caixa vermelha) e baixos (caixa preta) são desenhados para enriquecer C. elegans com alta e baixa colonização por Ochrobactrum BH3. (B) Imagens RFP representativas (4x) dos poços contendo 15 vermes classificados de portas RFP altas e baixas (Bar = 1 mm). (C) Imagens representativas (10x) de vermes individuais de portas RFP altas e baixas (Bar = 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Conjunto de dados representativos gerados por grandes classificadores de partículas para populações de N2 nos dias 2 e 3 adultos cultivados em E. coli OP50 e Ochrobactrum BH3. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: Scripts utilizados na análise e geração de figuras de conjuntos de dados representativos no ambiente R. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A vermimetria de fluxo tem sido utilizada para caracterizar genes e vias de C. elegans contra a colonização e toxicidade de patógenos em diversos estudos21,22. Aqui, uma abordagem de alto rendimento é apresentada que usa C. elegans para investigar como os microbiomas intestinais modulam sua fisiologia hospedeira. Em comparação com os métodos existentes que utilizam unidades formadoras de colônias (UFC) ou sequenciamento do amplicon de 16S rRNA 9,16,17,23,24, essa abordagem não requer contagem trabalhosa intensiva ou introduz potencial viés de PCR. Além de medir microbiomas em uma população inteira, essa abordagem permite que os usuários visualizem variações individuais dentro da população. Esta abordagem é limitada apenas pela disponibilidade de expressão de proteínas fluorescentes ou coloração de micróbios e pelo número de canais de detecção no LPS. Considerações adicionais para o design experimental são discutidas abaixo para que os usuários possam criar um fluxo de trabalho personalizado com base em suas necessidades.
Considerações para criar e semear um microbioma definido
Primeiro, cada cultura bacteriana é normalizada para um valor OD600 de 1 antes de misturar diferentes cepas. Vale ressaltar que, dependendo da complexidade da comunidade e das relações interespécies, a densidade inicial pode ter vários impactos na composição do microbioma estabelecido23. Embora a DO possa ser facilmente medida por espectrofotômetros, uma ressalva é que bactérias diferentes terão concentrações diferentes (por exemplo, o número de células por mL) para o mesmo valor de DO e devem ser ajustadas de acordo. Em segundo lugar, a variação na composição do microbioma nos gramados deve ser considerada. Uma vez que o microbioma é semeado na placa NGM (ou outro meio), o microbioma é permitido crescer durante a noite à temperatura ambiente antes de lançar populações sincronizadas de L1 C. elegans nas placas. Devido às variações nas taxas de crescimento e interações interespécies entre as cepas bacterianas, os microbiomas cultivados em placas NGM ou qualquer placa com substratos para crescimento diferirão em composição da mistura original de sementes. O uso de uma placa NGM livre de peptona pode preservar a comunidade microbiana original13. No entanto, devido ao crescimento limitado do microbioma na placa livre de peptona, uma maior semeadura OD ou um número reduzido de L1s sincronizados por placa pode ser necessário. Isso evita que a população passe fome antes de atingir a idade desejada para o exame. Outra abordagem é sequenciar ou determinar a proporção de micróbios no gramado.
Mensuração da colonização do microbioma e fisiologia de C. elegans
Primeiro, os limiares de extinção (EXT) e tempo de voo (TOF) para adultos podem variar com base na idade, no fundo da cepa de C. elegans e nos micróbios em que são cultivados. Ter uma população adulta de 1 dia de idade no experimento para cada condição de verme/bactéria pode ser útil para determinar a SQE e os pontos de corte de extinção, bem como para controlar a variação devido ao meio de crescimento e ao ambiente. Além do confinamento para adultos, TOF e EXT podem ser aplicados em gate para larvas, e um gráfico de densidade da progênie pode estimar a época e a saída da reprodução em nível populacional (Figura 3L). Em segundo lugar, os ganhos de PMT e a tensão no LPS precisam ser ajustados para maximizar a relação sinal-ruído e definir a faixa de sinal para evitar a saturação. Isso depende da intensidade fluorescente das cepas bacterianas e de seus níveis de colonização. O PMT padrão em 350 funciona bem para colonizadores altos, como Ochrobactrum BH3, mas os usuários podem precisar aumentar o PMT ou os valores de tensão para colonizadores baixos, como E. coli OP50. Terceiro, devido a diferenças nas propriedades dos fluoróforos e seus níveis de expressão em cepas de bactérias transgênicas, os valores fluorescentes não refletem o número absoluto de bactérias presentes no microbioma. Portanto, os valores de GFP e RFP não podem ser usados para comparar a colonização entre dois micróbios fluorescentes diferentes diretamente. A ruptura e o plaqueamento de animais para identificar contagens de bactérias vivas podem ajudar a resolver melhor essas relações24.
Aplicações potenciais para estratégias baseadas no enriquecimento
Este método fornece uma plataforma de alto rendimento acessível para investigar o impacto das mudanças no microbioma na fisiologia do hospedeiro em nível populacional. Do lado microbiano, a crescente disponibilidade de ferramentas e recursos para editar genomas bacterianos25,26,27 aumentará o número de mutantes microbianos fluorescentes e funcionais relacionados ao microbioma natural de C. elegans. Do lado do hospedeiro, numerosos repórteres fluorescentes estão disponíveis para explorar a ligação entre a sinalização celular e a composição do microbioma. A capacidade de enriquecer uma população hospedeira ou mutante a partir de uma população mutagenizada (por exemplo, mutagênese EMS forward)28 ou cepas selvagens agrupadas29, com características específicas de colonização do microbioma, pode avançar muito a capacidade de conectar genes do hospedeiro que regulam o impacto do microbioma. Além disso, a seleção de populações com base nas características do hospedeiro e/ou microbioma também pode facilitar um quadro de modalidades de perfilamento baseadas em ômica. Esta abordagem tem grande flexibilidade e promete avançar na compreensão dos mediadores moleculares das interações hospedeiro-microbioma.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do NIH DP2DK116645 (para B.S.S.), Dunn Foundation prêmio piloto e NASA grant 80NSSC22K0250 (para B.S.S.). Este projeto também foi apoiado pelo Cytometry and Cell Sorting Core no Baylor College of Medicine com financiamento do CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), do NIH (S10 OD025251, CA125123 e RR024574), e da assistência de Joel M. Sederstrom, além de uma concessão de instrumentação para a concessão LPS NIH (S10 OD025251). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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